Articolo metodologico

Esplorazione delle interazioni proteina-glicano: progressi nella risonanza magnetica nucleare

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DOI:

10.3791/68674

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26 agosto 2025

 ,  , 
1Institute of Medical Biochemistry Leopoldo de Meis (IBqM), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2National Center for Structural Biology and Bioimaging (CENABIO), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 3Laboratory of Connective Tissue, Clementino Fraga Filho University Hospital

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo basato su NMR studia le deboli interazioni proteina-glicano utilizzando cianovirina-N e D-mannosio. Combinando metodi rilevati da ligando e proteine, mappa i siti di legame, rileva gli effetti allosterici e identifica i complessi di incontro. L'approccio delinea la preparazione dei campioni e l'analisi dei dati, offrendo informazioni strutturali e dinamiche preziose per la diagnostica specifica dei glicani e i meccanismi di riconoscimento.

Abstract

Le interazioni proteina-glicano sono fondamentali per molti processi biologici e sono sempre più riconosciute come bersagli promettenti per le strategie diagnostiche nelle malattie infettive, infiammatorie e neoplastiche. Tuttavia, caratterizzare queste interazioni, soprattutto quando sono deboli e transitorie, rimane tecnicamente impegnativo. La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) offre vantaggi unici per lo studio di tali interazioni in condizioni quasi fisiologiche, fornendo informazioni sulla risoluzione atomica sia negli aspetti strutturali che dinamici. In questo studio, presentiamo un protocollo NMR integrato progettato per studiare le interazioni proteina-glicano a bassa affinità utilizzando la lectina cianovirina-N specifica per il mannosio e il monosaccaride D-mannosio come sistema modello. Il protocollo combina approcci NMR basati su ligandi e proteine per mappare in modo completo i siti di legame e rilevare eventi di legame sottili, inclusi potenziali effetti allosterici o complessi di incontro. Le fasi critiche del protocollo includono un'attenta preparazione del campione, un controllo preciso delle concentrazioni e la standardizzazione spettrale per garantire la riproducibilità e l'affidabilità dei dati. La risonanza magnetica mobile in soluzione consente il rilevamento di interazioni transitorie che sono spesso inaccessibili con altre tecniche. Sebbene le interazioni deboli siano essenziali per la vita, c'è una tendenza in letteratura verso complessi a più alta affinità, anche se i complessi a bassa affinità sono rilevanti in molte importanti funzioni biologiche, come la trasduzione del segnale e la comunicazione cellula-cellula. Questa tecnica fornisce una potente piattaforma per studiare il riconoscimento proteina-glicano e può fungere da strumento prezioso per identificare nuovi marcatori diagnostici sulla base delle interazioni glicano-specifiche.

Introduzione

Le interazioni proteina-glicano sono fondamentali per un'ampia gamma di processi biologici, tra cui il riconoscimento cellula-cellula, la modulazione della risposta immunitaria e le interazioni patogeno-ospite 1,2. Queste interazioni molecolari sono altamente specifiche e dinamiche e svolgono un ruolo cruciale nei meccanismi sia fisiologici che patologici 3,4,5. Un classico esempio di tali interazioni si verifica con le lectine, proteine che riconoscono e si legano specificamente ai glicani. La cianovirina-N (CVN), ad esempio, è stata ampiamente studiata come modello sperimentale a causa della sua capacità di interagire in alta affinità con oligosaccaridi ad alto mannosio 5,6,7.

Oltre alle lectine, anche molte proteine glicosilate, come le integrine, svolgono un ruolo essenziale nel riconoscimento e nella segnalazione cellulare. Le integrine sono recettori transmembrana che subiscono frequentemente glicosilazione delle loro subunità, influenzando la loro stabilità e affinità per i ligandi, inclusi i glicani 5,8,9,10. Tuttavia, la caratterizzazione strutturale di queste interazioni rimane impegnativa a causa dell'intrinseca eterogeneità e flessibilità dei glicani, che complica gli approcci tradizionali della biologia strutturale. In questo contesto, lo sviluppo di metodologie avanzate in grado di catturare queste interazioni in soluzione è di grande valore per questo campo, in particolare per la glicobiologia11,12.

La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) è emersa come un potente strumento per studiare le interazioni proteina-ligando a livello atomico. A differenza di altre tecniche, come la cristallografia a raggi X e la microscopia crioelettronica, la risonanza magnetica mobile consente lo studio delle interazioni biomolecolari in condizioni quasi fisiologiche, fornendo informazioni sia sulla struttura che sulla dinamica. Questa flessibilità consente ai ricercatori di modulare parametri ambientali come il pH (tipicamente tra 4,0 e 8,0), la forza ionica (ad esempio, 0-500 mM NaCl) e la temperatura (generalmente 273-330 K), adattando così le condizioni alle specificità dei complessi proteina-glicano. Inoltre, la risonanza magnetica mobile è particolarmente vantaggiosa per l'analisi delle interazioni transitorie e deboli, che sono spesso caratteristiche degli eventi di riconoscimento proteina-glicano13,14.

Diverse tecniche NMR sono state impiegate per studiare le interazioni proteina-glicano, utilizzando approcci basati sia su proteine che su ligando. Dal punto di vista proteico, la titolazione eteronucleare a coerenza quantica singola (HSQC) è ampiamente utilizzata per mappare i siti di legame monitorando le perturbazioni dello spostamento chimico dopo l'aggiunta del ligando. Gli esperimenti di dispersione per rilassamento consentono di rilevare i processi conformazionali e di scambio chimico che si verificano su una scala temporale da micro a millisecondi, fornendo informazioni sugli aspetti dinamici del riconoscimento dei glicani15,16. Queste tecniche basate sulle proteine richiedono in genere concentrazioni del campione nell'intervallo da 50 μM a 2 mM, a seconda della stabilità delle proteine e dell'efficienza di marcatura17,18.

Le tecniche NMR basate su ligandi offrono informazioni complementari concentrandosi sulle variazioni dei glicani durante il legame. La differenza di trasferimento di saturazione (STD-NMR) è particolarmente utile per identificare gli epitopi dei glicani coinvolti nel riconoscimento, in quanto satura selettivamente i segnali NMR delle regioni del ligando a stretto contatto con la proteina19,20. I ligandi dell'acqua osservati tramite spettroscopia a gradiente (WaterLOGSY)21,22 e la spettroscopia dell'effetto overhauser nucleare trasferito (Tr-NOESY) forniscono ulteriori mezzi per valutare il legame del ligando e i cambiamenti conformazionali durante le interazioni23. Inoltre, gli esperimenti di rilassamento di Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) aiutano a identificare interazioni deboli e transitorie che sono difficili da rilevare con i metodi convenzionali24. Gli esperimenti basati su ligandi sono spesso eseguiti a concentrazioni proteiche di 10-50 μM e possono richiedere l'ottimizzazione dei tempi di miscelazione e dei parametri di saturazione25. In particolare, questi metodi possono essere limitati dalla bassa solubilità dei glicani o dallo scarso rapporto segnale/rumore quando si lavora con piccoli ligandi.

Insieme, questi metodi NMR forniscono un quadro completo per chiarire le proprietà strutturali e dinamiche delle interazioni proteina-glicano. Con i continui progressi nelle strategie di sensibilità e marcatura isotopica, questa tecnica sta diventando sempre più essenziale nella glicobiologia, offrendo nuove prospettive sui meccanismi di riconoscimento molecolare con potenziali applicazioni nello sviluppo di farmaci e nella scoperta di biomarcatori. Tuttavia, il successo di questi approcci dipende da fattori quali l'omogeneità del campione, la complessità dei glicani e la presenza di regioni flessibili o disordinate che possono ampliare i segnali NMR o ostacolare l'interpretazione26. La risonanza magnetica mobile è un metodo potente per lo studio degli eventi transitori, che rappresenta una sfida importante nella biologia strutturale.

La CVN riconosce i residui di mannosile legati a α(1,2) presenti negli oligosaccaridi ad alto contenuto di mannosio con affinità nanomolari 27,28,29. Tuttavia, riconosce male il monosaccaride D-mannosio. Nel presente lavoro, abbiamo studiato l'interazione della CVN con il D-mannosio come un modo per illustrare come la NMR sia potente nella comprensione delle interazioni transitorie.

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Protocollo

NOTA: Eseguire tutte le fasi che coinvolgono colture batteriche e preparazioni tampone in conformità con i protocolli istituzionali di biosicurezza. Utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI) e, quando si maneggiano colture aperte o sostanze chimiche, lavorare in una cappa di biosicurezza o in una cappa chimica, se necessario.

1. Espressione di cianovirina-N

  1. Trasformare le cellule BL21 di E. coli con un plasmide codificante il gene CVN inserito nel vettore pET26a.
  2. Coltivare le cellule in 1 L di Super Brodo (32 g di triptone, 20 g di estratto di lievito, 5 g di NaCl per L), integrato con kanamicina (50 μg/mL), glucosio allo 0,5% (p/v) e 1,6 mM di MgSO4. Incubare in agitazione continua a ~250 giri/min a 37 °C.
  3. Per la produzione di 15CVN marcati con N, far crescere le cellule in terreno minimo M9 modificato utilizzando 15NH4Cl come unica fonte di azoto.
    1. Preparare 1 L di terreno minimo M9 mescolando 200 mL di soluzione sterile di sali 5x M9 contenente 64 g/L di Na2HPO4, 15 g/L di KH2PO4, 2,5 g/L di NaCl, 5 g/L di NH4Cl.
    2. Aggiungere 2 mL di 1 M MgSO4 (0,22 μm sterilizzato con filtro), 0,1 mL di 1 M CaCl2 (0,22 μm sterilizzato con filtro) e 4 g di glucosio (concentrazione finale 0,4%, disciolto in acqua distillata sterile e 0,22 μm sterilizzato con filtro).
    3. Portare il volume finale a 1 L con acqua distillata sterile.
      NOTA: Integratori come aminoacidi o vitamine possono essere aggiunti secondo necessità.
  4. Monitorare la coltura fino a raggiungere una densità ottica (OD600) di circa 1,2. Quindi, aggiungere isopropil-beta-D-tiogalattopiranoside (IPTG) a una concentrazione finale di 1,0 mM per indurre l'espressione proteica.
  5. Incubare per 20 ore dopo l'induzione a 37 °C.
  6. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 7.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
  7. Isolare la frazione periplasmatica come segue:
    1. Risospendere i pellet cellulari in volumi 0,4 di tampone Tris-HCl da 30 mM (pH 8,0) contenente il 20% di saccarosio e 1 mM di EDTA e incubare a temperatura ambiente agitando per 10 minuti.
    2. Centrifugare a 10.000 × g per 10 min a 4 °C.
    3. Risospendere i pellet risultanti in 0,4 volumi di acqua distillata ghiacciata e incubare su ghiaccio agitando per 10 minuti.
    4. Centrifugare nuovamente a 10.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
    5. Raccogliere il surnatante, che corrisponde alla frazione periplasmatica, per l'estrazione delle proteine.
      NOTA: Tutti i tamponi devono contenere un cocktail di inibitori della proteasi per prevenire la degradazione delle proteine.

2. Esperimenti NMR

NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati acquisiti a 14.1 T utilizzando una sonda a tripla risonanza inversa da 1H/15N/13C (vedi Tabella dei materiali) a 298K.

  1. Esperimenti basati su ligandi
    1. Preparazione del campione
      1. Preparare due campioni: uno contenente CVN e uno senza CVN (controllo solo ligando). Ogni campione contiene 600 μl di CVN da 80 μM in tampone fosfato di sodio (pH 7,4) contenente 50 mM di NaCl.
      2. Aggiungere il D-mannosio a una concentrazione finale di 4 mM.
      3. Aggiungere il 5% (v/v) D2O a ciascun campione.
      4. Trasferire il campione in una provetta NMR da 5 mm.
      5. Utilizzare un eccesso molare di 50 volte del ligando rispetto alla proteina.
        NOTA: In genere si raccomanda un eccesso di ligando compreso tra 10 e 1000 volte, con eccessi inferiori preferiti per le proteine piccole.
    2. Acquisizione spettrale per l'assegnazione del D-mannosio
      1. Acquisizione di spettri 2D TOCSY e 2D 1 H-13C HMBC utilizzando sequenze di impulsi standard:
        2D TOCSY: spettroscopia di correlazione totale sensibile alla fase (TOCSY) con scultura di eccitazione per la soppressione dell'acqua (DIPSI2ESGPPH).
        HMBC 2D: 1correlazione di legami multipli eteronucleari H-13C con selezione del gradiente e acquisizione non disaccoppiata (HMBCGPNDQF).
        NOTA: Questi esperimenti sono stati eseguiti allo scopo di assegnare il D-mannosio ma non sono mostrati, poiché l'assegnazione dello spostamento chimico non rientra nell'ambito di questo studio.
    3. Mappatura del legame del ligando attraverso la perturbazione dello spostamento chimico (CSP) del ligando
      1. Per la preparazione del campione e l'acquisizione degli spettri HSQC ¹H-¹³C, preparare una soluzione 4 mM di D-mannosio in tampone fosfato di sodio (pH 7,4), con 50 mM di NaCl e 5% D2O. Dividere la soluzione in due campioni: uno con CVN da 80 μM e uno senza CVN (riferimento solo ligando).
        NOTA: Questi spettri saranno utilizzati per determinare il CSP del D-mannosio in seguito all'interazione con CVN.
      2. Per l'impostazione dei parametri di acquisizione HSQC 1 H-13C, utilizzare la sequenza di impulsi standard HSQCETGPSI (selezione del gradiente e sensibilità migliorata 1 H-13C HSQC). Impostare i seguenti parametri per l'acquisizione:
        Dominio del tempo (TD): 1024 × 128 punti complessi (dimensioni ¹H × ¹³C)
        Larghezza spettrale (SW): 10,0171 ppm (6009,615 Hz) per ¹H, 80 ppm (12069,106 Hz) per ¹³C
        Frequenze portanti: 4,7 ppm per ¹H, 75 ppm per ¹³C
        - Numero di scansioni: 448.
      3. Calcolare il CSP utilizzando l'equazione seguente:
        figure-protocol-1
        dove figure-protocol-2 e figure-protocol-3 rappresentano le differenze di spostamento chimico tra D-mannosio in presenza di CVN (Figura 1A, etichettata in rosso) e D-mannosio libero (Figura 1B).
    4. Mappatura del legame del ligando attraverso la differenza di trasferimento di saturazione (STD)
      1. Creare un nuovo set di dati e configurare i parametri per gli esperimenti STD-NMR. Possono essere applicate due strategie sperimentali: (i) screening di diverse frequenze di saturazione per ottimizzare il rapporto segnale/rumore; (ii) fissare la frequenza di saturazione e variare il tempo di saturazione per valutare l'accumulo.
      2. Impostare esperimenti NMR 1D ¹H utilizzando la sequenza di impulsi zgpr. Regolare lo spettrometro su ¹H, eseguire lo shimming e misurare un impulso forte di 90° (ad esempio, ~10 μs con un'attenuazione di -10,6 dB, equivalente a ~11,482 W).
      3. Centrare la frequenza portante ¹H a circa 4,7 ppm, corrispondente al segnale dell'acqua.
      4. Selezionare la sequenza di impulsi STDDIFFESGP.3 e configurare i parametri di acquisizione come segue:
        Impostare la larghezza spettrale in base ai requisiti del campione.
        Impostare il ritardo tra le scansioni (d1) su 4 s.
        Definire il tempo di saturazione (d20) in base all'esperimento desiderato.
        Caricare il FQ2LIST contenente la frequenza di saturazione fuori risonanza (-40 ppm) e le frequenze di risonanza per saturare solo il segnale proteico.
        NOTA: Le frequenze di risonanza devono corrispondere ai protoni proteici e devono essere ad almeno 1000 Hz di distanza da qualsiasi segnale del ligando per evitare la saturazione diretta.
      5. Testare le seguenti frequenze di saturazione in risonanza per determinare le condizioni ottimali: -0,59 ppm, 0,73 ppm e 8,1 ppm (vedere la Figura 2A).
        NOTA: 0,73 ppm è stato selezionato come frequenza di saturazione in risonanza, in quanto forniva il miglior rapporto segnale/rumore. Utilizzando questa frequenza, il fattore di amplificazione STD (ASTD) è stato quantificato in funzione del tempo di saturazione. A tal fine, gli spettri STD sono stati acquisiti a diversi tempi di saturazione (0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 e 4 s) per costruire la curva di accumulo delle STD (Figura 2B). I corrispondenti valori diA STD sono stati quindi tracciati in funzione del tempo di saturazione (Figura 2C), consentendo la valutazione dell'efficienza del trasferimento di saturazione, che è proporzionale al tempo e alla vicinanza dell'idrogeno del ligando alla proteina. Un fattoreSTD è definito come:
        figure-protocol-4
        ISTD è la differenza nell'intensità del segnale tra gli spettri di risonanza on e off, I0 è l'intensità del segnale nello spettro di off risonanza, [L]T è la concentrazione totale del ligando e [P] è la concentrazione della proteina. Questa normalizzazione tiene conto degli effetti della concentrazione e consente il confronto tra diverse condizioni sperimentali. La STD si basa sulla diffusione dello spin e sul lento tumbling molecolare per trasferire in modo efficiente la saturazione dalla proteina al ligando legato. Le proteine più grandi (rotolamento lento) consentono una saturazione e una diffusione più efficienti della magnetizzazione all'interno della proteina 19,30,31,32.
      6. Impostare il numero di scansioni (ns) su 64 e calcolare la media dell'esperimento l4 (ciclo 4) volte.
      7. Calcola il numero totale di scansioni come: Scansioni totali = ns × l4. Utilizza 32.768 punti complessi nella dimensione diretta (TD) con una larghezza spettrale (SW) di 10,0171 ppm (6.009,615 Hz).
      8. Impostare il ritardo di interscansione (d1) su 4 s e il tempo di acquisizione (AQ) su 2,7262976 s. Il ritardo di rilassamento totale è uguale a d1 + AQ.
      9. Configurare l'impulso di saturazione come segue: durata 50 ms; forma gaussiana (p42); controllato tramite il programma sagomato 9 (SP9).
      10. Utilizzare una variante di sequenza di impulsi STD che includa un filtro T1ρ per sopprimere i segnali proteici residui. Impostare il tempo di spin-lock (d29) in base al peso molecolare delle proteine. Per proteine più grandi, utilizzare tempi di spin-lock più piccoli (~20 ms) e per proteine più piccole, più grandi (> 40 ms).
        NOTA: Tutti gli spettri STD sono stati acquisiti a 599,93 MHz (BF1). L'aggiustamento di d29 è fondamentale per ridurre al minimo il background proteico preservando l'integrità del segnale del ligando. Se necessario, ottimizza empiricamente questo parametro.
    5. Mappatura del legame del ligando tramite 1H-R2
      1. Selezionare il programma a impulsi CPMG_ESGP2D dalla libreria standard Bruker. Questa sequenza si basa sull'esperimento Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG), che incorpora la scultura dell'eccitazione per la soppressione dell'acqua33.
      2. Impostare l'esperimento come acquisizione 2D.
        NOTA: Questo è un esperimento pseudo-2D in cui solo la dimensione diretta viene utilizzata per le informazioni sullo spostamento chimico.
      3. Configurare i parametri di acquisizione come segue:
        Dominio del tempo (TD): 32.768 punti complessi nella dimensione diretta ¹H.
        (TD1): 2 punti.
        Larghezza spettrale (SW): 7,9932 ppm (4.795,396 Hz).
        Ritardo tra scansione (d1): 4 s.
        Frequenza portante (o1): 4,7 ppm (centrata sul segnale dell'acqua).
        Numero di scansioni (ns): 8.
        Numero di scansioni fittizie (ds): 4.
        Ritardo CPMG (d20): ≤1 ms (cioè inferiore a 1⁄3 J_HH).
        Numero di medie (TDav): 200.
      4. Esegui l'esperimento per 200 cicli di 8 scansioni ciascuno, ottenendo un accumulo totale di 1.600 scansioni. Regolare l'elenco dei contatori variabili (vclist) in base al tempo totale desiderato del ciclo CPMG (TCPMG). Qui, sono stati scelti 2 cicli per un TCPMG=8 ms e 200 cicli sono stati scelti per un TCPMG=800 ms.
      5. Eseguire due esperimenti con 1H-CPMG, uno per il campione contenente la proteina (4 mM di D-mannosio e 80 μM di CVN) e l'altro per il D-mannosio libero (4 mM di D-mannosio).
      6. Traccia gli spettri 1H per ogniT CPMGtramite il comando efp (moltiplicazione esponenziale seguita da trasformata di Fourier e correzione di fase) o sinm (moltiplicazione seno spostata di 90°, SSB=2) seguita da fp (trasformata di Fourier e correzione di fase). Regolare la funzione della finestra in base alla migliore strategia di elaborazione.
        NOTA: In questo esperimento sono stati utilizzati sinm e fp. La 1aseriale sarà lo spettro con unT CPMG di 8 ms (prima nella vclist) e laseconda seriale sarà di 800 ms (seconda nella vclist). Gli spettri H 1elaborati sono tracciati nella Figura 3.
      7. Calcola il quoziente CPMG (Q) tramite l'equazione 3.
        ​figure-protocol-5
  2. Esperimenti basati sulle proteine
    1. Preparazione del campione
      1. Preparare 600 μl di un campione contenente 436 μM di CVN uniformemente marcato con 15N in tampone fosfato di sodio (pH 7,4) integrato con 50 mM di NaCl e 5% di ossido di deuterio (D2O). Titolare il D-mannosio nel campione fino a una concentrazione finale di 60 mM. Per la titolazione, utilizzare una provetta NMR da 5 mm.
    2. Assegnazione della risonanza (passaggio di convalida opzionale)
      1. Confermare l'assegnazione del CVN libero in soluzione utilizzando i valori di spostamento chimico34 precedentemente riportati. Acquisisci i seguenti spettri a tripla risonanza: HNCO, HNCA, HNCACB e CBCACONH 35,36,37.
        NOTA: Questi esperimenti servono solo a convalidare l'assegnazione e non vengono mostrati, poiché l'assegnazione dello spostamento chimico non è l'obiettivo principale di questo protocollo.
    3. Mappatura del legame del D-mannosio su CVN mediante perturbazione dello spostamento chimico della proteina
      1. Acquisire 1spettro H-15N HSQC di 15CVN marcati con N a 298 K. Eseguire una titolazione aggiungendo D-mannosio per raggiungere le seguenti concentrazioni finali: 0, 1, 2, 5, 10, 20, 40 e 60 mM.
      2. Impostare l'esperimento 1 H-15N Fast-HSQC utilizzando la sequenza di impulsi FHSQCF3GPPH sensibile alla fase della libreria standard Bruker. Utilizzare i seguenti parametri:
        Dominio del tempo (TD): 1024 × 140 punti complessi nelle dimensioni 1H e 15N.
        Larghezza spettrale (SW): 16,0274 ppm (9615,385 Hz) nella dimensione 1H e 34 ppm (2067,119 Hz) nella dimensione 15N.
        Frequenza portante: 4,7 ppm (1H) e 119 ppm (15N).
        Numero di scansioni: 128.
      3. Calcola la perturbazione dello spostamento chimico (Δδ) utilizzando la seguente equazione:
        figure-protocol-6
        dove figure-protocol-7 e figure-protocol-8 sono le differenze di spostamento chimico tra il CVN in presenza e assenza di D-mannosio (Figura 4A).
        NOTA: Il fattore 10 rappresenta la differenza nelle larghezze spettrali tra le dimensioni del protone e dell'azoto.
      4. Calcolare la costante di dissociazione (KD) tracciando i valori CSP per ciascun residuo in funzione della concentrazione di D-mannosio. Adattare i dati risultanti a un'isoterma di legame a sito singolo utilizzando la seguente equazione (5).
        figure-protocol-9Equazione 5
        dove [PT] è la concentrazione proteica utilizzata nella titolazione (CVN), [PT] è la concentrazione del ligando (D-mannosio) e CSPmax è il CSP alla concentrazione di saturazione del ligando e CSPmin in assenza del ligando.
    4. Mappatura del legame del D-mannosio al CVN attraverso la posizione 15N-R2 della proteina.
      1. Misurare i valori 15N-R2 dei singoli residui di CVN in assenza e presenza di 60 mM di D-mannosio. Esegui tutti gli esperimenti a 298 K.
      2. Impostare l'esperimento 15N-R2 utilizzando la sequenza di impulsi sensibile alla fase basata su CPMG HSQCT2ETF3GPSI3D dalla libreria standard Bruker. Utilizzare i seguenti parametri:
        Dominio del tempo (TD): 1024 × 128 punti complessi nelle dimensioni 1H e 15N, con 8 punti nella pseudo dimensione.
        Larghezza spettrale (SW): 16,0274 ppm (1H; 9615,385 Hz) e 34 ppm (15N; 2067,119 Hz).
        Frequenza portante: 4,7 ppm (1H) e 119 ppm (15N).
        Numero di scansioni: 32. (v) Elenco dei contatori variabili: 1, 8, 2, 6, 3, 5, 4 e 7, corrispondenti a ritardi di rilassamento (Trelax) rispettivamente di 16,96, 135,68, 33,92, 101,76, 50,88, 84,96, 67,84 e 118,72 ms.
      3. Elabora gli spettri pseudo3D come una serie di spettri di rilassamento della correlazione 1H/15N simili a HSQC utilizzando NMRPipe38, seguendo il tutorial del software (vedi Tabella dei materiali per un link al tutorial).
      4. Importare gli spettri elaborati in una piattaforma di analisi NMR adatta (ad es. CCPNMR39). Seleziona tutti gli spettri e applica lo strumento "Segui modifiche di intensità". Traccia l'intensità di ogni picco incrociato in funzione delrilassamento T e adatta il decadimento a una funzione mono-esponenziale per estrarre 15valori N-R2 per ogni residuo.
      5. Calcolare l'errore sperimentale dal rapporto segnale/rumore degli spettri simili a HSQC a 67,84 ms. Elaborare una regione dello spettro contenente solo rumore e convertirla in un file di testo utilizzando il seguente comando:
        pipe2txt.tcl ./PROCs/ft/R2_67_84.ft2 > noise67_84.txt"
      6. Determinare la deviazione standard della regione di rumore utilizzando un software statistico (ad esempio, Origin (Pro), versione 2021). Definisci questo valore come l'intensità del rumore Irumore.
      7. Calcolare l'errore sperimentale per ciascun residuo utilizzando la seguente equazione:
        figure-protocol-10
        NOTA: È importante utilizzare l'errore sperimentale piuttosto che l'errore di adattamento. L'errore sperimentale definisce i limiti di interpretazione quando si confronta il 15N-R2 in assenza e presenza di D-mannosio.

figure-protocol-11
Figura 1: Perturbazione dello spostamento chimico del D-mannosio in presenza di CVN. (A) 1spettro H-13C-HSQC del D-mannosio in presenza di CVN. (B) 1spettro H-13C-HSQC di D-mannosio libero. Le etichette negli spettri mostrano ciascuna delle assegnazioni di spostamento chimico e la rispettiva configurazione anomerica (α o β). Le etichette in rosso sono quelle assegnate alla conformazione legata, e quelle in nero sono quelle assegnate alla conformazione libera. (C) Sovrapposizione degli spettri 1 H-13C-HSQC in presenza (verde) e assenza (blu) di CVN. (D) Struttura chimica del α- e del β-D-mannosio evidenziando il CSP osservato, che è stato calcolato secondo l'equazione (1). I valori CSP sono illustrati sotto i cerchi verdi. Il cerchio rosso rappresenta l'idrogeno β-anomerico che è svanito in presenza di CVN. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Spettri della differenza di trasferimento di saturazione (STD) del D-mannosio in presenza di CVN. (A) STD acquisiti a diverse frequenze di saturazione: -0,59, 0,73 e 8,1 ppm. (B) STD acquisito a diversi tempi di saturazione: 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 e 4 s. (C) Fattore di amplificazione STD (ASTD) calcolato secondo l'equazione 2 in funzione del tempo di saturazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: 1H-R2 di D-mannosio in presenza e assenza di CVN. (A) Rappresentazione degli spettri attesi di D-mannosio 1H-CPMG per un legante e un non legante acquisiti con tempi di rilassamento R2 di 8 e 800 ms in assenza (in basso) e presenza (in alto) di CVN. Q è stato calcolato secondo l'equazione 3. In assenza di interazione (Q ≈ 1), le intensità del segnale rimangono simili in entrambi i momenti di rilassamento del ligando con o senza la proteina. Dopo il legame (Q < 1), l'intensità del segnale diminuisce con l'aumentare del rilassamento per il campione contenente la proteina. (B) Rappresentazione schematica dello scambio chimico tra stati liberi e legati del D-mannosio. A seconda dei valori relativi della differenza di spostamento chimico (Δω) e della costante di cambio (kex = kon + koff), il sistema cade in regimi di scambio lento, intermedio o veloce. (e)1H Spettri NMR del D-mannosio libero e del D-mannosio in presenza di CVN, che mostrano differenze nell'intensità del segnale a 8 ms e 800 ms di tempo di rilassamento. Vengono mostrati i fattori Q calcolati per idrogeni specifici (H6β, H3β, H5α, H4β), con valori di Q più bassi che indicano interazioni più forti con CVN e identificano le regioni dello zucchero coinvolte nel legame. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Analisi delle perturbazioni a spostamento chimico (CSP) che rivelano residui di CVN coinvolti nel legame del D-mannosio. (A) Grafici a barre che mostrano i CSP di CVN dell'ammide principale (15 N-1H) dopo titolazione con D-mannosio a concentrazioni di 10 mM (in alto) e 60 mM (in basso). Le linee orizzontali indicano il CSP medio più una o due deviazioni standard (av + sd, av + 2 sd), che sono state utilizzate come soglie per identificare i residui significativamente perturbati. (B) Mappatura di residui significativamente perturbati sulla struttura di CVN complessato con il disaccaride Manα1-2Manα (PDB ID: 1IIY40). I residui con CSP superiori alla soglia av + 2 sd sono evidenziati in rosso e quelli compresi tra av + sd e av + 2 sd sono mostrati in blu. Le molecole di disaccaride Manα1-2Manα sono visualizzate in arancione per indicare la loro posizione di legame. (C) Curve di legame selezionate che rappresentano i CSP in funzione della concentrazione di D-mannosio. I dati sono stati adattati secondo l'equazione 5 come modello di legame a sito singolo per stimare KD, rivelando una gamma di affinità, con D44 che mostra l'interazione più forte (KD = 1,1 ± 0,35 mM) ed E41 la più debole (KD = 35 ± 29 mM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Analisi di 15N-R2 per CVN libero e legato al D-mannosio. (A, B) Tassi di rilassamento trasversale (15N-R2) misurati per ciascun residuo di CVN nei suoi stati (A) libero e (B) legato al D-mannosio. (C) Differenza nei valori di R2 (ΔR2 = R2bound− R2free) tracciata per residuo. Le linee blu e rosse rappresentano rispettivamente una e due deviazioni standard dalla media (av ± sd e av ± 2 sd). I residui con valori significativi di ΔR2 sono etichettati. (D) Mappatura dei valori di ΔR2 per la struttura di CVN complessata con il disaccaride Manα1-2Manα (PDB ID: 1IIY40). I residui con ΔR2 superiore o inferiore a av± 2 sd sono indicati in rosso; Quelli tra AV± SD e AV± 2 SD sono mostrati in blu. Le molecole di D-mannosio sono visualizzate in arancione per indicare la loro posizione di legame. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Risultati

Nel presente lavoro, abbiamo presentato esperimenti NMR per studiare le interazioni proteina-glicano. Il riconoscimento molecolare proteina-glicano è alla base di numerosi processi biologici che coinvolgono la matrice extracellulare (ECM), tra cui la regolazione dell'adesione, della migrazione, della proliferazione cellulare e di varie altre forme di comunicazione cellulare.

In questo caso, abbiamo scelto di lavorare con il monosaccaride D-mannosio, che è descritto come un legante debole. L'ob...

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Discussione

La spettroscopia NMR rappresenta un approccio versatile per lo studio delle interazioni proteina-glicano, in particolare grazie alla sua capacità di rilevare interazioni deboli e transitorie, come quelle osservate tra CVN e D-mannosio. Il protocollo qui descritto combina metodi NMR basati su ligando e proteine, consentendo una caratterizzazione più completa dell'interfaccia di interazione.

Le fasi critiche del protocollo includono un'attenta preparazione del c...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear Jiri Jonas (CNRMN) per l'utilizzo degli spettrometri NMR. Siamo grati alla Dott.ssa Carole Bewley per aver condiviso con noi le assegnazioni di spostamento chimico di CVN in complesso con Manα1-2Manα. Ringraziamo anche gli enti finanziatori FAPERJ e CNPq.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
13C GlucosioLaboratorio isotopico Cambrige.CLM-481
15N Cloruro di ammonioLaboratorio isotopico Cambrige.NLM-467
Cloruro di calcioSigma-AldrichVisualizzazione del materiale C4901
Coquetel inibisce la proteasiSigma-Aldrich4693159001
D2OLaboratorio isotopico Cambrige.DLM-4
D-MannosioSigma-AldrichCodice: M2069-5G
Cloruro di magnesioSigma-AldrichCodice: M8266
NMRPipeLink al tutorial del software: https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/demo.html
Cloruro di potassio (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786
Cloruro di potassio (KCl)Sigma-AldrichP3911
Cloruro di potassio (KH2PO4)Sigma-AldrichP0662
Tubo ShigemiBrukerZ1Z10684A
Cloruro di sodio (NaCl)Sigma-AldrichS9625
Fosfato di sodio (Na2HPO4)Sigma-Aldrich567545
Fosfato di sodio (NaH2PO4)Sigma-AldrichS97263
Spettrometro Bruker 600 MHzBruker
Spettrometro Bruker 800 MHzBruker
TiaminaSigma-AldrichVisualizzazione del materiale T1270
Sonda TXI a tripla risonanzaBruker
TriptoneSigma-Aldrich93657
Estratto di lievitoSigma-AldrichY1625

Riferimenti

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