Fabbricazione di microaghi polimerici ultra-affilati tramite microlavorazione e microstampaggio a controllo numerico computerizzato (CNC)

Sommario

Questo articolo introduce un protocollo di fabbricazione semplice, diretto e innovativo per la produzione di microaghi polimerici con punte eccezionalmente affilate attraverso il microstampaggio da stampi master creati tramite fresatura a controllo numerico computerizzato (CNC). Il sistema sviluppato è economico, facile da costruire e in grado di produrre microaghi con un'affilatura eccezionale per una maggiore penetrazione, migliorando così le prestazioni di consegna.

Abstract

I microaghi hanno recentemente ottenuto il riconoscimento come un metodo promettente nella somministrazione transdermica di farmaci grazie alla loro natura minimamente invasiva e indolore e possono essere progettati in modo flessibile attraverso modifiche geometriche per soddisfare specifici requisiti terapeutici. Pertanto, questo studio mira a sviluppare stampi master per microaghi utilizzando la tecnologia di fresatura a controllo numerico computerizzato (CNC) per creare microaghi polimerici con diversi gradi di affilatura per migliorare l'efficacia terapeutica. In precedenza, il nostro team ha ottimizzato con successo due parametri di lavorazione critici, la velocità di avanzamento e l'angolo di rampa, analizzando la loro influenza sugli aghi ottenuti. Pertanto, questo articolo presenta una serie completa di protocolli sperimentali per la fabbricazione e la valutazione delle prestazioni degli aghi modello a base polimerica. Inoltre, questo lavoro fornisce anche risultati rappresentativi per dimostrare la riproducibilità e l'efficacia terapeutica degli aghi del campione. Il nostro team di ricerca prevede che questo semplice protocollo consentirà ai ricercatori di creare microaghi economici e di alta precisione, facendo progredire così la tecnologia dei microaghi per ulteriori applicazioni biomediche, in particolare durante la pandemia.

Introduzione

Negli ultimi anni, i microaghi sono emersi come un candidato promettente per la somministrazione di farmaci grazie alla loro natura indolore e autosomministrabile, eludendo il metabolismo epatico di primo passaggio¹. I microaghi hanno attirato molta attenzione in molte applicazioni biomediche (ad esempio, vaccinazioni, trattamento del cancro, diagnostica, cosmetici), che richiedono una somministrazione precisa e minimamente invasiva di agenti terapeutici o altre sostanze nella pelle o nei tessuti sottostanti, migliorando l'efficacia del trattamento con effetti avversi limitati².

A seconda delle applicazioni previste, i microaghi possono essere realizzati in molte forme (ad esempio, solidi, rivestiti, cavi, porosi, rigonfiabili e solubili), potenzialmente per applicazioni diagnostiche e di somministrazione transdermica di farmaci penetrando lo strato corneo³. Da un punto di vista ingegneristico, sono disponibili numerose tecniche di fabbricazione per la produzione di microaghi. Tra questi, la microlavorazione CNC è un metodo preciso e versatile, ampiamente impiegato per la creazione di strutture tridimensionali complesse con elevata precisione e adattabilità, che lo rende particolarmente adatto per la fabbricazione di stampi master con microaghi⁴. In risposta, il nostro team di ricerca ha precedentemente proposto un approccio ottimizzato, a basso costo, semplice e innovativo per produrre stampi master a microaghi con punte ultra affilate utilizzando la tecnica di microlavorazione CNC⁵. Inoltre, i microaghi possono anche essere realizzati con un'ampia gamma di materiali (ad esempio, metalli, ceramiche, polimeri). Tra questi, i microaghi polimerici sono emersi come promettenti grazie alla loro biocompatibilità, biodegradabilità e non tossicità, rendendoli potenzialmente utili per applicazioni biomediche⁶.

Questo studio introduce un protocollo ottimizzato per fabbricare stampi master a microago, progettati per produrre aghi con elevata nitidezza attraverso la microlavorazione CNC e il microstampaggio. Questo approccio è stato ispirato dalla nostra ricerca precedente, che ha esplorato la fabbricazione di stampi master tramite fresatura CNC. Per esaminare i dati di supporto e le cifre relative all'ottimizzazione dei parametri di fabbricazione (ad esempio, velocità di avanzamento, angolo di rampa), i lettori sono incoraggiati a fare riferimento alla precedente pubblicazione⁵. Inoltre, questo lavoro valuta anche l'efficacia di questo protocollo proposto dimostrando la fabbricazione di un modello di microaghi basato su polimeri di nuova concezione. Per massimizzare i vantaggi di questo protocollo, i lettori sono incoraggiati a considerare le loro specifiche ingegneristiche. Ad esempio, le considerazioni critiche riguardano la selezione di materiali appropriati, utensili di fresatura e parametri ottimizzati (ad esempio, velocità di avanzamento, velocità del mandrino)⁷. Data l'elevata precisione e accuratezza richieste nella fabbricazione di microaghi, il processo di fresatura CNC deve essere in grado di produrre strutture che soddisfino criteri di progettazione specifici, come il diametro della punta e le diverse geometrie, offrendo al contempo una maggiore flessibilità rispetto alle tecniche di fotolitografia⁸. Inoltre, la replica dello stampo negativo PDMS in questo metodo ha dimostrato un alto livello di riproducibilità, in grado di resistere a più cicli di colata senza degradazione, rendendola un potenziale candidato per una fabbricazione semplice ed economica di microaghi con diversi gradi di affilatura⁹.

Protocollo

I reagenti, le apparecchiature e il software utilizzati per questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Fabbricazione di stampi master a microaghi a base di polimetilmetacrilato (PMMA)

1. Progettazione di stampi master Microneedle
   NOTA: La progettazione dello stampo master con microaghi è stata eseguita utilizzando Fusion 360 (Autodesk, USA, licenza didattica) (vedere la Tabella dei materiali).
   1. Aprire il software nell'ambiente di progettazione e creare un nuovo schizzo.
   2. Disegna una casella utilizzando la funzione Estrusione .
   3. Generare cavità a gradini utilizzando lo strumento Estrusione taglio .
   4. Crea un singolo corpo di microaghi come cilindro.
   5. Utilizzare lo smusso per fresare il cilindro in modo da formare un microago di forma conica.
   6. Generare uno stampo master 10 x 10 microneedle utilizzando il comando Array .
      NOTA: A seconda delle applicazioni previste, le dimensioni dei microaghi possono variare. In questo protocollo, gli aghi dimostrati sono formati con le seguenti dimensioni: forma conica, altezza dell'ago: 600 μm, diametro della base: 400 μm e distanza tra gli aghi: 1400 μm.
   7. Rivedere e finalizzare il progetto per verificarne l'accuratezza e la coerenza.
   8. Salva i disegni finali in un formato compatibile (ad es. .f3d) per un'ulteriore elaborazione.
2. Configurazione della produzione assistita da computer (CAM)
   1. Aprite il progetto dello stampo nell'ambiente CAM.
   2. Posizionare un pezzo in PMMA con il brodo sulla parte superiore dello stampo.
   3. Eseguire la spianatura per rimuovere la superficie superiore utilizzando una fresa a estremità piatte¹⁰.
      NOTA: Impostare i parametri per la fresa a candela piana, tra cui il diametro dell'utensile (3 mm), la velocità di avanzamento (300 mm/min), la velocità del mandrino (3000 giri/min), la profondità di taglio (1 mm) e il passo di avanzamento (1 mm).
   4. Utilizzare la fresatura di tasche per lavorare le cavità a gradini utilizzando una fresa a candela piatta⁵.
      NOTA: Impostare i parametri per la fresa a candela piana, tra cui il diametro dell'utensile (1 mm), la velocità di avanzamento (300 mm/min), la velocità del mandrino (4000 giri/min), la profondità di taglio (0,5 mm) e il passo di avanzamento (0,3 mm).
   5. Applicate nuovamente la fresatura di tasche per formare strutture cilindriche.
      NOTA: Impostare i parametri per la fresa a candela piana, tra cui il diametro dell'utensile (0,8 mm), la velocità di avanzamento (200 mm/min), la velocità del mandrino (4000 giri/min), la profondità di taglio (0,2 mm) e il passo di avanzamento (0,2 mm).
   6. Creare una struttura di microaghi di forma conica in PMMA utilizzando la fresatura di fori⁵.
      NOTA: Impostare i parametri per la fresatura di fori, tra cui il diametro dell'utensile (0,4 mm), la velocità di avanzamento (100 mm/min), la velocità del mandrino (4500 giri/min) e l'angolo di rampa (1,5°).
   7. Per generare il codice G per un'ulteriore elaborazione, fare clic con il pulsante destro del mouse sul programma Setup > Create NC. Dalla scheda Macchina e post , selezionare Tormach PathPilot come postprocessore desiderato. Infine, fai clic sul pulsante Pubblica all'interno della finestra di dialogo per generare il codice G.
3. Configurazione della microlavorazione a controllo numerico computerizzato (CNC)
   1. Preparazione del pezzo in polimetilmetacrilato (PMMA)
      1. Procurarsi un blocco pezzo in PMMA con dimensioni: larghezza: 30 mm, lunghezza: 30 mm e altezza: 5 mm.
      2. Fissare il blocco di PMMA sul piano di lavoro utilizzando i morsetti per evitare qualsiasi movimento durante la fresatura.
   2. Configurazione della lavorazione CNC
      1. Utilizzare un centro di lavoro a 3 assi con una velocità massima del mandrino di 5140 giri/min.
      2. Selezionare un utensile di fresatura appropriato e inserirlo in una pinza ER20, assicurandosi che sia fissato correttamente al mandrino.
   3. Processo di taglio
      1. Bloccare il pezzo in PMMA sulla morsa della macchina CNC.
      2. Impostare il punto zero per un posizionamento preciso tra la fresa a candela e il pezzo in lavorazione attraverso gli assi x, y e z.
      3. Iniziare la lavorazione con il percorso utensile definito da un programma G-code e dai parametri di taglio.
      4. Avviare il taglio automatizzato per fabbricare lo stampo master in PMMA.
         NOTA: Si consiglia di applicare continuamente un lubrificante a base di olio sul pezzo durante tutto il processo di taglio. Reimpostare il punto zero (asse z) dopo aver sostituito l'utensile di fresatura.
      5. Monitorare regolarmente il processo per verificarne la precisione e la stabilità dell'utensile.
         NOTA: Una volta completata la fresatura, rimuovere con cura lo stampo master del microago ottenuto dalla macchina CNC.
      6. Pulire la superficie lavorata utilizzando gli ultrasuoni per rimuovere il lubrificante in eccesso e i detriti.
4. Replica dello stampo negativo
   1. Preparazione della soluzione di colata di polidimetilsilossano (PDMS)
      1. Miscelare la base elastomerica e l'agente indurente in un rapporto di 10:1 (p/p).
      2. Aspirare il composto per 5 minuti per eliminare le bolle d'aria.
   2. Processo di fabbricazione di stampi negativi basato su PDMS
      1. Versare la miscela PDMS degassata sullo stampo master in PMMA con uno spessore approssimativo di 1 mm.
      2. Aspirare lo stampo contenente la miscela per altri 5 minuti per rimuovere le bolle d'aria.
   3. Processo di stagionatura
      1. Polimerizzare lo stampo PDMS in forno a 90 °C per 45 min per solidificare la struttura.
   4. Rimozione e replicazione della muffa
      1. Rimuovere con cautela lo stampo polimerizzato PDMS dallo stampo master in PMMA utilizzando una pinzetta.
      2. Ripetere il processo di replica per produrre più stampi negativi PDMS da un singolo stampo master in PMMA.
         NOTA: Gli stampi negativi PDMS possono essere riutilizzati per la fabbricazione di patch con microaghi, dimostrando un'elevata produttività e un approccio di fabbricazione efficiente.

2. Fabbricazione di patch polimeriche con microaghi

NOTA: Per valutare l'efficacia del sistema proposto, abbiamo dimostrato un processo di fabbricazione del campione per produrre microaghi modello basati su polimeri composti da alcol polivinilico (PVA), polivinilpirrolidone (PVP) e chitosano solubile in acqua (WCS), precedentemente sviluppato all'interno del nostro laboratorio.

1. Preparazione di soluzioni polimeriche
   1. Preparazione della soluzione WCS
      1. Preparare una soluzione WCS al 3% (p/v) sciogliendo direttamente la polvere WCS in acqua distillata.
         NOTA: Utilizzare un agitatore magnetico per accelerare la velocità di dissoluzione.
   2. Preparazione della soluzione PVA/PVP
      NOTA: La soluzione PVA/PVP migliora l'integrità strutturale del cerotto con microaghi fungendo da materiale di base di supporto.
      1. Preparare una soluzione PVA/PVP a una concentrazione del 7,5% (p/v) per ciascuna sostanza.
      2. Aggiungere la quantità calcolata di acqua distillata alla miscela in polvere.
      3. Mescolare continuamente la soluzione con un agitatore magnetico e riscaldarla a 70 °C per 4 ore fino a renderla omogenea.
      4. Coprire il becher contenente la soluzione con una pellicola per evitare l'evaporazione.
2. Fabbricazione di cerotti con microaghi
   NOTA: La fabbricazione di patch con microaghi PVA/PVP/WCS dallo stampo PDMS ottenuto utilizzando la tecnica della colata a solvente.
   1. Erogare 400 μl della soluzione WCS ottenuta sullo stampo PDMS negativo utilizzando una micropipetta.
   2. Posizionare lo stampo in una camera a vuoto e aspirare per 15 minuti per rimuovere eventuali bolle d'aria e assicurarsi che la soluzione riempia correttamente le cavità dello stampo.
   3. Applicare un altro strato di soluzione PVA/PVP come materiale di base sulla superficie dello stampo.
   4. Trasferire lo stampo in forno e asciugare a 65 °C per 4 ore per la completa solidificazione del cerotto con microaghi.
   5. Una volta essiccato, separare accuratamente il cerotto ottenuto dal PDMS utilizzando una pinzetta.

3. Valutazione dei cerotti con microaghi

1. Valutazione della resistenza meccanica
   1. Configurazione sperimentale per la misurazione dell'integrità strutturale con microaghi
      NOTA: Questo esperimento è stato condotto utilizzando un sistema sviluppato in proprio. In breve, l'apparecchiatura comprende (1) una stazione di prova della forza, (2) un'interfaccia software, (3) un microscopio USB e (4) una cella di carico da 10 N.
   2. Installazione del software di misura
      1. Scaricare tre file operativi dal pacchetto software "Configurazione automatica dell'iniezione dell'ago" disponibile in diversi tipi <.exe>, , , nel file supplementare 1, nel file supplementare 2 e nel file supplementare 3. Questi file corrispondono all'installazione di questo software di misura meccanica.
         NOTA: Per far funzionare il sistema, gli utenti aprono solo il file <.exe>, mentre gli altri file sono file di configurazione e non richiedono un'interazione diretta.
   3. Procedura di misurazione
      1. Posizionare un singolo microago sulla superficie del micro-palco, che è attaccato con nastro biadesivo.
      2. Regolare la velocità di spostamento a 40 mm/h.
      3. Regolare la distanza tra il sensore e la punta del microago finché il sensore non tocca direttamente la punta dell'ago.
      4. Registrare il grafico forza-spostamento ottenuto generato dal software di misurazione.
      5. Ripetere l'esperimento tre volte per ogni campione.
2. Valutazione della penetrazione
   1. Configurazione sperimentale per la misurazione della penetrazione con microaghi
      1. Preparare una pila di fogli di film di paraffina (PF) a otto strati con uno spessore di 125 μm ciascuno.
      2. Posizionare e fissare la pila PF sulla superficie del microstadio per garantire stabilità durante l'esperimento.
   2. Attacco per microaghi
      1. Collegare un singolo microago a una cella di carico meccanica per un corretto inserimento verticale.
   3. Procedura di inserimento
      1. Impostare la cella di carico collegata con un microago in modo che si muova verso il basso a una velocità costante di 40 mm/h nella pila PF.
   4. Raccolta e analisi dei dati
      1. Rimuovere il microago dalla pila PF.
      2. Aprire con cura gli strati PF per esporre ogni foglio.
      3. Osservare la pila PF dispiegata al microscopio per contare il numero di fori di penetrazione in ogni strato.
      4. Ripetere l'esperimento tre volte per ogni campione.

Risultati

Questo studio introduce un protocollo per la fabbricazione di stampi master per microaghi, progettati per ottenere microaghi eccezionalmente affilati utilizzando la microfresatura CNC. Per esaminare i dati sull'affilatura della punta, i lettori sono incoraggiati a fare riferimento alla precedente pubblicazione⁵. La Figura 1 mostra la vista schematica del design dello stampo master del microneedle con le sue dimensioni. La Figura 2 illustr...

Discussione

Questo studio ha sviluppato un protocollo sperimentale unico per fabbricare stampi master per produrre microaghi polimerici con un'eccellente affilatura attraverso la microlavorazione CNC e il microstampaggio. In primo luogo, questo approccio include l'integrazione di un progetto schematico con la fabbricazione di uno stampo master tramite fresatura CNC, seguita da una serie di processi di microstampaggio per creare patch di microaghi. Per molto tempo, il microstampaggio è stato...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
centro di lavoro a 3 assi	Tormach PCNC 1100		Fresa CNC per il taglio di materiali
Configurazione automatica dell'iniezione dell'ago	di misurazione meccanica	auto-sviluppato
Acqua distillata	Cole-Parmer WS-200 Series Stuart Water Stills
Software Fusion 360, versione Education	Autodesk, USA	Software di progettazione (https://www.autodesk.com/asean/products/fusion-360/overview?term=1-YEAR&tab=subscription)
Software ImageJ	National Institutes of Health, USA		Analisi delle immagini
Polidimetilsilossano	SYLGARD 184 Kit di elastomeri siliconici	1330-20-7	Utilizzato per stampi negativi
Polimetilmetacrilato			Utilizzato per stampi master
Alcool polivinilico	Sigma Aldrich, Stati Uniti	9003-39-8	Materiale microneedle
Polivinilpirrolidone	Sigma Aldrich, USA	9002-89-5	Materiale con microaghi
Rodamina B	Sigma Aldrich, USA	83689-1G	Modello di farmaco
Chitosano solubile in acqua			Materiale microneedle