Decodificare il comportamento naturale dall'incorporamento neuroetologico

Summary

Questo protocollo fornisce un quadro integrato basato su metodi neuroetologici computazionali avanzati per comprendere la codifica cerebrale in contesti naturalistici.

Abstract

Gli animali interagiscono con il loro ambiente naturale attraverso un'attività cerebrale ricca e dinamica. Comprendere come le dinamiche delle popolazioni neurali codificano il comportamento naturalistico rimane una sfida fondamentale nelle neuroscienze dei sistemi. I recenti progressi nell'analisi del comportamento basata sul deep learning e nell'imaging a fluorescenza in miniatura hanno aperto nuove strade per studiare il modo in cui il cervello codifica il comportamento naturale. Qui, questo studio presenta un quadro sperimentale e computazionale integrato che combina il Social Behavior Atlas (SBeA), la microscopia a due fotoni in miniatura (mTPM) e l'incorporamento coerente di registrazioni ad alta dimensione utilizzando variabili ausiliarie (CEBRA) per decodificare comportamenti complessi dalla dinamica del cervello. Questo studio utilizza le interazioni sociali naturalistiche tra topi che si muovono liberamente come sistema modello, consentendo l'annotazione comportamentale ad alta risoluzione insieme all'imaging neurale simultaneo. Questo framework include la stima precisa della posa comportamentale, il tracciamento sincronizzato del doppio mouse, l'allineamento dell'incorporamento neurale e la decodifica delle caratteristiche comportamentali direttamente dai componenti principali neurali. Questo studio dimostra che questo approccio raggiunge una precisione di decodifica di 3. ± 1,5 pixel per la postura e l'89 ± una precisione del 6% per la decodifica dei motivi tra gli animali, evidenziandone la robustezza e la generalizzabilità. Questo metodo fornisce un potente strumento per esplorare come l'attività cerebrale riflette gli stati comportamentali strutturati e getta le basi per studi futuri sui principi di codifica neurale naturalistica.

Introduction

Questo framework è progettato per acquisire e decodificare dati comportamentali e di neuroimaging da animali in movimento libero in contesti sperimentali naturalistici. Comprende tre componenti chiave: metodi di stima della posa e classificazione del comportamento basati sul deep learning, SBeA¹, tecniche di imaging a fluorescenza in miniatura mTPM² e un algoritmo di embedding neuroetologico basato sull'apprendimento contrastivo, CEBRA³. Recenti studi hanno evidenziato la complessità dei processi neuroetologici negli animali in movimento libero, che supera quella osservata nei paradigmi sperimentali a testa fissa ^4,5. Tuttavia, i limiti tecnici e la variabilità hanno ostacolato l'applicazione diffusa di questi approcci a indagini più ampie sul comportamento naturale. Questo protocollo presenta un quadro stabile e integrato che garantisce l'accessibilità dei dati comportamentali e neurali raccolti in contesti naturalistici per un'ampia gamma di laboratori di ricerca.

Dato che gli animali si muovono liberamente negli ambienti naturali, questo framework incorpora la stima della posa basata sul deep learning per ottenere un tracciamento preciso delle posture ^6,7. I metodi di tracciamento tradizionali basati sull'elaborazione delle immagini non sono sufficienti per catturare movimenti su larga scala, come la dinamica degli arti e delle zampe, rispetto agli approcci basati sul deep learning⁸. I comportamenti diversi e complessi esibiti dagli animali che si muovono liberamente pongono sfide per i metodi di classificazione del comportamento supervisionato⁹, poiché le categorie comportamentali predefinite spesso non riescono a comprendere l'intera gamma di fenotipi comportamentali naturali¹⁰. Di conseguenza, i metodi di classificazione basati sull'apprendimento non supervisionato sono più adatti per analizzare il comportamento in contesti naturalistici¹. Possono scomporre in modo completo il comportamento continuo in motivi discreti di subsecondi in base alle loro somiglianze strutturali intrinseche, e quindi le loro definizioni coerenti vengono fornite attraverso cluster basati sui dati.

L'imaging cerebrale negli animali che si muovono liberamente richiede di catturare l'ampia variabilità dell'attività di un singolo neurone ^4,5. Le registrazioni elettrofisiologiche negli animali che si muovono liberamente sono limitate nella loro capacità di rilevare neuroni con attività prevalentemente sottosoglia¹¹. Inoltre, la microscopia a fotone singolo soffre di bassa risoluzione e contrasto, rendendo difficile mantenere identità neuronali coerenti tra le sessioni di imaging¹². mTPM offre una risoluzione e un contrasto superiori rispetto alla microscopia a fotone singolo, rendendolo uno strumento più efficace per studiare la codifica neurale dei comportamenti naturali 2,13,14,15.

Stabilire una solida mappatura tra comportamento e dati neurali richiede metodi in grado di rivelare la loro struttura informativa condivisa¹⁶. Le tecniche convenzionali di riduzione della dimensionalità, come l'analisi delle componenti principali (PCA)¹⁷, l'embedding del vicino stocastico t-distribuito (t-SNE)¹⁸ e l'approssimazione e proiezione di varietà uniformi (UMAP)¹⁹, non possono incorporare efficacemente i dati comportamentali e neurali all'interno di uno spazio di funzionalità comune. Al contrario, gli approcci di embedding basati sul deep learning, come CEBRA, consentono l'integrazione di più modalità di dati in framework sia supervisionati che auto-supervisionati, generando rappresentazioni latenti di alta qualità³. Mentre negli ultimi anni sono emersi vari metodi alternativi 20,21,22, questo quadro proposto dà la priorità alle applicazioni pratiche incorporando metodi consolidati che sono disponibili in commercio o supportati da tutorial completi.

Rispetto a studi recenti ^4,5, questo quadro offre tre progressi chiave. In primo luogo, elimina i pregiudizi umani nella classificazione del comportamento. Studi precedenti si basavano sull'etichettatura manuale del comportamento, che è laboriosa e soggetta a incoerenza, in particolare poiché gli annotatori sperimentano affaticamento 23,24,25. Al contrario, questo quadro impiega la classificazione del comportamento non supervisionata, che preserva la struttura naturale dei modelli comportamentali scomponendo e raggruppando oggettivamente i motivi comportamentali prima di assegnare le definizioni^26,27. In secondo luogo, l'uso di mTPM consente l'acquisizione di dinamiche neuronali più complesse a livello di singolo neurone. Questo vantaggio metodologico amplia l'applicabilità di questo framework alla decodifica di comportamenti naturali complessi da diverse popolazioni neurali, comprese quelle coinvolte nella codifica sottosoglia²⁸. In terzo luogo, questo framework integra i dati comportamentali e neurali in uno spazio rappresentazionale unificato, piuttosto che impiegare UMAP per incorporare ciascuna modalità separatamente o utilizzare macchine a vettori di supporto per imporre una mappatura rigida tra attività neurale e comportamento ignorando le loro dinamiche intrinseche ^4,5. Questo approccio di incorporamento congiunto garantisce una rappresentazione più completa e biologicamente significativa della relazione tra comportamento e attività cerebrale.

Questo quadro è adatto per progetti di ricerca che prevedono la registrazione e la decodifica di dati comportamentali e neurali provenienti da animali in movimento libero in condizioni sperimentali naturalistiche. Sebbene l'attuale implementazione sia ottimizzata per gli studi sui topi, l'adattamento ad altri modelli animali potrebbe richiedere ulteriori sviluppi. Poiché i componenti hardware utilizzati in questo framework sono disponibili in commercio, da un lato, il costo complessivo può essere relativamente elevato. D'altra parte, questa disponibilità commerciale riduce significativamente il tempo dedicato alla risoluzione dei problemi logistici e garantisce l'acquisizione di risultati stabili e affidabili in modo efficiente.

Questo protocollo è progettato per essere riproducibile e accessibile ai laboratori di neuroscienze attrezzati per l'imaging di piccoli animali e il monitoraggio del comportamento. Il sistema completo integra un dispositivo mTPM disponibile in commercio con una configurazione di acquisizione comportamentale multi-angolo. Le registrazioni neurali tipiche vengono acquisite a 4,84 Hz con una risoluzione di 512 × 512 pixel e i dati comportamentali vengono acquisiti a 30 fotogrammi al secondo. La sincronizzazione dei dati si ottiene attraverso l'allineamento degli impulsi TTL durante la pre-elaborazione. L'addestramento e la decodifica possono essere eseguiti su una workstation standard con una GPU (ad esempio, NVIDIA RTX 3090 o equivalente) e l'intera pipeline richiede circa 100 GB di spazio di archiviazione per esperimento. Mentre l'attuale implementazione è ottimizzata per i topi che si muovono liberamente, il design modulare del flusso di lavoro consente l'adattamento ad altre specie regolando la calibrazione del tracciamento e i parametri di imaging in base alle dimensioni e alla mobilità dell'animale. Questi dettagli pratici supportano l'adattabilità e la riproducibilità del protocollo in una serie di contesti sperimentali.

Protocol

Il Comitato per la cura e l'uso degli animali presso l'Istituto di tecnologia avanzata di Shenzhen, Accademia cinese delle scienze, ha approvato tutte le procedure di allevamento e sperimentali.

1. Istituzione della piattaforma

NOTA: la piattaforma è costituita da due componenti principali: il dispositivo mTPM e il dispositivo di comportamento 3D (Figura 1A). Il dispositivo mTPM facilita la sincronizzazione in tempo reale dell'imaging mTPM con i dati comportamentali, consentendo così l'acquisizione efficiente, stabile e continua di dati di alta qualità da animali in movimento libero. Il dispositivo di comportamento 3D è dotato di quattro telecamere per catturare l'intera scena del comportamento animale e di un modulo di calibrazione automatica per la ricostruzione delle pose 3D degli animali. Entrambi i dispositivi devono incorporare moduli di sincronizzazione nelle rispettive versioni.

1. Connessione del dispositivo
   1. Rimuovere il guscio esterno del dispositivo di comportamento 3D. Posizionare le parti rimanenti del dispositivo di comportamento 3D, tra cui quattro telecamere e un modulo di calibrazione automatica, all'interno della camera di registrazione comportamentale del dispositivo mTPM.
   2. Collegare il cavo USB (Universal Serial Bus) del modulo di sincronizzazione del dispositivo di comportamento 3D alla workstation del dispositivo di comportamento 3D.
   3. Collegare il modulo di sincronizzazione del dispositivo mTPM al controller del dispositivo mTPM tramite un cavo SubMiniature versione A (SMA).
   4. Collegare la porta di uscita TTL (Transistor-Transistor Logic) del modulo di sincronizzazione del dispositivo di comportamento 3D alla porta di ingresso TTL del modulo di sincronizzazione del dispositivo mTPM tramite un cavo di conversione Neill-Concelman (BNC) a baionetta SMA.
2. Registrazione timestamp dei frame mTPM
   1. Inserire ogni alimentazione del dispositivo mTPM.
   2. Avviare il software di registrazione mTPM e il software di sincronizzazione mTPM.
   3. Impostare i percorsi di salvataggio dei frame mTPM e i timestamp di sincronizzazione.
      NOTA: Non utilizzare lettere non inglesi e caratteri speciali per denominare i percorsi.
   4. Impostare il numero di fotogrammi di registrazione del software di registrazione mTPM. Il numero consigliato di fotogrammi è 6000, che è sufficiente per completare il passaggio di debug della sincronizzazione.
   5. Selezionare ogni canale del software di sincronizzazione mTPM.
   6. Avviare la registrazione di mTPM tramite il software di registrazione mTPM. Prima di iniziare la registrazione, spegnere tutte le luci all'interno della stanza per proteggere l'mTPM dalla combustione eccessiva della luce. Il software di sincronizzazione mTPM verrà eseguito automaticamente quando l'utente avvia la registrazione.
   7. Verificare se i timestamp dei frame mTPM vengono acquisiti dal software di sincronizzazione mTPM.
      NOTA: i timestamp dei frame mTPM visualizzati nel software di sincronizzazione mTPM sono impulsi TTL acuti. Ogni fotogramma dell'imaging attiva un impulso TTL nitido, che per impostazione predefinita è di 4,84 Hz. Se non viene visualizzato alcun impulso sul pannello del software, ci sono 2 problemi normali. Il primo è che il driver del controller del dispositivo mTPM non supporta l'acquisizione del timestamp. Migliorare la versione del driver per supportare l'acquisizione del timestamp può risolvere il primo problema. Il secondo è il cattivo collegamento del cavo SMA. Assicurarsi che i connettori SMA siano serrati saldamente. Prima di controllare i timestamp, torna a 1.1.2, quindi prova passo dopo passo.
   8. Attendi che la registrazione si interrompa. Verificare se il file .tif dei frame mTPM, un file con estensione tdms e un file .tdms_index dei timestamp sono stati salvati.
3. Registrazione timestamp di quattro telecamere del dispositivo di comportamento 3D
   1. Imposta il percorso di salvataggio dei video e i timestamp del comportamento nello script di sincronizzazione della fotocamera personalizzato.
      NOTA: Il codice di sincronizzazione della fotocamera personalizzato è a https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/camera_code/mul_camera_save_video_event.py.
   2. Avviare il software di sincronizzazione mTPM. Impostare i percorsi di salvataggio dei timestamp di sincronizzazione mTPM.
   3. Avviare la registrazione del software di sincronizzazione mTPM. Eseguire lo script di sincronizzazione della fotocamera personalizzato.
   4. Verificare se i timestamp del comportamento vengono acquisiti dal software di sincronizzazione mTPM.
      NOTA: i timestamp del comportamento mostrati nel software di sincronizzazione mTPM sono impulsi TTL bruschi. Un timestamp del comportamento viene inviato al software di sincronizzazione mTPM per ogni 30 fotogrammi della registrazione del fotogramma video del comportamento. I timestamp del comportamento verranno salvati anche nella postazione di lavoro del dispositivo di comportamento 3D.
   5. Verificare se sono stati salvati quattro file .avi di video di comportamento, un file .txt di timestamp di comportamento nel dispositivo di comportamento 3D e un file .tdms e un file .tdms_index dei timestamp di comportamento nella workstation mTPM.
4. Calibrazione della fotocamera del dispositivo di comportamento 3D
   1. Regola l'angolo di ripresa di quattro telecamere. Le quattro telecamere dovrebbero coprire in modo completo l'intera base del campo aperto, estendendo al contempo il campo visivo di almeno 20 cm al di sopra del limite più lontano del campo aperto, per garantire che le istanze del topo che si impenna siano completamente catturate.
   2. Posizionare il modulo di calibrazione al centro delle aree di ripresa. Eseguire il software di calibrazione della fotocamera. Prima di eseguire il software di calibrazione della fotocamera, spegnere tutte le luci.
      NOTA: Quattro telecamere cattureranno i fotogrammi della scacchiera mobile visualizzata dalla schermata di calibrazione. La calibrazione della fotocamera si basa sul metodo di calibrazione²⁹ di Zhang.
   3. Dopo aver eseguito il software di calibrazione della fotocamera, verrà salvato un file .mat, che contiene la matrice di proiezione della fotocamera per la ricostruzione della posa 3D degli animali. Poiché l'indicizzazione dei dati di comportamento nella fase di sincronizzazione del sistema si basa sul file .mat di calibrazione, assicurarsi che la fase di calibrazione della fotocamera sia terminata prima della fase di sincronizzazione dell'intero sistema.
5. Sincronizzazione dell'intero sistema
   NOTA: prima di questo passaggio, assicurarsi che i timestamp dei frame mTPM e del dispositivo di comportamento 3D possano essere ricevuti separatamente dal software di sincronizzazione mTPM.
   1. Attivare tutti gli alimentatori del dispositivo mTPM e del dispositivo di comportamento 3D.
   2. Avviare il software di registrazione mTPM, il software di sincronizzazione mTPM e lo script di sincronizzazione della fotocamera personalizzato.
   3. Impostare il loro percorso e i parametri facendo riferimento al passaggio 1.3.1. Avviare la registrazione di mTPM tramite il software di registrazione mTPM.
   4. Eseguire lo script di sincronizzazione della fotocamera personalizzato. Assicurarsi che l'inizio della registrazione dei frame mTPM sia prima dell'esecuzione dello script di registrazione del comportamento in modo che il software di sincronizzazione mTPM possa ricevere i timestamp dal dispositivo di comportamento 3D. Impostare l'ora di fine della registrazione dei frame mTPM su un valore superiore al tempo di registrazione del comportamento in modo che il software di sincronizzazione mTPM possa acquisire i timestamp del comportamento senza perdite.
      NOTA: il tempo di registrazione dei frame mTPM consigliato è superiore a 5 minuti di registrazione del comportamento. Ad esempio, se l'utente desidera registrare un comportamento di 15 minuti, il numero di fotogrammi mTPM deve essere impostato su 4,84 x (15+5) x 60 = 5808 fotogrammi.
   5. Attendere l'arresto della registrazione. Dopo la registrazione, è presente un file di .tif frame mTPM, due file TDMS di sincronizzazione mTPM, due file .tdms_index, quattro file di .avi video di comportamento e un file di .txt timestamp di comportamento.
   6. Eseguire il codice di sincronizzazione personalizzato per allineare il frame mTPM e i video di comportamento. Il codice di sincronizzazione personalizzato è a https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step1_align_tpm_data.m.
      1. Prima di eseguire questo script, organizzare manualmente i file come segue:
         ----\Percorso radice # Il percorso per salvare tutti i dati
         --------\behavior_all # Il percorso per salvare i dati sul comportamento
         ------------\A-B-C-D-E-caliParas.mat # File di calibrazione della fotocamera
         ------------\A-B-C-D-E-camera-1.avi # video di comportamento dalla telecamera 1
         ------------\A-B-C-D-E-camera-2.avi # video di comportamento dalla telecamera 2
         ------------\A-B-C-D-E-camera-3.avi # video di comportamento dalla telecamera 3
         ------------\A-B-C-D-E-camera-4.avi # video di comportamento dalla telecamera 4
         ------------\A-B-C-D-E-event.txt # timestamp del comportamento dal dispositivo di comportamento 3D
         ----\tpm_suite2p # Il percorso per salvare i dati mTPM
         --------\sep # Il percorso per salvare i frame mTPM e i timestamp
         ------------\A-B-C-D-E-event # Il percorso per eseguire l'allineamento del timestamp
         ----------------\beh.tdms # Il file .tdms del canale di comportamento
         ----------------\beh.tdms_index #The file di .tdms_index del canale di comportamento
         ----------------\tpm.tdms # Il file .tdms del canale mTPM
         ----------------\tpm.tdms_index # Il file .tdms_index del canale mTPM
         ------------\A-B-C-D-E-tpm # Il percorso per salvare i frame mTPM
         ----------------\F.tif # I fotogrammi mTPM di ogni registrazione
         --------\process # Il percorso per estrarre le tracce neurali
         ------------\C # Il percorso di ogni mouse
         ----------------\F.tif # I fotogrammi mTPM di ciascun mouse
         Da A a G sono definizioni di campi nome, dove
         A significa gruppi sperimentali, ad esempio, liberi,
         B indica la sequenza di video, ad esempio, seg1,
         C indica l'identità degli animali, ad esempio, 1tpmss,
         D indica i partner di interazione, ad esempio 1wt,
         E indica la data sperimentale, ad esempio 20220226, e
         F indica il blocco di fotogrammi di registrazione mTPM (5000 fotogrammi per blocco), ad esempio social 1.
         NOTA: Il frame rate del sistema di tracciamento comportamentale 3D è di 30 Hz, mentre quello dell'mTPM è di 4,84 Hz. Poiché la massima precisione di sincronizzazione ottenibile è limitata dalla frequenza di fotogrammi più bassa (4,84 Hz), la risoluzione temporale della sincronizzazione è di circa 206 ms. I timestamp comportamentali fungono da riferimento e ogni frame mTPM è allineato al punto temporale comportamentale più vicino. Gli intervalli tra i fotogrammi mTPM successivi rispetto alla sequenza temporale comportamentale vengono interpolati utilizzando un approccio graduale.

2. Registrazione dei dati neuroetologici

NOTA: Il processo di registrazione dei dati neuroetologici consiste in quattro passaggi chiave (Figura 1B).

1. Montaggio di mTPM
   NOTA: poiché i dettagli del montaggio mTPM sono contenuti nell'esercitazione di mTPM, qui vengono introdotti solo i passaggi chiave.
   1. Prepara la finestra cranica.
      NOTA: La preparazione della finestra cranica comprende principalmente l'iniezione del virus, l'impianto del vetro di copertura e il fissaggio della piastra metallica. Poiché i siti di imaging sono diversi in varie ricerche, i dettagli della preparazione della finestra cranica sono diversi. In questo caso, la preparazione della finestra cranica viene eseguita da un servizio di outsourcing. L'area cerebrale di imaging nei dati di esempio è la corteccia somatosensoriale primaria (S1).
   2. Fissare il restrain del mouse al micromanipolatore mTPM. Fissare la testa del mouse al sistema di ritenuta attraverso la piastra metallica.
   3. Trova la fluorescenza attraverso mTPM. Spegnere tutte le luci prima di attivare l'imaging mTPM. Fissare l'mTPM al supporto prima dei passaggi seguenti.
      1. Aggiungere una goccia di gel oculare Carbomer nella parte superiore della finestra cranica. Spostare il mouse attraverso la piattaforma di movimento quando la finestra cranica è allineata sotto l'obiettivo mTPM.
      2. Spostare il micromanipolatore verticalmente per trovare il piano di imaging. Spostare il micromanipolatore all'interno del piano per centrare il piano di imaging.
   4. Fissare la base superiore all'mTPM. Incolla la base inferiore alla base superiore e alla finestra cranica.
      1. Per garantire la stabilità strutturale, riempire lo spazio tra le due basi e la staffa della piastra metallica fissata alla testa del mouse e incollarla con un adesivo strutturale acrilico ad alte prestazioni. Polimerizzare l'adesivo per 30 minuti prima di valutare la stabilità del legame sondando delicatamente la base con una pinzetta. Se necessario, viene applicato un adesivo aggiuntivo fino a ottenere un fissaggio sicuro.
         NOTA: È essenziale evitare qualsiasi adesione diretta tra la base e l'mTPM stesso. Le basi superiore e inferiore sono piccoli telai in alluminio. La base superiore è realizzata su misura per adattarsi perfettamente al contorno inferiore dell'alloggiamento mTPM. Le basi inferiori con più opzioni di altezza vengono utilizzate per colmare lo spazio tra la base superiore e la finestra cranica. Tutte le basi inferiori hanno le stesse dimensioni planari della base superiore per garantire la compatibilità meccanica, differendo esclusivamente in altezza per adattarsi alle diverse distanze tra cranio e base superiore.
   5. Aggiungere una goccia di gel oculare Carbomer all'interno della camera di base. Controllare la fluorescenza neuronale attraverso mTPM. Se la fluorescenza neuronale non è chiaramente visibile, rimuovere l'adesivo utilizzando un trapano cranico, consentendo la separazione della base, dopodiché la procedura di cui sopra viene ripetuta fino a raggiungere la chiarezza della fluorescenza.
   6. Fissare il foglio di alluminio con del nastro adesivo tra la fibra di mTPM e la finestra cranica.
      NOTA: Questo passaggio serve a mantenere un'adeguata schermatura della luce durante tutto il processo di registrazione. L'uso di fogli di alluminio e nastro adesivo è stato ridotto al minimo per ridurre il peso complessivo.
   7. Accendi la luce della stanza e verifica la nitidezza dei fotogrammi mTPM.
2. Mettere il mouse in un campo aperto
   NOTA: questo passaggio prevede il posizionamento del mouse in campo aperto, garantendo al contempo un corretto bilanciamento del peso per la fibra e mTPM.
   1. Gonfia almeno 10 palloncini di elio e legalo separatamente con dello spago di cotone. Staccare la piastra metallica dal fermamouse.
   2. Tieni il mouse per la coda usando una mano. Supporta la fibra mTPM usando l'altra mano.
   3. Posizionare delicatamente il mouse in campo aperto. Sospendi i palloncini di elio usando lo spago di cotone alla fibra. Regola il numero di palloncini fino a quando il mouse può muoversi liberamente ed esplorare il campo aperto senza vincoli.
      NOTA: Il numero ottimale di palloncini viene determinato quando il topo rimane a terra, con gli arti anteriori non sollevati dalla spinta verso l'alto, pur bilanciando sufficientemente il peso dell'mTPM per consentire all'animale di mantenere una postura naturale della testa e di stare in piedi spontaneamente. Lo spago di cotone deve essere legato ad un'altezza sopra il campo aperto per garantire una lunghezza delle fibre sufficiente per il movimento illimitato del topo. Lo spago di cotone era legato all'altezza della fibra ottica, che era approssimativamente allineata con il bordo superiore della camera a campo aperto. Nell'esempio fornito, una volta completato questo passaggio, un topo non trattato viene introdotto nel campo aperto per consentire la libera interazione sociale.
   4. Chiudere lo sportello dell'enclosure mTPM per ridurre al minimo i disturbi esterni.
3. Attivazione della registrazione mTPM.
   1. Avviare il software di registrazione mTPM e il software di sincronizzazione mTPM. Imposta il loro percorso e i parametri riferiti alla fase di creazione della piattaforma.
   2. Avviare la registrazione di mTPM tramite il software di registrazione mTPM. Verificare la presenza di marcatori temporali corrispondenti a ciascun fotogramma a due fotoni all'interno del software di sincronizzazione.
   3. Valutare se il contrasto delle immagini a due fotoni rimane inalterato e confermare che la locomozione del mouse non comprometta la stabilità dei fotogrammi registrati. Se vengono rilevati problemi, ripetere la procedura di sincronizzazione e il processo di montaggio mTPM fino a quando l'imaging a due fotoni non produce fotogrammi chiari con marcatori temporali accuratamente allineati.
4. Attivazione della registrazione del comportamento
   1. Avviare lo script di sincronizzazione della fotocamera personalizzato.
      NOTA: Il codice di sincronizzazione della fotocamera personalizzato è a https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/camera_code/mul_camera_save_video_event.py.
   2. Imposta il percorso e i parametri riferiti alla fase di creazione della piattaforma.
   3. Avvia la registrazione del comportamento tramite lo script di sincronizzazione della fotocamera personalizzato. Verificare la presenza di marcatori temporali corrispondenti a ogni 30 frame di comportamento all'interno del software di sincronizzazione mTPM.
   4. Controlla se i quattro flussi video provenienti dalle telecamere sono sincronizzati correttamente e controlla i parametri di acquisizione video del sistema di tracciamento comportamentale 3D.
      NOTA: Nella configurazione di cui sopra, le telecamere utilizzano una risoluzione dei fotogrammi di 640 × 480 pixel, una frequenza dei fotogrammi di 30 fotogrammi al secondo, fotogrammi RGB ed esposizione automatica. L'esposizione automatica consente alla telecamera di regolare dinamicamente la luminosità in base alle condizioni di illuminazione ambientale. Poiché il tempo di esposizione influisce direttamente sulla frequenza dei fotogrammi ottenibile, in particolare in condizioni di scarsa illuminazione in cui sono richieste esposizioni più lunghe, la frequenza dei fotogrammi potrebbe diminuire. Per garantire un'acquisizione stabile dei fotogrammi a 30 Hz, è importante controllare l'illuminazione dello sfondo per ridurre al minimo il tempo di esposizione. Le impostazioni di guadagno e binning della telecamera vengono mantenute ai valori predefiniti per tutta la durata della registrazione.
   5. La registrazione comportamentale si interromperà automaticamente una volta raggiunta la durata predefinita. Dopo aver completato la registrazione comportamentale, disattivare manualmente la registrazione e la sincronizzazione mTPM. Seguendo questi passaggi, viene completata un'unica prova di acquisizione simultanea di dati neurali e comportamentali.

3. Pre-elaborazione dei dati neuroetologici

NOTA: Se tutti i passaggi precedenti vengono completati correttamente, è necessario ottenere tre categorie di file di dati: fotogrammi di imaging a due fotoni (.tif), quattro registrazioni video comportamentali (.avi) insieme a un file di calibrazione della fotocamera (.mat) e due file di timestamp di sincronizzazione (.tdms) per la successiva pre-elaborazione dei dati (Figura 1C). Questi dati devono essere rinominati manualmente e inseriti nelle cartelle che fanno riferimento al passaggio 1.5.7.

1. Pre-elaborazione dei dati mTPM
   1. Estrai le traiettorie dei segnali neurali dai frame mTPM tramite suite2p³⁰. Mantieni i parametri di suite2p ai loro valori predefiniti per garantire la riproducibilità. Regolare solo la frequenza dei fotogrammi in modo che corrisponda alle impostazioni di acquisizione mTPM.
      NOTA: Poiché le fasi successive includono l'elaborazione del segnale e il controllo di qualità, non è necessario mettere a punto in modo approfondito i parametri suite2p in questa fase. Mantenere la coerenza tra i set di dati è di maggiore importanza.
   2. Eseguire il codice personalizzato per allineare i timestamp tra i frame mTPM e i video di comportamento.
      NOTA: questo script allinea i timestamp degli eventi comportamentali con i tempi di acquisizione mTPM corrispondenti. Genera e salva mappature di indici per ogni registrazione, consentendo l'analisi sincronizzata del comportamento e dei dati neurali. Questo codice personalizzato è disponibile a https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step1_align_tpm_data.m.
   3. Eseguire il codice personalizzato per convertire il formato dei dati dall'output suite2p.
      NOTA: questo script estrae e riorganizza i dati mTPM per i singoli animali identificando e mappando gli indici dei frame pertinenti. Seleziona le tracce di attività neurale corrispondenti e le ristruttura in un formato di dati standardizzato, consentendo un'analisi semplificata a valle delle registrazioni segmentate. Questo codice personalizzato è disponibile a https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step2_separate_tpm_data.m.
   4. Esegui il codice personalizzato per ricampionare i segnali neurali in modo che si allineino con i frame di comportamento.
      NOTA: questo script esegue il ricampionamento temporale dei dati mTPM per allineare le tracce di attività neurale con i timestamp comportamentali. Carica i dati neurali precedentemente segmentati e gli indici di sincronizzazione, estrae di conseguenza le tracce ricampionate e salva l'output in un formato standardizzato per un'ulteriore elaborazione del segnale. Il metodo del ricampionamento temporale è l'interpolazione graduale. Questo codice personalizzato è disponibile a https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step3_resample_tpm_data.m.
   5. Esegui il codice personalizzato per perfezionare le traiettorie neurali.
      1. Poiché l'interpolazione graduale può introdurre artefatti di squillo e rumore ad alta frequenza, progettare un filtro passa-basso equiripple con una frequenza della banda passante di 2 Hz e una frequenza della banda di arresto di 2,2 Hz per mitigare questi artefatti. L'ordine del filtro è 61.
      2. Successivamente, utilizzare il metodo di denoising di Weijian Zong per raffinare le tracce di calcio mTPM ricampionate¹³. Stima le linee di base locali utilizzando criteri percentili e di varianza locale e calcola i segnali ΔF/F. ΔF/F è una misura adimensionale che rappresenta la variazione relativa dell'intensità della fluorescenza rispetto al basale, comunemente utilizzata per quantificare l'attività neurale nell'imaging del calcio. Poiché sia il numeratore (ΔF) che il denominatore (F) sono espressi in unità di fluorescenza arbitrarie, il valore ΔF/F risultante non ha unità fisica ed è espresso come rapporto o percentuale. Le celle con segnali estremamente piatti o saturi vengono escluse in base alle soglie di intervallo del segnale. Le tracce di attività neurale di alta qualità risultanti vengono salvate per l'analisi a valle (Figura 2A, Figura 3A e Figura 4A).
         NOTA: Il codice personalizzato è disponibile all'indirizzo https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step4_filter_tpm_data.m.
2. Pre-elaborazione dei dati sul comportamento
   1. Estrai le pose comportamentali dalle registrazioni video utilizzando un tracker di pose anti-deriva (ADPT)⁷.
      NOTA: ADPT affronta il problema della frequente deriva dei punti osservata nei metodi basati su reti neurali convoluzionali come DeepLabCut⁶ e SLEAP²². L'ADPT è particolarmente adatto per gli scenari che coinvolgono dispositivi di registrazione neurale, come l'imaging mTPM in animali che si muovono liberamente, in quanto riduce efficacemente la deriva del punto causata dal movimento della fibra. Il repository di ADPT è a https://github.com/tangguoling/ADPT.
      1. Dato che la configurazione sperimentale coinvolge due topi, con l'mTPM che funge da identificatore per uno di essi, addestrare due modelli ADPT indipendenti a topo singolo per stimare separatamente le pose di ciascun topo.
      2. Per ogni modello, annota manualmente 16 punti chiave 1,10,15,31 - inclusi il naso, l'orecchio sinistro, l'orecchio destro, il collo, gli arti anteriori sinistro e destro, gli arti posteriori sinistro e destro, le zampe anteriori sinistra e destra, le zampe posteriori sinistra e destra, la parte posteriore, la base della coda, la parte centrale della coda e la punta della coda - per circa 600 fotogrammi, con 150 fotogrammi etichettati manualmente per ogni vista della telecamera per un video di 15 minuti.
      3. Addestrare i modelli ADPT utilizzando i parametri predefiniti. I dettagli dei parametri di training e di stima sono a https://github.com/tangguoling/ADPT/blob/main/code/config.yaml e https://github.com/tangguoling/ADPT/blob/main/code/config_predict.yaml.
   2. Ricostruzione di pose di animali in 3D. Una volta addestrati, applica i due modelli in modo indipendente per prevedere le pose di ciascun mouse da ciascuno dei video acquisiti da fotocamere diverse. Unire i dati risultanti in un unico file di tabella per un'ulteriore elaborazione.
   3. Eseguire una ricostruzione 3D delle traiettorie comportamentali utilizzando la triangolazione in combinazione con il file di calibrazione della fotocamera³². Dopo la ricostruzione, ottenere le traiettorie di movimento del topo soggetto (quello che trasporta l'mTPM, Figura 2B, Figura 3B, Figura 4B) e del topo oggetto (il conspecifico interagente, Figura 2C, Figura 3C, Figura 4C) per la successiva analisi.
   4. Negli studi sull'interazione sociale, le distanze interindividuali fungono da indicatori critici delle dinamiche sociali³³. Calcolare le distanze corporee relative tra i due topi utilizzando le distanze euclidee a coppie tra i punti corporei corrispondenti, fornendo misure quantitative per ulteriori analisi del comportamento sociale (Figura 2D, Figura 3D, Figura 4D).
   5. Scomporre e classificare i motivi comportamentali.
      NOTA: Anche se i passaggi precedenti producono traiettorie di posa a grana fine, non ci dicono ancora cosa sta facendo l'animale. Il comportamento si riferisce al modo in cui un animale si muove in un periodo specifico e l'assegnazione del comportamento implica l'attribuzione a ciascuno di tali periodi di un'etichetta significativa e interpretabile dall'uomo. Il modo normale è quello di utilizzare le annotazioni umane.
      1. Poiché le registrazioni comportamentali sono spesso troppo lunghe per essere etichettate manualmente nella loro interezza, utilizza metodi di apprendimento automatico.
         NOTA: l'apprendimento supervisionato aderisce a regole di etichettatura predefinite: gli annotatori umani assegnano etichette a segmenti di comportamento selezionati, che vengono quindi utilizzati per addestrare l'apprendimento automatico o i modelli di intelligenza artificiale per prevedere le etichette nell'intero set di dati. Sebbene questo approccio migliori l'efficienza della classificazione del comportamento, rimane vincolato dall'insieme limitato di etichette interpretabili dall'uomo, una limitazione particolarmente significativa quando si ha a che fare con comportamenti complessi e naturalistici. Per catturare la ricca variabilità dei comportamenti naturalistici, sono stati sviluppati metodi di classificazione del comportamento non supervisionati. Questi approcci identificano le somiglianze intrinseche tra i motivi comportamentali nel tempo e le raggruppano all'interno di spazi di caratteristiche a bassa dimensione, consentendo un'interpretazione umana più efficiente e imparziale. In sostanza, la classificazione supervisionata si basa su etichette umane predefinite per guidare il riconoscimento del comportamento, mentre la classificazione non supervisionata scopre strutture comportamentali latenti senza etichettatura preventiva, offrendo una maggiore flessibilità nel catturare dinamiche naturalistiche complesse.
      2. Nell'ambito del comportamento naturalistico, identificare i motivi comportamentali dei due topi utilizzando l'Atlante del comportamento (BeA)¹⁰ e l'Atlante del comportamento sociale (SBeA)¹ ( Figura 2E, Figura 3E, Figura 4E), entrambi metodi di clustering non supervisionati progettati per la segmentazione comportamentale. Questi metodi scompongono e raggruppano il comportamento animale in motivi inferiori al secondo basati sulle loro strutture dinamiche e gerarchiche intrinseche³⁴, associandoli successivamente a categorie comportamentali definite.
   6. Estrai motivi comportamentali di singoli topi usando BeA.
      1. Per ridurre il rumore, applicare un filtro mediano con una finestra temporale di 500 ms. Eseguire l'allineamento del corpo utilizzando i punti chiave della base posteriore e della coda per facilitare la scomposizione dei movimenti non locomotori, mentre i punti chiave dell'arto anteriore destro, dell'arto anteriore sinistro, dell'arto posteriore destro e dell'arto posteriore sinistro vengono utilizzati per la normalizzazione delle dimensioni del corpo.
      2. Per la scomposizione del comportamento, utilizzare 39 coordinate corporee allineate, tra cui: naso (x, y, z), orecchio sinistro (x, y, z), orecchio destro (x, y, z), collo (x, y, z), arto anteriore sinistro (x, y, z), arto anteriore destro (x, y, z), arto posteriore sinistro (x, y, z), arto posteriore destro (x, y, z), zampa anteriore sinistra (x, y, z, z), zampa anteriore destra (x, y, z), zampa posteriore sinistra (x, y, z), zampa posteriore destra (x, y, z), posteriore (z) e base della coda (x, z).
      3. Impostare l'indice di riduzione temporale su 5, con una risoluzione di clustering pari a 3. Utilizzare il clustering spettrale per l'inizializzazione, impiegando un kernel gaussiano con una larghezza di banda sigma di 30. Impostare le lunghezze di segmentazione minima e massima rispettivamente su 500 ms e 2000 ms.
      4. Per l'incorporamento del motivo comportamentale, applicare UMAP con 30 vicini più prossimi e una distanza minima di 0,05. Raggruppa i motivi attraverso il clustering gerarchico utilizzando il collegamento di Ward e la distanza euclidea a coppie per migliorare la stabilità della classificazione. Il repository di BeA si trova all'indirizzo
      5. Identifica i motivi comportamentali sociali utilizzando SBeA. Impostare i parametri di inizializzazione per SBeA in modo che siano coerenti con quelli utilizzati in BeA, con le seguenti modifiche: la dimensione mediana della finestra del filtro è impostata a 1000 ms, la lunghezza minima di segmentazione è aumentata a 2000 ms e la lunghezza massima di segmentazione è estesa a 5000 ms per la scomposizione del comportamento sociale.
      6. Per l'incorporamento del motivo, applicare un kernel gaussiano con una larghezza di banda sigma di 2. Il numero finale di cluster di comportamento sociale varia da 16 (limite inferiore) a 280 (limite superiore). Negli esempi presentati, solo i 16 cluster più grandi vengono utilizzati a scopo dimostrativo. Il repository di SBeA è a https://github.com/YNCris/SBeA_release/blob/main/README_SBeA_mapper.md.

4. Mappatura dei dati neuroetologici

1. Preparare i set di dati di mappatura. A seguito delle preparazioni di cui sopra, sono disponibili sette set di dati per la mappatura neuroetologica, tra cui attività neuronali, pose del soggetto, pose dell'oggetto, distanze del corpo, motivi del comportamento del soggetto, motivi del comportamento dell'oggetto e motivi del comportamento sociale. Organizzare manualmente questi file come segue:
   Percorso dati # Il percorso per salvare tutti i dati
   ----\A-B-C-D-E-neu.mat # Attività neuronali
   ----\A-B-C-D-E-pose-tpm.mat # Il soggetto si posa
   ----\A-B-C-D-E-pose-free.mat # Pose oggetto
   ----\A-B-C-D-E-rel_dist.mat # Distanze del corpo
   ----\A-B-C-D-E-mov-tpm.mat # Motivi di comportamento del soggetto
   ----\A-B-C-D-E-mov-free.mat # Motivi di comportamento dell'oggetto
   ----\A-B-C-D-E-sbea.mat # Motivi di comportamento sociale
   Le definizioni dei campi A, B, C, D ed E sono le stesse del punto 1.5.7. I dati dimostrativi per la riproduzione sono a https://doi.org/10.6084/m9.figshare.29606795.v1.
2. Creare gli incorporamenti della mappatura utilizzando CEBRA.
   NOTA: Dato che CEBRA integra approcci basati su ipotesi e scoperte per costruire embedding, è adatto per scoprire rappresentazioni neurali associate a varie variabili ausiliarie (Figura 5A).
   1. Per garantire un confronto sistematico degli embedding tra diverse modalità, standardizzare i parametri dei modelli CEBRA. L'architettura del modello utilizza i 10 offset, con una dimensione del batch di 1024, una velocità di apprendimento di 0,0001 e un parametro di temperatura di 1.
   2. Imposta la dimensione di output su 3 ed esegui l'addestramento per un massimo di 15.000 iterazioni. Usa la distanza del coseno come metrica di somiglianza, mentre la variabile condizionale è definita come il delta temporale con un offset temporale di 10. Utilizzare i dati dell'attività neuronale come input e le variabili ausiliarie come etichette per generare incorporamenti articolari.
3. Per l'auto-incorporazione delle attività neuronali, applicare gli stessi parametri CEBRA, ma utilizzare solo i dati dell'attività neuronale come input.

Results

Lo studio del comportamento naturale presenta una maggiore complessità rispetto agli esperimenti basati su prove. In primo luogo, in condizioni naturali, sia l'attività neurale che il comportamento mancano di una linea di base fissa. Queste attività sono ricorrenti, il che significa che sono influenzate da stati precedenti, e quindi, l'allineamento dell'insorgenza di comportamenti specifici per il confronto dell'attività neurale non riesce a districare gli effetti di precedenti stati neuroetologici. In secondo luogo, la codifica neurale nel comportamento naturale si verifica principalmente a livello di popolazione ^4,5. La variabilità osservata nei singoli neuroni è abbastanza sostanziale da essere considerata come rumore. Per convalidare ciò, questa parte ha condotto un'analisi di correlazione tra l'attività neurale e le pose comportamentali naturali (Figura 2F, Figura 3F, Figura 4F). Le matrici del coefficiente di correlazione risultanti non hanno rivelato alcuna corrispondenza neurone-specifica con le tracce di posa. In particolare, i coefficienti di correlazione tra i segnali neurali e le pose del soggetto, le pose degli oggetti o le distanze intercorporee rientrano tutti nell'intervallo da -0,3 a +0,3, comunemente considerati come correlazioni deboli¹⁵ (Figura 2G, Figura 3G, Figura 4G). Questi risultati indicano che, in condizioni naturalistiche, le informazioni relative alla posa non sono codificate in modo neurone-specifico.

Alla luce di questi fattori, questo quadro offre un approccio oggettivo per acquisire e mappare i dati neuroetologici a livello di popolazione neurale. L'imaging mTPM garantisce che la variabilità dei singoli neuroni sia preservata il più possibile. Inoltre, l'uso della stima della posa basata sul deep learning mediante ADPT e metodi di scomposizione del comportamento non supervisionati, come BeA e SBeA, genera ricche variabili ausiliarie, consentendo a CEBRA di interpretare efficacemente la variabilità all'interno delle popolazioni neurali.

Questi esempi dimostrano che gli incorporamenti CEBRA congiunti sono presenti in tutte le variabili ausiliarie, comprese le pose del soggetto, le pose dell'oggetto, le distanze del corpo, i motivi del comportamento del soggetto, i motivi del comportamento dell'oggetto e i motivi del comportamento sociale (Figura 5A). Al fine di verificare la coerenza dei motivi comportamentali e degli incorporamenti neurali tra le sessioni o i soggetti, l'analisi di Procuste³⁵ viene utilizzata su tre coppie di topi (Figura 5B). Dato che le inclusioni CEBRA sono distribuite su una sfera unitaria, è stato abilitato solo il parametro di rotazione nell'analisi di Procuste. Poiché le inclusioni CEBRA a comportamento naturale mancano di una linea di base chiara, questa parte ha prima eseguito il campionamento dell'allineamento guidato dall'etichetta sulle inclusioni per allinearsi, garantendo punti di ancoraggio coerenti prima di applicare l'analisi di Procuste. Visivamente, questi inserti CEBRA mostrano un certo grado di coerenza intrinseca, con la distanza del corpo e i motivi sociali che mostrano il massimo allineamento. Si adatta alla quantificazione dell'RMSE prima e dopo l'allineamento di Procuste (Figura 5C). Quindi, l'accuratezza della decodifica dell'incorporamento viene confrontata per le pose (Figura 5D) e i motivi (Figura 5E). Sebbene le loro rappresentazioni differiscano, ognuna è decodificabile con elevata precisione. Sebbene l'RMSE di decodifica della distanza del corpo sia significativamente superiore a quello delle pose del soggetto e dell'oggetto, non è superiore alla precisione di tracciamento dell'ADPT⁷.

Per esplorare le origini di questi incorporamenti guidati da ipotesi, è stato generato un incorporamento auto-organizzato dell'attività neurale attraverso CEBRA (Figura 5A, colonna di destra). La forma dell'incorporamento neurale è più complessa rispetto agli altri incorporamenti articolari, incorporando modelli di vari incorporamenti articolari. Inoltre, le somiglianze tra le inclusioni neurali e le inclusioni articolari sono state confrontate utilizzando la trasformazione di Procuste, e quindi sono state confrontate le loro somiglianze con il coseno (Figura 5F). La somiglianza del coseno è derivata al minuto tra gli incorporamenti allineati nei punti temporali corrispondenti.

L'inclusione congiunta della posa del soggetto S1 è stata selezionata come base per i confronti di somiglianza basati sul ruolo ben consolidato dell'S1 nella codifica di input somatosensoriali auto-organizzati³⁶. Questo incorporamento funge da punto di riferimento biologicamente significativo per valutare come altre variabili, come i motivi relativi agli oggetti, sono rappresentate all'interno dello stesso spazio neurale. Tali confronti ci permettono di valutare la forza relativa della codifica per diverse dimensioni comportamentali rispetto a una linea di base somatosensoriale auto-correlata.

Quando si confronta la somiglianza del coseno degli incorporamenti neurali con il soggetto S1 pone l'incorporamento congiunto come linea di base, questo studio rileva che gli incorporamenti articolari per i motivi degli oggetti sono significativamente più bassi. Ciò suggerisce che, durante il periodo di 15 minuti di interazione sociale libera in questo esempio, le attività neurali S1 del topo soggetto codificano principalmente sia il suo comportamento che le interazioni sociali in corso. Sebbene questa analisi funga da caso dimostrativo, lo stesso quadro metodologico può essere facilmente applicato a indagini più granulari, ad esempio confrontando le strutture di incorporamento in epoche temporali distinte per scoprire cambiamenti dinamici nella codifica neurale.

Figura 1: Procedura per la raccolta dei dati neuroetologici. (A) L'integrazione dei dispositivi. (B) L'operazione di registrazione dei dati. (C) Estrazione del segnale neurale, stima della posa 2D e ricostruzione 3D della traiettoria corporea dopo la registrazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Dati pre-elaborati del topo 1 per ulteriori analisi. (A) Attività neuronali. (B) Pose del soggetto. (C) Pose di oggetti. (D) Distanza del corpo. (E) Motivi comportamentali. Dall'alto verso il basso ci sono i motivi del soggetto, dell'oggetto e del comportamento sociale. (F) Le matrici del coefficiente di correlazione tra attività neurale e pose. A sinistra: i coefficienti di correlazione tra l'attività neurale e le pose del soggetto. Al centro: i coefficienti di correlazione tra l'attività neurale e le pose degli oggetti. A destra: i coefficienti di correlazione tra attività neurale e distanza corporea. I coefficienti di correlazione sono tra ogni traccia neuronale e ogni dimensione di posa. (G) Le distribuzioni dei coefficienti di correlazione di F. Gli indici dei neuroni sono ordinati in base ai coefficienti di correlazione tra l'attività neurale e le pose del soggetto. Abbreviazioni: N & S = attività neurale e pose del soggetto, N & O = attività neurale e pose dell'oggetto, N & B = attività neurale e distanze del corpo, CC = coefficienti di correlazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Dati pre-elaborati del topo 2 per ulteriori analisi. (A) Attività neuronali. (B) Pose del soggetto. (C) Pose di oggetti. (D) Distanza del corpo. (E) Motivi comportamentali. Dall'alto verso il basso ci sono i motivi del soggetto, dell'oggetto e del comportamento sociale. (F) Le matrici del coefficiente di correlazione tra attività neurale e pose. A sinistra: i coefficienti di correlazione tra l'attività neurale e le pose del soggetto. Al centro: i coefficienti di correlazione tra l'attività neurale e le pose degli oggetti. A destra: i coefficienti di correlazione tra attività neurale e distanza corporea. I coefficienti di correlazione sono tra ogni traccia neuronale e ogni dimensione di posa. (G) Le distribuzioni dei coefficienti di correlazione di F. Gli indici dei neuroni sono ordinati in base ai coefficienti di correlazione tra l'attività neurale e le pose del soggetto. Abbreviazioni: N & S = attività neurale e pose del soggetto, N & O = attività neurale e pose dell'oggetto, N & B = attività neurale e distanze del corpo, CC = coefficienti di correlazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Dati pre-elaborati del topo 3 per ulteriori analisi. (A) Attività neuronali. (B) Pose del soggetto. (C) Pose di oggetti. (D) Distanza del corpo. (E) Motivi comportamentali. Dall'alto verso il basso ci sono i motivi del soggetto, dell'oggetto e del comportamento sociale. (F) Le matrici del coefficiente di correlazione tra attività neurale e pose. A sinistra: i coefficienti di correlazione tra l'attività neurale e le pose del soggetto. Al centro: i coefficienti di correlazione tra l'attività neurale e le pose degli oggetti. A destra: i coefficienti di correlazione tra attività neurale e distanza corporea. I coefficienti di correlazione sono tra ogni traccia neuronale e ogni dimensione di posa. (G) Le distribuzioni dei coefficienti di correlazione di F. Gli indici dei neuroni sono ordinati in base ai coefficienti di correlazione tra l'attività neurale e le pose del soggetto. Abbreviazioni: N & S = attività neurale e pose del soggetto, N & O = attività neurale e pose dell'oggetto, N & B = attività neurale e distanze del corpo, CC = coefficienti di correlazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Analisi dell'incorporamento di dati neuroetologici da parte di CEBRA. (A) Incorporamento di CEBRA. Da sinistra a destra ci sono l'incorporamento congiunto dell'attività neurale S1 e delle pose del soggetto, l'incorporamento congiunto dell'attività neurale S1 e delle pose dell'oggetto, l'incorporamento congiunto dell'attività neurale S1 e delle distanze corporee tra due animali, l'incorporamento congiunto dell'attività neurale S1 e dei motivi di comportamento del soggetto, l'incorporamento congiunto dell'attività neurale S1 e dei motivi di comportamento dell'oggetto, l'incorporamento congiunto dell'attività neurale S1 e dei motivi del comportamento sociale e l'incorporamento neurale di S1. (B) L'analisi di Procuste allinea le inclusioni di cui sopra. I cerchi grigi rappresentano la coppia di topi 1, che funge da incorporamento di riferimento. I segni più verdi rappresentano la coppia di topi 2 e le croci arancioni rappresentano la coppia di topi 3, entrambi allineati alla coppia di topi 1. (C) L'errore quadratico medio (RMSE) prima (a sinistra) e dopo (a destra) l'allineamento di Procuste (test t accoppiato, n=3, media ± SEM). (D) L'RMSE della ricostruzione della posa da incorporamenti CEBRA (ANOVA unidirezionale seguita dal test di confronto multiplo di Tukey, n=3, media ± SEM). (E) L'accuratezza della ricostruzione del motivo dagli incorporamenti CEBRA (ANOVA unidirezionale seguita dal test di confronto multiplo di Tukey, n=3, media ± SEM). (F) Le somiglianze del coseno tra l'incorporamento congiunto e l'incorporamento neurale di S1 (ANOVA unidirezionale seguita dal test di confronto multiplo di Dunnett, n=45, media ± SEM). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

No.	Problema rilevato	Probabile causa	Possibili soluzioni
1	Nessun timestamp di comportamento	(1) Cavi SMA o BNC difettosi	(1) Sostituire i cavi SMA e BNC
		(2) Driver USB-to-TTL mancante	(2) Installare il driver USB Prolific PL2303
		(3) Selezione errata della porta COM	(3) Verificare il numero della porta COM in Gestione periferiche e aggiornarlo sia nel software mTPM che nello script del comportamento della fotocamera.
2	Nessuna fluorescenza visibile durante il montaggio in mTPM	(1) Mancanza di espressione virale	(1) Usa un mouse diverso
		(2) Campo visivo errato	(2) Regolare nuovamente il campo visivo
		(3) Potenza laser insufficiente	(3) Aumentare gradualmente la potenza del laser
		(4) Gel di carbomer essiccato	(4) Riapplicare il gel Carbomer fresco
3	L'imaging mTPM mostra uno schermo completamente bianco	(1) Dispersione di luce	(1) Riavvolgere il foglio di alluminio per una corretta schermatura
		(2) Potenza laser insufficiente	(2) Aumentare gradualmente la potenza del laser
		(3) Fibra staccata dalla testina mTPM	(3) Reinserire la fibra nell'mTPM e serrare la vite di fissaggio
4	Fotogrammi persi nei video comportamentali	(1) Scarsa illuminazione ambientale	(1) Aumenta l'illuminazione dello sfondo
		(2) Porta USB errata	(2) Utilizzare almeno porte USB 3.0
		(3) Prestazioni insufficienti del computer	(3) Utilizzare una macchina con Intel i7-9700K o superiore, RAM a doppio canale e archiviazione SSD.
5	Nessuna locomozione nei mouse montati su mTPM	(1) Uso ripetitivo dello stesso mouse	(1) Evitare di riutilizzare i topi entro 3 giorni
		(2) Uso eccessivo di fogli di alluminio	(2) Utilizzare una pellicola minima necessaria per la schermatura della luce
		(3) Numero o volume insufficiente di palloncini ad elio	(3) Regolare il numero e il gonfiaggio dei palloncini per supportare la fibra mTPM consentendo al contempo la postura e il movimento naturali dei topi.
6	Stima imprecisa della posa 2D	(1) Numero insufficiente di fotogrammi etichettati manualmente	(1) Annota almeno 200 fotogrammi in modo incrementale
		(2) Modello ADPT sottoaddestrato	(2) Aumentare le epoche di addestramento nel file config.yaml di ADPT
7	Ricostruzione anomala della posa 3D	(1) Calibrazione errata della fotocamera	(1) Migliora il contrasto di calibrazione e l'angolo di inclinazione
		(2) Input di posa 2D impreciso	(2) Aumenta il numero di fotogrammi della scacchiera acquisiti
			(3) Risolvere prima i problemi di posa 2D (vedere il problema 6)
8	Disallineamento tra dati neurali e comportamentali	(1) Sequenza errata di inizializzazione del software	(1) Avviare sempre la registrazione mTPM prima del comportamento della fotocamera
		(2) Fotogrammi di comportamento eliminati	(2) Risoluzione dei problemi di perdita di frame (vedere il problema 4)
			(3) Assicurarsi che sia disponibile spazio su disco sufficiente
9	Overflow della memoria durante l'elaborazione BeA/SBeA	(1) Durata eccessiva della registrazione	(1) Suddividere le registrazioni in segmenti più brevi (5-60 minuti), quindi eseguire BeA/SBeA
		(2) RAM di sistema limitata	(2) Aumentare il fattore di riduzione temporale (ad esempio, da 5 a 10) in BeA
			(3) Aggiorna la RAM ad almeno 64 GB
10	CEBRA non viene eseguito sulla GPU	(1) Mancata corrispondenza tra CUDA e driver GPU	(1) Non seguire direttamente il tutorial per installare CUDA 11.3
		(2) Versione PyTorch incompatibile	(2) Controlla il modello della tua GPU e la versione del driver (nvidia-smi)
			(3) Installare le versioni CUDA e PyTorch corrette di conseguenza, quindi installare CEBRA tramite pip

Tabella 1: Elenco di risoluzione dei problemi. Di seguito è riportato un elenco di 10 problemi non banali riscontrati in precedenza e possibili soluzioni.

Discussion

Questo framework di registrazione e decodifica neuroetologica si basa su dispositivi disponibili in commercio, garantendo che la maggior parte dei problemi di risoluzione dei problemi possa essere affrontata dalle rispettive aziende. Anche così, questo studio fornisce un elenco di problemi riscontrati di frequente per facilitare il riferimento e semplificare la risoluzione dei problemi (Tabella 1). Questa accessibilità rende il framework più facile da usare per i nuovi arrivati. Inoltre, il framework è altamente flessibile, con la sincronizzazione tra registrazioni neurali e comportamentali che si basano su segnali TTL standard. Di conseguenza, è semplice integrare altri dispositivi di registrazione fisiologica nel framework, se necessario. Le successive procedure di analisi sono inoltre sufficientemente generali da supportare sistemi di registrazione neurale e comportamentale completamente personalizzati.

Il costo associato a questo framework, che si basa su dispositivi commercializzati, è relativamente elevato (~500.000 USD), imponendo così un ulteriore onere finanziario al laboratorio. Sebbene i recenti strumenti open source come MINI2P¹³ e Anipose³⁷ possano aiutare a ridurre i costi dei materiali, questa esperienza suggerisce che le spese complessive rimarranno simili quando si tiene conto dei costi delle risorse umane coinvolte nel debugging. Un altro limite di questo quadro risiede nell'interpretabilità degli embedding CEBRA. Essendo un metodo basato su reti neurali artificiali, è intrinsecamente difficile da interpretare. Sebbene questo esempio fornisca un approccio semplice per spiegare gli incorporamenti, sarà necessario sviluppare ulteriori metodi caso per caso per diversi progetti. Una potenziale soluzione per un'ulteriore interpretazione degli incorporamenti CEBRA è l'applicazione di sistemi dinamici³⁸. Inoltre, il comportamento naturale può essere segmentato in fasi distinte, come le interazioni quando i due topi sono distanti o vicini. Diverse questioni scientifiche possono richiedere lo sviluppo di flussi di lavoro personalizzati per l'analisi dei dati.

Sebbene l'attuale sistema di telecamere mTPM + 3D sia distribuito in un'arena in campo aperto, la sua applicazione non si limita a questo specifico contesto comportamentale. I principali vincoli derivano dal legame fisico del sistema di imaging, che limita l'entità della mobilità degli animali, e dal campo visivo della telecamera 3D, che limita il volume tracciabile. Questi fattori possono essere affrontati nelle future iterazioni incorporando moduli di imaging wireless³⁹ o array di trap-camera⁴⁰ per consentire paradigmi comportamentali più complessi e naturalistici. In particolare, sia il sistema mTPM che la configurazione della fotocamera 3D sono in grado di eseguire l'acquisizione continua di dati^{24 ore su 24 10,41}, rendendo l'intera pipeline adatta per studi comportamentali e di registrazione neurale su larga scala.

Questo studio adotta un approccio completamente basato sui dati per indagare la codifica neurale del comportamento spontaneo e quindi si astiene intenzionalmente dall'assegnare etichette semantiche predefinite a motivi comportamentali raggruppati. Questa decisione è radicata nell'obiettivo di preservare la generalizzabilità del framework di mappatura del comportamento neurale, consentendogli di operare indipendentemente dalle categorie comportamentali imposte dallo sperimentatore. I lettori interessati all'interpretabilità biologica e alla classificazione supervisionata dei motivi comportamentali possono fare riferimento a lavori precedenti ^1,10, nonché a un recente studio⁴², che ha sistematicamente confrontato il clustering di motivi non supervisionato con comportamenti etichettati manualmente utilizzando lo stesso framework sottostante dell'Atlante del comportamento. Questi studi forniscono anche visualizzazioni estese, tra cui sequenze di pose 3D, traiettorie e incorporamenti a livello di motivo, disponibili attraverso repository pubblici. Insieme, queste risorse offrono intuizioni complementari sulla struttura semantica del comportamento, supportando al contempo l'approccio di decodifica neurale flessibile e generalizzabile adottato qui.

Questa pipeline di elaborazione dei dati è stata progettata pensando alla modularità e alla flessibilità, consentendo l'adattamento a diverse impostazioni sperimentali e preferenze degli utenti. Ogni componente principale della pipeline, che va dalla stima della posa 3D, al clustering dei motivi comportamentali non supervisionato, alla pre-elaborazione del segnale neurale, all'incorporamento neuroetologico congiunto, è implementato come un modulo indipendente con interfacce di input e output chiaramente definite. Questa architettura consente agli utenti di sostituire strumenti o algoritmi alternativi in ogni fase (ad esempio, diversi framework di stima della posa ^6,22, algoritmi di clustering del comportamento^43,44 o decodificatori neurali^45,46) senza interrompere il flusso di lavoro complessivo. Sebbene questi componenti siano progettati per essere interoperabili, questo studio non ha testato in modo esaustivo tutte le possibili combinazioni di metodi alternativi e gli utenti potrebbero dover eseguire ulteriori ottimizzazioni per garantire la compatibilità nelle loro applicazioni specifiche. Tale modularità facilita sia la riproducibilità che l'estensibilità e consente di adattare il quadro alle specie, alle modalità di registrazione o ai paradigmi comportamentali oltre a quelli qui dimostrati. Per supportare un uso più ampio da parte della comunità, questo studio fornisce una panoramica schematica e una tabella riassuntiva (Figura 1, Tabella dei materiali).

Le impostazioni dei parametri utilizzate per SBeA e CEBRA in questa pipeline si basano su una combinazione di valori predefiniti e sintonizzazione empirica specifica per questo contesto sperimentale, che muove liberamente topi in condizioni di interazione sociale naturale. Questi parametri sono stati convalidati per riprodurre tutti i risultati presentati in questo studio senza richiedere ulteriori aggiustamenti. Sebbene gli utenti desiderino mettere a punto alcuni parametri per adattarsi a diverse configurazioni di registrazione o attività comportamentali, tali modifiche non sono necessarie per replicare questa pipeline. Per gli utenti che lavorano in altri contesti, si consiglia di consultare la documentazione originale e la letteratura per SBeA e CEBRA, dove vengono forniti intervalli di parametri e indicazioni specifiche per le attività. Questa implementazione funge da solida configurazione di riferimento che può essere applicata direttamente o adattata in base alle esigenze.

Il principale progresso di questo quadro risiede nella sua applicazione agli animali che si muovono liberamente. Studi precedenti condotti con animali a testa fissa possono essere adattati alle condizioni di libero movimento all'interno di questo quadro. Ad esempio, compiti come il Compito Vai/Non Vai⁴⁷ e la Scelta Forzata⁴⁸ Two-Alternative possono essere modificati e integrati in questo framework in base a paradigmi di comportamento naturale. Questo approccio elimina gli artefatti causati dalla restrizione della testa, consentendo lo studio della relazione tra compito e stati comportamentali naturali. Questo quadro fornisce agli animali una maggiore autonomia nel processo decisionale. Supporta inoltre gli studi del midollo spinale in contesti naturalistici, combinando il metodo di registrazione del midollo spinale mTPM⁴⁹. Inoltre, facilita lo studio del comportamento di gruppo libero, un fenomeno che non è fattibile in configurazioni a testa fissa. Il flusso di lavoro di analisi dei dati consente l'interpretazione dell'attività della popolazione neurale attraverso più variabili, utilizzando gli embedding per svelare la complessità della funzione cerebrale dietro le popolazioni neurali.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema di registrazione del comportamento 3D	BayONE Scientifico	BA-3D-Mouse	Modulo di sincronizzazione integrato
Palloncino	AliExpress	URL: https://tinyurl.com/3uex669s	Qualsiasi pallone abbastanza leggero da volare quando è riempito di elio. I palloncini sono palloncini sferici in alluminio, di circa 45 cm di diametro, e sono dotati di valvole autosigillanti. L'URL fornisce un esempio dei palloncini.
Gel contorno occhi Carbomer	Vidisico	Gel oculare lubrificante a base di Carbomer 980	10 g
Spago di cotone	AliExpress	URL: https://tinyurl.com/ywu7u754	Spessi e leggeri, diametro 1-2 mm. L'URL fornisce un esempio dello spago di cotone.
Trapano cranico	RWD	78001	Punta da 0,8, 1,4 e 2,1 mm
Modulo telecamera personalizzato configurabile	Intel	RealSense D435	/
Adesivo acrilico strutturale ad alte prestazioni	HUITIAN	1320	490 ml
Mouse per l'imaging	TRANSCEND VIVOSCOPE	URL: https://en.tv-scope.com/	Il topo maschio con sfondo C57BL/6J (10 settimane di età) è stato alloggiato in 1 topo per gabbia sotto un 12  h ciclo luce-buio a 22– 25&sottile; ° C con il 40%... 70% di umidità ed è stato consentito l'accesso all'acqua e al cibo ad libitum. I virus AAV9-CaMKII-GCaMP6s sono stati iniettati nella sua corteccia somatosensoriale primaria (AP, − 0,60 mm; ML, &meno; 2,40 millimetri; DV, 2,00 mm). Nel nostro studio, i topi sono stati preparati da TRANSCEND VIVOSCOPE come parte del loro servizio professionale di preparazione degli animali. Questo servizio include l'iniezione di virus, l'impianto di finestre craniche e l'installazione di piastre di base su misura per il loro sistema di microscopia miniaturizzata a due fotoni.
Mouse per l'interazione	BayONE LAC	URL: https://lac.bayonesci.com/	I topi maschi con background C57BL/6J (10 settimane di età) sono stati alloggiati in 5 topi per gabbia sotto un 12  h ciclo luce-buio a 22– 25&sottile; ° C con 40– 70% di umidità e sono stati autorizzati ad accedere all'acqua e al cibo ad libitum. Tutte le procedure di allevamento e sperimentazione sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali presso l'Istituto di tecnologia avanzata di Shenzhen, Accademia cinese delle scienze.
Sistema di registrazione neurale mTPM	TRANSCEND VIVOSCOPE	SUPERNOVA-600	Il SUPERNOVA-600 è un sistema di imaging miniaturizzato a due fotoni completamente integrato per roditori in movimento libero, che include tutti i componenti ottici e di registrazione essenziali, ma esclude i dispositivi di stimolazione esterni. Dovrebbe contenere il modulo di sincronizzazione integrato.