Qui, presentiamo un protocollo per valutare gli effetti cardioprotettivi della segnalazione NRG1/ErbB4 in un modello di ratto di danno da ischemia-riperfusione, valutando lo stress ossidativo e le vie di segnalazione apoptotica.
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Articolo di ricerca
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Qui, presentiamo un protocollo per valutare gli effetti cardioprotettivi della segnalazione NRG1/ErbB4 in un modello di ratto di danno da ischemia-riperfusione, valutando lo stress ossidativo e le vie di segnalazione apoptotica.
Il danno da ischemia-riperfusione miocardica (MIRI) persiste come un impedimento sostanziale alla gestione delle malattie cardiovascolari. La fisiopatologia della MIRI è complessa e coinvolge lo stress ossidativo, il sovraccarico di calcio, l'infiammazione e l'apoptosi. La via di segnalazione NRG1/ErbB4 è stata implicata nella modulazione delle risposte allo stress ossidativo nel cuore, riducendo potenzialmente il danno cellulare causato dai radicali liberi. Questo studio mirava a chiarire i meccanismi molecolari attraverso i quali la via NRG1/ErbB4 conferisce protezione in un modello di ratto di danno da ischemia-riperfusione miocardica (MIRI). È stato stabilito un modello MIRI di ratto, che ha coinvolto 30 ratti maschi adulti di Sprague-Dawley assegnati in modo casuale a cinque gruppi: controllo, operazione fittizia, MIRI, NRG1 ricombinante e AG1478. Le concentrazioni di NRG1 nei tessuti cardiaci sono state misurate mediante ELISA, mentre i livelli di p-ErbB4 e la proteina totale ErbB4 sono stati valutati mediante Western blot. L'apoptosi dei cardiomiociti e i livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono stati valutati mediante citometria a flusso. Nel gruppo MIRI, i livelli di NRG1 erano significativamente ridotti rispetto ai gruppi di controllo e operativi fittizi (p < 0,05). Il trattamento ricombinante con NRG1 ha portato a un marcato aumento dei livelli di NRG1 nel tessuto cardiaco, insieme a un aumento del rapporto di espressione p-ErbB4/ErbB4 (p < 0,05). Il gruppo AG1478 ha mostrato livelli più bassi di NRG1 e un ridotto rapporto p-ErbB4/ErbB4 rispetto al gruppo NRG1 ricombinante (p < 0,05). In termini di livelli di apoptosi e ROS, il gruppo MIRI ha mostrato tassi significativamente più elevati rispetto ai gruppi di controllo e di funzionamento fittizio (p < 0,05). Il trattamento con NRG1 ricombinante ha ridotto significativamente l'apoptosi delle cellule miocardiche e i livelli di ROS (p < 0,05), mentre AG1478 ha attenuato questi effetti, ma in misura minore. La via di segnalazione NRG1/ErbB4 svolge un ruolo protettivo fondamentale nella MIRI nei ratti. L'integrazione con NRG1 esogeno eleva efficacemente i livelli di NRG1 nel cuore, attiva la via di segnalazione ErbB4, riduce l'apoptosi delle cellule miocardiche e diminuisce i livelli di ROS, mitigando così il danno indotto da MIRI.
Il danno da ischemia-riperfusione miocardica (MIRI) rappresenta una sfida critica nella gestione delle malattie cardiovascolari1. Sebbene il ripristino del flusso sanguigno al miocardio ischemico sia essenziale per il trattamento dell'infarto del miocardio, la riperfusione stessa può esacerbare il danno al tessuto cardiaco, limitando così l'effetto terapeutico. I meccanismi alla base della MIRI sono complessi e comprendono vari processi fisiopatologici, tra cui lo stress ossidativo, il sovraccarico di calcio, le risposte infiammatorie e l'apoptosi 2,3,4.
Il fattore di crescita nervoso 1 (NRG1) e il suo recettore Erb-B2 Tyrosine Kinase 4 (ERBB4) svolgono un ruolo fondamentale nella fisiologia e patologia cardiaca. NRG1, un ligando extracellulare, interagisce con il recettore ErbB4 per attivare una cascata di vie di segnalazione che sono cruciali per lo sviluppo del cuore, il mantenimento dell'integrità strutturale e la risposta alle lesioni cardiache5. Evidenze emergenti evidenziano il ruolo svolto dalla via di segnalazione NRG1/ErbB4 nelle malattie cardiache. In condizioni di ischemia-riperfusione miocardica, l'espressione e la funzione di NRG1 possono essere alterate6. Studi precedenti hanno suggerito che NRG1 promuove la sopravvivenza delle cellule miocardiche e inibisce l'apoptosi eccessiva attivando ErbB4. Inoltre, la via di segnalazione NRG1/ErbB4 può regolare la risposta allo stress ossidativo nel cuore e mitigare il danno cellulare causato dai radicali liberi. Pertanto, chiarire la funzione della via di segnalazione NRG1/ErbB4 nella MIRI è vitale per comprendere le basi biologiche di questa lesione e sviluppare nuove strategie terapeutiche 7,8.
Questo studio ipotizza che la via di segnalazione NRG1/ErbB4 svolga un ruolo protettivo nella MIRI. Pertanto, in questo studio, è stato costruito un modello di ratto di ischemia-riperfusione miocardica per studiare sistematicamente il meccanismo della via di segnalazione NRG1/ErbB4 nella MIRI. Regolando la concentrazione di NRG1 e osservando i cambiamenti nello stato di attivazione di ErbB4, nel tasso di apoptosi delle cellule miocardiche e nel livello di stress ossidativo. Questo studio tenta di rivelare il meccanismo molecolare attraverso il quale la via di segnalazione NRG1/ErbB4 esercita un effetto protettivo nella MIRI. La novità di questo studio risiede nel rivelare il significato della via di segnalazione NRG1/ErbB4 nel danno da ischemia-riperfusione miocardica, e anche nel fornire una nuova prospettiva per le strategie di trattamento delle malattie cardiache basate su questa via.
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Animali da esperimento
Trenta ratti maschi adulti di Sprague-Dawley (SD), di età compresa tra 8 settimane e il peso di 180-200 g, sono stati ottenuti da un venditore commerciale. Questi ratti sono stati alloggiati in condizioni specifiche prive di agenti patogeni per 1 settimana prima degli esperimenti. Gli esperimenti hanno ricevuto l'approvazione dal Comitato Etico del Primo Ospedale di Nanping (NO. NPSY202208010).
Modelli animali di danno da ischemia-riperfusione miocardica
I ratti sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico al 3% alla dose di 50 mg/kg. Dopo aver confermato l'assenza di riflessi, gli animali sono stati posti in posizione supina e le zone del collo e del torace sono state rasate e disinfettate con etanolo al 75%. È stata praticata un'incisione cervicale sulla linea mediana (~2 cm) per esporre la trachea, seguita da intubazione orale con un catetere da 16 G per mantenere la pervietà delle vie aeree durante l'intervento chirurgico. Successivamente, il muscolo grande pettorale sinistro è stato accuratamente sezionato per esporre il terzo e il quarto spazio intercostale. È stata eseguita una toracotomia praticando un'incisione tra questi spazi e il pericardio è stato aperto per esporre completamente il cuore. Per indurre l'ischemia, l'arteria coronarica discendente anteriore sinistra (LAD) è stata legata utilizzando un 8-0 sutura in nylon. Un tubo in polietilene (PE-10) è stato inserito tra il LAD e la legatura per consentire l'occlusione reversibile. L'ischemia è stata mantenuta per 45 minuti, confermata visivamente dallo sbiancamento del miocardio e dalle alterazioni dell'ECG. La riperfusione è stata avviata rilasciando la legatura, consentendo la ripresa del flusso sanguigno per 3 ore. La legatura è stata rimossa 45 minuti dopo.
Raggruppamento sperimentale
I ratti sono stati assegnati in modo casuale a cinque gruppi (n = 6 ciascuno). (1) Gruppo di controllo: i ratti hanno ricevuto cure standard senza alcun intervento chirurgico o trattamento. (2) Gruppo operatorio fittizio: i ratti sono stati sottoposti a toracotomia e filettatura dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD) senza legatura, fungendo da controlli chirurgici. (3) Gruppo MIRI: i ratti sono stati sottoposti a induzione di lesioni da ischemia-riperfusione miocardica e sono stati somministrati soluzione fisiologica normale per via intragastrica come controllo del veicolo. (4) Gruppo NRG1 ricombinante: i ratti hanno ricevuto un'iniezione endovenosa di NRG1 umano ricombinante (rh-NRG1) alla dose di 5 mg/kg, 30 minuti prima della toracotomia, seguita dalla procedura MIRI. (5) Categoria AG1478: ai ratti è stato somministrato per via endovenosa rh-NRG1 (5 mg/kg) in combinazione con AG1478 (20 mg/kg), un inibitore della chinasi del recettore ErbB, 30 minuti prima della toracotomia, e poi sono stati sottoposti alla procedura MIRI.
Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)
Gli animali sono stati soppressi mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico (150 mg/kg). I tessuti cardiaci sono stati raccolti immediatamente dopo la riperfusione e omogeneizzati su ghiaccio in un volume appropriato di PBS ghiacciato. Gli omogeneizzati sono stati quindi centrifugati a 1200 x g per 10 minuti a 4 °C per separare il surnatante. La concentrazione di NRG1 nel surnatante è stata quantificata utilizzando un kit ELISA NRG1 disponibile in commercio, seguendo esattamente le istruzioni del produttore. In breve, i campioni e gli standard sono stati aggiunti ai pozzetti della piastra ELISA, incubati a temperatura ambiente per il tempo raccomandato, seguiti dal lavaggio e dall'aggiunta di anticorpi di rilevamento. L'assorbanza è stata misurata alla lunghezza d'onda specificata utilizzando un lettore di micropiastre e i livelli di NRG1 sono stati calcolati in base alla curva standard. Il volume del campione era di 100 μl, la diluizione dell'anticorpo era 1:100 e la lunghezza d'onda per misurare l'assorbanza era fissata a 450 nm.
Analisi del western blot
I tessuti cardiaci sono stati asportati da ratti anestetizzati e risciacquati in PBS ghiacciato per rimuovere il sangue residuo. Per ogni cuore, sono stati pesati circa 0,5 g di tessuto ventricolare sinistro e inseriti in 500 μL di tampone di lisi RIPA appena preparato. Il tessuto è stato quindi omogeneizzato su ghiaccio utilizzando un trituratore meccanico di tessuti fino a quando non è stato completamente lisato, seguito da incubazione su ghiaccio per 30 minuti per garantire la completa estrazione delle proteine. I lisati sono stati centrifugati a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C per rimuovere i detriti. Le concentrazioni proteiche sono state determinate utilizzando un kit di dosaggio BCA. Quantità uguali di proteine totali (ad esempio, 30 μg per corsia) sono state caricate e separate mediante SDS-PAGE. Le proteine sono state quindi trasferite su membrane di fluoruro di polivinilidene (PVDF) utilizzando un sistema di trasferimento a umido a 100 V per 90 minuti. Le membrane sono state bloccate con il 5% di latte in polvere scremato in soluzione salina tamponata con Tris con Tween-20 (TBST) allo 0,1% per 1 ora a temperatura ambiente. Successivamente, le membrane sono state incubate per una notte a 4 °C con anticorpi primari contro ErbB4 fosforilata (p-ErbB4) ed ErbB4 totale, ciascuno diluito 1:1000. Dopo il lavaggio, le membrane sono state incubate con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) per 1 ora a temperatura ambiente. Le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando un substrato di chemiluminescenza potenziata (ECL) e catturate utilizzando un sistema di imaging su gel. Le intensità di banda sono state quantificate utilizzando il software ImageJ ed è stato calcolato il rapporto tra p-ErbB4 e ErbB4 totale per valutare i livelli di fosforilazione.
Citometria a flusso
L'apoptosi dei miociti cardiaci è stata valutata mediante citometria a flusso. I tessuti cardiaci sono stati finemente tritati e digeriti enzimaticamente utilizzando una miscela di collagenasi di tipo II (1 mg/mL) e proteasi (ad es. tripsina, 0,25%) a 37 °C con una leggera agitazione per 20-30 minuti. La digestione enzimatica è stata terminata aggiungendo un volume uguale di siero fetale bovino (FBS). La sospensione cellulare è stata filtrata attraverso una rete di nylon da 70 μm e centrifugata a 300 × g per 5 minuti a 4 °C per raccogliere le cellule. Il pellet cellulare è stato risospeso in un tampone di legame, quindi incubato con annessina V-FITC e ioduro di propidio (PI) secondo il protocollo del produttore. Dopo l'incubazione per 15 minuti a temperatura ambiente al buio, i campioni sono stati immediatamente analizzati mediante citometria a flusso. Le cellule apoptotiche precoci sono state identificate come annessina V-positiva e PI-negativa, mentre le cellule apoptotiche o necrotiche tardive erano positive per entrambi i marcatori. I tassi di apoptosi sono stati quantificati e confrontati tra i gruppi sperimentali. La strategia di iniezione adotta un'impostazione a cancello incrociato/rettangolare. Durante l'esecuzione del rilevamento sulla macchina, il cancello trasversale è stato impostato come una linea tratteggiata e tutti i parametri sono stati applicati per garantire la coerenza dello screening dei dati. La portata è stata regolata in base alla concentrazione delle celle (mantenuta a 1000 celle/s) e il caricamento del campione a bassa velocità può evitare l'intasamento degli ugelli.
Rilevamento dei livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS)
I cardiomiociti sono stati isolati dai tessuti cardiaci, seguiti da centrifugazione a 300 × g per 5 minuti e lavaggio due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Le cellule sono state quindi incubate con 10 μM 2',7'-diclorofluoresceina diacetato (DCFDA) a 37 °C per 30 minuti al buio, seguendo le istruzioni del produttore. Dopo la colorazione, le cellule sono state lavate due volte con PBS per rimuovere il colorante non legato in eccesso. I livelli intracellulari di ROS sono stati misurati immediatamente mediante citometria a flusso, rilevando l'intensità della fluorescenza emessa dopo l'ossidazione del DCFDA. L'intensità media di fluorescenza (MFI) di ciascun campione è stata quantificata utilizzando il software FlowJo per confrontare i livelli di ROS tra i gruppi sperimentali. La strategia di gating è quella descritta sopra (sezione sulla citometria a flusso).
Analisi statistica
L'analisi dei dati è stata condotta utilizzando il software SPSS, presentato come media ± deviazione standard (SD). L'analisi unidirezionale della varianza con il test post hoc di Tukey è stata eseguita per confrontare più gruppi e il test t di Student è stato utilizzato per i confronti a coppie. Un valore p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
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NRG1 esercita un effetto protettivo contro l'apoptosi dei cardiomiociti indotta da MIRI
L'analisi citofluorimetrica ha indicato un notevole aumento dei tassi di apoptosi nel gruppo MIRI rispetto ai gruppi di controllo e sham (P < 0,05). Entrambi i gruppi ricombinanti NRG1 e AG1478 hanno mostrato tassi di apoptosi significativamente ridotti rispetto al gruppo MIRI (P < 0,05). Al contrario, il gruppo NRG1 ricombinante ha mostrato un tasso di apoptosi ridotto rispetto al gruppo AG1478 (P < 0,05)...
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La MIRI continua a rappresentare un ostacolo significativo nella gestione delle malattie cardiovascolari, dato che il ristabilimento della perfusione nel tessuto cardiaco ischemico può paradossalmente intensificare il danno miocardico. L'insorgenza di MIRI è multifattoriale e coinvolge stress ossidativo, sovraccarico di calcio, reazioni infiammatorie e disfunzione mitocondriale 9,10.
NRG1, un ligando e...
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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione per le scienze naturali della provincia del Fujian (numero di sovvenzione.2024J011604,2023J011877) e dal Progetto di ricerca giovanile della Commissione provinciale del focolare del Fujian (numero di sovvenzione.2019-9-25).
CONTRIBUTO DELL'AUTORE:
Maozhi Huang ha guidato l'ideazione e la progettazione del progetto di ricerca, ha pianificato e dettagliato il protocollo sperimentale, ha partecipato agli esperimenti chiave e ha scritto la prima bozza del manoscritto. Jianping Zheng ha contribuito in egual misura alla ricerca complessiva, compresa la progettazione, la raccolta dei dati e la stesura del manoscritto. Xianlu Cheng ha contribuito al disegno della ricerca, ha raccolto campioni e analizzato i dati. Chaoqun You ha collaborato alla stesura e alla strutturazione del manoscritto. Ziguo Chen ha controllato i dati e ha contribuito a migliorare la sezione dei metodi e dei materiali. Ling Jiang ha fornito il controllo accademico e la guida durante tutto il processo di ricerca. Shanghua Xu ha guidato la direzione generale del progetto, ha coordinato le risorse e ha rivisto e rivisto il manoscritto finale.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| AG1478 | Tecnologia BioLab | WD102925 | Farmaco d'intervento AG1478 |
| Kit per il rilevamento dell'apoptosi dell'annessina V-FITC/PI | Meilune | Visualizzazione del materiale MA0220 | Citometria a flusso per apoptosi |
| Kit per il dosaggio delle proteine BCA | Meilunbio | MA0082-2 | Quantificazione delle proteine WB |
| Sistema di imaging a chemiluminescenza | Bio-Rad (Stati Uniti) | ChemiDoc Touch | Imaging Western blot |
| Cloridrato di ciamemazina | Huamu Salute Animale | 20220601 | Anestetico per modellismo animale |
| Kit di rilevamento ECL | Meilunbio | MA0186-1 | Chemiluminescenza WB |
| ERbB4 | Proteintech | 19943-1-AP | Anticorpo primario WB |
| Citometro a flusso | BD | FACSCalibur | Rilevamento dell'apoptosi con citometria a flusso |
| GAPDH | Proteintech | 60004-1-Ig | Anticorpo di controllo del carico WB |
| IgG anti-topo di capra coniugata HRP(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | Immunoistochimica |
| IgG anti-coniglio di capra coniugato HRP (H+L) | Proteintech | SA00001-2 | Immunoistochimica |
| Lettore di micropiastre | Termo | K3 | Rilevamento ELISA |
| PAGINA Kit di preparazione del gel 15% | Meilunbio | MA0384 | Elettroforesi WB |
| p-ERbB4 | Affinità | AF3445 | Anticorpo primario WB |
| Marcatore proteico pre-colorato | Meilunbio | MA0342 | Elettroforesi WB |
| Kit ELISA per ratto Neuregulin-1 (NRG-1) | Meimiano | MM-61434R2 | Rilevamento ELISA |
| Kit per il dosaggio delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) | Meilune | MA0219 | Saggio WB |
| rhNRG1 | Tecnologia BioLab | WD091127 | Farmaco d'intervento NRG1 |
| tampone di lisi RIPA | Meilunbio | MA0151 | Estrazione di proteine per Western blot |
| Buffer di caricamento SDS-PAGE (5x) | Beyotime | P0015L | Elettroforesi WB |
| Sodio Dodecil Solfato | Sigma | 151-21-3 | Elettroforesi WB |
| Su Tai 50 | Virbac (Francia) | 8X22A | Anestetico per modellismo animale |
| Sistema di elettroforesi proteica verticale | Bio-Rad (Stati Uniti) | POWER PAC 200 | Elettroforesi Western blot |
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