Ridimensionamento per un grande impatto: produzione semplificata di virus adeno-associati ricombinanti ad alto rendimento

Sommario

Nonostante siano ampiamente utilizzati nella consegna genica, i vettori virali adeno-associati ricombinanti (rAAV) devono affrontare notevoli sfide di produzione. Questo protocollo delinea metodi di produzione su microscala e miniscala utilizzando sia celle aderenti che in sospensione. I metodi semplificano la generazione, la purificazione e l'ottimizzazione dei vettori, accelerando così la ricerca preclinica e facilitando i progressi all'interno della pipeline della terapia genica.

Abstract

Negli ultimi anni, i vettori virali adeno-associati ricombinanti (rAAV) sono emersi come una piattaforma leader per le applicazioni di terapia genica. Tuttavia, i complessi processi di produzione e purificazione rimangono colli di bottiglia significativi nello sviluppo dei farmaci. La produzione di rAAV su piccola scala ad alto rendimento senza procedure di purificazione laboriose e dispendiose in termini di tempo offre una valida strategia alternativa per accelerare la ricerca preclinica e lo screening terapeutico in fase iniziale. Questo approccio consente la rapida generazione di diverse varianti di rAAV o costrutti terapeutici di qualità sufficiente per la valutazione iniziale in vitro e in vivo . Questo protocollo introduce due metodi distinti per tipo di cella e scala di produzione: la produzione su microscala e la produzione su miniscala di rAAV. La produzione su microscala viene effettuata in un formato a 6 pozzetti utilizzando cellule 293T del rene embrionale umano (HEK) aderenti (micro-6 pozzetti), mentre la produzione su miniscala utilizza celle di sospensione in piastre a 24 pozzetti (mini-HT24). I vettori generati attraverso questi metodi vengono sottoposti ad analisi a valle per ottimizzare le condizioni di coltura cellulare e/o vengono utilizzati per valutare l'attività biologica dei transgeni. Le principali letture analitiche includono la titolazione del genoma del vettore (vg/mL), la determinazione del titolo del capside (vp/mL), l'analisi del western blot e i saggi di trasduzione cellulare. Inoltre, i vettori prodotti su miniscala e semi-purificati utilizzando resine di affinità vengono confrontati con preparati a scala media purificati tramite gradienti di densità di cloruro di cesio. I metodi semplificati qui descritti dimostrano un potenziale significativo per affinare i parametri delle colture cellulari, identificare i candidati principali durante gli screening (ad esempio, cassette transgeniche ottimizzate o capsidi AAV superiori) e migliorare l'espressione transgenica. Nel complesso, i flussi di lavoro presentati supportano la creazione di una piattaforma robusta ed efficiente per lo sviluppo iterativo nella pipeline della terapia genica che può essere facilmente implementata in qualsiasi laboratorio di ricerca.

Introduzione

Lo sviluppo di farmaci è un processo complesso e dispendioso in termini di risorse che richiede l'integrazione di dati di alta qualità provenienti da varie fasi, tra cui l'identificazione del bersaglio, la convalida preclinica e gli studi clinici¹. In risposta alle crescenti richieste di tempistiche più rapide e costi ridotti², l'industria farmaceutica ha adottato sempre più saggi su piccola scala ad alto rendimento (HT) in combinazione con l'intelligenza artificiale (AI) avanzata come pietra angolare delle moderne strategie di sviluppo ^3,4,5. I saggi HT consentono lo screening e la valutazione rapidi di un gran numero di farmaci candidati o variabili di dosaggio in una frazione del tempo e dei costi rispetto ai metodi tradizionali ^5,6.

Nelle applicazioni di terapia genica, in particolare quelle che utilizzano vettori virali adeno-associati (AAV), l'elevato costo dei beni e i lunghi tempi di produzione pongono sfide significative⁷. Il processo di sviluppo inizia con la produzione del materiale plasmidico necessario per la trasfezione, seguito dalla crescita cellulare ad alte densità sufficienti per la produzione di vettori virali. Dopo la trasfezione, è necessario un periodo di incubazione da due a cinque giorni prima della raccolta e il processo si conclude con la purificazione e la caratterizzazione del lotto ^8,9. Nel complesso, questo flusso di lavoro può richiedere fino a un mese ed è in genere limitato a un numero limitato di preparazioni che possono essere eseguite in parallelo quando si utilizzano colonne di affinità o ultracentrifugazione in gradiente 9,10,11,12.

Riconoscendo la necessità di protocolli di produzione di AAV su piccola, mini o microscala, il campo ha adattato diversi approcci per produrre AAV ricombinante (rAAV) in piccole configurazioni di laboratorio. Questi approcci prevedono tipicamente l'uso di più piastre da 15 cm per cellule aderenti^{13, 14} o 50-2000 mL¹⁵ palloni di agitazione per colture in sospensione. In passato, venivano impiegati metodi di purificazione AAV, come l'ultracentrifugazione a gradiente (ad es. iodixanolo¹⁶, cloruro di cesio (CsCl)¹⁷ o gradienti di saccarosio¹⁸). Questo metodo economico e indipendente dal sierotipo era molto adatto per la produzione di rAAV su scala di laboratorio, ma la sua natura ad alta intensità di lavoro e la limitata capacità dell'ultracentrifuga lo rendono meno adatto alle applicazioni ad alto rendimento^19,20.

La continua domanda di una maggiore produttività ha portato all'esplorazione di approcci alternativi per ridurre la produzione di rAAV. Utilizzando celle aderenti, sono stati studiati formati come piastre a 6 pozzetti^{13, 21, 22}, 96 pozzetti²³ e persino piastre a 384 pozzetti²⁴. Più recentemente, sono state adottate le celle in sospensione, data la loro migliore scalabilità e la potenza comparabile, o addirittura superiore, dei preparati vettoriali⁸.

Tuttavia, la produzione ad alto rendimento di rAAV in cellule in sospensione con volumi di coltura inferiori a 15 mL rimane un'area specializzata, con protocolli pubblicati limitati ^7,25,26. La maggior parte degli studi si concentra su volumi maggiori per ottenere rese sufficienti per le applicazioni a valle ^8,9,27, ma come per le celle aderenti, i formati miniscale offrono riduzioni significative del consumo di risorse e dei tempi di lavorazione, soddisfacendo così un'esigenza critica sul campo. È importante sottolineare che i protocolli su miniscala e microscala utilizzano spesso "lisati grezzi" o raccolti di colture cellulari non purificate contenenti particelle vettoriali, per la caratterizzazione e le analisi a valle.

Questo studio delinea due protocolli che utilizzano sia cellule produttrici aderenti che in sospensione (Figura 1). I lisati grezzi di rAAV prodotti da cellule HEK293T aderenti vengono utilizzati direttamente per applicazioni successive, come la trasduzione di cellule bersaglio. Al contrario, i rAAV generati nelle celle di sospensione subiscono un'ulteriore lavorazione tramite purificazione con resina per affinità ad alto rendimento. Questi metodi sono stati sviluppati specificamente per migliorare la resa, valutare la qualità dei vettori e monitorare l'espressione transgenica, il tutto riducendo al minimo il consumo di reagenti e materiali costosi. I risultati qui presentati mostrano che sia i lisati grezzi (da cellule aderenti) che il materiale purificato per affinità (da celle in sospensione) sono adatti, a seconda dell'ambito di applicazione. Inoltre, il rAAV ottenuto utilizzando resine di affinità è stato direttamente confrontato con le controparti purificate utilizzando la tradizionale ultracentrifugazione con cloruro di cesio in termini di resa, purezza ed efficienza di trasduzione in co-colture neuronali di derivazione umana.

L'adozione di saggi su piccola scala ad alto rendimento nello sviluppo di farmaci per la terapia genica rappresenta un progresso indispensabile, che accelera l'innovazione e colma il divario tra la scoperta scientifica e la realtà terapeutica. Questi metodi non solo riducono i costi e le tempistiche, ma consentono anche di testare in parallelo numerose condizioni, contribuendo in ultima analisi allo sviluppo efficiente di terapie trasformative.

Protocollo

1. Produzione di micro-6 pozzetti di vettori rAAV in cellule aderenti

NOTA: La produzione di micro-6 pozzetti di rAAV è una versione adattata da un protocollo precedentemente pubblicato da Fakhiri et ^al.21.

1. Semina e trasfezione di cellule HEK293T
   1. Scongelare una fiala di HEK293T cellule²⁸ a bagnomaria a 37 °C.
   2. Trasferire le cellule in 30 mL di terreno di coltura cellulare aderente in fiasche T175 e mantenerle nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco + 10% di siero fetale di vitello (FCS), a 37 °C e 5% di CO₂.
   3. Dividere HEK293T ogni 2-3 giorni: aspirare il terreno di coltura cellulare e aggiungere con cura 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per lavare le cellule.
      NOTA: In questo protocollo sono stati utilizzati solo passaggi cellulari al di sotto del passaggio numero 15 per garantire l'integrità e la salute delle cellule, che influisce direttamente sulla produzione di rAAV.
   4. Aggiungere 2 mL di tripsina/acido etilendiamminotetraacetico allo 0,025% alle cellule e incubare per 2 minuti a 37 °C (o fino a quando le cellule non si staccano).
   5. Arrestare la reazione aggiungendo 20 mL di terreno fresco e sospendendo le cellule nel terreno utilizzando una pipetta da 25 mL. A seconda della confluenza, le cellule possono essere diluite 1:10 o 1:20 in 24 mL di terreno DMEM ad alto contenuto di glucosio. Per ottenere una densità cellulare sufficiente per la trasfezione, seminare 7 × 10⁶ cellule HEK293T in un pallone T175.
   6. Dopo 72 ore a 37 °C, prelevare le cellule mediante tripsinizzazione (come descritto nei passaggi 1.1.3-1.1.5), risospendere in 20 mL di terreno e contare le cellule.
      NOTA: Le celle possono essere contate utilizzando vari metodi, a seconda della precisione, della produttività e dell'attrezzatura disponibile desiderate. Principalmente vengono utilizzati due approcci: il conteggio manuale (camera Neubauer) e i contatori di celle automatizzati. Questo protocollo utilizza un analizzatore cellulare completamente automatizzato e basato su immagini per misurare i parametri cellulari critici come la vitalità, la densità cellulare e il tasso di aggregazione.
   7. Seminare celle a una densità di 0,5 × 10⁶ cellule/pozzetto in una piastra a 6 pozzetti. Per distribuire le cellule in modo uniforme, agitare delicatamente la piastra e inserirla nell'incubatore di CO₂ .
   8. Dopo 24 ore, le cellule raggiungono una confluenza del 60-70% e possono essere triplicate.
   9. Per ogni pozzetto, miscelare 90 μL di terreno privo di siero con un totale di 2,6 μg di DNA plasmidico, inclusi pTransgene, pRep/Cap e pHelper in un rapporto molare 1:1:1.
   10. In una seconda provetta, aggiungere 5 μL di polietilenimmina (PEI) a 90 μL di terreno privo di siero appena prima della trasfezione.
   11. Dopo aver combinato le due soluzioni, agitare la miscela e incubare a temperatura ambiente (RT) per 10 min.
   12. Aggiungere la miscela di trasfezione goccia a goccia a ciascun pozzetto. Agitare delicatamente le piastre prima di rimetterle nell'incubatrice.
       NOTA: È possibile eseguire un cambio del mezzo dopo la trasfezione, ma non è stato applicato come pratica standard, poiché le cellule hanno mantenuto una buona vitalità durante l'esperimento.
2. Raccolta e lisi delle cellule
   1. 72 ore dopo la trasfezione, aspirare con cura il terreno cellulare dalla/e piastra/e.
   2. Staccare le cellule aggiungendo 500 μl di PBS in ciascun pozzetto e pipettare con cura su e giù.
   3. Trasferire la sospensione cellulare in provette da microcentrifuga da 1,5 mL.
   4. Misura la vitalità e la densità delle cellule manualmente o automaticamente seguendo le istruzioni del produttore.
   5. Trasferire 50 μl dalla sospensione in una piastra con fondo a 96 U per determinare l'efficienza di trasfezione quantificando le popolazioni reporter-positive tramite citometria a flusso.
      NOTA: Si consiglia sempre di eseguire un controllo di trasfezione in parallelo, ovvero una trasfezione di 1-2 pozzetti con un transgene che trasporta una proteina fluorescente (ad esempio, proteina fluorescente verde (GFP), mCherry, ecc.) per monitorare l'efficienza di trasfezione sulla piastra. I pozzetti con cellule non trasdotte fungono da controllo negativo.
   6. Centrifugare la sospensione cellulare rimanente a 800 × g per 10 minuti a RT in celle a pellet, che contengono la maggior parte dei vettori prodotti.
   7. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 100 μL di PBS. La sospensione cellulare può essere conservata a -80 °C.
      NOTA: Per ottenere un lisato grezzo dalle cellule raccolte, utilizzare uno dei due approcci descritti di seguito.
   8. Nel primo approccio, le cellule possono essere sottoposte a cinque cicli di congelamento-scongelamento, ciascuno di 5 minuti, utilizzando un bagno d'acqua preriscaldato a 37 °C e azoto liquido. Agitare brevemente i campioni tra i cicli per 2-3 s.
   9. La seconda opzione, la più utilizzata in questo protocollo, è la sonicazione. In questo caso, trasferire la sospensione cellulare su piastre o provette a reazione a catena della polimerasi (PCR) a parete sottile e posizionarla a 4 °C in un sonicatore a bagno d'acqua.
      1. Sonicare i campioni per un totale di 3 minuti con incrementi di 30 s on-off al 25% di ampiezza (intensità).
   10. Dopo la sonicazione, pellettare le cellule utilizzando una centrifuga da tavolo (16.100 × g per 10 minuti a 4 °C) per rimuovere i detriti cellulari e ottenere una sospensione vettoriale priva di cellule.
   11. Trasferire i surnatanti in provette da 1,5 mL e pipettare 10 μL di ciascun campione in una piastra a 96 pozzetti a basso legame per l'analisi digitale droplet (dd)PCR o digitale (d)PCR.
   12. Conservare le provette e le piastre a 96 pozzetti a -80 °C fino a nuovo utilizzo.
3. Trasduzione di cellule HEK293A mediante lisati grezzi
   NOTA: HEK293A cellule potrebbero non essere adatte a tutti i sierotipi AAV. Per identificare una linea cellulare appropriata, consultare database come SPIRIT²⁹ (vedere la Tabella dei materiali per un collegamento al database SPIRIT) o gli articoli di ricerca originali pertinenti^30,31.
   1. Seminare HEK293A le cellule in tre piastre da 96 pozzetti un giorno prima della trasduzione a densità di 1,5 × 10⁶ cellule per piastra.
   2. Il giorno successivo, mescolare 10 μl dei vettori prodotti con diversi volumi di PBS per generare diluizioni 1:2, 1:10 e 1:100.
   3. Utilizzando una pipetta multicanale, trasdurre le cellule in piastre a 96 pozzetti in triplicati tecnici.
   4. Incubare le cellule con i rAAV senza scambio di terreno per 72 ore. Successivamente, eseguire gli esperimenti a valle in base al transgene espresso, come le misurazioni del livello delle proteine, l'analisi della citometria a flusso per l'espressione delle proteine fluorescenti, le analisi knockdown/knockout, ecc.
   5. Per la citometria a flusso standard eseguita in questo protocollo, aspirare il terreno e staccare le cellule aggiungendo 25 μl di tripsina/EDTA allo 0,025%.
   6. Incubare a 37 °C per 3 min.
   7. Arrestare la reazione aggiungendo 175 μL di albumina sierica bovina (BSA) all'1% in PBS in ciascun pozzetto.
   8. Utilizzare 100 μl di sospensione cellulare per l'analisi della citometria a flusso.

2. Produzione mini-HT24 di vettori rAAV in celle di sospensione

NOTA: Nella configurazione mini-HT24, a differenza della produzione di micro-6 pozzetti descritta in precedenza, le preparazioni purificate di vettori rAAV vengono generate utilizzando celle di sospensione. Le colture in sospensione producono quantità più elevate di rAAV a causa dell'aumento della densità cellulare che può essere raggiunta all'interno dello stesso volume di coltura. In questo protocollo, è stato impiegato un formato a 24 pozzetti profondi. I lisati cellulari grezzi vengono purificati ad alto rendimento utilizzando resine di affinità AAVX con l'obiettivo di generare prodotti più puliti necessari per determinate applicazioni in cui i lisati grezzi non sono adatti (vedere la sezione Discussione).

1. Coltivazione e tripla trasfezione di celle di sospensione in piastre profonde 24 pozzetti
   1. Scongelare un flaconcino di cellule di produzione virale (VPC) in sospensione a bagnomaria a 37 °C. Celle di passaggio meno di 30 volte per garantire la qualità costante dei vettori prodotti.
   2. Trasferire le cellule in 30 mL di terreno di coltura in sospensione in un pallone di agitazione e coltivarle per 2-3 giorni in condizioni di coltura di mantenimento: 37 °C, 8% di CO₂, 95% di umidità e 140 giri/min (raggio della piattaforma di agitazione 25 mm).
   3. Determinare la densità cellulare vitale dopo 2-3 giorni (vedere la NOTA al passaggio 1.1.6). Continuare con la subcoltura e l'espansione fino a raggiungere il numero desiderato di cellule vitali necessarie per la produzione di AAV.
      NOTA Cellule di sottocoltura a una densità vitale di > 4 × 10⁶ cellule/mL e < 6 × 10⁶ cellule/mL o secondo le istruzioni del produttore in base alla singola linea cellulare utilizzata. Seme a una densità vitale di 6 × 10⁵ cellule/mL per 3 giorni, diviso o 3 × 10⁵ cellule/mL per 4 giorni. Dividere secondo le istruzioni del produttore.
   4. Seminare 3 × 10⁶ cellule/mL in 2,5 mL di ciascun pozzetto della piastra profonda 24 pozzetti e coprire la piastra con un coperchio a membrana sterile.
   5. Preparare la miscela a tripla trasfezione per ogni costrutto rAAV come segue:
      1. Preparare il DNA-Mix dei plasmidi di produzione (pHelper, pRep/Capsid, pTransgene) in un rapporto molare 1:1:1 con una massa finale di 600 ng di DNA per 1 × 10⁶ cellule vitali.
      2. Preparare la miscela in un terreno di coltura in sospensione a un volume finale pari al 2,5% del volume di coltura da trasfettare.
      3. Preparare il PEI-Mix in un terreno di coltura in sospensione a un volume finale pari al 2,5% del volume di coltura da trasfettare. Utilizzare una massa finale di 1 ng di PEI per 1 ng di DNA.
      4. Combinare DNA-Mix e PEI-Mix trasferendo l'intero volume del singolo PEI-Mix al DNA-Mix corrispondente, ottenendo un volume di miscela di trasfezione pari al 5% del volume di coltura.
      5. Miscelare pipettando su e giù 10 volte.
         NOTA: Non agitare la miscela di trasfezione dopo il tempo di incubazione per evitare l'interruzione dei complessi PEI-DNA che si sono formati durante l'incubazione³².
      6. Incubare a RT per 10 min.
   6. Aggiungere le miscele di trasfezione goccia a goccia ai pozzetti corrispondenti agitando accuratamente la piastra a pozzetti profondi.
   7. Sigillare la piastra con una pellicola di rayon sterile e traspirante e coprirla ulteriormente con il coperchio della membrana corrispondente per ridurre al minimo l'evaporazione.
   8. Assicurarsi che la piastra sia posizionata su un vassoio adatto per l'agitazione a pozzetti profondi e fissarla saldamente.
   9. Incubare le cellule a 37 °C, 8% di CO₂, 95% di umidità e 225 giri/min per 72 ore.
      NOTA: I diversi formati di piastre a pozzetti profondi richiedono una valutazione individuale della velocità di agitazione per consentire uno scambio di gas efficiente e la coltura di cellule in una sospensione omogenea senza che le cellule si depositino sul fondo nel tempo. Ciò richiede test iniziali che dipendono dalle singole apparecchiature e configurazioni di laboratorio, nonché dalle linee cellulari utilizzate per la produzione. Considerare in particolare il raggio di agitazione, il formato della piastra e la forma del fondo del pozzetto per mantenere omogenea la sospensione cellulare ed evitare che le cellule si depositino sul fondo.
2. Raccolta e lisi
   1. Raccogliere le cellule trasferendo l'intero volume di coltura di ciascun pozzetto in provette da 5 mL etichettate singolarmente e centrifugare a 800 × g per 20 minuti a 4 °C.
   2. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 550 μL di (D)PBS di Dulbecco e trasferire la sospensione in una provetta con tappo a vite da 1,8-2,0 mL per evitare aerosol e gocce durante l'apertura delle provette.
      NOTA: A questo punto è possibile stoccare anche il pellet per procedere successivamente con il processo di purificazione. Conservare i pellet risospesi con soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbecco a -80 °C e assicurarsi di tenerne conto durante le fasi del ciclo di congelamento-disgelo.
   3. Preparare i lisati immergendo i tubi in azoto liquido per circa 2 minuti, quindi scongelandoli a bagnomaria a 37 °C. Ripeti questo ciclo 3-5 volte.
   4. Centrifugare i lisati per 5 minuti a 1000 × g a 4 °C. Coprire i secchi della centrifuga con coperchi a tenuta di aerosol.
   5. Rimuovere con cautela le provette dalla centrifuga.
      NOTA: I lisati devono essere limpidi e privi di detriti visibili o torbidità per evitare di intasare la resina utilizzata nel processo di purificazione. Evitare di scuotere o disturbare i pellet. Ripetere la fase di centrifugazione nel caso in cui i surnatanti non siano limpidi. Considerare una velocità di centrifugazione più elevata o una durata maggiore in caso di campioni altamente concentrati o campioni con grandi quantità di detriti.
3. Purificazione rAAV ad alto rendimento basata su resina di affinità
   1. In un becher, preparare il tampone di eluizione aggiungendo 720 mg di acido citrico a 50 ml di acqua ultrapura per raggiungere una concentrazione finale di 75 mM di acido citrico.
   2. Mescolare il tampone fino a quando la polvere non si è completamente sciolta.
      NOTA: Assicurarsi che il volume del pozzetto sia sufficiente per contenere i volumi del tampone e i puntali delle pipette senza fuoriuscire o rischiare la contaminazione incrociata dei pozzetti vicini.
   3. Regolare il pH a 3,0 aggiungendo goccia a goccia 1 M di acido cloridrico (HCl) mescolando continuamente il tampone e misurando con un elettrodo di pH.
   4. Eseguire la filtrazione sterile sul tampone utilizzando una dimensione dei pori di 0,22 μm.
   5. Preparare le colonne di una piastra a 96 pozzetti profondi con un volume di pozzetti di 2-2,2 mL per la purificazione secondo lo schema descritto nella Tabella 1.
      NOTA: I campioni sono stati purificati utilizzando una pipetta elettronica multicanale. Il processo è compatibile con i sistemi automatizzati di manipolazione dei liquidi e può essere scalato per una maggiore produttività dei campioni.
   6. Eseguire la purificazione in una cabina di biosicurezza su RT utilizzando i parametri mostrati nello schema di purificazione (vedere la Tabella 1) o ottimizzare i parametri in base alle esigenze individuali, a seconda del volume della resina o del campione, del titolo previsto, ecc.
   7. Dopo l'eluizione, aggiungere 1/4 del volume di eluizione del tampone di neutralizzazione a ciascun campione.
   8. Miscelare pipettando l'80% del volume 10 volte verso l'alto e verso il basso.
   9. Preparare le piastre per dialisi rimuovendo le cassette della membrana e aggiungendo 1600 μl di tampone per dialisi a ciascun pozzetto.
      NOTA: Assicurarsi di non mettere le membrane a contatto con liquidi prima di eseguire la dialisi, poiché la riasciugatura può compromettere l'integrità e il funzionamento della membrana.
   10. Trasferire l'intero volume del campione (massimo 300 μl) in una cassetta per dialisi con un formato di volume e una dimensione dei pori della membrana adeguati (≥ 20.000 cutoff di peso molecolare (MWCO)). Assicurarsi che le membrane siano caricate in modo omogeneo e che non siano presenti bolle d'aria.
   11. Posizionare le cassette nei pozzetti caricati della piastra per dialisi e sigillare la piastra con un foglio sigillante.
   12. Trasferire la piastra di dialisi su una piattaforma di agitazione e incubare a 300 giri/min, 4 °C per 30 minuti.
   13. Sostituire il tampone per dialisi e ripetere l'incubazione a 300 giri/min, 4 °C per 30 minuti.
   14. Ripeti lo scambio e l'incubazione del tampone 3 volte in totale.
   15. Trasferire l'intero volume dei campioni dializzati in provette di conservazione etichettate e conservarli a 4 °C se vengono successivamente utilizzati per la caratterizzazione o altri esperimenti.
   16. Conservare a -80 °C per la conservazione a lungo termine. Evitare cicli di congelamento e disgelo in quanto ciò può influire sulla potenza degli AAV e, se necessario, preparare aliquote di piccolo volume.
4. Titolazione del titolo genomico rAAV da lisati grezzi e purificazione a base di resina mediante PCR digitale (dPCR)
   1. Per determinare il titolo genomico dei lisati grezzi, cioè i genomi virali per mL (vg/mL), scongelare i campioni vettoriali raccolti a RT e quindi pipettare 10 μL in una provetta.
      NOTA: Sono disponibili diversi metodi per determinare il titolo del genoma virale (vg/mL) di una preparazione vettoriale, con la quantificazione assoluta che si basa tipicamente su due approcci principali: il metodo basato su goccioline o emulsioni (ddPCR) e il metodo basato su micropiastre, rappresentato dalla PCR digitale (dPCR)^33,34. Oltre a questi metodi digitali, la quantificazione assoluta può essere ottenuta anche utilizzando la PCR quantitativa (qPCR). Sebbene la qPCR sia tradizionalmente un metodo di quantificazione relativa, può essere adattata per la quantificazione assoluta utilizzando una curva standard plasmidica. Si tratta di un plasmide contenente la sequenza bersaglio a una concentrazione nota, che funge da riferimento per estrapolare il titolo del genoma virale ^21,33. Sebbene la qPCR sia più veloce e meno costosa della ddPCR o della dPCR, è meno precisa e si basa molto sull'accuratezza dello standard plasmidico¹⁶. Indipendentemente dal metodo di quantificazione, i campioni devono essere pretrattati per rilasciare i genomi virali dalle particelle. Questo protocollo segue un metodo precedentemente descritto da Dobnik, D. et al³⁵.
   2. Trattare i campioni di rAAV con una nucleasi a 37 °C per 30 minuti per degradare il DNA plasmidico libero dal processo di trasfezione.
      NOTA: Opzionale, a seconda dell'enzima utilizzato: riscaldare i campioni a 95 °C per 15 minuti per inattivare l'enzima e lisare il capside del vettore.
   3. Dopo il raffreddamento a RT, aggiungere la proteinasi K per 15 minuti per digerire i frammenti di capside.
   4. Per l'inattivazione della proteinasi K, riscaldare nuovamente i campioni a 95 °C per 15 minuti.
   5. Preparare le miscele master ddPCR o dPCR seguendo le istruzioni del produttore.
   6. Utilizzare sonde di DNA marcate in quanto forniscono un segnale più specifico rispetto ai coloranti intercalanti. Progettare sonde per legarsi "centralmente" nel genoma virale, cioè nel transgene (vedi NOTA), piuttosto che nel promotore o nella coda della poliA, e selezionare un fluoroforo come l'esacloro-6-carbossifluoresceina (HEX) o la 6-carbossifluoresceina (FAM) che sia compatibile con il rispettivo sistema PCR.
      NOTA: Recentemente, la ddPCR multiplex o dPCR, che impiega set di primer/sonde mirati a diverse regioni del genoma virale, è stata utilizzata per migliorare l'accuratezza della determinazione del titolo ^36,37. Questo approccio consente la quantificazione di genomi intatti applicando le formule delineate negli studi di riferimento o utilizzando soluzioni software integrate.
   7. Condurre una diluizione seriale di 10 volte dei campioni post-processati in ddH₂O utilizzando piastre a 96 pozzetti a basso legame con il DNA. Infine, trasferire 5,5 μL (per ddPCR) o 2 μL (per dPCR) del modello (diluizioni 10,⁴- e 10,⁵) alla piastra ddPCR a 96 pozzetti, che contiene già la ddPCR/dPCR Master Mix comprensiva di primer/sonde. Regolare l'intervallo di diluizione in base all'efficienza produttiva dei singoli costrutti per garantire che le misurazioni rientrino nell'intervallo di rilevamento lineare.
      NOTA: Poiché la quantificazione dPCR/ddPCR è un metodo altamente sensibile, sono necessarie 10⁴ e 10⁵ diluizioni dei campioni.
   8. Seguire i passaggi descritti di seguito per la ddPCR.
      1. Per l'amplificazione PCR, seguire le istruzioni del produttore per ottimizzare le condizioni del saggio, comprese le regolazioni dei tempi di ricottura e amplificazione in base al set di primer/sonda utilizzato. Il protocollo di ciclo standard utilizzato in questo studio era il seguente: denaturazione iniziale a 9 °C per 10 minuti (rampa °C/s); 35 cicli di denaturazione a 9 °C per 30 s e amplificazione a 6 °C per 60 s; seguito da un ultimo passaggio di allungamento a 9 °C per 10 minuti (rampa °C/s).
      2. Dopo l'amplificazione PCR dei bersagli del genoma virale rAAV, trasferire la piastra al lettore di goccioline e seguire le istruzioni del produttore per misurare l'intensità della fluorescenza in ciascun pozzetto. Il lettore di goccioline consente la quantificazione assoluta del numero di copie del genoma virale e della reazione μL.
   9. Seguire i passaggi descritti di seguito per la dPCR.
      1. Come descritto per la quantificazione basata sulla ddPCR, seguire le istruzioni del produttore per ottimizzare le condizioni del saggio.
      2. Come punto di partenza, seguire il profilo termico preimpostato sul dispositivo dPCR, che include una fase iniziale di denaturazione a 9 °C per 2 minuti, seguita da 40 cicli di denaturazione a 9 °C per 15 s e ricottura/estensione a 5 °C per 30 s.
         NOTA: Questo protocollo è stato eseguito utilizzando le velocità di rampa e i volumi di reazione raccomandati specificati dal produttore.
   10. Analizza i dati ddPCR e dPCR utilizzando varie soluzioni software, in genere fornite dal produttore dello strumento (ad esempio, QX manager e QIAcuity Software Suite 1.2, rispettivamente). Per entrambi i metodi, selezionare solo diluizioni del campione con un rapporto adeguato di partizioni/goccioline positive e negative per la quantificazione.
       NOTA: Per la determinazione dei titoli di particelle rAAV (vp/mL; vp = particelle virali) da lisati grezzi e materiale purificato con resina AAVX, è possibile utilizzare un saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)., Sono disponibili vari kit ELISA sandwich standard disponibili in commercio per la quantificazione dell'AAV (i kit utilizzati in questo lavoro sono elencati nella Tabella dei materiali). Eseguire il test secondo il manuale o i manuali del produttore. Assicurarsi che il kit ELISA utilizzato sia compatibile con il sierotipo AAV in produzione.
5. Analisi del rapporto VP da rAAV purificati
   NOTA: Per determinare il rapporto tra le proteine del capside virale (VP) di ciascun campione proveniente dai singoli pozzetti della configurazione a 24 pozzetti profondi, è possibile eseguire il western blot standard o i protocolli automatizzati basati su capillari.
   1. Per rilevare le proteine del capside AAV2 VP1, VP2 e VP3, utilizzare un anticorpo monoclonale primario anti-AAV VP1/VP2/VP3. Assicurarsi che l'anticorpo primario funzioni con il rispettivo sierotipo o variante del capside.
   2. Utilizzare controlli positivi adeguati, come VP1, VP2 e VP3 ricombinanti o uno standard di riferimento AAV.
   3. Preparare il controllo positivo con un rapporto molecolare di 1:1:10 (VP1:VP2:VP3) per imitare il rapporto VP previsto. Questo serve anche come riferimento per la quantificazione del rapporto VP utilizzando l'integrazione dell'area del segnale.
   4. Selezionare un kit capillare con un intervallo adatto che comprenda le proteine del capside da rilevare, comprese le più piccole (VP3 con ~ 60 kDa) e le più grandi (VP1 con ~ 82 kDa). Questo può variare a seconda del sierotipo e della variante del capside utilizzata.
   5. Preparare i reagenti e la scala biotinilata forniti nel kit secondo le istruzioni del produttore.
   6. Preparare una serie di diluizioni dei campioni (in base al titolo genomico a partire da 1 × 10¹² vg/mL a 1 × 10^{10 vg} /mL o diluizioni 1:2 a partire dal campione non diluito fino a 1:64) nel tampone di diluizione fornito del kit per garantire un buon intervallo di rilevazione per ciascun campione.
   7. Diluire l'anticorpo primario nel tampone di diluizione anticorpale fornito secondo le istruzioni del produttore o in base a test precedenti. Inizia con 1:100.
   8. Utilizzare un kit di rilevamento corrispondente a seconda della fonte dell'anticorpo primario.
   9. Caricare la piastra secondo lo schema fornito con il kit.
   10. Assicurarsi di riempire le colonne vuote con acqua o tampone di diluizione del campione per non danneggiare i capillari dello strumento a causa dell'asciugatura.
   11. Coprire la piastra con un foglio sigillante e centrifugare a 1200 × g, 5 min, a 4 °C.
   12. Trasferire la piastra e i capillari allo strumento e utilizzare le condizioni standard preimpostate per la corsa.
   13. Analizza la corsa utilizzando un software di analisi dei dati, come Compass (versione 6.3.0)³⁸.
       NOTA: Per analizzare l'integrità, la monodispersione e la purezza delle particelle, si consiglia la microscopia elettronica a trasmissione con colorazione negativa (ns-TEM). L'analisi TEM può essere eseguita come descritto da Steininger et. al²⁵. Tuttavia, anche altri metodi, come la fotometria di massa³⁹, SEC-MALS⁴⁰ e la colorazione del nastro⁴¹ , possono fornire letture complementari per valutare la qualità dei preparati rAAV.
6. Trasduzione con particelle virali purificate
   NOTA: Per trasdurre cellule con vettori virali purificati, è necessario determinare una molteplicità di infezioni (MOI). Il MOI è definito come il numero di genomi contenenti particelle aggiunti per cellula. È importante notare che questo è un valore teorico; il numero effettivo di genomi rAAV consegnati per cellula dipende dalla capacità del capside di trasdurre con successo le cellule bersaglio. Pertanto, il MOI ottimale deve sempre essere determinato sperimentalmente. In questa sezione, l'obiettivo era quello di confrontare due stock di vettori virali, che sono stati prodotti utilizzando diversi metodi di purificazione (ultracentrifugazione con cloruro di cesio e resina di affinità AAVX). A tal fine, le co-colture neuronali di origine umana sono state trasdotte con le due preparazioni e l'efficienza di trasduzione è stata valutata utilizzando la microscopia a fluorescenza.
   1. Rivestire una piastra di fondo ottico nera a 96 pozzetti con PLO allo 0,1% (poli-L-ornitina) per una notte a 4 °C o incubare a 37 °C per ≥ 1 ora.
   2. Il giorno della semina, aspirare il reagente di rivestimento PLO e rivestire con la matrice della membrana basale a fattore di crescita ridotto e incubare a 37 °C per ≥1 h.
   3. Coltura di motoneuroni con astrociti in un rapporto 1:6 o secondo la raccomandazione del fornitore.
   4. A 2 giorni in vitro (DIV), trasdurre la co-coltura con un MOI di 50.000.
   5. Scongelare le aliquote virali a 4 °C.
   6. Preparare i terreni di trasduzione (vettori virali al MOI desiderato in base ai genomi virali per cellula + terreni di coltura cellulare in volumi appropriati per sostituire il 50% dei terreni di coltura per pozzetto).
   7. Esegui lo scambio del 50% dei terreni con i mezzi di trasduzione.
   8. A 5 DIV, eseguire uno scambio completo di terreni di coltura regolari.
   9. Mantenere le cellule con una sostituzione regolare dei terreni di coltura ogni 2-3 giorni o secondo le raccomandazioni del fornitore.
   10. Monitora i livelli di espressione con un microscopio per immagini dal vivo dotato di eccitazione corretta per il transgene reporter. Per i neuroni di origine umana, l'espressione del plateau si osserva tra 10-14 giorni dopo la trasduzione (vedi Figura 4A).

Passo	Buffer/Materiale	Volume del pozzetto [μL]	Volume di lavoro [μL]	Cicli	Portata [μL/min]
1. Equilibrio	Equilibrio/ Lavaggio I Buffer	1100	950	2	500
2. Caricamento in corso/ Catturare	Campione surnatante	550	500	4
3. Lavare I	Equilibrio/ Lavaggio I Buffer	1100	950	2
4. Lavaggio II	Tampone Wash II	1100	950	2
5. Eluizione	Tampone di eluizione	70 μl (puntali in resina da 20 μl) 250 μl (80 μl di puntali in resina)	60 μL (20 μL di puntali in resina) 240 μl (puntali in resina da 80 μl)	4
6. Neutralizzazione	Buffer di neutralizzazione	Aggiungere 1/4 del volume di eluizione direttamente a ciascun campione 70 μl di campione eluito → aggiungere 17,5 μl 250 μl di campione eluito → aggiungere 62,5 μl		-	-

Tabella 1: Layout della piastra e parametri di purificazione per la purificazione con resina di affinità di rAAV.

Risultati

Negli ultimi anni, la domanda di produzione di vettori AAV su scala di laboratorio è aumentata in modo significativo, portando alla creazione di numerose organizzazioni di ricerca a contratto che offrono questo come servizio⁴². Dati i costi elevati e le tempistiche ritardate spesso associate all'esternalizzazione, la produzione interna di rAAV rimane un'opzione interessante. In particolare, i protocolli ad alto rendimento che riducono al minimo il consumo di materiale e le ore di lavoro, integrando al contempo le fasi di purificazione, sono estremamente vantaggiosi nella pipeline di sviluppo dei farmaci.

Questo protocollo delinea due configurazioni ad alto rendimento per la produzione di rAAV: un approccio a micro-6 pozzetti che utilizza celle aderenti e un protocollo mini-HT24 per celle in sospensione (vedere la panoramica nella Figura 1). La configurazione a micro-6 pozzetti utilizza celle di HEK293T aderenti per produrre rAAV in un formato a 6 pozzetti. Questo materiale è stato utilizzato per valutare gli effetti di due reagenti di trasfezione PEI disponibili in commercio e del cloruro di sodio (NaCl) sulla produzione di rAAV2 (Figura 2A). Qui, sono stati monitorati contemporaneamente diversi parametri: (i) vitalità della cellula produttrice ed efficienza di trasfezione utilizzando un transgene GFP (Figura 2B e Figura 1 supplementare) e (iii) percentuale di cellule GFP-positive (GFP+) dopo la trasduzione con lisati grezzi (Figura 2C). L'esperimento di trasduzione è servito come lettura indiretta economica e rapida dei titoli vettoriali e delle funzionalità. È interessante notare che rapporti più bassi tra il reagente di trasfezione e il DNA sono stati sufficienti per promuovere una produzione efficiente di vettori (Figura 2B) mantenendo una buona vitalità cellulare. Inoltre, l'aggiunta di 150 mM di NaCl è apparsa vantaggiosa, in particolare quando si utilizza il reagente PEIpro. L'esecuzione di questo esperimento su microscala ha offerto diversi vantaggi: (i) un flusso di lavoro rapido, con semina cellulare, trasfezione e raccolta di vettori completati entro una settimana; ii) compatibilità con i saggi analitici standard a valle; e (iii) ampia applicabilità a tutti i sierotipi di AAV.

Per le applicazioni che richiedono quantità maggiori di vettori rAAV, come gli esperimenti in vivo o gli studi cinetici in vitro (in cui viene applicata una gamma più alta o più ampia di MOI), è necessario aumentare la scalabilità. Per stabilire un protocollo mini-HT24 che fornisca materiale sufficiente per la purificazione ad alto rendimento, sono state utilizzate celle di sospensione. Rispetto alle cellule aderenti, le colture in sospensione offrono una migliore scalabilità e sono più efficienti in termini di spazio, in quanto non sono vincolate dalla superficie. Poiché le cellule in sospensione crescono liberamente nel terreno, possono occupare l'intero volume di coltura, rendendo più semplice lo scale-up in tre dimensioni. Ciò consente di ottenere densità cellulari più elevate rispetto alle colture di ovaiole. Inoltre, i sistemi di sospensione sono più facili da mantenere e da lavorare in quanto non sono necessarie fasi di distacco durante il passaggio o la raccolta. L'uniformità della produzione di rAAV nel formato a 24 pozzetti è stata valutata analizzando tre parametri chiave in tutta la piastra (Figura 3): (A) Titolo di particelle (vp/mL); (B) rapporto VP nel capside; (C) Titolo genomico (vg/mL) e (D) Rapporto vuoto-pieno.

Sebbene sia stata osservata una certa variabilità tra questi parametri, è rimasta in gran parte all'interno di un intervallo duplice, che rientra nel margine di errore di misurazione. L'espressione della proteina VP è stata valutata anche utilizzando l'analisi automatizzata del western blot (Figura 3E). Infine, viene presentato un confronto tra le rese totali ottenute dalla produzione di micro-6 pozzetti, mini-HT24 e su media scala (shake flask) per guidare la selezione della scala appropriata in base ai requisiti sperimentali e alle esigenze analitiche a valle (Figura 3F).

Un aspetto critico di qualsiasi protocollo di purificazione AAV è la valutazione della purezza e della potenza del vettore. Qui, i vettori purificati con resina sono stati confrontati fianco a fianco con quelli purificati utilizzando un metodo di ultracentrifugazione (UC) a due fasi basato su cloruro di cesio (CsCl) (Figura 4). La potenza comparabile tra i due preparati è stata osservata al microscopio a fluorescenza, come dimostrato dalla trasduzione riuscita di motoneuroni e astrociti (Figura 4A). L'analisi al microscopio elettronico non ha rivelato differenze significative nella forma delle particelle o nello stato di aggregazione. Tuttavia, c'è stata una leggera tendenza che indica che la purificazione di CsCl ha prodotto in modo più coerente preparazioni più pulite (Figura 4B).

Figura 1: Panoramica degli approcci di produzione e preparazione di rAAV. Questa figura illustra i metodi di produzione di rAAV, che vanno dai palloni di agitazione su scala midi alle colture in sospensione mini-HT24 e alle colture aderenti a micro-6 pozzetti. Questi approcci consentono la generazione di rAAV su varie scale, utilizzando diverse strategie di lisi cellulare e purificazione dei vettori. La caratterizzazione finale degli rAAV include tipicamente qPCR/dPCR per la quantificazione del genoma virale (vg/mL), ELISA per la determinazione del titolo del capside (vp/mL) e saggi di trasduzione cellulare per valutare l'attività biologica. Creato in BioRender. Ohland, P. (2025) https://BioRender.com/x3sfbdd. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Ottimizzazione del protocollo di trasfezione per la produzione di rAAV a micro-6 pozzetti. (A) Panoramica schematica dell'esperimento con parametri testati e letture analitiche. (B) HEK293T cellule sono state seminate in piastre a 6 pozzetti a una densità di 0,5 × 10⁶ cellule/pozzetto 24 ore prima della trasfezione. Sono state testate diverse quantità di DNA, tipi di PEI (Pro o Max), rapporti e concentrazioni di NaCl. (C) Percentuale di cellule HEK293A GFP-positive (GFP+) 72 ore dopo la trasduzione con volumi uguali di lisati dal pannello A (10 μL ciascuno). Per semplicità, viene mostrata solo la condizione del DNA che ha portato alla resa del vettore più alta (2650 ng). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Caratterizzazione analitica di rAAV prodotto in una configurazione mini-HT24 e confronto del titolo su diverse scale. (A) Analisi ELISA di titoli di capside rAAV purificati in ciascun pozzetto. I valori sono rappresentati come variazioni al di sopra del titolo medio delle particelle della piastra dopo la purificazione. I titoli attesi dipendono dal capside AAV utilizzato e dal transgene confezionato. I titoli delle particelle per i diversi vettori AAV variavano tra un basso 10^{e 11} un alto 10¹² VP/mL. (B) Analisi del VP-ratio da parte di WES di rAAV purificato dai pozzi indicati. AAV2 ricombinante VP1, VP2 e VP3 sono stati utilizzati come controlli positivi con un rapporto molare di 1:1:10. (C) Analisi dPCR di rAAV purificato da ciascun pozzetto. I valori sono indicati come variazioni superiori al titolo genomico medio della piastra dopo la purificazione. I titoli attesi dipendono dal capside AAV utilizzato e dal transgene confezionato. I titoli genomici per i diversi vettori AAV variavano tra un basso 10¹⁰ (rAAV2) e un alto^10-11 vg/mL (rAAV9, non mostrato qui). (D) Rapporto vuoto/pieno (E/F) dei pozzetti indicati, basato sui risultati genomici e del titolo particellare dei pannelli A e C. I valori sono normalizzati alla media della piastra. L'E/F medio in formato mini-HT24 per rAAV2 indicato è del 10,6% ± del 3,0% dopo la purificazione della resina per affinità AAVX. (E) Analisi capillare western blot delle proteine VP in campioni purificati di rAAV2 da ciascun pozzetto. (F) Confronto delle rese totali del genoma virale considerando i volumi finali del campione e la concentrazione di ciascun metodo. I dati sono mostrati come differenza media di piegatura rispetto al formato più piccolo (micro-6 pozzetti), con barre di errore che indicano la deviazione standard (SD) dalle repliche biologiche. Per la produzione ad alta produttività a 24 pozzetti profondi con purificazione della resina per affinità AAVX, SD = ±0,176 (n = 24); per la sonicazione a micro-6 pozzetti; SD = ±0,349 (n = 6); e per la produzione standard su media scala con purificazione a gradiente di CsCl, SD = ±134,70 (n = 2). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Confronto della potenza e della purezza tra rAAV purificato con resina ad alto rendimento (HT) e campioni standard purificati con CsCl. (A) I motoneuroni e gli astrociti di derivazione umana sono stati trasdotti con lo stesso costrutto rAAV che esprime il reporter di fluorescenza mRuby3 sotto il promotore della sinapsina umana come reporter a un MOI di 50.000. Le immagini al microscopio a fluorescenza sono state acquisite con un microscopio a imaging dal vivo sette giorni dopo la trasduzione (DPT). Gli rAAV sono stati purificati utilizzando il metodo standard del gradiente CsCl (in alto) o l'approccio basato sulla punta della resina di affinità HT AAVX (in basso). I campioni purificati con CsCl sono stati esposti a un ulteriore ciclo di congelamento-scongelamento prima di eseguire la trasduzione e confrontati con rAAV purificati con resina. (B) Analisi al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) di varianti basate sul sierotipo rAAV2 purificate tramite metodi a gradiente CsCl (in alto) e punta in resina HT (in basso). Due lotti di campioni di rAAV2 purificati con resina HT possono essere confrontati senza dialisi (in basso a sinistra) e con dialisi (in basso a destra). I rapporti vuoto-pieno (E/F) sono stati determinati utilizzando TEM per essere > pieni al 90% per i campioni purificati con ultracentrifugazione a gradiente di CsCl e < al 40% per i campioni purificati con resina di affinità AAX. Barra della scala = 100 nm. Il pannello B mostra immagini rappresentative dei lotti purificati utilizzando i metodi indicati. Si prega di notare che queste immagini non appartengono alle stesse preparazioni utilizzate per gli esperimenti di trasduzione mostrate nel pannello A. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 1 supplementare: Trasfezione di celle di HEK293T per la produzione di rAAV2-GFP utilizzando la configurazione a micro-6 pozzetti. Per la trasfezione sono state utilizzate varie quantità di DNA, concentrazioni di NaCl (in mM), prodotti PEI e rapporti PEI-DNA (come descritto nella Figura 2). Le immagini sono state scattate 72 ore dopo la trasfezione utilizzando lo stesso tempo di esposizione (320 ms). In questa figura sono mostrate immagini rappresentative di microscopia in campo chiaro e a fluorescenza. Ingrandimento: 10X. Barra della scala non visualizzata; L'immagine è solo a scopo illustrativo e di valutazione qualitativa. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Questo documento di protocollo delinea metodi efficienti per la produzione di rAAV in ambienti ad alta produttività e su piccola scala utilizzando sia celle aderenti che in sospensione. Queste metodologie rispondono alla crescente domanda di processi di produzione rAAV scalabili e flessibili che supportino la ricerca preclinica riducendo al minimo i tempi, i costi e il consumo di risorse.

Sia i sistemi di celle aderenti che quelli in sospensione offrono vantaggi e sfide distinti per la produzione di rAAV su piccola scala. I sistemi cellulari aderenti, come le cellule HEK293T²⁸ coltivate in formati di piastre multi-pozzetto, sono particolarmente adatti per la progettazione di vettori in fase iniziale e per studi comparativi. La loro compatibilità con i protocolli di coltura e trasfezione consolidati consente un'implementazione semplice nella maggior parte dei laboratori. Ad esempio, Grosse et al. ha utilizzato la produzione su piccola scala in piastre a 6 pozzetti per studiare la funzionalità dell'AAP, una proteina cruciale per l'assemblaggio del capside virale²². Drittanti et al. hanno prodotto vettori rAAV in piastre a 96 pozzetti per valutare la cinetica della replicazione di rAAV e testare gli effetti di diversi helper Adenovirus sulla produzione di rAAV²³. In particolare, in quest'ultimo studio, è stato descritto un saggio di replicazione utilizzando cellule HeLa specializzate che esprimono AAV Rep e Cap per amplificare ulteriormente il segnale. Più recentemente, Quan et al. hanno applicato un protocollo di produzione ad alto rendimento a 384 pozzetti nel contesto di uno screening siRNA, riportando titoli relativi²⁴. Tuttavia, data la quantità limitata di materiale, rimane ancora incerto quanti saggi e letture possano essere condotti, o se sia possibile ottenere MOI sufficienti negli esperimenti di trasduzione cellulare oltre alla misurazione delle proteine fluorescenti, con un potenziale impatto sulla riproducibilità.

In questo lavoro, la produzione basata su micro-6 pozzetti in cellule HEK293T aderenti è stata utilizzata per ottimizzare le condizioni di coltura per rAAV2 (Figura 1 e Figura 2). In linea con studi precedenti e rapporti tecnici ^43,44, rapporti PEI-DNA più bassi e l'aggiunta di NaCl durante la trasfezione hanno avuto un impatto positivo sulla produzione di rAAV. Ciò si rifletteva indirettamente nell'efficienza di trasduzione dei vettori prodotti nelle cellule HEK293A. Le notevoli differenze osservate con i rapporti PEI:DNA più bassi sono state principalmente attribuite allo stress cellulare, come indicato dalla bassa vitalità cellulare, in particolare con PEIpro. Sebbene gli effetti fossero meno evidenti in condizioni di PEImax, le immagini al microscopio hanno rivelato aree prive di cellule nello strato cellulare, indicando stress o distacco cellulare (Figura 1 supplementare).

È importante sottolineare che questi risultati non erano direttamente applicabili alla produzione di vettori in colture in sospensione, sottolineando che le condizioni sperimentali che aumentano la produzione di rAAV in cellule HEK293T aderenti potrebbero non sempre tradursi in cellule in sospensione, anche quando il tipo di cellula sottostante rimane lo stesso. Questa discrepanza potrebbe essere attribuita a differenze a livello trascrittomico e proteomico tra questi due sistemi⁴⁵. Di conseguenza, un più stretto allineamento con i processi di produzione clinica può richiedere l'uso di colture in sospensione nelle prime fasi di sviluppo. Sulla base di queste osservazioni e del vantaggio di ottenere densità cellulari più elevate in sospensione, è stato adottato un sistema a 24 pozzetti profondi per produrre rAAV in colture in sospensione su miniscala (mini-HT24). Questo sistema è stato sottoposto a un'ampia convalida, dimostrando titoli coerenti di vg/mL e vp/mL in tutta la piastra, insieme a un'espressione e rapporti uniformi della proteina VP (Figura 3A-E). Infatti, le densità cellulari più elevate raggiunte nella configurazione mini-HT24 (3 × 10⁶ cellule/mL) rispetto al formato micro-6 pozzetti (5 × 10⁵ cellule per pozzetto) hanno portato a titoli rAAV più elevati, come mostrato nella Figura 3F. Ciò evidenzia un vantaggio chiave dei sistemi basati su sospensioni, che non sono limitati dalla superficie del recipiente di coltura. Tuttavia, l'implementazione di tali sistemi richiede attrezzature specializzate che potrebbero non essere disponibili in tutti i laboratori. Infine, si raccomanda di convalidare ulteriormente le molecole guida identificate o le condizioni di coltura superiori dal sistema mini-HT24 utilizzando sistemi di minibioreattori come AMBR15 o AMBR250, poiché è stato dimostrato che questi sistemi imitano più da vicino le condizioni di produzione in grandi bioreattori^46,47.

La scelta del livello di purificazione gioca un ruolo cruciale nel determinare l'idoneità dei preparati rAAV per specifiche applicazioni a valle. I lisati grezzi, derivati sia da colture aderenti (micro-6 pozzetti) che in sospensione (mini-HT24), forniscono un'opzione rapida ed efficiente in termini di risorse per i saggi di screening preliminari. Questi lisati contengono una miscela di particelle virali, detriti cellulari e componenti del terreno, che è accettabile per applicazioni come la genomica dei vettori/titolo di particelle, lo screening dell'efficienza di trasduzione e l'analisi del western blot. Particolarmente applicabile negli studi che affrontano questioni biologiche fondamentali (come esemplificato sopra nell'indagine sulla funzionalità dell'AAP), l'ottimizzazione delle condizioni delle colture cellulari e lo screening e la selezione preclinica dei candidati. Tuttavia, la presenza di impurità può richiedere diluizioni più elevate, con conseguente riduzione della sensibilità del saggio. Inoltre, le impurità possono influire negativamente sulla vitalità di tipi di cellule sensibili, come le cellule primarie.

A differenza dei lisati grezzi, le preparazioni purificate con resina per affinità AAVX, utilizzate esclusivamente nel protocollo basato su sospensione, raggiungono un livello di purezza più elevato isolando selettivamente i capsidi intatti. Ciò supera i limiti dei lisati cellulari grezzi, rendendo queste preparazioni più adatte per applicazioni come studi in vivo , nonché analisi dettagliate in vitro della cinetica di espressione del transgene e letture funzionali precise, che spesso richiedono quantità maggiori di materiale (vedere il confronto della resa nella Figura 3F). Per le applicazioni in vitro , le rese dei vettori rAAV prodotti nell'impostazione mini-HT24 erano generalmente sufficienti per la maggior parte delle letture, a seconda del numero di cellule e dei MOI richiesti. Al contrario, le applicazioni in vivo richiedono tipicamente la produzione su scale di matraccia midi-shake o più grandi, a seconda della dose, della via di somministrazione e del modello animale. Nonostante l'aumento dei costi e dei tempi necessari per la purificazione, la coerenza e l'affidabilità del materiale risultante spesso giustificano l'investimento per casi d'uso critici. In particolare, i risultati mostrati nella Figura 4 dimostrano che i vettori rAAV purificati con metodi di resine di affinità si comportano in modo paragonabile a quelli purificati tramite ultracentrifugazione tradizionale con cloruro di cesio (CsCl). Ciò è in linea con le precedenti osservazioni secondo cui i capsidi vuoti non hanno alcun effetto sulla trasduzione o possono addirittura aumentarla, a seconda delle specie AAV presenti⁴⁸. È importante notare, tuttavia, che in questo esperimento sono stati utilizzati solo un MOI e un punto temporale e le condizioni ottimali devono essere determinate individualmente per ogni tipo di cellula. Mentre la purificazione con CsCl generalmente produce un fondo più pulito, gli AAV purificati con punta di resina HT mostrano una maggiore variabilità in termini di purezza (vedere le immagini TEM nella Figura 4). Nel complesso, questi risultati supportano ulteriormente l'adozione di flussi di lavoro ad alta produttività e su piccola scala.

L'uso di puntali riempiti di resina di affinità su piccola scala nella purificazione ad alto rendimento fornisce una soluzione pratica per lo screening rapido di rAAV, ma diversi aspetti tecnici richiedono attenzione per garantire risultati affidabili. A causa del volume limitato del letto di resina, queste punte sono particolarmente soggette a intasamento, soprattutto durante la lavorazione di lisati grezzi. Pertanto, la chiarificazione dei lisati mediante centrifugazione ad alta velocità è essenziale per rimuovere i detriti cellulari prima del carico, poiché una chiarificazione insufficiente può ridurre le portate e compromettere la resa. Per la configurazione mini-HT24, si consiglia di ottimizzare i protocolli di trasfezione e di mantenere un volume di lavoro massimo di 2,5-3 mL per pozzetto. Quando si lavora con vari sierotipi o librerie di capside, è consigliabile testare diversi tipi di resina di affinità, poiché l'efficienza di legame e il recupero possono variare a seconda della struttura del capside⁴⁹. Il sistema di pipettaggio elettronico multicanale portatile consente una facile integrazione di questo flusso di lavoro nei piccoli laboratori, offrendo flessibilità senza la necessità di automazione. Tuttavia, la movimentazione manuale può introdurre variabilità e differenze tra i lotti. Per una maggiore coerenza, le piattaforme automatizzate per la manipolazione dei liquidi possono essere utili. È necessario prestare particolare attenzione per evitare la contaminazione incrociata durante l'aggiunta del campione e del tampone e l'uso di formati di piastre appropriati con un volume adeguato dei pozzetti è essenziale per evitare il trabocco. Affrontando queste considerazioni, tra cui la chiarificazione dei campioni, l'ottimizzazione del protocollo, la selezione della resina e un attento pipettaggio, i ricercatori possono ridurre al minimo i problemi tecnici e migliorare la robustezza e la riproducibilità dei flussi di lavoro di purificazione di affinità ad alta produttività e su piccola scala.

In conclusione, la combinazione di metodi di produzione di rAAV ad alto rendimento e su piccola scala con strategie di purificazione specifiche per l'applicazione fornisce una piattaforma versatile per far progredire la ricerca sulla terapia genica. Questi protocolli rispondono alla crescente domanda di flussi di lavoro convenienti ed efficienti, mantenendo al contempo la flessibilità necessaria per soddisfare i diversi requisiti sperimentali. Bilanciando i compromessi tra purezza, scalabilità e consumo di risorse, i ricercatori possono accelerare lo sviluppo preclinico e facilitare la transizione alle applicazioni cliniche.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,9% soluzione salina non tamponata	B. Braun, Melsungen, Germania	7647-14-5	Tampone Wash II
1 M Acido idroclocirrico	Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, Stati Uniti	1099700050	Regolazione del pH dei tamponi
10x DNase I Buffer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stati Uniti	AM8170G	ddPCR/dPCR
1M Tris-HCl, pH 9,0	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stati Uniti	J60707. AP	Tampone di neutralizzazione
Micropiastre a 24 pozzetti profondi	Enzyscreen, Heemstede, Paesi Bassi	CR1424cl	Attrezzature per colture in sospensione
Pallone di Erlenmeyer in policarbonato da 250 mL con tappo di sfiato	Corning, New York, NY , Stati Uniti	431144	Attrezzature per colture in sospensione
66 - 440 kDa separazione 8x25 cartucce capillari	BioTechne, Minneapolis, MN, Stati Uniti	SM-W008	Kit automatizzato di Western blot
96 pozzetti 2,2 mL di polipropilene DeepWell	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stati Uniti	AB0661	Piastra di elaborazione e conservazione dei campioni
Piastra inferiore a 96 pozzetti nera/trasparente, superficie TC	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stati Uniti	165305	Saggi di trasduzione
AAV2 VP1, proteina ricombinante	PROGEN, Heidelberg Germania	640823	Reagente Wes
AAV2 VP2, proteina ricombinante	PROGEN, Heidelberg Germania	640824	Reagente Wes
AAV2 VP3, proteina ricombinante	PROGEN, Heidelberg Germania	640825	Reagente Wes
AAV2 Xpress ELISA	PROGEN, Heidelberg Germania	PRAAV2XP	Utilizzato per campioni purificati in resina HT.
Modulo di rilevamento anti-topo per Wes	BioTechne, Minneapolis, MN, Stati Uniti	DM-002	Kit automatizzato di Western blot
Primer in avanti specifico per saggio/modello	Costume	Costume	ddPCR/dPCR
Sonda specifica per saggio/modello	Costume	Costume	ddPCR/dPCR
Primer inverso specifico per saggio/modello	Costume	Costume	ddPCR/dPCR
BalanCD HEK293 - Liquido	FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC INC, Santa Ana, CA, Stati Uniti	NC1192689	Terreno per coltura cellulare in sospensione
Albumina sierica bovina	Elettroforesi SERVA, Heidelberg, Germania	cAlbumina sierica bovina	Integratore per terreno cellulare aderente
Pellicola di rayon traspirante, sterile	VWR International LLC, Radnor, PA, Stati Uniti	391-1262	Attrezzature per colture in sospensione
Termociclatore C1000	Laboratori Bio-Rad, Hercules, Stati Uniti	1851096	per ddPCR
Kit ELISA per perdite di ligando CaptureSelec AAVX	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stati Uniti	8113522000	ELISA
Analizzatore HiRes Cedex	Roche Holding AG, Basilea, Svizzera	5650216001	Contatore di celle
Micropiastra per coltura CELL, 96 pozzetti	Greiner Bio-One, Kremsmü nster, Austria	655162	Apparecchiature per colture cellulari adeguate
Acido citrico	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stati Uniti	5949-29-1	Reagente di purificazione; CAUTELA
telecamera TEM basata su CMOS TVIPS XF416	Tietz Video and Image Processing Systems GmbH, Gilching, Germania	XF416	Sistema di elaborazione video e immagini
Software bussola (versione 6.3.0)	BioTechne, Minneapolis, MN, Stati Uniti		WES Software
Costar Piastre a pozzetti multipli trasparenti con trattamento TC a 6 pozzetti	Corning, New York, NY , Stati Uniti	3516	Apparecchiature per colture cellulari adeguate
ddPCR Olio generatore di goccioline	Laboratori Bio-Rad, Hercules, Stati Uniti	#1864110	reagente ddPCR
ddPCR Olio per lettore di gocce	Laboratori Bio-Rad, Hercules, Stati Uniti	#1863004	reagente ddPCR
ddPCR Supermix per sonde (no dUTP)	Laboratori Bio-Rad, Hercules, Stati Uniti	#1863023	reagente ddPCR
DMEM, glicemia alta	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stati Uniti	11960044	Terreno per colture cellulari aderenti
DMEM, basso contenuto di glucosio	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stati Uniti	11885084	Terreno per colture cellulari aderenti
Piastre DNA a 96 pozzetti a basso legame	Eppendorf, Amburgo, Germania	30129504	ddPCR/dPCR
Provette per DNA a basso legame	Eppendorf, Amburgo, Germania	30108051	ddPCR/dPCR
DPBS	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stati Uniti	14190094	Tampone di lavaggio
Griglie EM (T600H-Cu 698 l/pollice Hex. mesh Thin Bar; EMS)	Scienze della microscopia elettronica, Hatfield, PA, Stati Uniti	FFTH600-Cu-UL	Analisi al microscopio elettronico
Sistema di imaging EVO M5000	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stati Uniti	AMF5000	Microscopio a immagini dal vivo per saggi di trasduzione
Pacchetto standard EZ 3	BioTechne, Minneapolis, MN, Stati Uniti	PS-ST03EZ-8	Kit automatizzato di Western blot
Provette da centrifuga coniche Falcon 15mL	Fisher Scientific, Schwerte, Germania	11507411	Elaborazione dei campioni
Provette da centrifuga coniche Falcon 50mL	Fisher Scientific, Schwerte, Germania	10203001	Elaborazione dei campioni
Matrice della membrana basale a fattore di crescita ridotto senza LDEV Geltrex	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stati Uniti	A1413201	Rivestimento della piastra di coltura
Integratore GlutaMAX (L-Alanil-L-Glutammina)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stati Uniti	35050061	Integratore per terreno cellulare aderente
HEK293A	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stati Uniti	Codice: R70507	Saggi di trasduzione (solo per uso di ricerca)
HEK293T	ATCC, Manassas, Virginia, Stati Uniti	Codice CRL-3216	Coltura cellulare adesiva, utilizzata per la produzione di rAAV (solo per uso di ricerca)
Soluzione HEPES, 1M	Merck, Darmstadt, Germania	#H0887	Integratore per terreno cellulare aderente
Nucleasi attiva del sale HL, SAN (25 U/µ L)	ArcticZymes Technologies, Troms, Norvegia	70910-202	ddPCR/dPCR
IdroSpeed Lavapiastre per micropiastre	Tecan, Mä nnedorf, Svizzera	30190101	ELISA
Kit di astrociti iCell, 01434	FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc., Madison, WI, Stati Uniti	R1092	Saggi di trasduzione
Kit motoneurone iCell, 01279	FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc., Madison, WI, Stati Uniti	R1051	Saggi di trasduzione
Infinito 200 PRO	Tecan, Mä nnedorf, Svizzera	30213617	ELISA
JEM-1400Plus è un microscopio elettronico a trasmissione	JEOL Ltd., Akishima, Tokyo, Giappone	JEM-1400Plus	microscopio elettronico a trasmissione
Copertura sandwich a bassa evaporazione con perni	Enzyscreen, Heemstede, Paesi Bassi	CR1224c	Attrezzature per colture in sospensione
Lettore di micropiastre  SpectraMax i3	Molecular Devices, San Jose, CA, Stati Uniti	i3x	ELISA
Anticorpo monoclonale di topo anit-AAV2 VP1/VP2/VP3	PROGEN, Heidelberg Germania	690058	Reagente Wes
Acqua priva di nucleasi	Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germania	3036430103	ddPCR/dPCR
Opti-MEM, Siero Ridotto Medio	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stati Uniti	#31985070	Terreno per la formazione del complesso PEI-DNA
PBS	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stati Uniti	#10010023	Tampone di lavaggio
PEI-MAX, polietilenimmina, 1mg/ml stock	Polysciences Europe,  Hirschberg an der Bergstraß e, Germania	24765 o 24765	Reagente di trasfezione
PEIpro	Polyplus, Illkirch-Graffenstaden, Francia	101000033/10mL	Reagente di trasfezione
Piastra per microdialisi Pierce, 96 pozzetti, 0,3 mL, 20K MWCO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stati Uniti	Codice A50472	Apparecchiature di depurazione
Poloxamer 188	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stati Uniti	P5556-100mL	Reagente per colture cellulari; CAUTELA
Soluzione di poli-L-ornitina (0,01%)	Sigma-Aldrich	A-004-M	Saggi di trasduzione
Soluzione di proteinasi K (20 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stati Uniti	25530049	ddPCR/dPCR
ProteinSimple " Wes"	BioTechne, Minneapolis, MN, Stati Uniti	004-600	Dispositivo per Western Blot automatizzato
Sistema a otto piattaforme QIAcuity	Qiagen, Hilden, Germania	911052	per dPCR
QIAcuity Nanopiastra 8.5k 96 pozzetti	Qiagen, Hilden, Germania	250021	ddPCR/dPCR
Kit PCR sonda QIAcuity	Qiagen, Hilden, Germania	250101, 250102 o 250103	ddPCR/dPCR
Suite software QIAcuity 1.2	Qiagen, Hilden, Germania		Software dPCR
Gestore QX	Laboratori Bio-Rad, Hercules, Stati Uniti		Software ddPCR
Lettore di gocce QX200	Laboratori Bio-Rad, Hercules, Stati Uniti	1864003	per ddPCR
Microprovetta con tappo a vite, 1,5 ml, PCR Performance Tested	Sarstedt, Nü mbrecht, Germania	72.703.416	Attrezzature per colture in sospensione
Tappo a vite, DNA LoBind, 5,0 mL	Eppendorf, Amburgo, Germania	30122348	Attrezzature per colture in sospensione
Incubatore agitatore	Infors AG, Bottmingen, Svizzera	Multitron	Attrezzature per colture in sospensione
Piruvato di sodio (100 mM)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stati Uniti	11360070	Terreno per colture cellulari aderenti
Sistema di trombe a micropiastre Sonicator	QSonica, Newtown, CT, Stati Uniti	Q700MPXC	Sonicatore utilizzato per la generazione di lisato grezzo
SPIRITO			Collegamento alla banca dati SPIRIT: https://spirit.cladiac.com/aav.html
Steriflip-GP Unità di filtraggio superiore per provette sterili per centrifuga	Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, Stati Uniti	SCGP00525	Attrezzature per la preparazione dei tamponi
T-175, PALLONE PER COLTURE CELLULARI, 550 ML, 175 CM²	Greiner Bio-One, Kremsmü nster, Austria	660175	Apparecchiature per colture cellulari adeguate
Tripsina/EDTA 0,025%	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stati Uniti	R001100	Reagente per colture cellulari
Cellule di produzione virale 2.0 (VPC2.0)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stati Uniti	A49784 o A51218	Produzione rAAV
		J63596. K2	Diluire 1:10 per soluzione di lavoro PBST