Un modello murino di amministrazione continua continua della pressione positiva delle vie aeree neonatale e il metodo di precisione del taglio polmonare per misurare la contrattilità delle vie aeree

Sommario

Dimostriamo un metodo non invasivo per somministrare diversi livelli di CPAP a topi neonatali non anestetizzati. La tecnica è pensata per imitare parzialmente la somministrazione di CPAP per molti neonati prematuri, al fine di valutarne gli effetti sullo sviluppo polmonare. Dimostriamo inoltre gli effetti della CPAP sulla contrattibilità delle vie aeree utilizzando il metodo della precision polmonare slice.

Abstract

Le forze meccaniche associate al supporto respiratorio a pressione positiva utilizzato nella terapia intensiva dei neonati prematuri possono avere conseguenze sia positive che involontarie per lo sviluppo polmonare. Il supporto a pressione positiva migliora lo scambio gassoso polmonare, limita l'atelectasia e migliora l'ossigenazione sistemica, ma sono ben noti anche gli effetti dannosi delle modalità invasive, come la ventilazione meccanica, sullo sviluppo polmonare. Tuttavia, ci sono grandi lacune nella nostra comprensione degli effetti avversi delle forme di ventilazione meno invasive. Qui, la pressione positiva continua delle vie aeree (CPAP) è una delle modalità di supporto respiratorio più comuni, rappresentando la meno invasiva dello spettro della pressione positiva. Un importante limite nello studio dello sviluppo delle vie aeree umane è la mancanza di modelli adeguati all'età e la possibilità di somministrare la CPAP ai piccoli animali neonatali. Abbiamo risolto questo problema sviluppando un modello murino di CPAP neonatale somministrato quotidianamente a topi neonati svegli e non anestetizzati — un modello che utilizza livelli clinicamente rilevanti di CPAP in una fase dello sviluppo polmonare del topo corrispondente ai neonati pretermini, quando è probabile che ricevano la CPAP in terapia intensiva. Qui dimostriamo il nostro modello CPAP, che include un sistema comodo e progettato su misura in grado di somministrare la CPAP in modo non invasivo al neonato non anestetizzato con livelli facilmente regolabili. Forniamo inoltre una dimostrazione del metodo del taglio polmonare a taglio di precisione per la misurazione ex vivo dell'iperreattività delle vie aeree. Il PCLS è descritto qui perché fornisce una comoda lettura funzionale del sistema polmonare, che può essere tecnicamente difficile nei modelli animali di piccole dimensioni (neonatali), e ha anche ampia applicabilità ad altri modelli non correlati alla CPAP. Mostriamo dati che dimostrano che il CPAP provoca iperreattività nelle vie aeree, che può avere importanti implicazioni cliniche per la scelta della modalità di supporto respiratorio nella terapia intensiva dei neonati pretermini.

Introduzione

Le problematiche respiratorie, come apnea e difficoltà respiratoria, per molti neonati prematuri richiedono modalità di supporto respiratorio salvavita, che, purtroppo, contribuiscono a morbilità infantile e a lunghe degne ospedaliere. Il supporto respiratorio supplementare_O2 e a pressione positiva, inclusa la ventilazione meccanica (MV) e il CPAP meno invasivo, sono modalità comuni di supporto respiratorio. Tuttavia, il principale problema a breve e lungo termine per i sopravvissuti al periodo critico della prematurità rimane la malattia cronica delle vie^aeree 1,2,3,4, manifestata come sibilazione/asma a vita, scarsa funzione polmonare e riduzione della capacità di esercizio. Sebbene gli effetti dannosi dell'O2 e della MV supplementari siano stati ampiamente implicati nella patogenesi della displasia broncopolmonare (BPD) e nelle morbilità respiratorie a lungo termine^{per decenni} 5,6,7,8, alcune evidenze suggeriscono che forme non invasive di supporto respiratorio, come la CPAP, potrebbero avere effetti indesiderati sul polmone ^{in via di} sviluppo ^6,9,10,11,12. Tuttavia, si sa molto poco sugli effetti avversi della CPAP, principalmente a causa delle difficoltà tecniche associate alla somministrazione non invasiva agli animali neonatali.

Dato il tasso complessivo di aumento dell'asma^{pediatrica 13} e l'aumento dei tassi di sopravvivenza dei neonati pretermine oltre il ricovero in terapia intensiva neonatale, comprendere i meccanismi che avviano cambiamenti strutturali e funzionali avversi delle vie aeree tracheobronchiali immature e come queste contribuiscono a disturbi polmonari permanenti indipendentemente dal supplementare_O2 è un importante bisogno clinico e di ricerca non soddisfatto. Le evidenze emergenti suggeriscono che la CPAP neonatale possa avere effetti avversi a lungo termine sulla funzione delle vie aeree e contribuire ai disturbi del respiro sibilante, il che è significativo poiché la CPAP è diventata la modalità preferita di supporto respiratorio negli sforzi per evitare la tossicità da_O2 derivante da_O2 supplementare. Le sfide tecniche associate alla somministrazione della CPAP a neonati piccoli e adeguati all'età hanno ostacolato i progressi nella nostra comprensione degli effetti della CPAP (sia vantaggiosi che dannosi) sullo sviluppo polmonare. Abbiamo risolto questo problema sviluppando il primo modello neonatale di CPAP 10,11,12,14,15 consegnato quotidianamente (con livelli variabili di CPAP per 3 ore al giorno) a topi svegli e non anestetizzati dalla nascita in poi, permettendo così lo studio dei livelli clinicamente rilevanti di CPAP in uno stadio di sviluppo polmonare paragonabile a neonati molto pretermini (~24-28 settimane di feto) che probabilmente riceveranno il^{CPAP 16. 17}. Abbiamo effettuato risonanze magnetiche nel modello neonatale murino e abbiamo confermato che la CPAP provoca gonfiamento^{polmonare 11} e che la CPAP per la prima settimana postnatale provoca un aumento a lungo termine (3 settimane di età) della reattività delle vie aeree (cioè, 2 settimane dopo la CPAP⁾10,11,12,14, che si allinea con il respiro sibilante nei bambini piccoli (3-4 anni). Qui forniamo una dimostrazione dettagliata del nostro sistema CPAP progettato su misura per topi neonati e descriviamo un metodo pratico per valutare la contrattilità delle vie aeree utilizzando il metodo ex vivo precision lung slice method (PCLS).

Il PCLS offre un'ottima e comoda opportunità per indagare i meccanismi di iperreattività delle vie aeree e le rispettive vie di reattività. Utilizzando il metodo PCLS, le singole vie aeree vengono visualizzate in tempo reale per misurare il restringimento delle vie aeree in risposta a un broncocostrittore come la metacolina dopo aver pretrattato le vie aeree con specifici inibitori dei recettori/canali. Questi studi sono importanti per comprendere le conseguenze fisiopatologiche della CPAP in caso di prematurità, al fine di fornire interventi mirati e attuabili che permettano l'ottimizzazione delle cure cliniche necessarie mitigando al contempo le potenziali conseguenze a lungo tutta la vita.

Protocollo

Gli esperimenti vengono condotti su topi in gravidanza nel tempo, monitorati quotidianamente per determinare il giorno della nascita. I topi vengono trattati con o senza CPAP nel 21% di_O2 per la prima settimana di vita postnatale. Tipicamente i polmoni vengono rimossi in preparazione alla misurazione della reattività AW utilizzando il metodo di precisione polmonare (PCLS) 2 settimane dopo la CPAP, anche se tali misurazioni sono possibili già a partire da P8 giorni (immediatamente dopo la CPAP) o fino all'età adulta. Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida del National Institute of Health (NIH) per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono state approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali presso la Case Western Reserve University.

1. Montaggio della maschera CPAP

1. Costruire una maschera individuale dall'estremità tagliata di una siringa da 5 mL contenente la sezione Luer lock per il collegamento del tubo che consenta la consegna del flusso d'aria e della pressione positiva alle vie aeree del topo (Figura 1A).
2. Preforare la componente della siringa della maschera per ospitare un Luer-Lock filettato collegato a un gomito, un raccordo Luer per il tubo e un tubo standard per acquario (diametro 3/8").
3. Utilizzare il tubo laterale per permettere al flusso d'aria corrente di passare attraverso una perdita regolabile a valle per impostare la contropressione ai polmoni del topo e un manometro su misura per monitorare il livello CPAP in tempo reale.

2. Progettazione del collare

1. Costruisci il colletto con sezioni tagliate sulle punte delle dita di guanti da laboratorio standard di piccole dimensioni. Usalo per collegare il mouse all'unità della maschera.
2. Usa un foraforo (1/4 di pollice) per creare un foro nell'apice della punta del dito tagliato, che crea un'apertura uniforme e di dimensioni uniformi per adattarsi alla faccia e alla testa del topo.
   NOTA: Il foratore garantisce una dimensione della maschera coerente, ma sono necessari fori più grandi intorno a P4 per adattarsi alla crescita del mouse.

3. Costruzione del manometro

1. Costruire un manometro con due pipete sierologiche usa e getta collegate tramite tubi curvi per acquario (Figura 1A). Assicurati che il manometro sia a metà pieno d'acqua contenente una goccia di colorante colorato per facilitare la visualizzazione del livello CPAP.
2. Collega il manometro in serie con, e a valle, di un controller di flusso (portata ~600-700 mL/min) e della maschera.

4. Adattamento del collare e della maschera al topo

1. Per posizionare il collare sul topo (vecchio di 1 giorno), prima posizionalo sull'estremità aperta della maschera, che, con una manovra attenta, deve essere allungata in modo da poter accogliere il volto e la testa del topo.
2. Inserisci il volto del topo attraverso l'apertura del collare, che viene delicatamente rilassato dalla posizione tesa sopra il viso/la testa. A ~4 giorni di età, taglia piccole fessure nell'apertura del collare per adattarsi alla crescita e alla testa più grande del topo, anche se si consiglia anche un punch intero di dimensioni maggiori.

5. Somministrare CPAP a più topi contemporaneamente

1. Realizzare un sistema in grado di somministrare CPAP a più (fino a 10) topi neonatali utilizzando una serie di controller di flusso e manometri (Figura 1B). Fornire il flusso d'aria a monte tramite un normale serbatoio d'aria con un regolatore standard e farlo passare attraverso un controller di flusso che fornisce il flusso complessivo a tutti i dispositivi CPAP e alle unità maschera/collare.
2. Fai bollire l'aria in un serbatoio d'acqua per l'umidificazione prima di passarla direttamente alle unità CPAP e somministra la CPAP a ciascun animale in modo indipendente.
   NOTA: Un mouse di controllo riceve una maschera, lo stesso flusso d'aria, ma senza contropressione o CPAP.
3. Effettuare tutti gli esperimenti su una borsa termica con acqua ricircolata a ~38 ^°C per mantenere una temperatura corporea stabile.

6. Cronologia

1. Monitorare quotidianamente i topi incinte per determinare la data di nascita e poi eseguire la prima sessione CPAP il giorno successivo (P1 giorno di età) per 2 ore (Figura 2) per minimizzare la durata in cui i cuccioli sono lontani da una madre allattante.
2. Per i giorni successivi (P2-P7), esegui ogni sessione CPAP per una durata di 3 ore. Eseguire la CPAP per più di 7 giorni, se necessario, e a qualsiasi livello di CPAP, anche se si usano regolarmente 7 giorni di CPAP a 6 cmH₂O.
3. Successivamente, valuta gli animali per gli effetti della CPAP sulla reattività delle vie aeree, sia immediatamente dopo (P8) la fine della CPAP (P7) sia sugli effetti a lungo termine (ad esempio, P21 o età adulta) utilizzando la preparazione di precisione per incisioni polmonari (sezione 8).

7. Prelievo dei tessuti e contrattilità delle vie aeree

1. Prelevare polmoni per tecniche molecolari o fisiologiche (ad esempio, reazione a catena della polimerasi (PCR), western blots, immunoistochimica, RNASeq, proteomica, metabolomica, ecc.).
   NOTA: L'attenzione principale è sugli effetti della CPAP sulla contrattibilità delle vie aeree, che possono essere valutati in vivo (anestetizzato e ventilato meccanicamente, P21 giorni o più) per la meccanica del sistema respiratorio o ex vivo utilizzando il PCLS (P8 giorni o più). Quest'ultimo presenta grandi vantaggi nell'indagare composti o agenti che prendono di mira vie specifiche che potrebbero non essere adatte all'uso in studi vivo .

8. Estrazione/preparazione a polmone intero per il metodo della precision polmonare slice (PCLS)

1. Eutanasiare il topo tramite overdose anestetica (iniezione intraperitoneale di una miscela ketamina/xilazina; rispettivamente 100 mg/kg/10 mg/kg) per preparare i polmoni a misurazioni ex vivo della reattività delle vie aeree alla metacolina applicata in bagno.
2. Posizionare il topo supino per la cannulazione della trachea usando una siringa riempita di agarosio. Inserisci la cannula attraverso una piccola incisione ventrale del collo e avanzala di ~3 mm prima di fissarla con una sutura.
3. Inietta delicatamente agarosio liquefatto (40 °C) per gonfiare i polmoni (0,4 mL per topi P8; 0,8 mL per topi P21) e mettere il topo in frigorifero per 30 minuti per permettere all'agarosio di raffreddarsi e gelificarsi.

9. Sezionamento polmonare per il metodo PCLS

1. Una volta raffreddato l'agarosio, inserisci un lobo polmonare (a scelta) nell'agarosio al 2%, mettilo su un vibratomo, taglia in sezioni da 300 μm e immergi in soluzione DMEM + Pen/Strep per un'incubazione notturna (5% CO₂, 37°C).
2. Il giorno seguente, risciacquare le fette polmonari con HBSS e montarle in una camera di registrazione per immagini in tempo reale delle risposte delle vie aeree alla sfida della metacolina.
   NOTA: I risultati presentati rappresentano solo trattamenti ingenui (controllo, cioè senza CPAP) e CPAP, e non vengono utilizzati agonisti o antagonisti/inibitori.
   1. Esegui immagini delle vie aeree.
      1. Posiziona le fette di polmone su una camera di perfusione su misura e coprile con un sottile e leggero foglio di rete e un sottocopertura, che vengono tenuti in posizione con grasso al silicone.
      2. Poi, montare la camera di registrazione contenente la fetta su un microscopio e perfusere (7 mL/min) continuamente con HBSS a temperatura ambiente utilizzando una pompa per perfusione.
      3. Usa un microscopio montato con una fotocamera per identificare le singole vie aeree. Dopo un periodo iniziale di 3 minuti di registrazione di base, perfondere la camera con concentrazioni crescenti di metacolina (2 min ciascuna) e registrare continuamente variazioni nell'area dei lumen delle vie aeree.
   2. Quantifica la dimensione delle vie aeree.
      1. Identificare una singola immagine (software ImageJ) di una via aerea per una data concentrazione di metacolina (e di base) e quantificare l'area del lumen selezionando la soglia di regolazione per assicurarsi che l'area del lume sia completamente catturata (Figura 3A).
      2. Poi, applica queste impostazioni alle immagini successive della stessa via aerea a concentrazioni diverse (cioè, la stessa soglia viene usata per una determinata via aerea).
      3. Poi, seleziona l'area del lumen per la misurazione usando lo strumento di tracciamento della bacchetta (Figura 3B) e premi Ctrl + M (Figura 3C) per quantificare automaticamente l'area del lumen in pixel. Ripeti questo per ogni concentrazione di metacolina; i dati sono disponibili numericamente per rappresentazione grafica con la reattività delle vie aeree espressa come frazione della dimensione di base del lumen (Figura 3).
   3. Dimensione del campione
      1. Scegli le vie aeree a caso e esegui la risposta alla metacolina su una sezione AW/polmonare, anche se tipicamente si possono valutare più sezioni per animale. Pertanto, i gruppi di trattamento possono essere costituiti da più vie aeree/animali provenienti da più cucciolate.
      2. Classificare le vie aeree in grandi (>0,05 mm²) o piccole (<0,05^{mm 2}), poiché è stato precedentemente stabilito che il CPAP influisce sulle vie aeree di diverse dimensioni.

10. Consegna di farmaci

1. Analizza utilizzando sezioni esposte a (o incubate con) siRNA che mirano a specifiche vie per 48 ore dopo l'escossione e la sezione.
   NOTA: Agonisti e antagonisti specifici per vari recettori possono essere applicati comodamente nelle sezioni polmonari in modo acuto, il che è un vantaggio se tali composti non sono appropriati o sicuri per la somministrazione in vivo .
2. In alternativa, i polmoni possono essere fissati con inflazione (formalina) a pressioni di gonfiaggio standardizzate (25_{cmH 2}O), conservati e preparati per immunoistochimica e colorazione per analisi successive tramite microscopia confocale.

Risultati

Analisi RM del volume polmonare durante il CPAP neonatale
L'analisi RM è stata utilizzata per visualizzare i cambiamenti nel volume polmonare in topi di 3 giorni, non anestetizzati e che respiravano spontaneamente (n = 4 topi). Il volume polmonare aumentava con l'aumento delle pressioni di gonfiaggio (cioè CPAP) fino a 9_{cmH 2O}(Figura 4A). Sono inoltre mostrate immagini rappresentative di un topo di 3 giorni di età a 0 e 6_c...

Discussione

La CPAP è una modalità necessaria di supporto respiratorio per i neonati pretermine con difficoltà respiratoria. La CPAP viene sovrapposta alla respirazione spontanea e contribuisce a migliorare l'ossigenazione sistemica mantenendo il volume polmonare elevato e prevenendo il collasso alveolare e l'atelectasia. Pertanto, la CPAP presenta importanti benefici salvavita ed è stato dimostrato che migliora lo sviluppo alveolare, anche se i benefici possono dipendere dalla gravità e dalla durat...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siringa da 5 mL	Fisher Scientific	149556458
1 mL di siringa	Fisher Scientific	309659	Iniettare agarosio attraverso la cannula
Perforatrice da 1/4"	McMaster Carr	3427A57
Stampi da incorporamento 22 x 22 x 20	Fisher Scientific	22-19
Aghi da 23 G	Fisher Scientific	305193	Per attaccare la cannula alla siringa, sarebbero necessarie altre dimensioni per epoche diverse da P21 e nbsp;
Pipette sierologiche da 2 mL	Fisher Scientific	13-678-12C	Per la realizzazione del moanometro
Valvole di fuga regolabili	Qualsiasi negozio di animali		https://www.petco.com/shop/ en/petcostore/product/imagi Tarium-Air-Control-Valve
Tubi per acquari	Qualsiasi negozio di animali		https://www.petsmart.com/fish/ filtri e pompe/aria e acqua -pompe/top-fin-acquario-airline -tubing-5291863.html
Fotocamera	Amscope	MU300
Cannula tubing	Fisher Scientific	427411	Per i topi P21. Saranno necessarie altre misure per altre età.  Il tubo dovrebbe adattarsi perfettamente alla trachea
Copertine	Fisher Scientific	12-541-014	18 mm x 18 mm
DMEM:F12	Invitrogen	11039-021
Controllori di flusso	Strumenti chiave	GS10510AVB	Per il flusso d'aria ai singoli topi
Misuratore di portata	Avantor	MFLX68560-04	Per il flusso d'aria all'intero sistema
Gaymar T Pump	Braintree Scientific	TP-700	Per mantenere la temperatura corporea durante il CPAP
Soluzione salina bilanciata di Hanks	Fisher Scientific	MT-20023cv	Diluire a 1x per l'uso
ImageJ	NIH	Download gratuito	https://imagej.net/ij/download.html
Guanti in lattice taglia piccola	Fisher Scientific	MF-300-S	Per la realizzazione delle maschere CPAP
Punto di metraglitura basso agarosio	Invitrogen	165200-100
Mesh	Amazon		https://www.amazon.com/Top- Rifinitura-Poliestere-Crine di Cavallo -vendita/dp/B01AC93LJ0/ref=sr _1_fkmr2_1?parole chiave=dritz%2 Bpoliestere%2Bcrino di cavallo%2Bbr aiuto& qid=1562072725& s=gatew ay& sr=8-1-fkmr2&; th=1
Metacolina	Millipore	A2251
Microscopio	Leica	DMLFS
Pen/streptococco	Invitrogen	15140-148
Pompa a perfusione	Apparato di Harvard	70-2027
Camera di registrazione	Strumenti Warner	RC-27	O simili
Cuscina riscaldante riutilizzabile	Braintree Scientific	TP-R	Per l'uso con la pompa T Gaymar
Grasso al silicone (Molykote111)	Amazon		https://www.amazon.com/Molykote -Lubrificante-Componenti-Resistente- Volatilità/dp/B0DYDFLXGZ/ref=sr_1 _1_sspa?crid=2D4LQC7SRX07P&; dib=eyJ2IjoiMSJ9.HcWWXlt8ThxcB eGCZ6iH5jwumyClyFGkW141klcjnn OH3hc60r0hy53Ji-9HDW0TtH33nJ- 7UmalEzJGg59qB2gzsGNzFMelw
Piastre sterili a 6 pozzi	Fisher Scientific	3516	Per la coltivazione delle fette
Filo di sutura 3-0	Fisher Scientific	SP117	Per legare la cannula alla trachea
Raccordi per tubi	Apparato di Harvard	72-1406
Vibratome (pelco eaislicer)	Ted Pella	11000	O equivalente