Method Article

Ruolo osseo-protettivo del bupleuro in un modello di ratto di osteoporosi postmenopausale

DOI:

10.3791/68675

⸱

August 22nd, 2025

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1YouJiang Medical University for Nationalities, 2Affiliated Hospital of YouJiang Medical University for Nationalities, 3ShenZhen International Travel Health Care Center (ShenZhen Customs Port Clinic)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo studio, abbiamo utilizzato un modello di ratto ovariectomizzato di osteoporosi postmenopausale per dimostrare che il liquido orale Bupleurum (Chai hu) migliora la microstruttura ossea sopprimendo i fattori pro-infiammatori e potenziando quelli anti-infiammatori. Ciò suggerisce che il suo meccanismo antinfiammatorio mitiga parzialmente l'osteoporosi indotta da carenza di estrogeni.

Abstract

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Il protocollo mira a studiare gli effetti della somministrazione di Chai hu sull'osteoporosi postmenopausale nei ratti ovariectomizzati (OVX). Le femmine di ratto Sprague-Dawley di otto settimane sono state sottoposte a ovariectomia bilaterale utilizzando l'approccio dorsale per stabilire un modello di osteoporosi postmenopausale. Diverse dosi di Chai hu liquido orale sono state somministrate mediante sonda gastrica orale per 12 settimane consecutive, seguite da valutazioni della microstruttura ossea e misurazioni dei livelli di citochine infiammatorie. Il trattamento con Chai hu a dosi medie e alte ha parzialmente inibito la perdita ossea, ridotto l'espressione di citochine pro-infiammatorie e sovraregolato i livelli di citochine anti-infiammatorie nei ratti OVX. C'è stata una significativa riduzione della gravità della distruzione ossea da basse ad alte dosi e sono stati osservati miglioramenti dose-correlati nella ricostruzione microstrutturale ossea. Chai hu ha mitigato la perdita ossea indotta dalla carenza di estrogeni e il deterioramento microstrutturale, sopprimendo così la progressione dell'OP in questo modello OVX. È probabile che ciò sia dovuto agli effetti antinfiammatori delle vie coinvolte.

Introduction

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L'osteoporosi (OP) è una comune malattia metabolica ossea caratterizzata da diminuzione della massa ossea, riduzione della forza ossea e distruzione della microarchitettura ossea1. L'OP può manifestarsi come primaria o secondaria e l'OP primario è classificato come OP postmenopausale (PMOP), OP senile e OP idiopatico (che si verifica spesso negli adolescenti). Tra questi, la PMOP di tipo I si verifica principalmente nelle donne PM, dove c'è una marcata diminuzione della densità ossea dopo la menopausa a causa della riduzione dei livelli circolanti di estrogeni2. Si tratta di una malattia metabolica sistemica delle ossa, che provoca un aumento dell'attività degli osteoclasti e un'intensa differenziazione3. Inoltre, l'intensità del riassorbimento osseo è molto maggiore della sua formazione, con conseguente diminuzione della massa ossea, aumento della fragilità ossea e del rischio di fratture4.

La ricerca attuale ha scoperto che molte malattie infiammatorie croniche, come l'osteoartrite e la parodontite, sono associate a una significativa perdita ossea, suggerendo che l'infiammazione può essere strettamente correlata all'OP5. Con l'avanzare dell'età, oltre ai cambiamenti endocrini, le funzioni fisiologiche e immunitarie diminuiscono e il corpo viene lasciato in uno stato di infiammazione cronica per lunghi periodi di tempo. Molti di questi fattori che promuovono l'infiammazione e le citochine derivate dalle cellule T svolgono un ruolo importante nella perdita ossea. Pertanto, la PMOP è anche riconosciuta come una malattia infiammatoria cronica 6,7.

La medicina tradizionale cinese (MTC) ha una lunga storia e una ricca esperienza clinica nella prevenzione e nel trattamento della PMOP, concentrandosi sulla gestione olistica e sulla diagnosi e il trattamento individualizzati, e può regolare il sistema endocrino e immunitario allo stesso tempo, il che è una benedizione per le donne in postmenopausa8. Permette a un'ampia percentuale di donne di avere accesso alle cure mediche. I moderni studi farmacologici e le sperimentazioni cliniche hanno dimostrato che la MTC presenta i vantaggi del multi-targeting, della bassa tossicità e degli effetti collaterali ed è economica. Il rischio di complicanze può essere notevolmente ridotto nel trattamento MTC di PMOP9.

Il chai hu stesso ha proprietà antinfiammatorie10 e antidepressive11e può regolare la secrezione ormonale nel corpo12 oltre a favorire una buona salute13. Chai hu è l'ingrediente principale che svolge un ruolo importante nella formula del composto MTC, Xiaoyao Pills, che ha l'effetto di calmare le emozioni, favorire la digestione e l'assorbimento nello stomaco e nell'intestino. È anche noto per reintegrare il qi e l'energia del sangue, oltre a regolare i sintomi del ciclo mestruale e il disagio ad esso associato14. Il principale costituente del Chai hu è la saponina Chai hu, che ha una forte attività antinfiammatoria, che si manifesta principalmente nell'inibizione dell'espressione di citochine pro-infiammatorie, come il fattore di necrosi tumorale α (TNF-α), l'interleuchina 1β e l'IL-615. Inoltre, migliora l'espressione della citochina antinfiammatoria, IL-10, alleviando così l'infiammazione, come la colite, l'endometrite e l'epatite16.

Rispetto ai trattamenti OP standard (compreso l'uso di bifosfonati17, modulatori selettivi del recettore degli estrogeni18 e denosumab19), Chai hu, come MTC comunemente usato, ha il potenziale vantaggio di un meccanismo d'azione multi-componente e multi-target. Le terapie standard di solito prendono di mira specifiche vie metaboliche ossee20 (inibizione dell'attività degli osteoclasti), che possono essere associate a determinati effetti collaterali come disagio gastrointestinale, aumento del rischio di osteonecrosi delle mascelle e sintomi simil-influenzali, nonché elevati costi dei farmaci a lungo termine21.

Una revisione della letteratura pertinente ha rilevato che l'uso di Chai hu per intervenire nei ratti PM con OP potrebbe avere effetti terapeutici attenuanti22. Pertanto, sulla base della bioinformatica e dell'analisi farmacologica, nonché della simulazione del docking molecolare per prevedere i siti di docking23, abbiamo ipotizzato che Chai hu potesse intervenire nel processo infiammatorio, modulare lo stato immunitario del corpo e ripristinare l'omeostasi immunitaria ossea. Questi favoriranno la stabilità dello stato di ricostruzione ossea e otterranno l'effetto terapeutico desiderato di alleviare l'OP.

Questo studio ha impiegato la somministrazione di Chai hu liquido orale (concentrazione: 1 g/mL) per 12 settimane consecutive. Il regime posologico è stato progettato sulla base di dosi clinicamente comuni negli studi di MTC e farmacocinetica24.

L'obiettivo generale di questo metodo di somministrazione è stabilire un protocollo di dosaggio stabile e clinicamente rilevante, valutando così sistematicamente l'effetto di intervento prolungato di Chai hu nel modello target (un modello di ratto di osteoporosi postmenopausale). Questo approccio di somministrazione garantisce che il farmaco mantenga un'efficace concentrazione plasmatica per tutto il periodo sperimentale, fornendo una base di intervento affidabile per le valutazioni successive (come gli indicatori del metabolismo osseo e i livelli dei fattori infiammatori). Inoltre, aiuta a chiarire il ruolo del Chai hu nelle malattie correlate e la sua relazione dose-effetto, offrendo al contempo un paradigma di riferimento per la somministrazione standardizzata delle medicine tradizionali cinesi nella ricerca sperimentale.

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Protocol

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Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono gli animali sono state condotte in conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (8a edizione) e sono state specificamente approvate dal Comitato etico animale dell'Università medica di Youjiang per le nazionalità (approvazione n. 2024071001).

1. Analisi della farmacologia di rete

NOTA: La cyberfarmacologia è un approccio che combina biologia dei sistemi, biologia computazionale e farmacologia e mira a comprendere il meccanismo d'azione dei farmaci e le interazioni farmaco-farmaco analizzando le reti biomolecolari25.

  1. Screening di composti attivi con buona biodisponibilità orale (OB) e farmaco-somiglianza (DL) utilizzando strumenti come il database di farmacologia e la piattaforma di analisi dei sistemi di medicina tradizionale cinese (TCMSP: http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php). Impostare l'OB a ≥30% e il DL a ≥0,1826. Cerca Chai hu e fai clic su Dettagli erba e scarica tutti i dati del composto. Assegna un nome al file scaricato Chaihu.
  2. Ottieni il nome di destinazione dell'ingrediente principale incollando l'ID MOL dell'ingrediente principale nel database TCMSP. Incolla nella ricerca batch TCMSP e seleziona Previsione target, quindi fai clic su Invia.
  3. Apri il database UniProtsh, copia la colonna Nome target nella ricerca e trova il nome della proteina in grassetto, che è esattamente lo stesso del nome della proteina target incollata. Dopo aver trovato il nome della proteina corrispondente, raccogli i nomi dei geni corrispondenti nella colonna successiva.
  4. Filtra i geni correlati all'osteoporosi nel database GeneCards (https://www.genecards.org) in base al punteggio di pertinenza ≥ 1 e ottieni tutti i (5741) geni27.
    NOTA: Le ragioni per la selezione di geni con un punteggio di rilevanza ≥ 1 dal database GeneCards sono le seguenti: Un punteggio ≥ 1 indica che il gene ha associazioni documentate con la malattia bersaglio, distinguendolo chiaramente dai geni senza associazioni riportate (punteggio = 0). Questa soglia garantisce la conservazione di geni con rilevanza credibile per la malattia, evitando al contempo un'eccessiva interferenza da parte di geni non correlati. Una soglia più bassa (<1) potrebbe includere geni senza associazioni convalidate, aumentando così i falsi positivi.
  5. Ottenere i geni intersecanti dopo aver combinato set di geni correlati alla malattia con bersagli farmacologici per l'intersezione. Sulla base delle interazioni tra i bersagli della malattia e i principi attivi dei farmaci, costruisci una rete di intersezione tra principio attivo della medicina tradizionale cinese, bersaglio e malattia utilizzando il software Cytoscape.
  6. Ottenere informazioni sull'interazione proteina-proteina (PPI) attraverso il database String (https://cn.string-db.org/) e costruire una rete PPI. Apri Cytoscape (https://www.cytoscape.org), carica il file TSV scaricato sulla rete di caricamento, quindi seleziona Calcola > TOP10 o TOP20 e fai clic su Invia.
  7. Crea due tabelle per l'importazione in Cytoscape. Crea un file di foglio elettronico chiamato Rete. Nella colonna A, inserisci gli stessi ID MOL (CH1, CH2...) che sono stati sostituiti con l'abbreviazione della medicina tradizionale cinese. Etichettare la colonna B come ID MOL e ordinarla in ordine crescente in base agli ID MOL. Etichetta la colonna C come simbolo. Copia gli ID dei componenti (MOL ID) e i nomi dei geni dai file relativi a Chaihu rispettivamente nelle colonne B e C. Quindi elimina la colonna B e rinomina la colonna A come MOL ID.
  8. Estendi la tabella fino alla fine del testo. Nella colonna Simbolo, inserisci gli ID MOL (CH1, CH2...), sostituiti con l'abbreviazione della medicina tradizionale cinese. Nella colonna MOL ID, inserire l'abbreviazione della medicina tradizionale cinese: CH. Con i passaggi sopra descritti si completa l'integrazione informativa e la costruzione della rete Medicina Tradizionale Cinese - Componente - Target.
  9. Quindi, esegui il secondo modulo, il file TYPE. Crea un nuovo foglio di calcolo e chiamalo TYPE. Etichettare la colonna A come termine e la colonna B come TIPO. Copia il nome del gene nella colonna dei termini e assegnagli l'attributo del gene nella colonna del tipo (lo scopo è cercare il gene; tutti i nomi dei geni verranno selezionati, in modo che sia facile da usare). Inserisci gli ingredienti nella colonna Termine e assegna all'ingrediente l'attributo farmaco1.
  10. Importa nel software Cytoscape. Importa rete per caricare il file di rete e importa tabella per caricare il file di tipo. Nella casella di ricerca, digita gene, premi Invio, in modo che tutti i geni siano selezionati, trascina i geni selezionati verso sinistra, quindi fai clic su Layout > Attribute() > Selected (scegli rotondo o quadrato tra parentesi).
  11. Combina i risultati dell'analisi farmacologica di rete con i dati sperimentali per identificare i composti chiave e i meccanismi molecolari dell'azione dei farmaci.

2. Docking molecolare

NOTA: Il docking molecolare è una tecnica computazionale per prevedere la modalità di legame ottimale e l'affinità tra una piccola molecola (ligando) e una proteina bersaglio o una biomolecola28.

  1. Preparazione del recettore e del ligando
    1. Fonte del recettore (proteina): Ottenere il file PDB delle proteine bersaglio dalla RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org). Cerca 3Q4B (esempio di recettore IL-6), fai clic su Scarica file > formato PDB.
    2. Per rimuovere le molecole d'acqua cristallografiche, fare clic su Modifica > Elimina > Acqua, ioni estranei e ligandi non essenziali (conservano cofattori critici come gli ioni metallici) facendo clic su Modifica > Elimina > eteroatomi. Per aggiungere gli atomi di idrogeno mancanti, fare clic su Modifica > idrogeni > Aggiungi. Salva come protein.pdbqt. facendo clic su Modifica > Addebiti > Calcola Gasteiger, quindi su Griglia > macromolecola > Scegli > Salva come PDBQT.
    3. Ligando (piccola molecola) fonte: Scarica la struttura del ligando da PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). Cerca Saikosaponin A (CID:6443568), fai clic su Conformatore 3D > Scarica SDF.
    4. Utilizza il software Open Babel per convertire il file Saikosaponin A in formato SDF in un file in formato PDB con conformazioni tridimensionali a bassa energia e chiamarlo saikosaponinA.
  2. Impostazione dei parametri di docking (strumenti AutoDock)
    1. File del recettore di carico e del ligando. Importa il file della piccola molecola saikosaponina A e salvalo come file PDBQT. Successivamente, caricare il recettore e il ligando: fare clic su Docking > Macromolecule > Open, selezionare IL6_receptor.pdbqt; quindi fare clic su Docking > Ligand > Open, selezionare saikosaponinA.pdbqt.
    2. Configura la casella della griglia: fai clic su Griglia > Casella della griglia, regola le dimensioni della casella per comprendere completamente il sito attivo (usa la manopola di controllo sul pannello di sinistra per mettere a punto), quindi salva le impostazioni correnti facendo clic su File > Chiudi salvataggio corrente e denomina il file grid.gpf.
    3. Configurare il programma in esecuzione AutoGrid: fare clic su Esegui AutoGrid, selezionare il file grid.gpf e quindi fare clic su Avvia. Quindi, configura i parametri di docking: In sequenza, nel menu Docking, fai clic su Macromolecola e seleziona il file proteico IL6_receptor.pdbqt; fare clic su Ligando e selezionare il file della piccola molecola saikosaponina A.pdbqt; impostare l'algoritmo genetico e confermarlo; regolare i parametri di aggancio e confermarli. Infine, in Output, selezionare l'algoritmo lamarckiano (4,2), assegnare al file il nome dock.dpf e salvarlo.
    4. Eseguire AutoGrid e salvare i risultati: fare clic su Esegui AutoDock, selezionare il file dock.dpf e avviare la simulazione. Al termine, fare clic su Scrivi complesso, assegnare un nome alla struttura complessa e salvarla in formato PDBQT.
  3. Analisi dei risultati con PyMOL
    1. Convertire il file in formato PDBQT ottenuto dalla precedente fase di docking molecolare in formato PDB utilizzando il software Open Babel. Quindi importare il file in formato PDB nel software PyMOL per le successive operazioni di visualizzazione.
    2. Individua il ligando e separalo individualmente: dopo aver selezionato il ligando, cambiane il colore facendo clic su Sele e quindi scegliendo un Colore da Colore. Nella colonna Sele, fare clic su Estrai oggetto in Azione per estrarre il ligando come nuovo oggetto indipendente.
    3. Misurazione della distanza del legame idrogeno: nella colonna Sele, fare clic su Azione, trovare Contatti polari e fare clic su Agli altri atomi nell'oggetto; I legami idrogeno saranno visualizzati come linee gialle. Fare clic sull'opzione Misurazione nella colonna Procedura guidata, fare clic sugli atomi ad entrambe le estremità del legame idrogeno in sequenza, quindi fare clic su Fine per completare la misurazione.
  4. Esportare l'immagine: fai clic su "Esporta immagine come PNG nel file". Se è necessario il rendering ad alta definizione, immettere ray 300 (pixel regolabili) e premere Invio.

3. Analisi Micro-CT

  1. Iniettare femmine di ratto SD (32 settimane di età, 320-350 g) per via intraperitoneale con pentobarbital sodico (40 mg/kg) per un'anestesia profonda, confermata dall'assenza di riflesso corneale (nessun battito di ciglia al tocco del batuffolo di cotone) e riflesso del dolore (nessuna contrazione degli arti posteriori al pizzico del forcipe).
    1. Eseguire un intervento chirurgico di isolamento degli arti posteriori. Eutanasia dei ratti mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico a una dose 3-5 volte superiore alla dose dell'anestetico chirurgico (40 mg/kg), posizionarli supini e praticare un'incisione trasversale di 3 cm, 1 cm sopra la sinfisi pubica lungo il legamento inguinale. Sezionare senza mezzi termini lo spazio tra i muscoli gracile e sartorio per esporre l'arteria femorale (struttura tubolare pulsante). Legare entrambe le estremità dell'arteria femorale usando suture 4-0, lasciando una sezione non legata in mezzo, prima di troncare il vaso con le forbici oftalmiche e sezionarlo.
    2. Ruotare internamente l'arto inferiore per dislocare la testa del femore dall'acetabolo e tagliare la capsula articolare e il legamento rotondo, preservando l'integrità della testa del femore. Immergere l'arto posteriore intatto in soluzione fisiologica pre-raffreddata, quindi fissare in soluzione di formaldeide al 4% per 24-48 ore.
  2. Configurazione dell'imaging: Consegna del femore fisso alla struttura per la scansione micro-CT. Accendere il dispositivo Micro-CT e selezionare il programma preimpostato per la scansione delle ossa di piccoli animali . Utilizzare i seguenti parametri di scansione: Tensione dei raggi X = 90 kV, Corrente dei raggi X = 80 μA, Campo visivo (FOV) = 36 mm, Dimensione dei pixel = 72,0 μm, Rotazione = 360°, Durata della scansione = 14 min.
  3. Posizionare il femore della zampa sinistra del ratto fissato nel portacampioni, fissare l'epifisi femorale da fotografare, avviare il dispositivo e attendere il completamento dell'autotest della macchina. Avvia una scansione di anteprima (scansione rapida a bassa risoluzione) per confermare che il campione è centrato, quindi regola la regione di interesse per coprire l'intero femore.
  4. Al termine della scansione e della fotografia, la sorgente di luce a raggi X si spegne automaticamente. In questo momento, il valore di radiazione all'interno della macchina supera lo standard ed è assolutamente vietato estrarre il campione senza dispositivi di protezione.
  5. Analisi delle immagini: analizza i parametri ossei (densità minerale ossea [BMD], numero trabecolare) utilizzando il software integrato dello scanner. Salva ed esporta le immagini ricostruite per un'ulteriore valutazione.

4. PCR quantitativa in tempo reale per l'estrazione di RNA da tessuto osseo di ratto

  1. Rimuovere i muscoli aderenti e la fascia dal femore destro. Tagliare 100-200 mg di tessuto osseo in piccoli pezzi. Aggiungere 2-3 perle di macinazione e 500 μL di tampone di estrazione dell'RNA. Omogeneizzare con un trituratore di tessuti a 70 Hz per 5 minuti a 4 °C.
  2. Separazione di fase: dopo la centrifugazione, la soluzione si separa in una fase acquosa superiore (contiene RNA) e in un precipitato scuro inferiore (contiene proteine, DNA e polisaccaridi). Trasferire con cautela 500 μl di surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL priva di RNasi.
  3. Processare la soluzione superiore ottenuta dall'isolamento per l'estrazione dell'RNA totale secondo le istruzioni del produttore.
  4. Dopo aver aggiunto l'isopropanolo alla soluzione di lisi, capovolgere delicatamente il tubo per mescolare la soluzione e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per 10 minuti. A questo punto eseguire un controllo visivo; se si osservano precipitati di RNA flocculante bianco (che aderiscono alla parete del tubo), indica che l'RNA è stato efficacemente precipitato.
  5. Utilizzare un puntale per pipetta da 200 μl per aspirare il liquido residuo. Trattenere il pellet di RNA bianco sul fondo/parete del tubo. Risospendere l'RNA in 50-100 μL di acqua priva di RNasi e conservarlo a -80 °C.
  6. Mescolare 2 μL di RNA stampo, 10 μL di master mix, 2 μL di DNasi e 5 μL di acqua priva di nucleasi in una provetta priva di nucleasi. Miscelare delicatamente pipettando.
  7. Incubare a 37 °C per 2 minuti per rimuovere la contaminazione genomica del DNA. Incubare a 55 °C per 15 min. Al termine della reazione, incubare a 85 °C per 5 minuti per interrompere la reazione.
  8. Configura il sistema di PCR quantitativa a fluorescenza in tempo reale posizionando il DNA trascritto inversamente sul ghiaccio. Premiscelare tutti i componenti: 10 μL di qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox), 0,4 μL ciascuno di Forward Primer e Reverse Primer e 8,2 μL di acqua priva di RNasi, dividere e aggiungere 1μL di DNA, manipolare sul ghiaccio e proteggere dalla luce.
  9. Eseguire il programma qPCR come segue: Pre-denaturazione a 95 °C per 5 min, 1 ciclo seguito da denaturazione a 95 °C per 10 s per 40 cicli. Eseguire ricottura, estensione, acquisizione della fluorescenza a 60 °C per 30 s per 40 cicli nel canale SYBR Green. Ottenere una curva di fusione per temperature da 65 a 95 °C con incrementi/passo di 0,5 °C e 5 s/passo. I primer utilizzati sono riportati nella Tabella 1.

5. Preparazione degli animali

  1. Ottenere 48 ratti SD nullipare femmine (grado SPF, età 8 settimane, peso corporeo 200-220 g).
  2. Prima delle procedure sperimentali, acclimatare tutti i ratti con un periodo di quarantena di 7 giorni in una struttura di isolamento di grado SPF e in un ambiente di laboratorio controllato con SPF (temperatura: 22-24 °C, umidità: 45%-55%).

6. Preparazione del farmaco in esame

  1. Ottenere il liquido orale Chai hu (China National Medical Product Approval No. Z41021539). La formulazione contiene Chai hu (fonte settentrionale) come ingrediente attivo, con eccipienti tra cui agente aromatizzante, saccarosio e glicole propilenico. Ogni flaconcino da 10 ml contiene un estratto equivalente a 10 g di erba grezza.

7. Preparazione di un modello di ratto ovariectomizzato

  1. Preparazione preoperatoria: ratti veloci per 12 ore con accesso ad libitum all'acqua. Eseguire la sterilizzazione degli strumenti mediante sterilizzazione in autoclave di tutti gli strumenti chirurgici.
  2. Anestesia e preparazione: somministrare pentobarbital sodico per iniezione intraperitoneale (40 mg/kg). Controllare la profondità dell'anestesia valutando l'assenza del riflesso corneale (nessun battito di ciglia al tocco corneale con batuffolo di cotone) e l'assenza del riflesso del pizzicamento delle dita dei piedi (nessuna retrazione degli arti posteriori durante il clamping). Dopo 15-20 minuti, radere il sito chirurgico, disinfettare con iodio e coprire con un telo fenestrato. Applicare unguento oculare alla vitamina A (contenente 15.000 UI/g) durante l'operazione per evitare che gli occhi dell'animale si secchino (Tabella 2).
  3. Modello di ratto ovariectomizzato: eseguire l'intervento chirurgico in una sala operatoria sterile dedicata. Tutto il personale indossava camici isolanti. Pulire il piano di lavoro e l'attrezzatura circostante con etanolo al 75% (Tabella 2) prima dell'intervento chirurgico e accendere le lampade a raggi ultravioletti per almeno 30 minuti per eliminare i microbi nell'aria e sulle superfici.
    1. Praticare un'incisione di 1 cm sulla pelle dorsale, sezionare senza mezzi termini il tessuto sottocutaneo, pizzicare lo strato muscolare e praticare un'incisione di 1 cm. Individua il cuscinetto adiposo ed esteriorizzalo per identificare l'ovaio (di colore rosso vivo). Legare la tuba di Falloppio con sutura 4-0, asportare il tessuto ovarico e inserirlo in una provetta da centrifuga da 50 ml contenente il 4% di paraformaldeide (Tabella 2).
  4. Chiusura e disinfezione della ferita: cospargere la polvere di penicillina nella ferita prima della sutura. Sutura lo strato muscolare con la sutura n. 6 non assorbibile e chiusura della pelle con la sutura n. 2. Disinfettare l'incisione chiusa con iodio e applicare la polvere topica di penicillina.
  5. Cure postoperatorie: Metti i ratti in gabbie fresche con bottiglie di acqua calda e asciugamani per mantenere la temperatura corporea. Digiunare gli animali (acqua consentita) per 24 ore dopo l'intervento chirurgico per prevenire l'ostruzione intestinale. Applicare quotidianamente la polvere di penicillina sul sito di incisione per 3 giorni consecutivi.
    1. Iniettare lidocaina (concentrazione 1%-2%, massimo 5 mg/kg) intorno all'incisione chirurgica per ridurre il dolore postoperatorio immediato. Fornire un'analgesia continua per 3-5 giorni, riducendo gradualmente la dose in base alla gravità del dolore per evitare interruzioni brusche.
    2. Tenere l'animale in posizione laterale o a testa in giù prima del risveglio per evitare la caduta della lingua e l'ostruzione delle vie aeree; consentono un posizionamento autonomo e confortevole dopo il risveglio. Isolare gli animali postoperatori dagli altri fino al completo recupero per evitare combattimenti o infezioni incrociate (Figura 1).

8. Raggruppamento sperimentale e somministrazione di farmaci

  1. Assegnazione del gruppo: dividere un totale di 40 ratti SD in cinque gruppi (n = 8 per gruppo), vale a dire, controllo normale, controllo modello, Chai hu a bassa concentrazione, Chai hu a media concentrazione e Chai hu ad alta concentrazione.
  2. Per il gruppo a dose media (5 ml/kg), selezionare il dosaggio in base alle linee guida riportate in 29,30. Seguire un rapporto di gradiente di concentrazione di 1:2:4 per il gruppo a bassa concentrazione: 2,5 mL/kg, il gruppo a media concentrazione: 5 mL/kg e il gruppo ad alta concentrazione: 10 mL/kg.
  3. Somministrazione del farmaco: utilizzare la sonda gastrica orale e somministrare il farmaco una volta al giorno. Per il gruppo di controllo normale e il gruppo di controllo modello (animali sottoposti a ovariectomia bilaterale), eseguire la sonda gastrica orale con una quantità uguale di soluzione fisiologica. Iniziare il trattamento alla settimana 1 dopo l'intervento chirurgico e continuare per 12 settimane.

9. Analisi post-esperimento e raccolta dati

  1. Eseguire le seguenti analisi su cinque gruppi di animali: micro-TC della struttura ossea e determinazione dell'espressione dell'mRNA delle citochine infiammatorie nei tessuti femorali di ratto.
  2. Raccogliere dati che includono immagini visualizzate della microstruttura trabecolare femorale; parametri ossei quantitativi (tra cui densità minerale ossea, frazione di volume osseo, deviazione standard dello spessore trabecolare, spaziatura trabecolare, numero trabecolare e densità di connettività); e i relativi livelli di espressione dell'mRNA delle citochine pro-infiammatorie (IL-6, IL-17) e delle citochine anti-infiammatorie (IL-4, IL-10) nei tessuti femorali.
  3. Esegui analisi dei dati utilizzando il software GraphPad Prism 10.1.2 mediante analisi della varianza unidirezionale (ANOVA). La significatività statistica per le differenze tra gruppi nelle medie è stata definita come p < 0,05. Sono stati eseguiti confronti multipli post-hoc utilizzando il test di Tukey.

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Results

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Analisi della funzione GO e dell'arricchimento della via KEGG

Ci siamo basati sull'analisi dell'arricchimento GO e KEGG in bioinformatica per prevedere il potenziale meccanismo d'azione di Chai Hu sul PMOP. L'analisi dell'arricchimento di OB dei geni bersaglio che si intersecano con i principi attivi di Chai hu per le malattie ha prodotto 2138 voci significative e i primi dieci risultati significativi sono elencati per ciascun gruppo (Figu...

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Discussion

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La PMOP è un disturbo sistemico del metabolismo osseo che si verifica spesso nelle donne con PM ed è causato da una mancanza di estrogeni che provoca un'interruzione dell'equilibrio osteoblasto-osteoclasto, portando a un maggiore riassorbimento osseo degli osteoclasti e a una diminuzione della produzione ossea degli osteoblasti31. Un numero crescente di studi ha dimostrato che i livelli di fattori infiammatori nell'organismo influenzano anche la differenziazione t...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma di ricerca scientifica e sviluppo tecnologico della città di Baise e dal progetto di miglioramento delle abilità di base per la ricerca scientifica degli insegnanti di età giovane e di mezza età delle università del Guangxi 2025 (Progetto n.: 2025KY0549). Gli autori ringraziano il Dr. Dev Sooranna dell'Imperial College di Londra e YMUN per l'editing del manoscritto. ZY e LYR hanno contribuito in egual misura a questo lavoro.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Iniezione di cloruro di sodio allo 0,9% HuarenfarmaceuticoH1712059
1&volte; PBS Thermofisher10010023
75% di alcol NanchinoreagenteC069156931
Etanolo al 95% NanchinoreagenteC0691520075
Etanolo anidroMacklinE809056
Bupleurum chinense Henan Baiquan Farmacia Co.Z41021539
soluzione di decalcificazione SolarbioE1171
unguento all'eritromicina Guangzhou Baiyunshan Pharmaceutical Group Company Limited Fabbrica farmaceutica Baiyunshan HejigongH44023088
Alcool isopropilico Jinan Jinrihe Chemical Co.23727-29-9
capsule di penicillina V potassioSichuan FarmaceuticoH20103156
poliformaldeide (CH2O)nBeyotimeP0099
disinfettante iodio-povidone Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co.H44023924
Kit PCR a fluorescenza in tempo realeYeasen BiotecnologieCodice 11201ES03
Kit di estrazione dell'RNAMonadbiotechMI20201S
Kit di trascrizione inversa dell'RNAYuGongBiotecnologiaEG15123S
Pentobarbital di sodio Shanghai Jixiang Biotecnologia Co.JX082085
Trizol ThermofisherCodice 15596026CN

References

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