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Articolo metodologico

Sviluppo, caratterizzazione e valutazione di sistemi liquidi ionici basati su CAGE per la somministrazione transdermica

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DOI:

10.3791/68658

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26 settembre 2025

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1LEO Foundation Center for Cutaneous Drug Delivery, Department of Pharmacy, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo discute la standardizzazione per la preparazione di sistemi liquidi ionici basati su CAGE per garantire la riproducibilità e semplificare il flusso di lavoro complessivo tra i diversi laboratori scientifici.

Abstract

I liquidi ionici hanno recentemente ottenuto un notevole riconoscimento per le loro applicazioni nell'ambito della somministrazione di farmaci, in particolare per il loro potenziale di consentire la penetrazione cutanea dei farmaci e migliorare la permeazione dei farmaci. Oltre a migliorare la permeabilità della barriera, i liquidi ionici hanno eccellenti proprietà di solvatazione, affrontando la sfida della dissoluzione di farmaci scarsamente solubili. A causa della grande asimmetria tra i cationi organici e gli anioni, questi sali funzionali rimangono liquidi a temperatura ambiente. Dal punto di vista dell'applicazione, i liquidi ionici forniscono un approccio promettente e altamente sintonizzabile per servire molteplici aree terapeutiche. Un liquido ionico biocompatibile composto da colina e acido geranico (CAGE), in un rapporto ionico stechiometrico di 1:2, ha un immenso potenziale per la somministrazione transdermica di un'ampia gamma di ingredienti farmaceutici attivi, tra cui piccole molecole, peptidi, proteine e acidi nucleici. Questo ha un impatto minimo sulla funzione di barriera cutanea. In questo articolo, condividiamo i nostri metodi per la preparazione, la caratterizzazione e la valutazione di CAGE. I risultati rappresentativi sono mostrati per la caratterizzazione CAGE utilizzando la spettroscopia NMR, la calorimetria differenziale a scansione, la titolazione Karl-Fischer per l'analisi del contenuto d'acqua e gli studi di interazione barriera ex vivo sulla pelle suina.

Introduzione

La pelle è l'organo più grande e vitale del corpo, funge da barriera protettiva contro le sostanze nocive e previene la perdita d'acqua1. Allo stesso tempo, l'applicazione di farmaci su e attraverso la pelle offre una vasta gamma di vantaggi. Rispetto agli iniettabili e alla somministrazione orale, la somministrazione cutanea aumenta la compliance del paziente ed evita il metabolismo di primo passaggio nel fegato2. Soprattutto per le condizioni della pelle, le formulazioni somministrate per via cutanea eccellono nel fornire un effetto localizzato, diminuendo l'esposizione sistemica3. Tuttavia, la natura quasi impermeabile della pelle mette a dura prova il successo del parto cutaneo4. La pelle umana è composta da tre diversi strati: l'epidermide, il derma e l'ipoderma4. L'epidermide è lo strato esterno della pelle e può essere ulteriormente suddivisa in diversi sottostrati, con lo strato corneo che è lo strato più esterno, composto principalmente da cheratinociti. Lo strato corneo funge da barriera di permeazione prominente per la maggior parte delle molecole, inibendo il loro trasporto negli strati più profondi della pelle5. Questa funzione di barriera deriva dalla presenza di corneociti incorporati in una disposizione lipidica strettamente compatta, comprendente principalmente fosfolipidi, steroli e ceramidi, spesso indicata come struttura fisica6. Per superare questa barriera cutanea, sono stati utilizzati potenziatori chimici della permeazione (CPE) per veicolare macromolecole, poiché interrompono la struttura dello strato corneo interagendo con i lipidi e le proteine presenti in esso7.

I liquidi ionici (IL) sono emersi come CPE di nuova generazione8. Questi sono costituiti da cationi e anioni organici voluminosi, disposti in modo asimmetrico e coordinati da deboli interazioni ioniche non direzionali9. A causa di queste deboli forze intermolecolari, le IL esistono come liquidi al di sotto di 100 °C e non sono in grado di impacchettarsi in una struttura cristallina ben definita10. Gli IL sono altamente sintonizzabili, poiché la loro efficacia dipende fortemente dalla scelta di cationi o anioni e dal rapporto stechiometrico tra questi ioni. Pertanto, hanno un'elevata capacità solubilizzante e stabilizzante per farmaci con varie idrofobicità11. Gli IL soddisfano le proprietà uniche sia dei lipidi che dei polimeri fornendo un rilascio e un incapsulamento prolungati di macromolecole, rispettivamente12.

Le IL biocompatibili a base di colina e acido geranico (CAGE), presenti in un rapporto molare stechiometrico di 1:2, hanno applicazioni significative nel rilascio transdermico di composti sia idrofili che idrofobici. È stato riportato che CAGE migliora significativamente il rilascio transdermico di proteine (insulina13) e acidi nucleici (siRNA14). CAGE è preparato mediante reazione di metatesi salina tra bicarbonato di colina e acido geranico, con CO2 come sottoprodotto15. La reazione di metatesi salina offre la formazione di nuovi composti tramite scambio ionico in condizioni blande in modo diretto, rapido e altamente selettivo. In generale, mancano flussi di lavoro facili da seguire per lo sviluppo e la valutazione di CAGE IL. Pertanto, qui forniamo uno di questi flussi di lavoro, descrivendo in dettaglio ogni fase della preparazione CAGE per consentire ai ricercatori di diversa provenienza di entrare in questo spazio di ricerca.

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Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con la Direttiva dell'Unione Europea 2010/63 e sono state approvate dalla Danish Veterinary and Food Administration (Licenza n. DK-13-oth-931833).

1. Preparazione della gabbia mediante reazione di metatesi salina

  1. Ricristallizzazione dell'acido geranico (purezza 85%, mol wt 168,23 g/mol)
    1. Prendi un pallone a fondo tondo da 500 ml e misurane il peso.
    2. Pesare 40,0 g di acido geranico nel pallone. Ciò corrisponde a 0,2 mol di acido geranico.
    3. Ricristallizzare l'acido geranico in un acido geranico 70:30% (p/p):acetone: Aggiungere (40 g*0,85*0,30)/(0,70*0,784 g/mL) = 18,42 mL di acetone al pallone a fondo tondo.
    4. Prendi un becher da 5 L e prepara circa 0,5 L di ghiaccio secco ed etanolo.
    5. Immergere il pallone a fondo tondo nella miscela fredda di ghiaccio secco ed etanolo senza agitarlo per consentire il raffreddamento esterno. Decantare l'acetone e le impurità dall'acido geranico solido/ricristallizzato quando la cristallizzazione ha raggiunto l'equilibrio (corrispondente a circa il volume dell'acetone aggiunto, in genere entro 0,5-2 ore). Ripetere questo passaggio 5-6 volte per garantire una purezza sufficiente.
    6. Rimuovere l'acetone rimanente mediante evaporazione rotatoria sotto vuoto a 40 giri/min per almeno 20 minuti o fino a quando il pallone a fondo tondo non si raffredda più al tatto (l'acetone ha una pressione di vapore di 240 mbar a 20 °C).
    7. Pesare e annotare la massa del pallone e dell'acido geranico ricristallizzato. Calcolare la resa in base al peso iniziale del pallone vuoto. L'intervallo di rendimento previsto è del 60-80%.
  2. Reazione di metatesi salina
    1. Per un rapporto molare 2:1 di acido geranico:colina, calcolare il numero di moli di colina, tenendo conto della resa della ricristallizzazione dell'acido geranico. Ad esempio, con una resa del 70% si dovrebbero aggiungere 0,07 mol di colina (0,2*70/100=0,14, 0,14/2 = 0,07).
    2. Il bicarbonato di colina ha una purezza dell'80% e un peso molecolare di 165,19 g/mol. Di conseguenza, aggiungere 14,45 g (0,07*165,19 = 11,56 g; 100/80*11,56 g = 14,45 g) di bicarbonato di colina goccia a goccia per evitare fuoriuscite.
    3. Agitare il campione per una notte a una velocità di 300 giri/min (o appropriata) a temperatura ambiente (18 ± 3 h) o fino a quando l'evaporazione della CO2 cessa.
    4. Essiccare il campione mediante evaporazione rotativa a 60 °C, 30 mbar per 40 minuti. Per prima cosa, aumentare la temperatura, quindi ridurre lentamente la pressione per evitare la formazione di schiuma.
    5. Aliquotare CAGE in flaconcini di vetro in volumi appropriati per l'applicazione prevista (ad es. 2 mL di CAGE in flaconcini di vetro da 4 mL).
    6. Asciugare i flaconcini sotto vuoto a 60 °C per 48 ore.

2. Caratterizzazione di CAGE

  1. Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR)
    1. Sciogliere CAGE a una concentrazione di 25 mg/mL in dimetilsolfossido deuterato (d-DMSO), garantendo un volume finale di almeno 500 μL.
      NOTA: I solventi deuterati sono essenziali nella risonanza magnetica mobile per evitare l'interferenza degli atomi di idrogeno nel solvente.
    2. Trasferire 500 μl della soluzione preparata in una provetta NMR pulita e asciutta (in genere di 5 mm di diametro, a seconda dello strumento). Sigillare il tubo con un tappo per evitare l'evaporazione e la contaminazione.
      NOTA: Evitare di introdurre bolle d'aria, in quanto possono influire sull'omogeneità del campo magnetico.
    3. Utilizzare uno spettrometro NMR (ad es. 400 MHz) con i seguenti parametri:
      -Numero di scansioni: 8-16 per 1H NMR; 1.000-5.000 per NMR a 13C (a seconda della concentrazione e del rapporto segnale/rumore (S/N) desiderato.
      -Ritardo di rilassamento (D1): 1-2 s per 1H e 13C NMR.
    4. Elaborare i dati utilizzando un software appropriato.
      1. Regola le forme ottimali dei picchi tramite la correzione della fase e della linea di base.
        NOTA: Questa operazione viene in genere eseguita nel software NMR all'interno della scheda Elaborazione o Correzione (a seconda del software utilizzato), dove sono disponibili strumenti automatici per la regolazione della fase e la correzione della linea di base.
      2. Utilizzare il picco del solvente residuo (d-DMSO) come riferimento: ~ circa 2,50 ppm per 1H, ~ circa 39,52 ppm per 13C NMR. Vedi Fulmer et al.15per riferimenti alle impurità.
    5. Integrare i picchi e assegnarli ai protoni nella struttura (vedi Figura 1).
  2. Contenuto d'acqua determinato dalla titolazione Karl Fischer
    1. Sciogliere 300 mg di CAGE in 300 μL di metanolo. Caricare in una siringa da 1 ml e pesare prima e dopo l'iniezione.
    2. Determinare il contenuto d'acqua utilizzando un titolatore coulometrico Karl Fischer secondo le istruzioni del produttore.
      1. Iniettare il campione nella cella di titolazione attraverso il setto utilizzando una siringa, inserire il peso della siringa vuota e premere Invio. Il risultato apparirà come % p/p.
      2. Regolare il contenuto d'acqua di metanolo per ottenere il contenuto d'acqua effettivo in CAGE (tipicamente 1-2% p/p). (Campione W = Campione W+diluente*(campione m+diluente m) - (Diluente W*diluente m)/campione m).
  3. Stabilità termica di CAGE mediante calorimetria differenziale a scansione (DSC)
    1. Porre 3-5 mg di ciascun campione in vaschette di alluminio Tzero e sigillare con un coperchio ermetico.
    2. Analizzare i campioni utilizzando un DSC nell'intervallo di temperatura da 80 °C a - 80 °C con un periodo isotermico di 10 minuti prima di raffreddarsi a - 80 °C.
    3. Utilizzare una velocità di riscaldamento/raffreddamento costante di 5 °C/min e uno spurgo dell'azoto di 50 mL/min.
    4. Elaborare i dati utilizzando un software appropriato.

3. Valutazione ex vivo dell'interazione barriera cutanea

  1. Trattamento dermatomico della pelle suina
    1. Tagliare il polistirene espanso (EPS) per adattarlo alla lama del dermatomero e avvolgerlo con nastro adesivo. Utilizza la pelle raccolta dalla regione lombare dei maiali usando un bisturi. Qui, la pelle è stata ottenuta da femmine di maiali danesi di 3,5 mesi di età (30-40 kg).
    2. Rimuovere il muscolo e il tessuto adiposo. Per facilitare la dermatomizzazione del tessuto è importante garantire un lato piatto e basolaterale uniforme.
    3. Rimuovi quanti più peli possibile dalla pelle usando un tagliacapelli.
    4. Sciacquare la pelle con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4) per rimuovere il sangue e i peli sciolti.
    5. Tagliare la pelle in pezzi più piccoli (5 cm x 15 cm) con un coltello per adattarla ai blocchi di EPS.
    6. Attacca la pelle al blocco EPS con gli aghi.
    7. Impostare il dermatomo a uno spessore di 0,5 mm e sezionare la pelle.
    8. Conservare la pelle dermatomizzata tra due strati di nastro da innesto e conservarla a -70 °C.
  2. Perdita di acqua transepidermica (TEWL)
    1. Preparare il PBS (pH 7,4) sciogliendo 1 compressa in 200 ml di acqua ultrapura. Degasare per 20 minuti in un bagno ad ultrasuoni.
    2. Accendere il bagno d'acqua collegato alle celle di diffusione Franz. Aggiungere circa 12 mL di PBS degassato e una microsfera magnetica a ciascuna cellula. Attivare l'agitazione magnetica (ad es. a 600 giri/min) garantendo una distribuzione uniforme nel mezzo recettore senza creare turbolenze. Si noti che non tutte le configurazioni di celle Franz consentono un controllo preciso della velocità di agitazione. Regolare la fonte di calore in modo che raggiunga una temperatura di 37 °C nel mezzo ricevente.
    3. Tagliare la pelle dermatomizzata in pezzi con un diametro di circa 3 cm (o di dimensioni adeguate) utilizzando un bisturi e montare con cura la pelle dermatomizzata sulle cellule di diffusione di Franz utilizzando pinze e anelli di tenuta, con lo strato corneo rivolto verso l'alto.
    4. Quindi, riempire completamente le camere dei recettori con PBS utilizzando una pipetta di vetro Pasteur, assicurandosi che siano riempite fino al segno che indica il volume noto del mezzo recettore. Rimuovere le bolle d'aria capovolgendo accuratamente le celle. Idratare per 30 min.
    5. Accendere il dispositivo TEWL ed equilibrare per 20 minuti fino a quando non si stabilizza secondo le linee guida del produttore.
    6. Posizionare la sonda TEWL su ciascuna cella Franz e premere Start nel software. Tenerlo premuto finché non viene visualizzata una lettura.
    7. Aggiungere 300 μl di campione sulla parte superiore della pelle (in triplicati, n=3) e occludere posizionando il nastro da innesto sulla parte superiore della cella di Franz. Incubare per 24 ore a 37 °C (temperatura del mezzo recettore).
    8. Rimuovere il campione strofinando il tessuto con salviette prive di lanugine. Lasciare agire per 30 min.
    9. Misurare il TEWL per ogni cellula per esaminare l'effetto dei campioni sulla barriera cutanea. Calcolare i valori TEWL relativi ai valori pre-esposizione e regolare rispetto al controllo PBS (TEWL relativo = (TEWL post-TEWL-pre/TEWLpre)/(TEWL(PBS)post-TEWL(PBS)pre/TEWL(PBS)pre)))*100.

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Risultati

Spettri NMR
L'obiettivo di questa tecnica è quello di confermare il successo della formazione di CAGE analizzando gli ambienti chimici degli atomi di idrogeno e carbonio utilizzando la spettroscopia NMR 1H e 13C. Gli spettri risultanti forniscono cambiamenti chimici caratteristici, modelli di scissione e valori di integrazione che riflettono la struttura molecolare e la composizione dell'IL sintetizzata. Lo spettro NMR del protone nella Figura 1 conf...

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Discussione

Il metodo di preparazione di CAGE descritto in questo lavoro è stato adottato dalla letteratura15. Tuttavia, è importante riconoscere che il processo di sintesi è sensibile a vari fattori esterni, che possono influenzare le proprietà del prodotto finale. Pertanto, una volta preparato, il sistema CAGE dovrebbe essere caratterizzato utilizzando tecniche come la spettroscopia NMR per confermare la formazione di CAGE.

Come mostrato nella

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario concorrente.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal contributo della Fondazione LEO n. LF15007 e LF-FE-23-700013.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tubi NMR da 5 mmSigma Aldrich41121705
AcetoneVWR23L064039
Padella Tzero in alluminioTA Instruments90,16,83,901
Dispositivo Aqua FluxSistemi Biox
Bruker Avance III NMRBrukerStrumento per la spettroscopia NMR
Bicarbonato di colinaSigma AldrichC7519
DermatomaZimmer Biomet
Calorimetro a scansione differenzialeTA Instruments
EtanoloVWR23J314009
Polistirene espansoPolistirolo
Celle di diffusione di FranzPermeGear
Acido GeranicoSigma Aldrich427764
Nastro per innestoParafilm
Karl Fischer TitolareMettler Toledo30252662
MetanoloVWR85681.32
PBSFischer Scientific10388739
Software di analisi universale TA 2000TA InstrumentsSoftware per l'analisi dei dati DSC
TopSpin SoftwareBrukerSoftware per l'analisi dei dati NMR

Riferimenti

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