Regolazione della transizione epiteliale-mesenchimale nel carcinoma ovarico da parte di LncRNA MALAT1 tramite SNAI2 e MiR-200c-3p

Sommario

Questo protocollo descrive i metodi per valutare il ruolo di MALAT1 nel promuovere la transizione epitelio-mesenchimale nel carcinoma ovarico epiteliale attraverso la sua regolazione dell'asse miR-200c-3p/SNAI2.

Abstract

L'RNA lungo non codificante MALAT1 regola la transizione epitelio-mesenchimale (EMT) e le metastasi nel carcinoma ovarico epiteliale (EOC) attraverso un meccanismo di RNA endogeno (ceRNA) in competizione che coinvolge la modulazione dei miRNA. Questo studio ha lo scopo di chiarire la via molecolare attraverso la quale MALAT1 influenza l'EMT e il comportamento metastatico attraverso l'interazione con miR-200c-3p e SNAI2. L'espressione di MALAT1 è stata manipolata geneticamente nella linea cellulare EOC SK-OV-3 mediante sovraespressione o knockdown. Gli effetti funzionali sui livelli di proteine correlate all'EMT, sulla migrazione cellulare e sull'invasione sono stati valutati utilizzando rispettivamente il Western blotting, la guarigione delle ferite e i saggi Transwell. L'analisi bioinformatica ha identificato il miR-200c-3p come bersaglio comune di MALAT1 e SNAI2. L'asse MALAT1/miR-200c-3p/SNAI2 è stato ulteriormente convalidato mediante saggi reporter a doppia luciferasi e colorazione in immunofluorescenza per confermare le interazioni molecolari dirette. La sovraespressione di MALAT1 ha aumentato la migrazione cellulare SK-OV-3 del 20% e l'invasione del 5%, accompagnata da un aumento significativo dell'espressione di SNAI2 (P < 0,01). Al contrario, il knockdown di MALAT1 ha soppresso questi fenotipi. I saggi della doppia luciferasi hanno confermato che il miR-200c-3p si lega direttamente sia a MALAT1 che a SNAI2 (P < 0,001). La sovraespressione di miR-200c-3p ha ridotto l'EMT guidata da MALAT1 sottoregolando SNAI2 (P < 0,05), mentre il ripristino di SNAI2 ha invertito gli effetti inibitori del silenziamento di MALAT1 sulle metastasi. Questo protocollo dimostra che MALAT1 promuove l'EMT e le metastasi nell'EOC funzionando come un ceRNA che sequestra il miR-200c-3p, portando alla derepressione di SNAI2. I risultati forniscono una nuova visione meccanicistica e identificano l'asse MALAT1/miR-200c-3p/SNAI2 come un potenziale bersaglio terapeutico per inibire le metastasi del cancro ovarico.

Introduzione

Il carcinoma ovarico (OvCa) è un tumore maligno altamente insidioso e diagnosticato tardivamente. Tipicamente progredisce in modo asintomatico fino a raggiungere stadi avanzati, caratterizzati da una crescita aggressiva principalmente all'interno della cavità peritoneale. Questo processo patologico si presenta tipicamente con ascite, ridotta risposta terapeutica e prognosi infausta¹. Le statistiche epidemiologiche del 2018 hanno rivelato circa 295.000 casi di nuova diagnosi in tutto il mondo, con 185.000 eventi di mortalità, riflettendo una traiettoria ascendente persistente del carico di malattia². Sebbene i moderni protocolli di trattamento incorporino l'intervento chirurgico e i regimi farmacologici, le persistenti limitazioni nella diagnosi precoce combinate con metastasi e resistenza terapeutica mantengono i tassi di sopravvivenza a lungo termine al di sotto del 45%³. La recidiva entro 12-18 mesi è comunemente osservata in molti pazienti con malattia avanzata⁴. Queste realtà cliniche sottolineano l'urgente necessità di identificare marcatori diagnostici clinicamente rilevanti e strategie di monitoraggio terapeutico. Pertanto, è prezioso per identificare marcatori diagnostici clinicamente rilevanti.

Attualmente, i ricercatori hanno scoperto che una parte sostanziale del genoma umano genera lunghi RNA non codificanti (lncRNA)⁵. Gli lncRNA non codificano proteine, esistono esclusivamente sotto forma di RNA e svolgono ruoli regolatori in varie funzioni biologiche delle cellule. Gli lncRNA mostrano non conservazione e mostrano pattern di espressione altamente tessuto-specifici⁶. In particolare, è stata osservata una sovraespressione specifica di lncRNA in più tessuti tumorali⁷. Il meccanismo dell'RNA endogeno (ceRNA) ha rivelato una nuova modalità di interazione con l'RNA. È ben noto che i microRNA (miRNA) possono silenziare i geni attraverso interazioni sequenza-specifiche con le regioni 3'non tradotte (UTR) dell'mRNA. Nel frattempo, gli RNA non codificanti (ncRNA) possono legarsi in modo competitivo ai miRNA, impedendo così la loro capacità di legarsi ai geni bersaglio e influenzando l'espressione genica⁸. Il meccanismo del ceRNA è attualmente l'ipotesi più ampiamente accettata per il ruolo regolatorio degli lncRNA. Il crosstalk tripartito tra trascritti codificanti, miRNA e RNA regolatori costruisce intricate reti molecolari che influenzano l'inizio e la progressione del tumore⁹.

Identificato per la prima volta nelle metastasi del carcinoma polmonare non a piccole cellule, MALAT1 è emerso come lncRNA ampiamente sovraespresso in numerose neoplasie maligne¹⁰. Nei nostri studi precedenti, abbiamo identificato un aumento dell'espressione di MALAT1 nei tessuti OvCa che si associa direttamente alla stadiazione¹¹ di OvCa. Qui presentiamo un protocollo per modulare geneticamente l'espressione di MALAT1 nella linea cellulare epiteliale OvCa (EOC) SK-OV-3 e valutare il suo impatto sull'espressione proteica correlata alla transizione epitelio-mesenchimale (EMT), sulla capacità migratoria e sul potenziale invasivo tramite saggi molecolari come qPCR, western blotting, saggi reporter a doppia luciferasi e saggi funzionali come saggi di guarigione delle ferite e saggi Transwell. L'obiettivo è quello di chiarire il meccanismo molecolare attraverso il quale MALAT1 regola l'EMT e la disseminazione metastatica nell'EOC attraverso interazioni con miR-200c-3p e SNAI2.

I metodi esistenti per lo studio delle interazioni lncRNA-miRNA spesso impiegano solo strumenti di previsione in silico , che potrebbero non essere convalidati sperimentalmente. Per gli studi di regolazione EMT, i metodi istologici tradizionali potrebbero non fornire informazioni molecolari dettagliate. Utilizzando saggi reporter a doppia luciferasi per la convalida sperimentale, il nostro studio supera queste limitazioni, offrendo una conferma più affidabile delle interazioni previste. Inoltre, la combinazione di più saggi funzionali, come i saggi scratch e Transwell, insieme alle tecniche molecolari, consente una comprensione completa dell'EMT sia a livello cellulare che molecolare, superando la profondità fornita dagli approcci a saggio singolo.

Protocollo

Coltura cellulare e trasfezione

La linea cellulare umana SK-OV-3 OvCa è stata coltivata in condizioni standard. Le cellule sono state mantenute in un terreno di coltura comprendente l'89% di 5A di McCoy, il 10% di siero fetale bovino e l'1% di soluzione di penicillina-streptomicina, in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO₂. Il terreno è stato sostituito ogni 2-3 giorni e le cellule sono state fatte passare al raggiungimento dell'80-90% di confluenza utilizzando lo 0,25% di tripsina-EDTA. I costrutti lentivirali per la sovraespressione di MALAT1 e il knockdown di MALAT1 (shRNA), così come i controlli mimici, inibitori e negativi del miR-200c-3p, insieme al siRNA mirato a SNAI2 e al corrispondente siRNA di controllo, sono stati ottenuti da fonti commerciali. Per la trasfezione, le cellule SK-OV-3 sono state seminate in piastre da 24 pozzetti a una densità di 5 × 10⁴ cellule/pozzetto in 500 μL di terreno completo e lasciate aderire durante la notte. Le trasfezioni sono state eseguite utilizzando un reagente di trasfezione a base lipidica (RRID: AB_2548650) secondo le istruzioni del produttore. In breve, gli acidi nucleici (miRNA imitatori/inibitori o siRNA) e un reagente di trasfezione a base di lipidi sono stati diluiti separatamente in terreno sierologico ridotto, incubati per 5 minuti, quindi mescolati insieme e incubati per altri 15 minuti a temperatura ambiente per consentire la complessazione. I complessi sono stati aggiunti goccia a goccia alle cellule. Dopo 6 ore, il terreno è stato sostituito con un terreno completo fresco. Le cellule sono state raccolte 24-48 ore dopo la trasfezione per le analisi a valle.

PCR quantitativa fluorescente in tempo reale (qPCR)

L'RNA totale è stato estratto da cellule SK-OV-3 in coltura utilizzando il reagente di estrazione dell'RNA secondo le istruzioni del produttore. In breve, le cellule sono state lisate in 1 mL di reagente per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e l'RNA è stato isolato utilizzando un kit di estrazione dell'RNA commerciale seguendo il protocollo fornito. La concentrazione e la purezza dell'RNA sono state determinate utilizzando uno spettrofotometro e per le applicazioni a valle sono stati utilizzati campioni con un rapporto A₂₆₀/A₂₈₀ compreso tra 1,8 e 2,0. La trascrizione inversa è stata eseguita utilizzando l'RT Master Mix (RRID: SCR_018597) con 500 ng di RNA totale in un volume di reazione di 20 μL. Le condizioni del ciclo termico erano le seguenti: 37 °C per 15 minuti, seguiti da 85 °C per 5 s per inattivare la trascrittasi inversa. Il cDNA risultante è stato conservato a -20 °C fino all'uso. La PCR quantitativa in tempo reale è stata condotta utilizzando un kit di rilevamento qRT-PCR miRNA commerciale su uno strumento di PCR in tempo reale. Ogni reazione è stata eseguita in un volume di 20 μl contenente 10 μl di 2x qPCR master mix, 1 μl di primer specifici (avanti e indietro, 10 μM), 2 μl di stampo di cDNA e 7 μl di acqua priva di RNasi. Le condizioni dei cicli termici erano: 95 °C per 10 min, seguiti da 40 cicli di 95 °C per 10 s e 60 °C per 30 s. L'analisi della curva di fusione è stata eseguita per verificare la specificità del prodotto. I livelli di espressione sono stati calcolati utilizzando il metodo ΔΔCt, con GAPDH (per l'mRNA) o U6 (per il miRNA) come controlli interni. Tutte le reazioni sono state eseguite in triplice copia e i dati sono presentati come media ± SD.
NOTA: Il reagente di estrazione dell'RNA è una sostanza chimica pericolosa. Deve essere maneggiato in una cappa aspirante in quanto è corrosivo e può causare irritazione alla pelle e agli occhi. I rifiuti contenenti il reagente devono essere smaltiti secondo le normative locali sullo smaltimento dei rifiuti pericolosi.

Saggio a graffio

Le cellule SK-OV-3 sono state seminate in piastre da 24 pozzetti a una densità di 5 × 10⁴ cellule/pozzetto e coltivate fino a raggiungere circa il 90-100% di confluenza, formando un monostrato uniforme. È stato quindi utilizzato un puntale per pipetta sterile da 10 μl per creare un graffio lineare attraverso il monostrato cellulare al centro di ciascun pozzetto. Per garantire la coerenza, durante la formazione dei graffi sono stati applicati lo stesso angolo e la stessa pressione in tutti i pozzetti. Dopo il graffio, è stato aggiunto il PBS per rimuovere le cellule staccate con due lavaggi delicati. Le cellule sono state quindi coltivate in terreno McCoy's 5A privo di siero per ridurre al minimo gli effetti della proliferazione. Le immagini dell'area di graffio sono state catturate immediatamente (0 h) e di nuovo a 24 h e 48 h utilizzando un microscopio invertito a 10x di ingrandimento. La larghezza del graffio in ogni punto temporale è stata misurata utilizzando il software ImageJ e la percentuale di chiusura della ferita rispetto alla larghezza iniziale utilizzata per calcolare il tasso di migrazione.

Saggio transwell

Le cellule SK-OV-3 sono state seminate nelle camere superiori degli inserti Transwell (la camera superiore contiene 200 μL di terreno completo all'1%, la camera inferiore contiene 1 mL di terreno completo al 5%) a una densità di 5 × 10³ cellule per inserto, incubate a 37 °C, 5% di CO₂ umidificato per 24 ore prima di ulteriori analisi. Dopo un'incubazione di 24 ore, gli inserti sono stati rimossi e lavati 3 volte con PBS, seguiti da fissazione in paraformaldeide al 4% (PFA) per 15 minuti. Dopo il lavaggio con PBS, le cellule sono state colorate con una soluzione di cristallovioletto all'1%. Dopo la colorazione, le cellule sono state risciacquate con PBS e osservate al microscopio invertito.
NOTA: Il cristallovioletto è una macchia biologica e può essere dannoso se ingerito o a contatto con la pelle. Devono essere maneggiati con cura e i rifiuti devono essere smaltiti correttamente secondo le normative locali.

Saggio reporter a doppia luciferasi

Le cellule trasfettate vengono incubate in condizioni di coltura standard (37 °C, 5% CO₂ ambiente umidificato) per 48 ore prima della lisi. Dopo 48 ore di incubazione, le cellule sono state lisate e centrifugate a 5.000 × g per 5 minuti a 4 °C. Un'aliquota di 50 μl del surnatante è stata trasferita in una piastra a 96 pozzetti, seguita dall'aggiunta sequenziale di 100 μl di reagente luciferasi lucciola e 100 μl di reagente luciferasi Renilla a ciascun pozzetto. Le attività della luciferasi Firefly e Renilla sono state misurate utilizzando il sistema di saggio Dual-Luciferase Reporter su un luminometro. L'attività della luciferasi Renilla è stata normalizzata all'attività della luciferasi Firefly per tenere conto delle variazioni nell'efficienza della trasfezione.

Saggio di immunofluorescenza

Le celle SK-OV-3 sono state fissate in PFA al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente e poi lavate 3 volte con PBS. Per bloccare il legame aspecifico, le cellule sono state incubate con siero di capra al 5% in PBS per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo il blocco, le cellule sono state incubate per una notte a 4 °C con anticorpi primari contro E-caderina (RRID: AB_2833860), N-caderina (RRID: AB_2837725) e Vimentina (RRID: AB_2835318), ciascuno diluito 1:200. Il giorno successivo, le cellule sono state lavate 3 volte con PBS e incubate con appropriati anticorpi secondari coniugati con fluorofori [anti-topo IgG-FITC (RRID: AB_2843438) e anti-coniglio IgG-FITC (RRID: AB_2843439)] diluiti 1:500 per 1 ora a 37 °C al buio.
NOTA: La paraformaldeide è tossica e potenzialmente cancerogena. Deve essere maneggiato con cura, indossando dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati come guanti e occhiali. I rifiuti contenenti PFA devono essere smaltiti come rifiuti pericolosi.

Analisi statistica

Per i confronti tra due gruppi, è stato utilizzato un test t e per i confronti di più gruppi è stata applicata l'ANOVA. I dati sono presentati come media ± SD. La significatività statistica è stata fissata a *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti con tre repliche biologiche (n = 3).

Risultati

Capacità migratorie e invasive di cellule SK-OV-3 modulate da MALAT1

Il flusso di lavoro sperimentale è descritto nella Figura 1. Per studiare il ruolo di MALAT1 nella migrazione e nell'invasione cellulare di OvCa, abbiamo modulato la sua espressione nelle cellule SK-OV-3. Dopo il knockdown di MALAT1, la qPCR ha confermato una significativ...

Discussione

L'OvCa, il quinto tumore ginecologico più importante, rimane una delle principali preoccupazioni per la salute delle donne². Tuttavia, la maggior parte dei casi viene identificata in stadi avanzati, il che limita significativamente le opzioni di trattamento efficaci, con conseguente miglioramento minimo dei tassi di sopravvivenza globale¹². Le metastasi tumorali si distinguono come uno dei principali fattori che contribuiscono alla mortalit...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,22 μ m Membrane in PVDF	Beyotime	FFP32
Kit di rilevamento qRT-PCR miRNA all-in-one	FulenGen	Pannello QP115
Albumina sierica bovina	Beyotime	ST025
Substrato di chemiluminescenza	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	TCH-C335
Substrato di chemiluminescenza	Millipore	WBKLS0100
Kit per il saggio del gene reporter a doppia luciferasi	beyotime	RG027
Siero fetale bovino	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	FBP-C550
IgG FITC anti-topo per capra	Affinità	S0007
IgG FITC anti-coniglio di capra	Affinità	S0008
Lipofectamina 2500	Guangzhou Yingxin Biotechnology Co., Ltd.	SJ-LIP-2500
Lentivirus da interferenza MALAT1	SHANGHAI GENECHEM Co., Ltd.	LV-MALAT1-sh
Lentivirus da sovraespressione MALAT1	SHANGHAI GENECHEM Co., Ltd.	LV-MALAT1-OE
5A di McCoy	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	GUMD-B305
miR-200c-3p mimico	SHANGHAI GENECHEM Co., Ltd.	MIC-HA-200C-3P
Analizzatore immunoenzimatico multifunzionale	Perkin Elmer	Immagina 2100
Soluzione di penicillina-streptomicina	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	GUSA-R002
Cocktail di inibitori della fosfatasi	GSbioth	GS1439A
Anticorpo primario E-caderina	Affinità	BF0219
Anticorpo primario N-caderina	Affinità	AF5239
Anticorpo primario Vimentina	Affinità	AF7013
PrimeScript RT Master Mix	Takara	RR036A
Sistema di rilevamento PCR in tempo reale	Bio-Rad	Pannello CFX96
Centrifuga refrigerata	Eppendorf	5810R
tampone di lisi RIPA	GSbioth	GS504A
Gel di poliacrilammide SDS	Beyotime	P0012A
Anticorpo secondario IgG di capra FITC	Affinità	S0007
Anticorpo secondario IgG di capra anti-coniglio FITC	Affinità	S0008
SiRNA SNAI2	Guangzhou Yingxin Biotechnology Co., Ltd.	si-ha-lumaca2
Database StarBase	Università Sun Yat-sen	http://starbase.sysu.edu.cn
Il kit per il dosaggio dei BCA	Dingguo Biotech	BCA02
L'incubatore per colture cellulari	Heraeus	Cella Hera 150
Il sistema di analisi per immagini	Bio-Rad	GEL DOC 1000
Il microscopio invertito	Scatto	MI152-N
Il kit per l'estrazione dell'RNA	ECOTOP	EK-1328-50T
Reagente TRIzol	Guangzhou Yingxin Biotechnology Co., Ltd.	T751379
Alimentatore universale per elettroforesi	wixscientific	WIX-EP600