Articolo metodologico

Saggio di diluizione FRET per l'analisi dello scambio dinamico tra assemblaggi proteici

DOI:

10.3791/68678

⸱

19 settembre 2025

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology and the Institute for Collaborative Biotechnologies, University of California, Santa Barbara

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive la purificazione e la marcatura covalente della reflectina A1, nonché un saggio di diluizione FRET per caratterizzare lo scambio dinamico della proteina reflectina tra assemblaggi proteici in funzione dell'età.

Abstract

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In qualità di driver molecolare per l'iridescenza sintonizzabile nei cefalopodi, il comportamento della fase sintonizzabile della proteina reflectina A1 continua ad essere al centro dell'ingegneria dei biomateriali. La modulazione della concentrazione salina e della densità di carica netta della proteina della reflectina A1 spinge la proteina a formare assemblaggi dinamici come intermedi per la separazione di fase liquido-liquido. Gli assemblaggi di reflectina, sebbene limitati nelle dimensioni dall'entità della neutralizzazione di carica della repulsione cationica della proteina, sono inizialmente in scambio dinamico con monomeri o oligomeri della soluzione circostante. È stato utilizzato un nuovo saggio di diluizione per il trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza (FRET), in combinazione con la diffusione dinamica della luce (DLS) e i saggi di concentrazione proteica, per caratterizzare il flusso bidirezionale di proteine tra gli assemblaggi di reflectina A1 e una fase diluita in funzione dell'età di assemblaggio. Questo saggio di diluizione FRET distingue tra flusso unidirezionale e bidirezionale di proteine all'interno e all'esterno di assemblaggi proteici e, pertanto, può essere applicato durante la formazione dell'assemblaggio. La differenziazione tra assemblaggi proteici dinamici e cineticamente arrestati è fondamentale per comprenderne le origini biofisiche e questo nuovo saggio di diluizione FRET può essere adattato per integrare le indagini biofisiche di altri assemblaggi proteici.

Introduzione

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L'iridescenza sintonizzabile nei calamari loliginidi è mediata dalle proteine della reflectina nelle cellule iridocitarie 1,2,3. Gli iridociti contengono invaginazioni di membrana estese e regolari che formano pile di lamelle di Bragg dense di proteine, che riflettono la luce in modo dipendente dall'angolo e dalla lunghezza d'onda 1,4,5,6. Una cascata di segnali innescata dall'acetilcolina culmina nella fosforilazione delle proteine cationiche della reflectina 1,2,7, riducendo la repulsione elettrostatica intra- e inter-proteica e guidando la condensazione delle reflectine nelle lamelle di Bragg da particelle di raggio idrodinamico 10-50 nm a un condensato liquido denso 3,8,9. La reflectina A1 in vitro forma assemblaggi con raggio di 10+ nm stabili le cui dimensioni sono precisamente regolate dalla densità di carica netta delle proteine 10,11,12, e questo comportamento colloidale sintonizzabile ha suscitato molto interesse bioingegneristico nella progettazione di materiali biofotonici sintonizzabili a base di reflectina 13,14,15,16,17,18. E' stato recentemente dimostrato che NaCl guida l'assemblaggio della reflectina A1 e la LLPS (Liquid-Liquid phase separation) aumentando entropicamente il contributo energetico dell'effetto idrofobico e schermando le cariche repulsive dei linker cationici alternati19.

Per i condensati simili a liquidi densi di proteine, lo scambio dinamico tra la fase densa e la fase diluita può essere facilmente analizzato utilizzando FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) a goccioline intere20; È necessario un saggio analogo per assemblaggi di proteine su scala nanometrica. Recenti segnalazioni di assemblaggi proteici fisiologicamente rilevanti come intermedi di LLPS 19,21,22 hanno suggerito la necessità di metodi equivalenti per interrogare la dinamica dell'assemblaggio e lo scambio dinamico tra gli assemblaggi e la coesistente fase diluita. I cluster proteici possono includere colloidi simili al vetro cineticamente arrestati prodotti dalla decomposizione spinodale arrestata, assemblaggi di equilibrio dinamico che scambiano monomeri o oligomeri dalla fase diluita e cluster metastabili 23,24,25,26,27. Le dinamiche di assemblaggio delle proteine dipendenti dall'età sono quindi fondamentali per comprendere i processi fisici che guidano la formazione di assemblaggi proteici nel contesto di un comportamento di fase più complesso.

Per caratterizzare la dinamica dei cluster proteici metastabili21, sono stati utilizzati approcci basati su FRET che analizzano l'interazione tra assemblaggi di proteina marcata con fluoroforo donatore e assemblaggi di proteina marcata con fluoroforo accettore. Dopo aver mescolato questi cluster, l'emergere di FRET dimostra lo scambio e il trasporto di proteine nei cluster21. Tuttavia, per alcune proteine, come la reflectina A1, i cluster si formano e crescono continuamente per tutta la durata dell'esperimento19. Per tali proteine, è necessario un approccio che deconvolusca il trasporto unidirezionale delle proteine in cluster, come potrebbe verificarsi durante la formazione continua di cluster dinamicamente arrestati, e il trasporto bidirezionale delle proteine tra gli assemblaggi.

Un approccio di diluizione FRET realizza questo tramite diluizione con fluoroforo (Figura 1), in cui una diminuzione di FRET significa trasporto bidirezionale di proteine tra assemblaggi. Sono stati preparati assemblaggi proteici di proteina reflectina che contenevano quantità uguali di proteina marcata con accettore-fluoroforo o donatore-fluoroforo. Questi assemblaggi di reflectina co-marcati sono stati diluiti con una soluzione contenente assemblaggi di reflectina non marcati e lo scambio dinamico di proteine tra gli assemblaggi è stato analizzato in funzione dell'età di assemblaggio. Questo metodo distingue la formazione continua di cluster proteici cineticamente arrestati dai cluster dinamici, inclusi ma non limitati a cluster metastabili, cluster che crescono a causa della maturazione di Ostwald o processi di ingrossamento simili, cluster che crescono per fusione e cluster che non sono intermedi per LLPS. Non distingue solo tra questi diversi meccanismi di scambio dinamico, che richiede metodi ortogonali come la diffusione dinamica della luce, l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) e i saggi di Bradford19,21. Questo protocollo descrive i metodi per la purificazione della reflectina A1 wild-type e del singolo mutante contenente cisteina A1-C232S, la marcatura covalente di A1-C232S e l'analisi di diluizione FRET.

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Protocollo

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I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Purificazione delle proteine ed etichettatura covalente

  1. Trasformazione
    1. Clonare i geni reflectina A1 e reflectina A1 C232S (GenBank KF661517.1) nei plasmidi pj411.
    2. Incollare le cellule di Rosetta 2 (DE3) con plasmidi utilizzando il trattamento con shock termico28.
    3. Piastre di cellule trasfettate su agar contenente 50 μg/mL di kanamicina.
    4. Selezionare una colonia isolata e aggiungerla a 5 mL di TB (Terrific Broth) contenente 50 μg/mL di kanamicina e incubare a 37° C su un agitatore a 250 giri/min per una notte.
    5. Isolare i plasmidi utilizzando il protocollo del kit di isolamento dei plasmidi per il sequenziamento.
  2. Espressione, lisi e purificazione dell'inclusione delle proteine
    1. Aggiungere 5 mL di coltura a 1 L LB (brodo di lisogenia) con 50 μg/mL di kanamicina e incubare a 37° C agitando. Ad un A600 di 0,6-0,7, indurre l'espressione aggiungendo IPTG (isopropil-β-D-tiogalattopiranoside) a una concentrazione finale di 5 mM.
    2. Dopo 16 ore, le celle di pellet sono state centrifugate a 12.000 x g per 10 minuti. Decantare il surnatante e congelare i pellet di celle in un congelatore a -80°C.
    3. Lisi le cellule e purificazione dei corpi inclusi utilizzando il reagente per la purificazione dei corpi inclusi secondo il protocollo del produttore, incluso un trattamento di 20 minuti con 1 μL (25-29 unità) di benzonasi e 3-5 KU di lisozima per mL di reagente per la purificazione dei corpi inclusi dopo la risospensione iniziale del pellet cellulare. I corpi inclusi purificati appariranno come pellet marrone scuro.
  3. FPLC (cromatografia liquida di proteine veloci)
    1. Preparare 2 L di urea 8 M: soluzione di acido acetico al 5% v/v (tampone A) e 1 L di guanidinio cloridrato 8 M: soluzione di acido acetico al 5% v/v (tampone B). Filtra entrambi utilizzando un filtro per palloni sottovuoto da 0,22 μm.
      ATTENZIONE: Evitare l'inalazione, il contatto con gli occhi e la pelle con il guanidinio cloridrato e indossare DPI (dispositivi di protezione individuale) adeguati durante la manipolazione. Smaltire in un contenitore per rifiuti dedicato.
    2. Risospendere i pellet corporei di inclusione in una soluzione di urea 8 M: acido acetico al 5% agitando energicamente con un'ancoretta magnetica. La soluzione apparirà torbida. Pre-raffreddare la centrifuga a 4 °C, centrifugare a 18.000 x g a 4 °C per 70 minuti e raccogliere il surnatante per FPLC. Il surnatante apparirà marrone e trasparente.
    3. Utilizzando una velocità di flusso di 2 mL/min per tutte le fasi successive, equilibrare 10 mL della colonna di scambio cationico con 5 volumi di colonna (CV) di 95% di tampone A, 5% di tampone B e caricare il campione. Lavare il campione non legato con 5 CV, quindi eseguire il gradiente a gradini: 5 CV di tampone A al 94%/Tampone B al 6%, quindi 5 CV di tampone B al 10%. La reflectina A1 eluisce al 10% di tampone B.
    4. Valutare la purezza delle frazioni corrispondenti al passaggio iniziale al 10% di Buffer B mediante SDS-PAGE e raggruppare se simile. Pre-raffreddare una centrifuga a 4 °C e concentrare le frazioni fino a un volume finale di 4-5 mL utilizzando un concentratore a rotazione MWCO da 15 mL 10 kDa.
  4. HPLC (cromatografia liquida ad alta prestazione)
    1. Preparare 2 L di acqua da 18 mΩ con acido trifluoroacetico (TFA) allo 0,1% e 2 L di acetonitrile con TFA allo 0,1%. Filtra entrambi utilizzando un filtro per palloni sottovuoto da 0,22 μm.
      ATTENZIONE: Il TFA è un acido fumante forte. Maneggiare in una cappa aspirante, indossando DPI appropriati e trasferire utilizzando solo il vetro. Evitare l'inalazione, il contatto con gli occhi e la pelle con l'acetonitrile e indossare DPI adeguati durante la manipolazione. Smaltire in un contenitore per rifiuti dedicato.
    2. Utilizzando una portata di 1 mL/min per tutti i passaggi successivi, equilibrare la colonna C4 con 5 CV di acqua all'85% a 18 mΩ, 0,1% di TFA e al 15% di acetonitrile, 0,1% di TFA.
    3. Iniziare a fluire e iniettare il campione. Flusso di 2 CV, quindi inizio del gradiente costante all'80% di acetonitrile, 0,1% di TFA su 5 CV. La reflectina A1 eluisce tipicamente al 73% di acetonitrile.
    4. Frazioni di congelamento del guscio che contengono la proteina reflectina in provette da 5 mL utilizzando un bagno di etanolo e ghiaccio secco. Liofilizzare e conservare a - 80 °C. Le proteine appariranno come sottili fogli bianchi.
  5. Preparazione di brodo proteico non etichettato
    1. Preparare 4 L di tampone acido acetico pH 4, 25 mM (21,05 mM di acido acetico, 3,95 mM di acetato di sodio triidrato) utilizzando acido acetico glaciale e acetato di sodio triidrato. Se necessario, regolare il pH con 4 M HCl o 4 M NaOH. Filtrare utilizzando un filtro sottovuoto da 0,22 μm.
      ATTENZIONE: Maneggiare acidi/basi forti indossando DPI adeguati. Non aggiungere mai acqua ad acidi o basi forti concentrati.
    2. Scongelare la provetta contenente la proteina reflectina liofilizzata e, con la provetta in un bagno di ghiaccio, risolubilizzare con un tampone di acido acetico a pH 4, 25 mM. Una soluzione proteica completamente risolubilizzata apparirà incolore senza torbidità visibile o precipitato.
      1. Utilizzando una cassetta per dialisi con interruzione del peso molecolare di 10 kDa, dializzare la proteina reflectina risolubilizzata in un volume di campione di 1000x pH 4, tampone di acido acetico 25 mM pre-raffreddato a 4 °C utilizzando due cambi di 12 ore a 4 °C.
    3. Diluire il campione con un tampone di acido acetico a pH 4, 25 mM per ottenere una concentrazione proteica finale di 100 μM e un volume finale di almeno 150 μL. Con uno spettrometro UV-VIS, misurare l'assorbanza a 280 nm e utilizzare il coefficiente di assorbimento molare29 della riflettina A1 (123.685 M-1 cm-1) per determinare la concentrazione proteica.
    4. Trasferire la proteina reflectina in una provetta da microcentrifuga con tappo a scatto da 0,5 mL e conservare a 4 °C fino a 7 giorni. Immediatamente prima degli esperimenti, centrifugare il brodo proteico di reflectina a 4 °C in una microcentrifuga pre-raffreddata a 18.000 x g per 15 minuti. Preparare la reflectina A1 C232S in modo simile utilizzando il coefficiente di assorbimento molare di 123.540 M-1 cm-1.
  6. Etichettatura delle proteine
    1. Preparare separatamente 10 mg/mL di FMTS (fluoresceina-metanoetiosfonato) e SRMT (sulforhodamina metanoetiosolfonato) aggiungendo 1 mL di dimetil-solfossido secco (DMSO) a una fiala contenente 10 mg di sonda fluorescente e pipetta.
      ATTENZIONE: Evitare l'inalazione, il contatto con gli occhi e la pelle con i reagenti metanetisolfonato.
    2. Aggiungere 7,7 μL di 10 mg/mL di FMTS o 10,4 μL di 10 mg/mL di SRMT a un tampone di acido acetico a pH 4, 25 mM fino a un volume finale di 150 μL e una concentrazione finale di 500 μM FMTS o SRMT. La soluzione apparirà torbida. Aliquotare e congelare il resto delle scorte di sonde fluorescenti a -80 °C.
    3. Combinare con 150 μL di proteina rifletterina da 100 μM e pipettare accuratamente la miscela. La concentrazione finale della proteina è di 50 μM e la concentrazione finale della sonda fluorescente è di 500 μM. La torbidità della soluzione diminuirà.
    4. Avvolgere in un foglio di alluminio e incubare in posizione verticale agitando delicatamente gli orbitali a temperatura ambiente per 4 ore, quindi per una notte a 4 °C. La torbidità della soluzione non deve cambiare.
    5. Se è presente del precipitato, risospendere con una vigorosa miscelazione con pipetta. La soluzione sarà torbida. Concentrare la reflectina utilizzando un filtro centrifugo MWCO da 10.000 kDa fino a un volume target di 100 μL e una concentrazione di 150 μM.
    6. Utilizzare lo stesso metodo HPLC e liofilizzazione della purificazione delle proteine per rimuovere la sonda fluorescente non legata e conservare le proteine a - 80 °C avvolte in un foglio. Risolubilizzare la proteina marcata utilizzando lo stesso metodo per la proteina non marcata. Determinare il grado di etichettatura.
      NOTA: La proteina reflectinica risolubilizzata marcata in fluorescenza apparirà giallo-verde (C199-F) o rosso scuro (C199-R) senza torbidità o precipitazione.
  7. Preparazione di brodo proteico co-marcato
    1. Aggiungere 27 μL di proteina A1 da 100 μM a una microcentrifuga con tappo a scatto da 0,5 mL.
    2. Aggiungere 1,5 μL di reflectina A1-C232S marcata con fluoresceina (denominata C199-F per indicare la posizione dell'amminoacido della fluoresceina) nella stessa provetta.
    3. Aggiungere 1,5 μl di reflectina A1-C232S marcata con sulforhodamina (indicata come C199-R per indicare la posizione dell'amminoacido della fluoresceina) nella stessa provetta. Le concentrazioni finali sono 90 μM A1, 5 μM C199-F e 5 μM C199-R.
    4. Avvolgere in un foglio di alluminio e conservare a 4 °C fino a 7 giorni.

2. Serie temporali FRET

  1. Preparazione dei tamponi e della filtrazione
    1. Preparare 500 mL di tampone 25 mM di acido 3-(N-morfolino)propansulfonico (MOPS). Regolare il pH della soluzione a 7 aggiungendo lentamente 4 M di idrossido di sodio. Filtrare 10 mL utilizzando una siringa da 10 mL e un filtro per siringa da 0,22 μm.
  2. Centrifugazione delle proteine
    1. Pre-raffreddare la microcentrifuga da tavolo a 4 °C. La riflettina A1 non marcata e co-marcata è in grado di produrre una quantità di 18.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
  3. Preparazione di assemblaggi A1 etichettati
    1. Per preparare tre repliche, pipettare 9,6 μL di tampone MOPS (pH 7, 25 mM) in tre provette per microcentrifuga con tappo a scatto da 0,5 mL.
    2. Aggiungere 0,4 μl di stock proteico marcato a ciascuna provetta che contiene già 9,6 μl di tampone MOPS fino a una concentrazione proteica finale di 4 μM. Pipettare lentamente la miscela due volte aspirando e dispensando l'intero volume del campione.
    3. Avvolgere immediatamente nella carta stagnola e riporre nell'incubatrice a 25 °C. Questa e tutte le successive soluzioni di assemblaggi mancano di torbidità o precipitazione apparente prima o dopo l'incubazione.
  4. Preparazione di assemblaggi A1 senza etichetta
    1. Per preparare tre repliche, pipettare 38,4 μL di tampone MOPS in tre provette per microcentrifuga da 0,5 mL con tappo a scatto.
    2. Aggiungere 1,6 μl di proteina di reflectina A1 a ciascuna provetta che contiene già 38,4 μl di tampone MOPS fino a una concentrazione proteica finale di 4 μM. Pipettare lentamente la miscela due volte aspirando e dispensando l'intero volume del campione.
    3. Avvolgere immediatamente nella carta stagnola e riporre nell'incubatrice a 25 °C.
  5. Temporizzazione e miscelazione di assemblaggi A1 co-marcati e non etichettati
    1. Ordina la preparazione degli assemblaggi come segue: prepara simultaneamente e separatamente assemblaggi di un riflettin sperimentale co-marcato e di uno sperimentale di reflectina non etichettato. Ripetere i passaggi 2.3 e 2.4.
    2. Miscelare aggiungendo 40 μl di assemblaggio sperimentale A1 non marcato a 10 μl del rispettivo sperimentale co-marcato e pipettare delicatamente la miscela aspirando e dispensando l'intero volume due volte. Le misurazioni verranno eseguite 24 ore dopo questo passaggio.
    3. Il tempo che intercorre tra l'assemblaggio della reflectina A1 mediante diluizione in tampone MOPS (pH 7, 25 mM) e la miscelazione di assemblaggi marcati e non marcati è l'età di assemblaggio. Le età degli assemblaggi utilizzate per questi dati erano 0 min, 1 min, 10 min, 30 min, 60 min, 120 min, 180 min, 540 min, 1080 min e 1620 min.
  6. Controlli
    1. Controllo positivo
      1. A partire dalle scorte proteiche A1 e marcate, preparare 20 μL di stock proteico ovvero 80 μM di A1 e 20 μM di proteine co-marcate.
      2. Aggiungere 38,4 μL di tampone MOPS a provette per microcentrifuga con tappo a scatto da 0,5 mL, quindi aggiungere 1,6 μL di proteine marcate con A1/20 μM da 80 μM e pipettare due volte aspirando ed erogando lentamente l'intero volume. Coprire immediatamente con un foglio di alluminio e riporre nell'incubatrice a 25 °C. Ripetere per un totale di 9 campioni.
    2. Controllo negativo
      1. Aggiungere 0,4 μl di stock marcato a una provetta per microcentrifuga con tappo a scatto da 0,5 mL che contiene già 9,6 μl di tampone MOPS. Pipettare lentamente la miscela due volte aspirando ed erogando l'intero volume del campione.
      2. Aggiungere 40 μl di tampone MOPS e pipettare la miscela due volte aspirando e dispensando l'intero volume del campione. Coprire immediatamente con un foglio di alluminio e riporre nell'incubatrice a 25 °C. Ripetere per un totale di 9 campioni.
  7. Cuvetta e tampone grezzo
    1. Imposta il fluorimetro in modo che ecciti a 488 nm e registri spettri continui da 520 a 700 nm.
    2. Riempire una cuvetta di sottofluorimetro al quarzo pulita con 50 μL di tampone MOPS (pH 7, 25 mM) e misurare.
    3. Rimuovere il tampone.
  8. Procedura sperimentale
    NOTA: Tutti gli esperimenti devono essere registrati 24 ore dopo aver miscelato gli assemblaggi di reflectina A1 co-marcati e non etichettati. Pipettare delicatamente 50 μl della soluzione sperimentale nella cuvetta e misurare.
    1. Rimuovere il campione, risciacquare con 500 μL di tampone di acido acetico, quindi con 500 μL di 0,22 μm di acqua filtrata a 18 mΩ. Eseguire il buffer blank.
  9. Controlli
    1. Misurare a 1440 min, 1960 min e 3060 min dopo aver preparato i controlli (corrispondenti a un'età di assemblaggio di 0 min, 520 min e 1620 min). Queste misurazioni concludono la parte sperimentale del protocollo.

3. Analisi dei dati

  1. Sottrarre gli spettri del buffer blank dagli spettri sperimentali.
  2. Determinare il rapporto tra Em588/Em520.
  3. Per ogni replica, determinare la media e la deviazione standard di ciascun gruppo di tre repliche. Traccia Em588/Em520 in funzione dell'età di assemblaggio.

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Risultati

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Dopo aver diluito gli assemblaggi di reflectina A1 contenenti sia la proteina marcata con fluoroforo donatore che la proteina marcata con fluoroforo accettore con assemblaggi di reflectina A1 non marcata, è stata osservata una diminuzione iniziale dell'emissione di FRET a 588 nm rispetto agli assemblaggi non diluiti (Figura 2A). Il FRET per gli assemblaggi con età minima 0 era simile al controllo positivo e il FRET per gli assemblaggi con età minima 1620 (il tempo tra la formazione dell'asse...

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Discussione

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Un punto comune di perdita di proteine durante la purificazione è la risospensione incompleta dei pellet dei corpi di inclusione per tutte le fasi del protocollo di purificazione dei corpi di inclusione e la risospensione finale dei corpi di inclusione purificati in acido acetico 8 M urea 5% v/v. La risolubilizzazione dei corpi inclusi può richiedere fino a 24 ore di agitazione vigorosa con una piccola ancoretta magnetica in una provetta conica da 40 mL. Per evitare una significativa per...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La ricerca è stata sostenuta dall'Institute for Collaborative Biotechnologies attraverso le sovvenzioni W911NF-19-2-0026 e W911NF-23-1-0330 dell'Ufficio di ricerca dell'esercito degli Stati Uniti. Il contenuto delle informazioni non riflette necessariamente la posizione o la politica del governo e non si deve dedurre alcuna approvazione ufficiale.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10 μ Micropipetta con capacità L
2 μ Micropipetta con capacità L
2-[(5-fluoresceinil)amminocarbonil]etilmetantiosolfonatoSanta Cruz BiotecnologieSC-216155CAS  351330-42-2
20 μ Micropipetta con capacità L
200 μ Micropipetta con capacità L
acido 3-(N-Morpholino)propansolfonico, acido 4-morfolinapropansolfonicoSigma-AldrichCodice: M1254CAS 1132-61-2
Acido aceticoSigma-AldrichCodice: A6283CAS 64-19-7
AcetonitrileSigma-Aldrich34851-1LCAS 75-05-8
Agar in polvereCarolina Biologica842133CAS 9002-18-0
Alluminio
Filtro ultracentrifugo Amicón, 10 kDa MWCOMillipore SigmaUFC501008Capacità 0,5 ml
Filtro ultracentrifugo Amicón, 10 kDa MWCOMillipore SigmaUFC90100815 ml di capacità
bilancia analitica
BenzonaseMillipore-Sigma70664-3CAS 9025-65-4
Reagente per l'estrazione delle proteine BugBusterMillipore Sigma70584-3
Spettrometro a fluorescenza Cary EclipseCary-Eclissi
Cary Eclipse Software
Provette da centrifuga Corning da 50 mlMillipore-SigmaCLS430829
Siringhe monouso, Luer-Lok 10 mLCole-ParmerUX-12915-02
DMSOSigma-AldrichD8418CAS 67-68-5
Ghiaccio secco
Sistema FPLC a doppia pompa
Sistema HPLC a doppia pompa
EtanoloMillipore SigmaEX0280-3CAS 64-17-5
Rotore centrifugo da pavimento capacità 500 ml
Centrifuga da pavimento 
Congelatore, -80 gradi C
Cappa aspirante
cloridrato di guanidinaTermo ScientificoAAA135430B50-01-1
Colonna per cromatografia a scambio cationico HiTrap SP HPCitiva17115101
Acido cloridricoSigma-Aldrich258148-25MLCAS 7647-01-0
Incubatrice
Isopropil β-D-1-tiogalattopiranosideSigma-AldrichI6758-1G
Kanamicina solfatoSigma-AldrichK1637CAS 25389-94-0
Liofilizzante
LisozimaTermo Scientifico90082
Ancoretta magnetica
Piastra di agitazione magnetica
Elettrodo micro pH S7Metler Toledo51343160
Microcentrifuga con controllo della temperatura
Filtro per siringa Millex PVDFMilliporeSLGVR33RS0,22 μ m, 33mm diam.
Filtro Milli-Q MillipakMillipore SigmaMPGP002A1
Sistema di purificazione dell'acqua ultrapura Milli-QMillipore Sigma
NaClTermo ScientificoAA12314A9CAS 7647-14-5
Flaconi da centrifuga Nalgene, stile 3120Millipore-SigmaB1283-4EAPer la pellettatura dei batteri
Laboratorio orbitale agitatore con incubatore
PC
Piastre di PetriSigma-AldrichP5731-500EA
Plasmide PJ411DNA 2.0
Proteina LoBind Tubi coniciEppendorfEP30108302Capacità 5 ml
Proteina LoBind Provette per microcentrifugaEppendorfEP022431102Capacità 0,5 ml
Pallone di Erlenmeyer con deflettore in Pyrex 1.000 mlMillipore-SigmaCLS44501Per l'incubazione di colture batteriche
Bicchieri Pyrex Griffin 2.000 mLMillipore-SigmaCLS10002LPer tutte le preparazioni di tamponi e soluzioni
Flaconi rotondi in Pyrex 1.000 mlMillipore-SigmaCLS13951LPer la conservazione di tutti i tamponi e la preparazione della soluzione, utilizzare con i filtri per palloni sottovuoto
Qiaprep Spin Miniprep KitQiagen27104
Frigorifero
Rosetta 2 (DE3) Cellule CompetentiNovagen71397-3
Cassette per dialisi Slide-a-lyzer 10K MWCOTermo ScientificoPI66383Capacità 0,5 ml
Acetato di sodio triidratoSigma-AldrichS8625CAS 6131-90-4
Idrossido di sodioSigma-AldrichCodice: 567530-250GMCAS 1310-73-2
Filtro per bottiglie sottovuoto SteritopMillipore SigmaS2GPT05RE0,22 μ m filtro sterile
Sub-microcuvetta, capacità 50 uLCellule di Starna16.40F-Q-10/Z15
sulforrodamina metanotiosolfonatoSanta Cruz BiotecnologieSC-220172CAS  386229-71-6
Acido trifluoroaceticoSigma-AldrichCodice 106232-25GCAS 407-25-0
TriptoneSpettro chimico T1333
UreaTermo ScientificoAAA123600ECAS 57-13-6
Spettrometro UV-VIS
Estratto di lievitoGibco211929

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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