Articolo metodologico

Migliorare il benessere dei gerbilli attraverso la formazione di rinforzo positivo in ambienti di ricerca

DOI:

10.3791/68657

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15 agosto 2025

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1Translational Animal Research Center, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz

In questo articolo

Sommario

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L'addestramento con il clicker serve come tecnica di rinforzo positivo per i gerbilli da laboratorio. Questo metodo mira a ridurre lo stress e migliorare l'efficienza della manipolazione attraverso il rinforzo positivo, contribuendo così al benessere degli animali da esperimento.

Abstract

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Migliorare il benessere degli animali da laboratorio riducendo al minimo lo stress e promuovendo una manipolazione adeguata alla specie è un obiettivo centrale della ricerca biomedica contemporanea in tutto il mondo. L'addestramento con il clicker, una forma ampiamente riconosciuta di addestramento di rinforzo positivo, utilizza un clic come rinforzo condizionato per collegare il comportamento desiderato e la ricompensa, consentendo agli animali di apprendere più rapidamente e con uno stress ridotto. Il nostro gruppo di ricerca ha precedentemente dimostrato che l'addestramento con il clicker funziona come una forma di arricchimento cognitivo nei topi e nei ratti. Nel presente studio, abbiamo adattato con successo questo approccio di addestramento per i gerbilli mongoli (Meriones unguiculatus), adattando il protocollo alle caratteristiche comportamentali specie-specifiche dei gerbilli. Una coorte di 43 gerbilli consanguinei (27 femmine e 16 maschi) è stata sottoposta a un protocollo standardizzato di addestramento clicker di 10 giorni, durante il quale hanno imparato ad avvicinarsi e interagire volontariamente con la mano dello sperimentatore in cambio di una ricompensa in cibo. Dopo il periodo di formazione, gli animali sono stati sottoposti a valutazioni comportamentali, tra cui un test in campo aperto e un test standardizzato di interazione umana, per valutare gli effetti dell'addestramento sul comportamento esplorativo e sull'interazione uomo-animale. I nostri risultati dimostrano che l'implementazione dell'addestramento con i clicker nei gerbilli è veloce, efficiente e ben tollerata. Gli animali addestrati, in particolare le femmine, hanno mostrato una maggiore interazione volontaria con la mano dello sperimentatore e una riduzione dei comportamenti ansiosi. Questi risultati suggeriscono che i protocolli di addestramento clicker adattati alla specie possono facilitare lo sviluppo della fiducia tra sperimentatore e animale, diminuendo in ultima analisi lo stress e migliorando sia il benessere degli animali che l'affidabilità dei risultati sperimentali.

Introduzione

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Affinare l'uso degli animali nella ricerca biomedica per ridurre lo stress e migliorare il benessere è un obiettivo internazionale ampiamente riconosciuto 1,2,3. Nel 2022, la Commissione europea ha riferito che degli 838.539 animali utilizzati nell'Unione europea (Alures), 3.440 erano gerbilli4. In Germania, nel 2023 circa 1,46 milioni di vertebrati e cefalopodi sono stati utilizzati in esperimenti sugli animali ai sensi della sezione 7 (2) della legge sul benessere degli animali (TierSchG)5. In combinazione con gli animali abbattuti per scopi scientifici, il numero totale di animali da laboratorio utilizzati in Germania nel 2023 ha raggiunto circa 2,1 milioni6. Questi numeri evidenziano l'importanza dell'utilizzo dei gerbilli nella ricerca biomedica, sottolineando la necessità di continui miglioramenti nei protocolli per il benessere degli animali.

Le esigenze comportamentali degli animali da laboratorio e l'importanza di strategie di gestione che supportino il benessere specie-specifico sono state ampiamente riconosciute come essenziali per la pratica etica e scientifica7. Le interazioni uomo-animale nell'allevamento sono spesso limitate al compito essenziale di trasferire gli animali da gabbie sporche a gabbie pulite, senza favorire un legame tra il conduttore e l'animale. Questa mancanza di interazione sociale può portare allo stress, che influisce negativamente sul comportamento e sulla fisiologia degli animali, influenzando in ultima analisi i risultati sperimentali8. La manipolazione impropria è una nota fonte di variabilità nei dati della ricerca9. Ad esempio, sollevare i topi per la coda aumenta l'ansia e lo stress, mentre i metodi a tunnel o a mano aperta promuovono un approccio volontario e riducono il comportamento ansioso10,11. La manipolazione è anche utilizzata come fattore di stress acuto standardizzato negli studi sui piccoli mammiferi a causa dei suoi effetti costanti su marcatori fisiologici come i livelli di glucocorticoidi12. Questi risultati evidenziano l'impatto sostanziale delle brevi interazioni umane e la necessità di tecniche di manipolazione raffinate e a basso stress13.

Il perfezionamento basato sulla formazione ha ottenuto un crescente riconoscimento come metodo efficace per migliorare sia il benessere degli animali che la qualità della ricerca10,14. Uno dei metodi di addestramento più efficaci utilizzati nella ricerca sugli animali è l'addestramento con clicker, che è spesso abbinato a ricompense alimentari15,16. Negli ultimi decenni sono stati pubblicati 34 studi sull'addestramento con i clicker, a testimonianza del crescente interesse scientifico per questo approccio formativo17. Gli studi dimostrano che i cani (47%) e i cavalli (30%) sono gli animali da laboratorio più comunemente addestrati, seguiti da gatti, bovini, pesci, capre e scimmie (ciascuno 3%)17. Gli animali addestrati possono partecipare volontariamente alle procedure, riducendo lo stress e minimizzando la necessità di contenzione fisica18.

Protocolli di rinforzo positivo sono stati applicati anche ai piccoli mammiferi. Studi recenti riportano un addestramento di successo nei conigli per le procedure di allevamento e nei gerbilli per la ricerca comportamentale19,20. In alcuni lavori precedenti, abbiamo dimostrato che i topi addestrati con il clicker mostravano un maggiore contatto con gli sperimentatori e un minor numero di indicatori comportamentali associati allo stress, come minzione, defecazione, vocalizzazione e comportamento fluttuante 21,22,23. Ciò è coerente con i risultati del campo veterinario, dove l'addestramento di piccoli mammiferi - come conigli, roditori e furetti - ha dimostrato di ridurre le risposte alla paura e facilitare la manipolazione attraverso tecniche di rinforzo positivo24. In particolare, abbiamo anche osservato una differenza specifica per sesso nelle prestazioni di allenamento: le femmine di topo hanno mostrato una maggiore motivazione e una maggiore frequenza di risposta rispetto ai maschi durante le sessioni di allenamento. Ciò suggerisce che i topi femmina possono impegnarsi più facilmente in compiti di addestramento volontario in condizioni standardizzate21.

Sebbene promettenti, gli approcci di addestramento esistenti per i gerbilli sono tipicamente legati a specifici paradigmi comportamentali e non progettati per l'uso generale nelle routine quotidianedi allevamento 25. Non è ancora stato stabilito un protocollo standardizzato ampiamente applicabile per i gerbilli della Mongolia (Meriones unguiculatus), indipendente da una particolare configurazione sperimentale. Per colmare questa lacuna, il presente studio mirava a sviluppare e convalidare un semplice protocollo di addestramento con clicker su misura per le caratteristiche specie-specifiche dei gerbilli. Il protocollo si concentra sulla riduzione dello stress attraverso una manipolazione delicata e un coinvolgimento volontario con lo sperimentatore. Ipotizziamo che questo approccio migliorerà il benessere degli animali, stabilirà linee di base comportamentali più coerenti e aumenterà l'affidabilità dei risultati sperimentali. Grazie alla sua semplicità e flessibilità, può essere facilmente implementato in un'ampia gamma di ambienti di laboratorio.

Per valutare l'efficacia e l'applicabilità del protocollo di formazione proposto, abbiamo formulato le seguenti previsioni specifiche e verificabili:
I gerbilli addestrati eseguirebbero in modo affidabile il comportamento target – sedendosi volontariamente sulla mano dello sperimentatore – entro un periodo di addestramento di 10 giorni.
Gli animali addestrati mostrerebbero una maggiore interazione volontaria con lo sperimentatore in un test standardizzato, rispetto ai controlli non addestrati.
Gli animali addestrati mostrerebbero indicatori comportamentali coerenti con un comportamento simile all'ansia ridotto, in particolare trascorrendo più tempo nella zona centrale di un test in campo aperto.
Le femmine di gerbillo potrebbero mostrare risposte comportamentali più forti all'addestramento rispetto ai maschi, riflettendo potenzialmente le differenze di sesso nell'adattamento all'interazione umana.
Queste previsioni hanno guidato la progettazione delle valutazioni comportamentali e hanno informato i criteri di valutazione per il protocollo.

Protocollo

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La manipolazione dei gerbilli e le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con le linee guida europee, nazionali e istituzionali per la cura degli animali. Approvato dalla licenza delle autorità locali G 21-1-100. Il protocollo prevede 10 giorni di allenamento (dal lunedì al venerdì), con pause nei fine settimana (sabato e domenica). Il protocollo può essere facilmente adattato per soddisfare esigenze specifiche. Tutti i materiali necessari sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione degli animali

  1. Ottenere il numero richiesto di animali dalla struttura di allevamento istituzionale. Mantenere gli animali sotto un ciclo luce/buio di 12 ore in un sistema di stabulazione aperto.
  2. Svezzare la prole a 5 settimane di età. Marchiare gli animali dopo lo svezzamento e alloggiarli in gruppi dello stesso sesso di 2-3 individui per gabbia.
  3. Posteriore e alloggiare tutti i gerbilli in gabbie di tipo 4 (590 x 380 x 200 mm; 1.815 m2). Equipaggia ogni gabbia con almeno tre tunnel e mastica la legna per arricchirla. Fornire cibo e acqua ad libitum (vedi Tabella dei Materiali).
  4. Assegnare in modo casuale gli animali a gruppi addestrati (femmine: n=27; maschi: n=16) e non addestrati (femmine: n=16; maschi: n=5) per ridurre al minimo i bias di selezione e garantire condizioni di base comparabili tra i trattamenti. Abituare gli animali sia alla ricompensa alimentare che alla mano dello sperimentatore all'interno dell'ambiente della gabbia di riproduzione, come descritto nel passaggio 2.2. del protocollo. All'inizio dell'addestramento, gli animali (femmine e maschi) avevano circa 8 settimane di età.

2. Assuefazione animale

NOTA: Se i gerbilli non sono stati trasportati, il tempo di assuefazione può essere ridotto. La panoramica grafica del protocollo è illustrata nella Figura 1. Negli animali allevati in casa, il periodo di assuefazione per i giovani può essere drasticamente ridotto se gli animali genitori sono ben abituati e l'abitudine manuale viene continuata almeno una volta alla settimana dal momento in cui i cuccioli diventano mobili. Questa fase preparatoria è progettata per ridurre la neofobia e stabilire un'associazione positiva con la manipolazione degli alimenti, garantendo una transizione graduale all'addestramento basato sul clicker.

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Figura 1: Panoramica del protocollo di assuefazione e addestramento per animali di provenienza esterna e allevati internamente: questa figura delinea la tempistica e le fasi procedurali chiave del protocollo di assuefazione e addestramento utilizzato per i gerbilli di provenienza esterna e i gerbilli allevati internamente. Il protocollo include la manipolazione iniziale, l'assuefazione al cibo, l'introduzione del clicker e l'addestramento del clicker, regolato in base all'origine e alla pre-esposizione degli animali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Settimana 1: Assuefazione per gli animali di provenienza esterna
    1. All'arrivo, ospita i gerbilli in gruppi dello stesso sesso di 2-3 animali per gabbia. Aggiungi materiale per il nido e la lettiera dalla scatola di trasporto, insieme a una piccola quantità di pellet di cibo familiare per supportare l'acclimatazione.
    2. Dotare ogni gabbia di almeno 3-4 tunnel (ad esempio, tubi di cartone o ripari di plastica) e riempire la lettiera fino a una profondità di circa 8-10 cm per consentire un comportamento di scavo tipico della specie.
    3. Evitare di sollevare i gerbilli per la coda, in quanto ciò può causare stress e rischiare lesioni alla coda26. Utilizzare invece una manipolazione a coppa per trasferire delicatamente gli animali quando necessario (vedere la Figura 2A).
    4. Iniziare immediatamente l'assuefazione alimentare spargendo ~5 g di semi di zucca o di girasole nella lettiera (vedi Tabella dei materiali). Questo incoraggia lo scavo e familiarizza gli animali con la ricompensa.
    5. Il giorno seguente, introduci una mano contenente ~10 semi di ricompensa nella gabbia per 2-3 minuti. Se gli animali non prendono direttamente i semi, metti ~5 g di semi nella lettiera.
    6. Ripetere questa procedura una volta al giorno fino a quando gli animali non prendono il cibo dalla mano. Questo di solito richiede circa una settimana. Se l'operazione ha avuto esito positivo in precedenza, procedere con l'addestramento con il clicker (vedere il passaggio 3).
    7. Durante l'assuefazione, valuta le preferenze alimentari offrendo diversi tipi di semi in mano e contando i semi rimanenti dopo 2-3 minuti.
      NOTA: Fornisci cibo in piccole porzioni esclusivamente come ricompensa per rafforzare il comportamento desiderato. Assicurarsi che la ricompensa alimentare sia conforme alle linee guida nutrizionali per gli animali da laboratorio. Sebbene questo protocollo utilizzi semi di zucca e girasole, altri premi adatti possono essere utilizzati se soddisfano i requisiti di igiene della struttura. Sono accettabili anche i bocconcini disponibili in commercio progettati per animali da laboratorio.
  2. Settimana 1: Assuefazione per gli animali allevati in casa
    1. Iniziare l'abitudine alla ricompensa alimentare direttamente nella gabbia di riproduzione mettendo ~5 g di semi di zucca o di girasole nella lettiera, come descritto nel passaggio 2.1.3. Questo passaggio dovrebbe essere iniziato con la coppia riproduttiva prima del parto per stabilire familiarità con la ricompensa.
    2. Una volta che gli animali da riproduzione consumano in modo affidabile i semi dalla lettiera, offri la ricompensa dalla mano dello sperimentatore seguendo la procedura descritta nel passaggio 2.1.4. Consenti agli animali di esplorare e prendi la ricompensa volontariamente per 2-3 minuti al giorno.
    3. Dopo che la femmina ha partorito, sospendere l'assuefazione manuale per un minimo di 1 settimana. Durante questo periodo, continua a fornire ricompense alimentari direttamente nella lettiera della gabbia 1-5 volte a settimana per mantenere l'esposizione.
    4. Riprendere l'assuefazione alle mani una volta che i cuccioli diventano mobili (circa il giorno 18-21 dopo il parto). Consenti agli animali di esplorare la mano con una ricompensa per 2-3 minuti per sessione. Ciò favorisce la familiarizzazione precoce della prole con il contesto di addestramento.
    5. A 5 settimane di età, svezzare i giovani e alloggiarli in gruppi dello stesso sesso di 2-3 animali per gabbia. Continua l'assuefazione mettendo la ricompensa alimentare nella nuova lettiera della gabbia il giorno del trasferimento.
    6. Il giorno successivo allo svezzamento, reintrodurre la somministrazione manuale di cibo come descritto sopra (fasi 2.1.4 e 2.1.5).
    7. Ripetere questa procedura una volta al giorno fino a quando gli animali non prendono il cibo dalla mano.
    8. Una volta che i giovani prendono la ricompensa in modo coerente dalla mano, procedi con il protocollo di addestramento (vedi passaggio 3). Questo di solito richiede circa 1 settimana. Se l'operazione ha avuto esito positivo in precedenza, procedere con l'addestramento con il clicker (vedere il passaggio 3).

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Figura 2: Manipolazione e assuefazione di un gerbillo utilizzando il rinforzo positivo. (A) Manipolazione a coppa di un gerbillo: un gerbillo viene raccolto delicatamente con entrambe le mani in modo a coppa per ridurre al minimo lo stress. (B) Inizio dell'addestramento: La mano dello sperimentatore viene posta sul pavimento della gabbia con le ricompense alimentari nel palmo. Il gerbillo riceve una ricompensa e un clic viene utilizzato per contrassegnare il comportamento. (C) Il gerbillo si siede volontariamente sulla mano dello sperimentatore, indicando un addestramento riuscito. La ricompensa in cibo è visibilmente posizionata sul palmo della mano. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Addestramento con clicker

NOTA: Iniziare l'addestramento solo se il gerbillo accetta il cibo dalla mano dello sperimentatore. In caso contrario, prolungare la fase di assuefazione al cibo oltre la durata descritta al punto 2.1. o 2.2.

  1. Panoramica della formazione
    1. Condurre una sessione di allenamento per gerbillo al giorno, ciascuna della durata di 4 minuti. Conduci l'addestramento direttamente nella gabbia di casa dell'animale per ridurre lo stress e mantenere un ambiente familiare. Non è necessario rimuovere tutti gli elementi di arricchimento, ma assicurarsi che almeno un tubo o un tunnel rimanga nella gabbia e che ci sia spazio sufficiente per la mano dello sperimentatore sul pavimento della gabbia.
      NOTA: Idealmente, la formazione dovrebbe essere condotta in una sala relax dedicata. Se ciò non è fattibile, può essere utilizzato un armadio insonorizzato all'interno della struttura per animali, a condizione che riduca efficacemente l'esposizione al rumore e ai disturbi ambientali.
    2. Per evitare che i segnali uditivi diventino variabili confondenti, evita rigorosamente la comunicazione verbale o i suoni vocali durante le sessioni di allenamento. Limitare qualsiasi interazione vocale con gli animali a periodi al di fuori del contesto di addestramento.
    3. Utilizzare la ripetizione del comportamento target (ad esempio, sedersi volontariamente sulla mano dello sperimentatore) come indicatore pratico del successo dell'assuefazione e dell'apprendimento durante l'allenamento. Considera l'allenamento di successo quando questo comportamento viene osservato almeno 5 volte per sessione per tre giorni consecutivi (vedi passaggio 3.4.4).
  2. Preparazione all'allenamento
    1. Prepara tutti i materiali necessari: taglia i semi di girasole a metà o i semi di zucca in terzi come ricompensa. Fornisci un clicker a pedale, un'app timer che utilizza segnali di colore (nessun suono) o qualsiasi altro timer silenzioso (digitale o analogico) e una gabbia secondaria pulita (vedi Tabella dei materiali).
    2. Sposta la gabbia di casa in un'area tranquilla e priva di distrazioni dove si svolgerà l'allenamento per ridurre al minimo i fattori di stress ambientale. Evita rumori improvvisi o forti come parlare, sbattere la porta o suoni dell'attrezzatura durante la sessione, poiché i gerbilli sono molto sensibili agli stimoli uditivi.
    3. Rimuovere tutti gli elementi di arricchimento ad eccezione di un tunnel. Assicurarsi che il tunnel rimanente non ostruisca l'accesso all'area di addestramento. Assicurati che ci sia spazio sufficiente per ospitare una mano.
    4. Trasferisci qualsiasi animale da compagnia nella gabbia secondaria pulita, inclusa una piccola quantità di lettiera domestica e arricchimento per ridurre lo stress durante la separazione.
    5. Posizionare il foot clicker (un dispositivo meccanico che produce un suono di clic quando viene premuto con il piede; vedere Tabella dei materiali) sotto il tavolo o la superficie di allenamento. Ciò consente all'addestratore di marcare il comportamento desiderato senza usare le mani, garantendo un tempismo coerente mantenendo entrambe le mani disponibili per interagire con l'animale.
  3. Giorno di formazione 1-5: Introduzione al clicker
    1. Avvia il timer: tocca Avvia nell'app o premi il pulsante sul timer silenzioso.
    2. Stare in piedi o sedersi davanti alla gabbia. Metti cinque pezzi del seme selezionato nel palmo della mano e appoggia la mano sul substrato in un angolo della gabbia.
    3. Fare clic nel momento in cui il gerbillo prende un seme dalla mano (Figura 2B). Se vengono prelevati più semi in sequenza, fare clic dopo ciascuno di essi. Usa il suono del clic per associare la ricompensa del cibo al comportamento di alimentazione dalla mano.
    4. Termina l'addestramento quando l'animale esegue il comportamento desiderato 5 volte o quando il timer raggiunge lo zero (dopo 4 minuti).
    5. A partire dal giorno 3, a seconda del comportamento del gerbillo, inizia a offrire i semi uno alla volta. Tenere la mano appena sopra il pavimento della gabbia per incoraggiare l'animale ad allungarsi o a fare un breve contatto con le zampe anteriori (Figura 2C). Questo aiuta a modellare il comportamento gradualmente e prepara l'animale per la fase di addestramento successiva (vedi passaggio 3.4).
  4. Giorni di allenamento 6-10
    NOTA: Suggerimento per l'addestramento opzionale: se un gerbillo è riluttante a salire sulla mano, suddividi il compito in passaggi più piccoli che aumentano la fiducia. Innanzitutto, rafforza il comportamento di toccare la mano prima di aspettarti che l'animale si arrampichi. Usa questa strategia di modellatura per ridurre lo stress e sostenere gli animali che richiedono più tempo per abituarsi alla manipolazione.
    1. Offri un solo seme alla volta. Tieni la mano leggermente sollevata sopra il substrato per incoraggiare il gerbillo a salire completamente sulla mano per accedere alla ricompensa. Questo passaggio si basa sul processo di shaping precedente e rappresenta la transizione al comportamento di destinazione finale.
    2. Una volta che il gerbillo si arrampica costantemente sulla mano, fai clic per rafforzare il comportamento. Inizia a offrire il seme usando la tua seconda mano (vedi Figura 3). Mantieni la mano da allenamento sopra il pavimento della gabbia in modo che il gerbillo debba arrampicarsi completamente su di essa. Usa una mano per tenere il seme tra il pollice e l'indice (Figura 3A) o usa una mano per presentare la ricompensa sopra il palmo dell'altra mano, su cui l'animale è incoraggiato a salire (Figura 3B).
    3. Valuta il successo dell'allenamento poiché il gerbillo si siede volontariamente sulla mano dello sperimentatore 5 volte per sessione e accetta la ricompensa dal palmo della mano o dalla seconda mano.
    4. Concludere l'allenamento dopo una durata massima di 3 settimane (5 giorni alla settimana) o quando l'obiettivo di allenamento è costantemente dimostrato per un periodo di 3 giorni consecutivi.
      NOTA: Sebbene il protocollo definisca una fase di allenamento strutturata fino a 3 settimane, le sessioni di rinforzo possono essere continuate oltre questo periodo, se necessario, in particolare quando è previsto un ritardo tra la fine dell'allenamento e l'inizio delle procedure sperimentali. Il rinforzo positivo continuo può aiutare a mantenere il comportamento appreso e garantire l'affidabilità nel tempo. Si consiglia di continuare il rinforzo una volta alla settimana dopo aver completato con successo la fase di formazione. Tuttavia, per garantire la coerenza e la comparabilità tra gli animali, prima di passare alle attività sperimentali dovrebbe essere documentato un chiaro punto finale dell'addestramento, definito dalle prestazioni stabili e ripetute del comportamento target.

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Figura 3: Esempi di posizionamento della mano durante la consegna della ricompensa. (A) La ricompensa viene tenuta tra il pollice e l'indice della stessa mano, mentre l'animale siede sul palmo. (B) La ricompensa viene tenuta con il secondo e l'indice, mentre l'animale siede sul palmo dell'altra mano. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Conduzione di test comportamentali dopo l'allenamento (giorno 10+)

  1. Test di interazione
    NOTA: Variabili dipendenti: La variabile dipendente primaria è la durata dell'interazione volontaria tra l'animale e la mano dello sperimentatore durante il secondo minuto del test. L'interazione è definita come il contatto fisico diretto, come annusare, arrampicarsi o toccare la mano con le zampe anteriori10. Il punteggio comportamentale si basa su registrazioni video e può essere eseguito manualmente o utilizzando un software di analisi comportamentale.
    1. Posizionare una telecamera montata su un treppiede sopra il tavolo dove verrà condotto il test di interazione.
    2. Se gli animali sono alloggiati in gruppi, trasferirli in una gabbia secondaria pulita contenente una manciata di lettiere dalla gabbia di casa.
    3. Rimuovi tutti i tunnel o i rifugi dalla gabbia domestica e mettili nella gabbia pulita. Lasciare solo la lettiera nella gabbia di prova (=gabbia di casa). Posiziona la gabbia di casa, che ora contiene solo lettiera, sotto la telecamera.
    4. Utilizzare la manipolazione a coppa per riportare delicatamente l'animale di prova nella gabbia di casa.
    5. Avvia la registrazione. Rimanere fermi davanti alla gabbia per 1 minuto. Dopo 1 minuto, posizionare una mano guantata all'interno della gabbia vicino al bordo anteriore per un altro 1 minuto.
    6. Cambia i guanti tra animali di sesso diverso.
  2. Test in campo aperto
    NOTA: Variabili dipendenti: le variabili misurate includono la distanza totale percorsa, il tempo trascorso nella zona centrale rispetto alla periferia, il numero di ingressi al centro e gli eventi di allevamento. Questi indicatori riflettono l'attività locomotoria generale e il comportamento ansioso. L'aumento del tempo centrale è tipicamente interpretato come una riduzione dell'ansia. Il comportamento viene registrato tramite video e analizzato utilizzando un software di tracciamento automatizzato (vedi Tabella dei materiali).
    1. Posiziona una telecamera sopra l'arena in campo aperto (100 cm x 100 cm x 40 cm).
    2. Avvia la registrazione video, quindi posiziona delicatamente l'animale al centro dell'arena usando la manipolazione a coppa. Registra il comportamento per 7 min.
    3. Dopo il test, riporta l'animale nella sua gabbia di casa. Pulisci la scatola del campo aperto e le pareti con etanolo al 70% dopo ogni animale. Attendi che l'etanolo sia completamente evaporato prima di posizionare l'animale successivo nell'arena.

5. Analisi statistica

  1. Sebbene l'accecamento completo dello sperimentatore non fosse fattibile durante le sessioni di addestramento a causa della natura dell'interazione diretta con gli animali, eseguire l'analisi dei dati comportamentali in cieco per ridurre la distorsione dell'osservatore.
  2. Sia per le prove di interazione che per quelle in campo aperto, registrare tutte le sessioni in video. Raccogli le variabili dipendenti manualmente da osservatori addestrati (test di interazione) o automaticamente utilizzando un software di analisi comportamentale (vedi Tabella dei materiali) per registrazioni in campo aperto (tempo trascorso nella zona centrale).
  3. Prima dell'analisi statistica, testare tutti i dati per la distribuzione normale utilizzando il test di Shapiro-Wilk. Identifica i valori anomali ed escludi utilizzando il metodo di regressione robusta e rimozione dei valori anomali (ROUT) con un tasso di falsi riscontri (Q) impostato al 10%. Per analizzare gli effetti dell'allenamento e del sesso sui risultati comportamentali, condurre un'ANOVA a misure ripetute a due vie per il test di interazione e un'ANOVA mista a due vie per valutare il tempo trascorso al centro del test in campo aperto.
  4. Classificare il test di interazione e il tempo cumulativo trascorso nella zona centrale del campo aperto come le principali variabili dipendenti. Conduci confronti post hoc utilizzando il test Honest Significant Difference (HSD) di Tukey. Un valore p di < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando software statistici (vedi Tabella dei materiali).

Risultati

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Tutti i gerbilli addestrati hanno imparato il compito assegnato entro 10 giorni, dimostrando la fattibilità dell'addestramento con il clicker in questa specie. La Figura 4 presenta il successo dell'addestramento di gerbilli femmine (n=27) e maschi (n=16) dal giorno 1 al giorno 10. L'ANOVA a misure ripetute che ha analizzato le prestazioni nel giorno di allenamento 1 rispetto al giorno 10 nei gerbilli maschi e femmine non ha rivelato alcun effetto significativo di interazione tra tempo e sesso (F(1, 41) = 0,003; p = 0,955), indicando che il miglioramento nel tempo era simile per entrambi i sessi. È stato osservato un effetto molto significativo del tempo (F(1, 41) = 38,83, p < 0,0001), dimostrando che i gerbilli di entrambi i sessi hanno pienamente rispettato il protocollo di allenamento entro il decimo giorno.

Il fatto che i gerbilli addestrati abbiano adempiuto al compito loro assegnato entro 10 giorni convalida l'efficacia della metodologia di addestramento con clicker in questa specie. Questo tasso di successo si allinea con i principi fondamentali del condizionamento operante, in cui il clicker funziona come un rinforzo secondario che colma il divario tra il comportamento desiderato e la ricompensa primaria (semi di girasole/zucca). Il clicker funge da ponte tra il comportamento e la ricompensa, consentendo all'addestratore di segnare il momento esatto in cui si verifica il comportamento desiderato con un tempismo preciso. Questo aiuta a creare un'associazione chiara e immediata tra l'azione e la sua conseguenza positiva.

I test comportamentali sono stati condotti dopo il completamento del protocollo di formazione, in particolare dopo il 10° giorno di formazione. L'analisi ANOVA mista a due vie ha mostrato che i gerbilli addestrati aumentavano l'interazione volontaria con la mano dello sperimentatore (Figura 5A). È stato rilevato un effetto significativo dell'addestramento (F (1, 60) = 22,89; p < 0,0001), con animali addestrati che si impegnavano più frequentemente con lo sperimentatore. L'analisi post hoc ha rivelato le differenze specifiche dell'allenamento nelle femmine (p < 0,0001, n = 27) e nei maschi (p = 0,049, n = 16). L'effetto del sesso non è stato osservato (F(1, 60) = 0,621, p = 0,434), suggerendo che i gerbilli maschi e femmine si sono comportati in modo simile nel complesso. L'analisi non ha rivelato alcuna interazione significativa tra sesso e allenamento (F(1, 60) = 0,078, p = 0,781).

L'aumento dell'interazione volontaria da parte dei gerbilli indica che l'addestramento con i clicker ha ridotto efficacemente le risposte innate alla paura attraverso il rinforzo positivo. Ciò può aiutare a ridurre al minimo lo stress durante la manipolazione e le procedure sperimentali, migliorando sia il benessere degli animali che la qualità dei dati.

Una valutazione del comportamento ansioso post-allenamento è stata effettuata utilizzando il test in campo aperto. La Figura 5B illustra la durata cumulativa trascorsa nella zona centrale. Nessuna interazione tra sesso e allenamento è stata osservata nella durata cumulativa nella zona centrale del test in campo aperto (F(1, 60) = 0,101, p = 0,751). Inoltre, non è stato riscontrato alcun effetto principale significativo del sesso (F(1, 60) = 0,001, p = 0,969. È stato osservato un effetto principale molto significativo dell'allenamento (F(1, 60) = 17,26, p < 0,0001; Test HSD di Tukey: p = 0,003 e p = 0,052 rispettivamente nelle femmine e nei maschi), indicando che i gerbilli addestrati trascorrevano significativamente più tempo al centro rispetto a quelli non addestrati. Questi risultati riflettono le risposte comportamentali misurate dopo che gli animali avevano completato il periodo di addestramento di 10 giorni.

L'OFT sfrutta il naturale conflitto di approccio-evitamento che i roditori sperimentano quando esplorano nuovi ambienti27. I gerbilli possono bilanciare la loro innata spinta all'esplorazione con la loro naturale tendenza ad evitare spazi aperti potenzialmente pericolosi. Pertanto, il fatto che i gerbilli addestrati trascorressero più tempo nella zona centrale ansiogena indica che l'addestramento con il clicker ha migliorato la loro volontà comportamentale generale di esplorazione, il che può indicare miglioramenti nel benessere generale.

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Figura 4: Convalida dell'addestramento dei clicker. Successo dell'allenamento il giorno 1 rispetto al giorno 10 per soggetti maschi e femmine: il successo dell'allenamento è stato valutato in gerbilli femmine (barre bianche, n = 27) e maschi (barre grigie, n = 16) il giorno 1 e il giorno 10 del protocollo di allenamento. Un'ANOVA a misure ripetute a due vie ha rivelato un effetto principale significativo del giorno di allenamento (p < 0,0001). Confronti multipli utilizzando il test HSD di Tukey hanno mostrato un aumento significativo del successo dell'allenamento dal giorno 1 al giorno 10 sia nelle femmine (p < 0,0001, n = 27) che nei maschi (p < 0,0001, n = 16). I dati sono presentati come media ± SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Valutazione comportamentale. (A) Test di interazione: La durata dell'interazione con la mano dello sperimentatore (in s) è stata misurata in gerbilli femmine e maschi addestrati (barre grigie) e non addestrati (barre bianche) dopo che gli animali avevano completato il periodo di addestramento di 10 giorni. L'ANOVA mista bidirezionale ha rivelato un effetto principale significativo dell'allenamento (p < 0,05) e un significativo effetto di interazione (p < 0,05). L'analisi post hoc utilizzando il test HSD di Tukey ha mostrato che i topi addestrati interagivano significativamente più a lungo con la mano dello sperimentatore rispetto ai topi non addestrati (femmine: p < 0,0001, maschi: p = 0,0497). I dati sono presentati come media ± SD. Femmine addestrate: n= 27; femmine non addestrate: n =16; maschi addestrati: n = 16; Maschi non addestrati: n = 5. (B) Test in campo aperto: il test è stato condotto dopo il completamento del protocollo di allenamento, in particolare dopo il 10° giorno di allenamento. La durata cumulativa trascorsa nella/e zona/e centrale/i è stata misurata in gerbilli femmine e maschi addestrati (barre grigie) e non addestrati (barre bianche). È stata eseguita un'ANOVA mista a due vie per analizzare gli effetti dell'addestramento sull'esplorazione della zona centrale. Confronti multipli utilizzando il test HSD di Tukey hanno rivelato che le femmine addestrate trascorrevano significativamente più tempo nella zona centrale rispetto alle femmine non addestrate (p = 0,003). I dati sono presentati come media ± SD. Femmine addestrate: n= 27; femmine non addestrate: n =16; maschi addestrati: n = 16; Maschi non addestrati: n = 5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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I risultati mostrano l'efficacia del protocollo proposto per abituare i gerbilli all'interazione umana in ambienti sperimentali. La capacità di tutti gli animali addestrati di completare il compito desiderato entro 10 giorni evidenzia l'efficienza di questo metodo.

Un passaggio critico del protocollo è l'assuefazione graduale alla mano dello sperimentatore, assicurando che i gerbilli associno l'interazione umana a uno stimolo positivo. L'uso di ricompense specie-specifiche ottimizza ulteriormente il processo di addestramento. Modifiche, come la regolazione della durata delle sessioni di allenamento o la modifica del tipo di ricompensa, potrebbero adattare ulteriormente il protocollo alle differenze individuali tra i gerbilli e ottimizzarlo per i requisiti specifici dell'esperimento.

Ci concentriamo sulle notevoli differenze specie-specifiche nel comportamento e nelle dinamiche di apprendimento tra topi e gerbilli della Mongolia. Tali differenze dovrebbero essere prese in considerazione quando si progettano protocolli di formazione. Ad esempio, i topi tendono ad essere più neofobici e sensibili allo stress, spesso richiedendo più tempo per abituarsi a nuovi ambienti e all'interazione umana28. Al contrario, i gerbilli mostrano una maggiore spinta esplorativa e curiosità sociale, che possono facilitare un coinvolgimento più rapido con le attività di formazione29. Nel presente studio, i gerbilli si sono avvicinati prontamente alla mano dello sperimentatore e hanno imparato ad associare il clicker a una ricompensa in meno sessioni di quanto riportato tipicamente per i topi21,22. Tuttavia, i gerbilli hanno anche mostrato una maggiore variabilità individuale, in particolare nei maschi, che può riflettere lo stress specifico del sesso o fattori motivazionali meno pronunciati nei modelli murini. Queste distinzioni evidenziano l'importanza di strategie di addestramento adattate alla specie e suggeriscono che i gerbilli possono beneficiare di sessioni più brevi e incentrate sulla ricompensa con una maggiore enfasi sull'interazione volontaria, mentre i topi possono richiedere una desensibilizzazione più graduale e una ripetizione costante. Comprendere queste differenze comportamentali e cognitive è fondamentale per perfezionare i protocolli di addestramento e massimizzarne l'efficacia tra le specie.

I gerbilli mongoli possono trarre notevoli benefici dall'addestramento con clicker non specifico o generalizzato, che si concentra sull'interazione positiva uomo-animale e sul condizionamento comportamentale di base piuttosto che sulla preparazione per una particolare configurazione sperimentale. Tale addestramento generalizzato migliora la tolleranza alla manipolazione, riduce i livelli di stress basale e promuove fattori comportamentali di base più prevedibili che sono preziosi in un'ampia gamma di contesti sperimentali30. L'addestramento non specifico promuove la flessibilità comportamentale e l'interazione volontaria coerente con lo sperimentatore, rendendo gli animali più adattabili a diversi ambienti, configurazioni o paradigmi di test 16,31,32. Ciò è particolarmente vantaggioso negli studi a lungo termine o negli esperimenti multifase, in cui gli animali sono esposti a una varietà di procedure. Nel presente studio, anche se l'addestramento non era direttamente legato a un singolo protocollo di test, i gerbilli hanno mostrato una migliore interazione con lo sperimentatore e una riduzione del comportamento correlato allo stress, supportando l'idea che l'assuefazione generale attraverso il rinforzo positivo può migliorare la resilienza sperimentale complessiva e il benessere degli animali.

Oltre a una maggiore interazione con lo sperimentatore, le femmine addestrate hanno trascorso molto più tempo nella zona centrale del test in campo aperto. Questo modello comportamentale è comunemente interpretato come una riduzione del comportamento ansioso nei roditori, in particolare in risposta ad ambienti nuovi o lievemente avversi33. Questi risultati suggeriscono che l'addestramento con il clicker può contribuire a ridurre gli indicatori comportamentali di ansia, migliorando così la capacità degli animali di far fronte alle procedure sperimentali. Ciò supporta la conclusione più ampia che i protocolli di assuefazione basati sul rinforzo positivo possono migliorare la resilienza allo stress e la stabilità comportamentale nei gerbilli da laboratorio. Oltre alla riduzione dello stress, l'addestramento con i clicker ha implicazioni più ampie per i risultati sperimentali34. I gerbilli addestrati hanno dimostrato una maggiore tolleranza alla manipolazione, che riduce al minimo le variazioni fisiologiche indotte dallo stress che potrebbero confondere i risultati della ricerca. Risultati simili sono stati riportati in altre specie, tra cui conigli e topi da laboratorio, dove gli animali addestrati con clicker hanno mostrato una maggiore interazione con gli sperimentatori e meno comportamenti legati all'ansia e alla depressione, come minzione ridotta, defecazione, vocalizzazione e comportamento di galleggiamento19,21.

Questi risultati evidenziano il potenziale dell'addestramento con i clicker per migliorare sia il benessere degli animali che la coerenza dei dati comportamentali riducendo la variabilità delle risposte correlate allo stress. È importante chiarire che lo scopo di questo protocollo non è quello di condizionare gli animali ad associare procedure intrinsecamente avversive, come i prelievi di sangue, a stimoli positivi come il clicker. Piuttosto, l'obiettivo è ridurre lo stress di base, abituare gli animali all'interazione umana e promuovere la partecipazione volontaria a compiti neutri o leggermente impegnativi. Sebbene alcuni studi abbiano esplorato l'uso del rinforzo positivo per preparare gli animali a procedure più invasive35, ciò richiede un processo di desensibilizzazione attentamente strutturato e va oltre l'ambito dell'attuale protocollo. L'applicazione errata dei segnali clicker in contesti associati al disagio potrebbe infatti portare ad associazioni negative non intenzionali. Tuttavia, se applicate correttamente, le tecniche di rinforzo positivo possono aiutare gli animali a far fronte a procedure potenzialmente avversive, migliorando la prevedibilità e consentendo un certo grado di controllo36. Sono necessari ulteriori studi per determinare se i gerbilli possono essere addestrati in modo affidabile per tali contesti, come è stato dimostrato con successo in altre specie come cani e primati non umani37,38.

Nonostante il suo successo, il metodo ha dei limiti. Alcuni gerbilli richiedevano periodi di assuefazione più lunghi, indicando la variabilità individuale nella velocità di apprendimento. Inoltre, il numero relativamente basso di gerbilli maschi non addestrati limita la potenza statistica dell'analisi, rendendo difficile trarre conclusioni solide. L'aumento della dimensione del campione in questo gruppo migliorerebbe probabilmente l'affidabilità e l'interpretabilità dei risultati. Ulteriori studi dovrebbero esplorare le potenziali differenze di sesso nelle risposte allo stress e nei meccanismi di apprendimento.

Le implicazioni più ampie di questo studio vanno oltre la riduzione dello stress. L'implementazione di protocolli di allenamento strutturati come parte dell'allevamento standard può ridurre la variabilità causata dalle risposte fisiologiche indotte dallo stress e migliorare l'affidabilità dei risultati sperimentali39,40. Ciò è particolarmente rilevante in discipline come le neuroscienze o la ricerca metabolica, dove lo stress è un fattore critico di confusione. Un'attenta reportistica e la standardizzazione delle procedure di formazione sono essenziali per evitare effetti di arricchimento indesiderati.

Andando avanti, la ricerca futura dovrebbe esplorare programmi di rinforzo alternativi, l'automazione delle procedure di addestramento e gli effetti a lungo termine tra le specie. Con l'aumento del supporto scientifico, l'addestramento con i clicker rappresenta una preziosa strategia di perfezionamento in grado di migliorare sia la qualità dei dati che il benessere degli animali. La standardizzazione dei protocolli di formazione e manipolazione tra i laboratori potrebbe contribuire a migliorare la riproducibilità e sostenere una più ampia adozione di pratiche umane ed efficaci nella ricerca biomedica.

Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dal Centro di Ricerca Traslazionale sugli Animali del Centro Medico Universitario dell'Università Johannes Gutenberg di Magonza.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
GabbieZoonlab GmbH3010006590 x 380 x 200 mm; 1.815 m2
TelecameraSonyHDR-CX240Edigitale HD Videocamera Registratore
Pellet di ciboSsniffV1644-000Art. Nr. I-Clicker-Blau
Foot Clickerhttps://www.hundeschulen.com
GraphPad PrismGraphPad Software, Inchttps://www.graphpad.com/featuresVersione 10 per finestre
aperto ScatolaNoldusMXO1S-M001opale 100 x 100 x 40 cm
Semi di zuccaREWE8820911REWE
Bio Pylon viewerBaslerhttps://www.baslerweb.com/de-de/software/pylon/
Semi di girasoleSeeberger4744292
TreppiedeManfrottoGT- mkbfra4gtxp bhBefree GT
TunnelsPlexx14179152 x 76 x 3 mm
Campo

Riferimenti

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