Produzione basata su microbioreattori di cellule stromali mesenchimali dipendenti dall'ancoraggio, preparate per la sindrome da difficoltà respiratoria acuta

Summary

Un protocollo è descritto per la produzione di cellule dipendenti dall'ancoraggio per microtrasportatori e microbioreatori come potenziali terapie cellulari. Rivolgendosi a un caso d'uso della sindrome da difficoltà respiratoria acuta, sono illustrati un rendimento cellulare comparabile e un'espressione genica favorevole rispetto alle condizioni di processo basate su fiaschette. Questo protocollo è estendibile ad altre celle dipendenti dall'ancoraggio e indicazioni del bersaglio.

Abstract

La terapia cellulare è un approccio terapeutico emergente per una serie di condizioni di salute. Tuttavia, produrre quantità sufficienti di celle di qualità rimane una sfida scientifica e tecnica attiva. Il prodotto cellulare finale non può essere sterilizzato; Pertanto, la sterilità e le considerazioni di qualità per progettazione sono fondamentali. Per le cellule dipendenti dall'ancoraggio, l'espansione basata su fiaschette è ancora utilizzata sia su scala di sviluppo che industriale, richiedendo ampie impronte fisiche, limitando il controllo dell'ambiente biochimico (pH, CO₂ e_O2, gradienti diffusivi di nutrienti e metaboliti) e fornendo segnali fisici che possono influenzare la qualità cellulare finale. Queste sfide hanno motivato l'adozione di approcci di produzione basati su bioreattori, ma tali approcci di solito avvengono su scale volumetriche che comportano sfide e possono risultare costose per la ricerca esplorativa su banco o lo sviluppo di processi. La produzione di terapia cellulare micro-portatore microbiore-microportatore è stata riportata come un controllo biochimico durante la coltura per un caso di prova di tipo di origine cellulare - cellule stromali mesenchimatici. Per la valutazione iniziale della qualità cellulare in vitro, è stata considerata la sindrome da difficoltà respiratoria acuta come un potenziale caso d'uso. L'approccio illustrato qui consente uno sviluppo rapido del processo su scala da banco grazie al piccolo volume (2 mL) e al rigoroso controllo biochimico nel microbioreatore. Per ottenere ciò per un tipo cellulare dipendente dall'ancoraggio, come le cellule stromali mesenchimate, è stata necessaria una modifica sostanziale del processo microbioreatario e si ha utilizzato una piattaforma di microtrasportatori alla gelatina prodotta internamente tramite un processo microfluidico. Qui, ulteriori dettagli sono illustrati per i parametri di metodo e processo utilizzati per coltivare tali cellule dipendenti dall'ancoraggio nel microbioreatore, con l'intento di permettere ad altri ricercatori di adattare queste pratiche ai propri casi d'uso e ai tipi di fonte cellulare.

Introduction

L'uso delle cellule vive come prodotto terapeutico è recentemente emerso come una nuova opzione terapeutica promettente per diverse sfide di salute. Ad esempio, le cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) hanno portato una remissione duratura a chi ha i cosiddetti tumori liquidi — leucemia, linfoma e mieloma multiplo — che erano refrattari a tutti i trattamenti precedentemente^{disponibili 1}. Più recentemente, un prodotto a base staminale/cellule stromali mesenchimale (Ryoncil) è stato approvato per trattare i bambini affetti da malattia acuta innestazione contro ospite refrattaria agli steroidi (SR-aGvHD), una condizione con mortalità > 50^{% 2}. Ma l'estensione ad altri bisogni clinici non soddisfatti richiede uno sviluppo intensivo sia della terapia sia dei mezzi per sviluppare e produrre quel prodotto.

Una di queste esigenze cliniche insoddisfatte si riscontra negli individui che soffrono di sindrome da difficoltà respiratoria acuta (ARDS). L'ARDS viene discusso qui per fornire un caso d'uso specifico che illustri il metodo, i risultati e la discussione sulle possibili estensioni ad altri target di malattia. Indicazione critica (progressione in ore a giorni), diffusa (> 200.000 casi annuali negli Stati Uniti) e mortale (mortalità 27%-46%, a seconda della gravità della manifestazione), ARDS ha attirato rinnovata e diffusa attenzione durante la pandemia di COVID-19 come meccanismo tipico di morte per i pazienti infettati da SARS-CoV-2 ^3,4. L'ARDS è caratterizzato da un aumento della permeabilità vascolare polmonare che porta a edema interstiziale, allagamento alveolare e infiltrazione di componenti cellulari, inclusi neutrofili e globuli rossi, nel compartimento^{alveolare 5}. Nella fase essudativa iniziale dell'ARDS, l'infiammazione innata mediata dalle cellule immunitarie genera questi risultati patogeni danneggiando l'integrità della barriera endoteliale ed epiteliale e promuovendo il reclutamento e l'attivazione delle cellule immunitarie tramite la secrezione di citochine pro-infiammatorie; La risoluzione efficace della risposta infiammatoria, la riparazione dell'integrità della barriera e l'evitamento di fibrosi eccessiva sono fondamentali per la^{sopravvivenza 3}. Sebbene terapie antivirali come il Remdesivir abbiano mostrato risultati promettenti nel combattere l'ARDS mediato da SARS-CoV-2, per altre etiologie attualmente non esistono interventi farmacologici approvati che riducano la^{mortalità 5}.

Le MSC possono offrire un approccio promettente al trattamento dell'ARDS, dato il loro tropismo specifico polmonare all'iniezione sistemica e la loro capacità di secernere segnali paracrini immunomodulatori nel microambiente^{circostante 6,7}. Studi meccanicistici hanno implicato l'espressione di fattori paracrini come interleuchina-10 (IL-10⁾⁸, indoleamine 2,3-dioxygenasi 1 (IDO1)⁹, prostaglandina E2 (PGE2)¹⁰ e altri nella determinazione della potenzialità terapeutica presunta della MSC per molteplici indicazioni, inclusa lesione polmonare acuta (ALI)/ARDS¹¹; pertanto, i livelli di espressione di questi prodotti genici rappresentano potenziali attributi critici di qualità (pCQA) che possono essere predittivi dell'efficacia clinica, fornendo criteri di rilascio trattabili per il prodotto cellulare finale durante la produzione. Tuttavia, produrre quantità sufficienti di cellule per raggiungere una dose terapeutica efficace è una sfida; Il rioncilo, ad esempio, è indicato per una somministrazione a 2 x 10⁶ cellule/kg di massa paziente, somministrato due volte a settimana per 4 settimane^{e 12}. Per un paziente di 80 kg, ciò equivale a >1,2 miliardi di MSC per un singolo ciclo di trattamento, rendendo necessaria una vasta superficie fisica per ospitare una superficie sufficiente per questa condizione di crescita 2D. Dato che questo prodotto a cellule vive non può essere sterilizzato prima della somministrazione del paziente senza danneggiare il potenziale terapeutico delle cellule, l'utilizzo delle attuali linee guida di Buona Pratica di Produzione per la produzione sterile è fondamentale, aumentando la complessità logistica della produzione cellulare e quindi il costo dei beni¹³.

Inoltre, studi precedenti hanno dimostrato che la produzione tipica di MSC in fiaschette di polistirene in coltura tissutale (TCPS) contribuisce all'insorgenza di eterogeneità fenotipica intra-popolazione. Per alcuni usi finali, questo rende impegnativo il controllo qualità tra i lotti nella ricerca e nella traduzione^clinica 14,15,16,17. Si ipotizza che il limitato controllo biochimico disponibile nelle fiaschette TCPS, inclusi gradienti diffusi di gas, nutrienti e prodotti metabolici di scarto, una scarsa regolazione del pH, ecc., contribuiscano a queste sfide.

Questi problemi motivano l'adozione di colture basate su bioreattori per sfruttare la superiore regolazione biochimica e la densità cellulare disponibili in un formato di crescita tridimensionale controllata con miscelazione^{dinamica 18}. Tuttavia, il processo o la produzione basati su bioreattori comportano le proprie sfide: essendo un tipo di cellula dipendente dall'ancoraggio, le MSC richiedono una qualche forma di substrato su cui crescere in un bioreattore, rendendo necessaria l'aggiunta di microtrasportatori. Inoltre, molti bioreattori commercialmente disponibili operano su scale di volume proibitive in termini di risorse (> 3 L di materiale di crescita) per il tipo di ricerca esplorativa da banco necessaria per identificare e perfezionare parametri di processo sconosciuti che influenzano l'espressione di indicatori misurabili della qualità cellulare. Queste caratteristiche sono descritte come potenziali attributi critici di qualità o^{pCQAs 19}.

Krupczak et al. hanno precedentemente riportato un approccio microtrasportatore-microbioretore che ha prodotto MSC con una migliore espressione di pCQA per ARDS, limitato a valutazioni in vitro ²⁰. Questo approccio combinava l'uso di una piattaforma di microtrasportatori a gelatina risolvibile prodotta internamente con una piattaforma di microbioreattori disponibile commercialmente, il Mobius Breez microbioreactor²¹. Questo microbioreattore utilizza camere di reattore monouso da 2 mL e incorpora molte caratteristiche desiderabili per un controllo biochimico migliorato, tra cui la regolazione di temperatura, pH, CO₂ e_O2 in un sistema dinamicamente misto e a perfusione a circuito chiuso, ma non è stato progettato pensando a celle dipendenti dall'ancoraggio come le MSC. Infatti, i canali microfluidici standard utilizzati per iniettare i contenuti dei reattori sono troppo piccoli per permettere il passaggio dei microportatori, richiedendo un adattamento sostanziale per consentire la produzione efficace degli MSC in questa piattaforma.

Qui viene descritto e illustrato un protocollo dettagliato allo scopo di adattare questo microbioreattore alla coltura dipendente dall'ancoraggio delle MSC. I parametri di processo qui riportati sono stati identificati con l'intento di informare lo sviluppo e la produzione dei processi MSC per la valutazione preclinica e in vitro dell'efficacia terapeutica dell'ARDS. Tuttavia, in linea di principio, questo protocollo può essere adattato ad altre applicazioni per utenti finali, altre condizioni infiammatorie o immunomodulatorie e altri tipi cellulari dipendenti dall'ancoraggio che potrebbero beneficiare di un controllo biochimico rafforzato in un contesto su scala da laboratorio. La Figura 1 schematizza il protocollo descritto nel video allegato, mentre la Figura 2, la Figura 3 e la Figura 4 illustrano i risultati chiave.

Protocol

1. Installazione e preparazione dei microbioreattori

1. Preparazione del numero richiesto di consumabili per microbioreattori
   1. Assicurati che l'armadietto di biosicurezza (BSC) sia attivo e sterile. Rimuovere la sacca di alluminio che copre il nuovo consumabile perforando la parte superiore della borsa e conservando la busta fino alla conclusione di questo esperimento (per registrare i dettagli del lot# in caso di difetto). Apri il packaging blister esterno e getta via il pacchetto idratante contenuto. Scartate il blister esterno.
   2. Spruzza l'imballaggio blister interno con etanolo al 70% e portalo nel BSC. Apri il blister interno e scartalo.
   3. Utilizzando una siringa sterile, rimuovere lo sturalavandini e collegare l'ugello a un filtro sterile da 0,22 μm. Versa 50 mL di acqua ultrapura non sterilizzata nel barile della siringa. Mentre si tiene la siringa sopra un tubo sterile di 50 mL in attesa, reinserire lo sturalavandini nella siringa e iniettare l'acqua filtrata sterile nel tubo di raccolta in attesa.
   4. Rimuovi il tappo di plastica trasparente che si collega alla bottiglia LL nel portabottiglie. Usando una nuova siringa sterile da 50 mL, rimuovi lo sturalavandini e collega l'ugello alla bottiglia LL. Versa l'acqua sterile filtrata nel cilindro della siringa e iniettala nella bottiglia LL.
      NOTA: Le porte di collegamento senza ago possono bloccarsi durante la procedura di sterilizzazione del produttore, quindi potrebbe essere necessario collegare e scollegare la siringa più volte per rompere la tenuta della bottiglia e iniettare con successo il contenuto. In alternativa, puoi usare una saldatrice per tubi per collegare una bottiglia sorgente al tubo saldabile in modo sterile per la bottiglia appropriata.
   5. Utilizzando questa stessa procedura, riempi la bottiglia L con 25 mL di DMEM a basso contenuto di glucosio non integrato con FBS, la bottiglia R con 25 mL di PBS sterile e la bottiglia RR con 8 mL di soluzione antiaderente per risciacquo. Usa una nuova siringa sterile per ogni liquido.
   6. Ripeti questa procedura per quanti consumabili siano necessari nell'esperimento.
2. Esegui un autotest POD in ciascun POD utilizzato per questo esperimento.
   NOTA: L'autotest dovrebbe completarsi senza problemi; Se un componente dell'auto-test fallisce, si affronta il fallimento prima di continuare.
3. Rimuovi le cassette auto-test dalle loro borse protette dalla luce.
4. Montare il consumabile sul bioreattore come descritto di seguito.
   1. Rimuovi il nastro verde dalle valvole del consumabile e montalo in posizione nel POD. Reinstalla le morsette e assicurati che non si sentano gas o aria sfrigolio mentre esce.
   2. Collega la linea bianca del sensore di pressione del rack delle bottiglie, la linea di pressione dell'aria rossa e la linea blu del vuoto tra i consumabili e la stazione base/POD. Assicurati che la porta di iniezione laterale sia chiusa con una pinza a goccia bianca.
   3. Segui i passaggi del software per avviare un nuovo esperimento. Questi si concludono con la funzione di autoprime e calibrazione, che richiede ~4-5 ore e può funzionare tutta la notte.
5. Etichetta ogni rastrelliera con la posizione del POD, così sarà facile distinguere a quale punto di riferimento restituire il consumabile dopo che è stato rimosso dal bioreattore. Usa nastro colorato per indicare la posizione: Pod0 = rosso, Pod1 = arancione, Pod2 = giallo, Pod3 = verde. Scrivi il nome dell'esperimento e la data sulla cassetta.
6. Lascia calibrare i consumabili durante la notte. Assicurati che i mezzi possano entrare nel reattore ed uscire nella linea di scarto.
7. Se si prevede di usare cellule immagazzinate in azoto liquido, scongelale e placcatele in modo che abbiano > 24 ore per recuperare dalla criostoccaggio prima dell'iniezione.

2. Ricalibrazione e preparazione dei microportatori

1. Assicurati che i passaggi di autoprimer e calibrazione siano stati completati con successo.
   1. Se la calibrazione non è stata completata con successo, identificare e correggere eventuali problemi alla radice e poi tentare una ricalibrazione. I problemi comuni includono la mancata rimozione della morsa bianca del portabottiglie, la mancata rimozione del nastro verde dal consumabile prima di inserirlo nel POD, e un volume del materiale insufficiente nella bottiglia di supporto.
2. Assicurati che i sensori di ossigeno disciolto siano stabili.
   1. Quasi il 10% dei consumabili presenterà deriva del sensore nel sensore DO dopo la calibrazione. Esegui l'azione correttiva preferita, ovvero rieseguire la calibrazione completa. Se necessario, esegui una delle seguenti procedure.
      1. Assicurati che non ci sia aria nella cassetta, poi deseleziona la casella Visualizza i comandi , quindi clicca su Autocalibra DO e pH.
         1. Se nell'aria era presente nel reattore quando è necessaria una ricalibrazione, si torna alla prima pagina della dashboard MBS cliccando sulla freccia blu a sinistra nell'angolo in alto a sinistra della finestra per il POD specifico in questione. Clicca sul pulsante per attivare le operazioni manuali. Seleziona la casella Waste tube ready e inserisci W nella casella di inserimento del testo per selezionare la bottiglia di scarto. Clicca sul pulsante Espulso-lavatura , poi clicca su Sì nella finestra pop-up. Questo svuoterà le camere del reattore e le riempirà con materiale proveniente dalla bottiglia di sorge.
3. Prepara il numero corretto di microportatori in tubi conici da 15 mL, uno per ogni condizione.
   NOTA: Il numero di microtrasporti, l'area superficiale aggregata e la densità di semina delle cellule dipenderanno dalla tua applicazione. Per questo protocollo, si raccomanda di iniettare un numero assoluto di microportatori che risulti in 75^cm2 di area di crescita disponibile per il microportatore per il confronto con una fiaschetta T75.
4. Permettere ai microportatori di depositarsi nel tubo; aspira quanta più quantità di soprandanzante possibile senza rimuovere microtrasportatori per fare spazio a cellule e mezzi freschi.

3. Iniezione di cellulari e microcarrier

1. Assicurati che le funzioni di autoprime e calibrazione siano state completate con successo.
2. Scorre la finestra del software come se il reattore fosse inoculato secondo il flusso di lavoro standard delle celle di sospensione.
3. Inserisci una nota nella finestra pop-up per indicare che a questo punto non è avvenuta alcuna iniezione di cellule.
4. Attiva le operazioni manuali per mettere in pausa la miscelazione del reattore e aggiungere una fascetta a C bianca alle linee del rack delle bottiglie.
5. Rimuovi ogni consumabile e trasferisci al BSC. Rimuovi il materiale esausto dalle bottiglie di scarto e perfusione e getta.
   1. Assicurati di rimuovere tutti i rifiuti dalla grande bottiglia di perfusione così come dal tubo più piccolo da 1,5 mL contenuto nella bottiglia di perfusione se prevedi di raccogliere substrati condizionati in qualsiasi momento dello studio.
6. Rimuovi il substrato di crescita non integrato con siero dalla bottiglia L e getta. Risciacquare la bottiglia L con ~20 mL di PBS sterile e poi scartarla. Aggiungi 25 mL di substrato di crescita integrato con siero nella bottiglia L.
7. Restituire i consumabili ai rispettivi POD. Metti le bottiglie della fonte di supporto sul ghiaccio per tutta la durata dell'esperimento. Rinfresca il ghiaccio ogni giorno.
   NOTA: Il ghiaccio umido può essere integrato con pacchi da congelatore per prolungare la durata del controllo della temperatura.
8. Lava i reattori con PBS e sciacqua le linee.
   1. Clicca sul pulsante Sciacquate le bottiglie , attiva il pulsante Radio per la Bottiglia L, seleziona Output to Waste, poi clicca Start Flush MSCserum.
      NOTA: Questo farà scorrere il nuovo supporto hMSC aggiunto attraverso la linea per garantire che non entri più supporti non FBS nel reattore.
   2. Clicca di nuovo sul pulsante Sciacquone bottiglie , seleziona il pulsante Radio per Bottle RR e inizia a scaricare. Questo farà sciacquare la soluzione antiaderente attraverso la linea e garantirà che sia preparata per l'ingresso nel reattore.
   3. Nella finestra Contenuto della Bottiglia, indica nel software che MSCserum si trova nella Bottiglia R, che in realtà contiene PBS.
   4. Vai alle operazioni manuali ed esegui tre cicli di espulsione-lavaggio sulla bottiglia di scarto.
9. Aggiungi una soluzione di risciacquo antiaderente al reattore.
   1. Torna alla finestra Contenuto della bottiglia e indica che MSCserum si trova nella Bottle RR, che in realtà contiene una soluzione antiaderente per risciacquo.
   2. Vai alle operazioni manuali ed esegui un ciclo di espulsione-lavaggio sulla bottiglia di scarto.
      NOTA: Il precedente lavaggio PBS serviva a impedire che componenti del DMEM interferissero con il lavaggio anti-aderenza; ora, il reattore dovrebbe essere pieno di soluzione di risciacquo antiaderente con tracce di PBS.
10. Dopo 30 minuti con la soluzione antiaderente, risciacqua il consumabile con PBS.
    1. Nella finestra Contenuto della Bottiglia, indica nel software che MSCserum si trova nella Bottiglia R, che in realtà contiene PBS.
    2. Vai alle operazioni manuali ed esegui tre cicli di espulsione-lavaggio sulla bottiglia di scarto.
    3. Torna alla finestra Contenuto della Bottiglia e indica nel software che MSCserum si trova nella Bottiglia L, che contiene supporti hMSC.
11. Svuota il reattore in attesa dell'iniezione di cellule e microportatori. Nel pannello delle operazioni manuali, clicca su Reinoculate e lascia il sistema nella fase in cui il cruscotto indica di vaccinare il reattore.
    NOTA: Qui, il termine inoculare significa semplicemente iniezione delle cellule destinate all'espansione nel microbioreatore.
12. Aggiungi resistori aggiuntivi per modulare la velocità di miscelazione in linea con la resistenza R0 predefinita.
13. Solleva le cellule dalla fiaschetta e contale con un emocitometro. Eseguire tutte le operazioni aperte in un BSC per garantire la sterilità.
    1. Aspira il substrato, poi lava con 5-10 mL di PBS preriscaldato. Aspira il PBS e aggiungi 5 mL di tripsina + EDTA alla fiaschetta.
    2. Incubare a 37 °C per 5 minuti o finché tutte le cellule non si sono visibilmente sollevate dalla superficie della fiaschetta.
    3. Aggiungere 10 mL di mezzo hMSC preriscaldato per neutralizzare l'attività tripsina. Preleva il contenuto liquido e depositalo in un tubo centrifuga da 15 mL.
    4. Centrifuga le celle a 300 x g per 5 minuti. Scartare il sovrantantante e risospendere la pellet cellulare in un volume appropriato di supporto hMSC per il conteggio. Per una fiaschetta T75 completamente confluente, un volume adatto è tipicamente di 2-4 mL, il che produce una concentrazione cellulare di ~1-2E6 cellule per mL.
    5. Mescola un campione delle cellule risospese con una parte uguale di colorante di Trypan Blue e carica la miscela in un emocitometro per il conteggio. Contate le cellule secondo le istruzioni del produttore.
14. Calcola il volume di soluzione cellulare necessario per raggiungere 150.000 celle e pipetta quella somma nel tubo conico da 15 mL in attesa contenente microportatori per ogni condizione. Aumenta il volume nella valvola tra 2,2 e 2,5 mL con un supporto hMSC fresco e caldo.
    NOTA: Il volume in ogni conico da 15 mL dovrebbe essere leggermente superiore a 2 mL, in modo che l'iniezione produca una condizione di reattore leggermente sovraccarico per evitare bolle, che saranno equalizzati in una fase successiva.
15. Aggiungi il volume appropriato di celle al controllo del fiaschone T75.
16. Lavorando con uno o due consumabili alla volta, rimuovi i consumabili dal POD e portali nel BSC.
17. Preleva cellule e microportatori in una siringa da 5 mL usando aghi smussati verdi da 4 pollici. Inietta le celle e i microtrasportatori nel reattore.
18. Restituire il consumabile alla stazione base e ripetere finché tutti i consumabili non sono stati iniettati.
19. Clicca sulle finestre del software per indicare che l'inoculazione è avvenuta. Quando il software torna alla home page normale, rimuovi la pinza bianca dalle linee di uscita dei consumabili.
20. Entra in manual ops ed esegui una funzione Eject Excess con la porta di uscita impostata su P per la perfusione. Attiva la modalità di miscelazione statica, usando 1680 s acceso e 120 secondi spento. Mantieni la frequenza di miscelazione a 5 Hz per il mixaggio statico.
21. Disattiva la misurazione di riferimento della densità ottica.
    1. Apri il client MBS e clicca su Connetti. Inserisci il seguente comando contenuto tra le virgolette: "dmem_write 0,1,2,3 F_measure_ODref_skip 1"
    2. Clicca su Invia, attendi la conferma che il comando è stato inviato con successo e chiudi il client MBS.
22. Dopo 24 ore, disabilita la modalità di miscelazione statica e riattiva la miscelazione normale. Riduci la frequenza di miscelazione a 1,5 Hz.

4. Funzionamento del microbioreattore

1. Monitora quotidianamente il microbioreatore per assicurarti che nessun problema possa disturbare l'esperimento. Assicurati che le bottiglie della fonte di supporto mantengano >5 mL di materiale per perfondere con successo il reattore senza problemi.
2. Sostituire i secchi di ghiaccio secondo necessità per mantenere il controllo della temperatura della bottiglia di supporto del substrato. Tieni la copertura protettiva sulla parte anteriore del microbioretore per prevenire il degrado dovuto alla luce dei componenti del mezzo volatile.
3. Assicurati che non vengano introdotte bolle nel reattore. Non dimenticare di cambiare periodicamente il supporto nel controllo della fiaschetta TCPS.

5. Prelievo del microbioreatore

1. Assicurati che il BSC sia sterile e pronto all'uso.
   1. Riscaldare i seguenti reagenti necessari in una perla o in bagno d'acqua a 37 °C: ~25 mL di mezzo hMSC caldo, 10 mL di PBS caldo e 1,5 mL di 10 mg/mL di Pronasi necessari per la raccolta.
2. Prepara lo scaffale per la raccolta.
   1. Attiva la modalità operativa manuale per ogni POD nel software.
   2. Clampa le linee di ingresso dei consumabili usando una pinza a C bianca lungo la parte trasparente della linea.
   3. Rimuovi i consumabili dal BSC. Rimuovi il contenuto della bottiglia di rifiuti e getta.
   4. Sciacquare la bottiglia di scarto con ~20 mL di PBS e buttarla via. Valuta il volume rimanente nella bottiglia del substrato e riempi con un supporto hMSC fresco (freddo) se necessario.
      NOTA: Qui, sono necessari > 4 mL di materiale per completare i tre cicli di espulsione e lavaggio necessari per la raccolta.
   5. Fodere la bottiglia di scarto con ~5 mL di substrato hMSC freddo per ammortizzare il liquido raccolto.
3. Preleva le cellule dal microbioreatore.
   1. Con una siringa da 1 mL, si aspira 200 μL di 10 mg/mL di Pronasi nella siringa e ~300-400 μL d'aria.
   2. Svita il tappo della linea di iniezione laterale e spruzza il connettore della valvola senza ago con etanolo al 70%. Rimuovi il nastro che fissa la linea di iniezione laterale annodata e sciogli il nodo. Sblocca la pinza bianca a goccia.
   3. Collega la siringa da 1 mL e inietta delicatamente la Pronasi nel reattore. Insegui il liquido lungo la linea di iniezione con aria per assicurarti che tutto il contenuto liquido venga consegnato al reattore.
   4. Riattacca la morsa a goccia e ricappucchia la linea di iniezione della porta laterale. Riportare il consumabile al suo POD, ricollegare tutte le linee, rimuovere il morsetto bianco a C e riprendere la miscelazione.
   5. Assicurati che la bottiglia di scarto e quella della fonte del materiale siano tenute sul ghiaccio. Avvia un timer di 5 minuti e lascia che la Pronasi digera i microportatori all'interno del reattore.
   6. Dopo 5 minuti, verifica se i microportatori si sono degradati verificando che non siano più visibili nel reattore. Se i microportatori sono ancora visibili, si prevede un minuto in più per la digestione. Se non sono visibili microportanti, procedi.
   7. Preleva le cellule. Attiva la modalità operazione manuale, imposta il # dei cicli a 3 e porta di uscita su W per lo spreco, poi clicca su Espulso Lavatura.
   8. Dopo aver completato i cicli di lavaggio di espulsione, rimuovi il consumabile nel BSC e ritira il contenuto della bottiglia di scarto usando una siringa da 10 o 20 mL.
   9. Distribuire il contenuto della bottiglia di rifiuti in un tubo centrifuga conico da 15 mL. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti, aspirare il soprantantante e valutare la dimensione della pellet cellulare.
   10. Sospendi la pellet cellulare in 1-5 mL di substrato di crescita o PBS e contare le cellule su un emocitometro. Ripeti questo passaggio per tutti i consumabili.
4. Preleva la condizione o le fiasche seguendo i tuoi normali protocolli di coltura cellulare. Un protocollo tipico per gli MSC è descritto nella versione 3.13.

6. Analizzare le cellule delle condizioni del microbioreatore e delle condizioni del fiaschone per applicazioni a valle

NOTA: I metodi analitici utilizzati per produrre i risultati presentati sono forniti brevemente di seguito e descritti in modo più dettagliato in Krupczak, Farruggio e Van Vliet (2024)²⁰.

1. Controllo ambientale: Utilizzare l'interfaccia grafica fornita dal microbioreatore per accedere e visualizzare i dati di ciascuno dei sensori integrati di un consumabile durante il periodo di coltura. Questi dati sono forniti nel software Breez Explorer, che viene installato nel portatile fornito insieme al microbioreatore.
2. Resa delle celle: Prelevare le MSC come descritto sopra e mettere le celle a 300 x g per 5 minuti. Rimuovere con cura il sovrantato e risospendere accuratamente la pellet cellulare in un volume appropriato di PBS o supporto hMSC (1-2 mL). Prendi un campione della miscela di cellule sospese e mescola con un volume uguale di colorante Trypan Blue. Micropipetta la miscela di campioni colorati in un chip di emocitometro e misura il numero e la vitalità cellulare su un emocitometro automatico o manuale.
3. Verifica l'espressione genica tramite la reazione a catena quantitativa della polimerasi inversa a due fasi come descritto di seguito.
   1. Purificazione dell'RNA: Usa un kit RNeasy Mini per isolare e purificare l'RNA da ogni campione seguendo le istruzioni del produttore. In breve, si lisano le cellule, si trasferisce il contenuto cellulare in un tubo di spin di purificazione e si lavano i campioni con ogni tampone per rimuovere componenti cellulari non necessari, acidi nucleici e proteine che potrebbero interferire con la successiva PCR.
   2. Conversione cDNA: Utilizzare un kit di trascrizione inversa ad alta capacità e un termociclatore per convertire l'RNA purificato in DNA complementare (cDNA) secondo le istruzioni del produttore. In breve, scongela i componenti del kit e crea un master mix combinando i componenti nei volumi appropriati per il numero di campioni. Carica parti uguali di RNA purificato e miscela master preparata (10 μL ciascuna) in ciascun pozzo di una piastra PCR, mantenendo la cura di tracciare le posizioni di ciascun campione identico. Segui il protocollo del produttore nel termociclatore per completare la reazione di trascrizione inversa.
   3. qPCR: Utilizzando primer specifici per la sequenza che coprono l'esone, validati per evitare il dimero dell'innesco, carica una piastra qPCR di 384 pozzi con primer diretto, primer inverso, cDNA del template, acqua senza nucleasi e miscela master in volumi appropriati (tipicamente, 1 μL, 1 μL, 1 μL, 7 μL, 10 μL, rispettivamente) utilizzando più pozzi di replicazione tecnica per ogni gene e campione. Dividere il contenuto su più piastre se necessario per catturare tutti i bersagli genici. Assicurarsi che tutti i campioni per un determinato gene target siano caricati sulla stessa lastra per evitare variabilità dei risultati, e che ogni lastra abbia un gene di mantenimento appropriato e controlli senza schemi. Misurare l'intensità di fluorescenza su una macchina qPCR appropriata e utilizzare il metodo ΔΔCt per la quantificazione relativa e calcolare l'espressione genica.

Results

Il microbioreattore ha permesso il monitoraggio e la regolazione dei fattori ambientali per circa 10 giorni in coltura. I fattori ambientali, tra cui pH (Figura 2A), temperatura (Figura 2B), ossigeno disciolto (Figura 2C) e anidride carbonica (Figura 2D), sono stati misurati e mantenuti con precisione nelle condizioni del microbioreatore...

Discussion

In questo protocollo viene descritto un metodo per espandere, primerare e prelevare le cellule utilizzando un approccio microtrasportatore-microbioreatore. Questo processo consente a cellule dipendenti dall'ancoraggio, come le MSC, di aumentare il numero cellulare sotto il controllo biochimico superiore di una piattaforma bioreattore (rispetto alle fiaschette TCPS convenzionali) su scala da laboratorio, adatto allo sviluppo rapido del processo. Inoltre, è stato dimostrato che la produzio...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soluzione antiaderente per risciacquo	Tecnologie Stemcell	7010
Cabina di biosicurezza
Microbioreattore Breez	MilliporeSigma
Centrifuga
Tubo conico, 15 mL
Tubo conico, 50 mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium, basso livello di glucosio	Gibco	11885084
Etanolo
Siero bovino fetale	Gibco	A5670701
Emocitometro
Nastro da laboratorio
Microcarrier
Tubo microcentrifuga, 1,5 mL
Microscopio
Ago, smussato, 4", calibro 18	Amazon	B0D663ZR6D
Soluzione salina tamponata con fosfato	Corning	21-040-CM
Pronase, da Streptomyces griseus	MilliporeSigma	10165921001
Pipetta sierologica, 10 mL	VWR	75816-100
Acqua sterile deionizzata
Filtro a siringa, 0,22 um, sterile	Prodotti scientifici Celltreat	229762
Siringa, 1 mL	BD	309628
Siringa, 20 mL	BD	302830
Siringa, 5 mL	BD	309646
Siringa, 50 mL	BD	309653
Fiaschetta di polistirene per coltura tissutale, T75	Thermo Fisher Scientific	130190
Trippan Blue	SigmaAldrich	T8154-100ML