Linfodenectomia mesenterica murina per interruzione selettiva della comunicazione linfatica con intestino specifico per regione

Sommario

Questo protocollo descrive una procedura di sopravvivenza per una linfadenectomia mesenterica murina sicura e ben tollerata a ciascuna delle quattro stazioni lungo la catena dei linfonodi mesenterici. Questa procedura è adattabile per consentire una interruzione selettiva della comunicazione linfatica con il colon distale, il colon prossimale e/o l'intestino tenue.

Abstract

La immunosorveglianza rispetto alla tolleranza all'antigene è un equilibrio delicato all'interno del microambiente intestinale, durante il quale il ruolo critico della priming delle cellule T circolanti nei linfonodi locali è ben noto. Dopo il priming delle cellule T, la letteratura recente ha iniziato a dimostrare un ruolo unico e non ridondante delle cellule T non circolanti che risiedono nel linfonodo drenante di un organo. Questo può essere particolarmente vero nell'intestino, dove il drenaggio linfatico è noto per essere altamente specifico. Tuttavia, per comprendere davvero l'impatto unico di queste cellule locali rispetto alla ridondanza funzionale sistemica, la comunità scientifica necessita di una procedura ben descritta per isolare e perturbare selettivamente questi nodi. Qui è descritta una procedura di sopravvivenza per una linfadenectomia mesenterica murina sicura e ben tollerata in ciascuna delle quattro stazioni lungo la catena dei linfonodi mesenterici. Questa procedura è adattabile per consentire una interruzione selettiva della comunicazione linfatica con il colon distale, il colon prossimale e/o l'intestino tenue. Sono incluse istruzioni dettagliate, ausili visivi, consigli utili per migliorare il successo e soluzioni di risoluzione dei problemi per una sopravvivenza subottimale. I linfonodi resezionati sono immediatamente pronti per ulteriori processi a valle, se desiderato. Questa tecnica è più adatta per studi che richiedono una interruzione selettiva del drenaggio linfatico dal colon distale, prossimale e/o intestino tenue.

Introduzione

Le cellule T sono uno dei principali tipi di cellule effettrici nell'immunità adattativa, con ruoli descritti in diverse categorie di malattia, tra cui infezioni, autoimmunità e^{neoplazia 1,2,3}. Un passaggio fondamentale per la funzionalità delle cellule T è il priming trifase da parte delle cellule presentanti di antigene all'interno degli organi linfici secondari, come i linfonodi^{locali 4}. Nella medicina moderna, un pilastro fondamentale della corretta resezione oncologica su più sistemi d'organo include un certo grado di campionamento locale o resezione dei linfonodi en^bloc 5,6,7,8. Ad esempio, nel cancro al colon, le linee guida consensuali raccomandano di rimuovere e esaminare 12 linfonodi nella resezione a intento curativo a causa di una chiara correlazione con un miglioramento della sopravvivenza a lungo^{termine 6,7}. Tuttavia, i linfonodi locali possono davvero essere resezionati impunemente? Studi recenti su topi hanno dimostrato che il linfonodo che drena il tumore contiene un serbatoio di precursori antitumorali delle cellule T, che possono essere protetti dalla differenziazione terminale e dall'esaurimento delle cellule T che avvengono nel microambiente^{tumorale 9,10,11}. Ciò suggerirebbe che rimuovere una popolazione così critica potrebbe ridurre le capacità di immunosorveglianza in corso.

Il modello di drenaggio della linfa intestinale nei topi è noto per essere molto specializzato lungo la catena dei linfonodi mesenterici; ad esempio, il colon prossimale viene quasi esclusivamente drenato dalla prima stazione linfonodale, l'intestino tenue dalla seconda/terza stazione, e il colon distale prevalentemente dalla quarta stazione¹² (Figura 1, Figura Supplementare 1). Pertanto, la comunicazione diretta tra segmenti intestinali e linfatici può essere interrotta con l'ablazione mirata di questi linfonodi. Per bloccare il traffico tra linfonodi e tessuti, sono comunemente utilizzati agonisti del recettore S1P, come FTY720, e il blocco dell'integrina; tuttavia, questi farmaci inibiscono in modo ampio il traffico e quindi non possono essere utilizzati per indagare il contributo di specifici^{linfonodi 13,14}. Tuttavia, la capacità della più ampia comunità scientifica di studiare l'effetto locale delle interazioni immunitarie all'interno dei linfonodi intestinali è limitata dall'assenza di una resezione chirurgica ben descritta per ciascuna stazione. Tenendo conto di questa lacuna, è stata sviluppata una procedura di sopravvivenza per la linfadenectomia mesenterica murina in ciascuna stazione gangodale, che qui è descritta. L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere l'escissione sicura e affidabile della stazione dei linfonodi mesenterici nei topi con alta sopravvivenza postoperatoria e tolleranza.

Questa procedura è stata testata ed è facilmente eseguita su topi giovani e adulti su più ceppi (ad esempio, Balb/c, C57BL/6J, 129S4), ma è limitata dalla necessità di linfonodi accessibili e facilmente identificabili. Pertanto, potrebbe non essere adatto a combinarsi con modelli o genotipi murini con linfonodi più piccoli del solito o impercettibili (ad esempio, topi carenti di linfotossina alfa)¹⁵. Inoltre, i topi più anziani (>15 settimane) tendono ad avere una maggiore adiposità viscerale, rendendo più difficile identificare e isolare i linfonodi e, sebbene questo non sia una controindicazione, può essere un limite per il successo e la procedura. Oltre a queste limitazioni, la linfadenectomia mesenterica offre una perturbazione altamente controllata e altamente selettiva dei linfonodi. Questa procedura sarebbe più adatta a risolvere questioni sull'effetto locale dei linfonodi e sulle loro cellule immunitarie residenti associate e sulle interazioni sui segmenti dell'intestino (ad esempio, colon prossimale, colon distale, intestino tenue).

Figura 1: Punti di riferimento anatomici delle stazioni nella catena dei linfonodi mesenterici. (A) Rappresentazione non etichettata e (B) etichettata di quattro principali stazioni linfonodi mesenterici in situ. Il drenaggio prossimale del colon avviene prevalentemente tramite la stazione 1, l'intestino tenue è prevalentemente la stazione 2/3 e il colon distale è prevalentemente la stazione 4. (DC = colon distale, ICV = vasi ileocolici, PC = colon prossimale, CEC = ceco, IV/JV = vasi ileali/vasi jejunali, SI = intestino tenue). Barre: 1,5 cm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

Tutte le procedure vengono eseguite in conformità con i protocolli del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali di Yale. Per sviluppare questa procedura, sono stati utilizzati ceppi C57BL/6 di 8-12 settimane, topi di tipo selvatico e controlli fittizi abbinati a età/sesso/genotipo. Sono stati inclusi sia maschi che femmine. Il peso corporeo variava da 18 a 25 g. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione di strumenti, animali e sala operatoria

1. Sterilizza tutti gli strumenti chirurgici. Assicurati che la superficie operativa e il cono nasale anestetico siano puliti con il 70% di etanolo.
2. Installa la macchina per vaporizzatore anestetico inalato, con un cono nasale e una succhiazione per la raccolta eccessiva di anestetici. Prepara una superficie operativa con un tappeto circolante ad acqua calda per mantenere la temperatura corporea e le forniture dell'animale in un luogo comodo e sterile.
   NOTA: Questa procedura non richiede un microscopio chirurgico; Tuttavia, considera di includere questo strumento per migliorare la visualizzazione.
3. Indurre l'anestesia somministrando isoflurano inalato al 2%-3% con un flusso di ossigeno di 2 L/min tramite cono nasale da una macchina vaporizzatore anestetica inalata (seguendo protocolli istituzionalmente approvati).
   1. Assicurati un piano di anestesia adeguato confermando una frequenza respiratoria di circa 30-40 respiri al minuto e la mancanza di risposta al pizzicamento del posteriore piede. Controllare periodicamente il piano di anestesia appropriato e regolare di conseguenza la portata di isoflurano.
      NOTA: In alternativa, è appropriato anche un anestetico iniettabile.
4. Segui le linee guida dell'istituto per l'analgesia appropriata e l'anestesia locale. Ad esempio, somministrare un analgesico a lunga durata come 3,25 mg/kg di buprenorfina XR sottocutaneamente e somministrare fino a 0,04 mL/5g di peso corporeo di soluzione di lidocaina da 1 mg/mL sottocutaneamente all'incisione prevista.
5. Preparare l'animale alla procedura posizionandosi supino, applicando lubrificante oculare, staccando o tagliando il pelo addominale e sterilizzando l'addome con soluzione di povidone/iodio, seguita dal 70% di etanolo (Figura 2A).
6. Usa guanti sterili e applica tende sterili sull'animale con una finestra sul campo operatorio. Mantieni la sterilità durante tutta la procedura.

Figura2: Immagini rappresentative dei principali passaggi procedurali nella linfadenectomia mesenterica. (A) Finestra addominale spolpita e sterilizzata. (B) Incisione di 0,5 cm attraverso la pelle e la linea alba. (C) Esposizione della catena linfonodica mesenterica orientando l'ileo destro, il colon prossimale sinistro e il ceco inferiore. Il primo linfonodo mesenterico si trova lungo l'arteria ileocolica (freccia bianca). (D) Linfonodo mesenterico estratto (freccia sbiadita). Squame: 0,5 cm. (E) Linfonodo mesenterico ex vivo (freccia bianca; 2,5 mm x 3 mm). Zecche = 1 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Preparazione della linfadenectomia mesenterica

1. Fai un'incisione mediana di 0,5-1 cm attraverso la pelle. Disseziona la pelle in modo diretto lontano dalla parete addominale e identifica la linea alba. Effettuare un'incisione di 0,5-1 cm attraverso la linea alba per accedere alla cavità peritoneale (Figura 4B).
   NOTA: Per migliorare l'accesso ai linfonodi della stazione 2/3/4, considera di estendere l'incisione cefalade, ma non per superare il processo cartilagineo dello xifoide.
2. Inietta 1 mL di soluzione salina sterile a temperatura corporea nella cavità peritoneale tramite un ago a punta smussata e inumidisce le tende sterili in preparazione alla posizione intestinale. Utilizzare tamponi sterili e umiditi con punta di cotone per identificare e eviscerare il ceco attraverso l'incisione.
   1. Evita di usare strumenti appuntiti per gestire l'intestino, poiché ciò può causare infortuni. Periodicamente inumidifica di nuovo tende e intestini per evitare danni dovuti all'asciugatura.
      NOTA: Il ceco murino generalmente si trova nel quadrante inferiore sinistro dell'addome, ma può essere ospitato in qualsiasi quadrante.
3. Chiarisci la o le stazioni dei linfonodi mesenterici target per la resezione e segui le istruzioni specifiche di seguito (ad esempio, 3.1-3.4). Vedi la Figura 1A,B per i punti di riferimento anatomici e l'identificazione.

3. Dissezione ed escissione delle stazioni dei linfonodi mesenterici

1. Prima stazione linfonodare (drenaggio prossimale del colon; Figura supplementare 1A,B').
   1. Orientare l'intestino esternalizzato su tende umidite con ceco inferiore, colon prossimale superiore e ileo terminale verso destra del chirurgo (lato sinistro dell'animale; Figura 1A, Figura 2C).
   2. Identifica la catena dei linfonodi mesenterici, che scorre longitudinalmente lungo il colon. Utilizzando pinze inclinate a punta fine, seziona in modo diretto la prima stazione linfonofodica lontano dai vasi ileocolici posizionando forze chiuse nello spazio tra queste strutture e lasciando che le pinze si apriscano delicatamente.
      1. Rimuovere le pinze e ripetere questa manovra 2-3 volte o finché non è stato creato un piano sufficiente per un'escissione sicura. Evitare danni ai principali vasi sanguigni colonici (Figura 3A,B).
         NOTA: Se si riscontra sanguinamento significativo, interrompere la procedura e sopportare l'animale in modo umano (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati).
   3. OPZIONALE: Per ridurre il rischio teorico di collaterali ai linfonodi vicini, eseguire una legatura opzionale con suture singole interrotte lungo la catena linfonodale (uno di 1 mm distale e uno di 1 mm prossimale alla prima stazione linfonodale) utilizzando sutura nera in nylon monofilamento 9-0 e pinze a punta fine per azionare l'ago (Figura 3C,D).
   4. Ritrai delicatamente la cauda della stazione linfatica legata e, usando forbici a punta fine, elimini la stazione linfonodale bersaglio dal cefalade alla cauda (Figura 3E).
      NOTA: Spesso i topi hanno un piccolo ma visibile vaso alimentare che si stacca dall'arteria ileocolica verso la parte posteriore del linfonodo. Il sanguinamento da questo vaso può essere controllato con una pressione delicata con un tampone con punta di cotone fino al raggiungimento dell'emostasi.

Figura3: Immagini e commenti annotati dalla linfadenectomia mesenterica (prima stazione). (A) La corretta orientazione dell'intestino espone la prima stazione linfonodale mesenterico (freccia bianca). (B) Si crea un piano tra l'arteria ileocolica (freccia blu) e il linfonodo. (C) La legatura con sutura dei vasi alimentari che entrano nell'apice del linfonodo (freccia blu) viene eseguita escludendo i vasi ileocolici uscendo dallo spazio tra queste strutture (freccia bianca). (D) Si esegue una legatura con sutura alla base del linfonofio, notando nuovamente ed evitando i rami distali dell'arteria ileocolica. (E) Il linfonodo viene esposto lungo il piano tissutale precedentemente creato, rimanendo in alto verso il linfonofio e lasciando le legature di sutura (frecce nere). (F) È confermata l'emostasi, si osservano rami distali dell'arteria ileocolica per garantire un corretto flusso sanguigno e lo spazio vuoto (freccia sbiadita) dove viveva precedentemente il linfonodo è considerato privo di residui. Barre: 0,5 cm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Seconda stazione linfonodare (drenaggio intestino tenue distale medio)
   1. Eviscera delicatamente anche l'intestino tenue. Orientare l'intestino esteriorizzato su tende umide con il ceco inferiore, il colon prossimale superiormente e l'intestino tenue verso destra del chirurgo (lato sinistro dell'animale; Figura 1A).
   2. Identifica la catena dei linfonodi mesenterici, che scorre longitudinalmente lungo il colon. La seconda stazione inizia alla confluenza dei vasi ileali/jejunali (Figura 1B).
      1. Utilizzando pinze angolate a punta fine, seziona in modo semplicemente il secondo linfonodo lontano dai vasi colonici posizionando forze chiuse nello spazio tra queste strutture e permettendo che le pinze si apriscano delicatamente.
      2. Rimuovere le pinze e ripetere questa manovra 2-3 volte o finché non è stato creato un piano sufficiente per un'escissione sicura. Evitare danni ai principali vasi sanguigni colonici. Inoltre, fai particolare attenzione ai vasi ileali e jejunali, che sarebbero dannosi in caso di lesione.
         NOTA: Se si riscontra un sanguinamento significativo, interrompere la procedura e sopprimere l'animale in modo umano.
   3. OPZIONALE: Per ridurre il rischio teorico di collaterali ai linfonodi vicini, eseguire una legatura opzionale con suture singole interrotte lungo la catena linfonfonica (una da 1 mm distale e una da 1 mm prossimale alla seconda stazione linfonodale) utilizzando suture in nylon monofilamento nero 9-0 e pinze a punta fine per infilare l'ago (Figura supplementare 2A).
   4. Ritrai delicatamente la stazione linfatica legata caudad e, usando forbici a punta fine, elimina la stazione linfonodale bersaglio da cefalade a caudad (Figura supplementare 2B).
      NOTA: Spesso i topi hanno un piccolo ma visibile vaso alimentare che si stacca dall'arteria ileocolica verso la parte posteriore del linfonodo. Il sanguinamento da questo vaso può essere controllato con una pressione delicata con un tampone con punta di cotone fino al raggiungimento dell'emostasi.
3. Secondo e terzo linfonodo (prox-drenaggio dell'intestino tenue a metà distalità; Figura supplementare 1C,D'
   1. Eviscerare delicatamente l'intero intestino tenue fino al punto di fissazione posteriore (legamento di Treitz). Orientare l'intestino esteriorizzato su tende umide con il ceco inferiore, il colon prossimale superiormente e l'intestino tenue verso destra del chirurgo (lato sinistro dell'animale; Figura 1A).
   2. Identifica la catena dei linfonodi mesenterici, che scorre longitudinalmente lungo il colon. La seconda stazione inizia alla confluenza dei vasi ileali/jejunali (Figura 1B).
      1. Utilizzando pinze angolate a punta fine, seziona in modo semplicemente il secondo e il terzo linfonodo lontano dai vasi colonici posizionando forze chiuse nello spazio tra queste strutture e lasciando che le pinze si apriscano delicatamente.
      2. Rimuovere le pinze e ripetere questa manovra 2-3 volte o finché non è stato creato un piano sufficiente per un'escissione sicura. Evitare danni ai principali vasi sanguigni colonici. Inoltre, fai particolare attenzione ai vasi ileali e jejunali, che sarebbero dannosi in caso di lesione.
         NOTA: Se si riscontra un sanguinamento significativo, interrompere la procedura e sopprimere l'animale in modo umano.
   3. OPZIONALE: Per ridurre il rischio teorico di collaterali ai linfonodi vicini, eseguire una legatura opzionale con suture singole interrotte lungo la catena linfatica (di solito una distale di 1 mm, due laterali da 1 mm e una prossimale da 1 mm alle seconde/terze stazioni linfonodali) utilizzando una sutura nera monofilamento in nylon 9-0 e pinze a punta fine per infilare l'ago (Figura supplementare 3B, C).
      1. Si noti i trattori linfatici afferenti, che si trovano appena superficiali rispetto ai fasci vascolari ileale/jejunale (Figura supplementare 3B). Fai attenzione a garantire legature di suture che vadano da parte profonda fino a linfomatiche e superficiali a strutture vascolari maggiori, poiché danni ai fasci vascolari ileali/jejunali sarebbero dannosi.
   4. Ritrai delicatamente le stazioni linfali legate della cefalade e, usando forbici a punta fine o extra-fine, elimina le stazioni dei linfonodi target dalla cauda alla cefalade.
      NOTA: Prima di procedere, assicurati che l'intestino tenue rimanga rosa e ben perfuso. La legatura incidentale dei vasi ileali/jegiunali porterà alla formazione ischemica dell'intestino tenue.
4. Quarto linfonodo (drenaggio distale del colon; Figura supplementare 1E,F')
   1. Eviscerare delicatamente l'intero intestino tenue fino al punto di fissazione posteriore (legamento di Treitz). Orientare l'intestino esteriorizzato su tende umide con il ceco inferiore, il colon prossimale superiormente e l'intestino tenue verso destra del chirurgo (lato sinistro dell'animale; Figura 1A).
   2. Identifica la catena dei linfonodi mesenterici, che scorre longitudinalmente lungo il colon. La quarta stazione si trova appena medialmente al colon distale e lateralmente alla terza stazione (Figura 1B, Figura 4A).
      1. Utilizzando pinze inclinate a punta fine o forbici a punta extra-fine, seziona in modo brusco la quarta stazione linfonodale, lontano dai vasi colonici e dall'adiposo circostante, posizionando forci/forbici chiuse nello spazio tra queste strutture e permettendo che le pinze/forbici si apriscano delicatamente.
      2. Rimuovere pinze/forbici e ripetere questa manovra 2-3 volte o finché non è stato creato un piano sufficiente per un'escissione sicura. Evitare danni ai principali vasi sanguigni colonici.
         NOTA: Se si riscontra un sanguinamento significativo, interrompere la procedura e sopprimere l'animale in modo umano.
   3. OPZIONALE: Per ridurre il rischio teorico di collaterali ai linfonodi vicini, esegui una legatura opzionale con suture singole interrotte su ciascun linfonodo identificabile (di solito uno a 1 mm dal linfonodo) utilizzando nylon monofilamento nero 9-0 e pinze a punta fine per infilare l'ago (Figura 4B - D).
   4. Ritrai delicatamente le stazioni linfali legate cefalade e, usando forbici a punta extra-fine, elimini la stazione linfonodale bersaglio dal caudad al cefalade (Figura 4D,E).

Figura 4: Immagini annote e commenti dalla linfadenectomia mesenterica (quarta stazione). (A) La corretta orientazione intestinale espone la quarta stazione linfonodalino mesenterico (frecce bianche) medialmente al colon distale e lateralmente alla terza stazione. (B,C) Dopo la dissezione smussata della stazione del linfonodo, viene eseguita una legatura con sutura (freccia nera) su ciascun nodo identificabile, assicurandosi di includere tutti i vasi nutritivi dei linfonodi (frecce blu). (D) Il linfonodo viene esposto lungo il piano tissutale precedentemente creato, rimanendo in alto verso i linfonodi e lasciando legature di sutura (frecce nere). (E) Dopo l'escissione della stazione nodale (frecce bianche), si conferma l'emostasi, sono visibili le legature di sutura (frecce nere) e lo spazio vuoto (frecce sbiadite) dove viveva precedentemente il nodo è considerato privo di nodo residuo. Barre in scala: 0,2 cm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Completamento della linfadenectomia mesenterica

1. Osserva i rami distali dei vasi ileocolic, dei vasi ileali e/o dei vasi jejunali per assicurarti che l'apporto sanguigno sia intatto. L'intestino ben perfuso è brillante e rosa con pulsazioni visibili.
   1. Utilizzando tamponi con punta di cotone, restituire il contenuto addominale nella cavità peritoneale. Fai attenzione a rimuovere eventuali frammenti di cotone, lanugine, drappeggiamento o sutura dall'intestino prima del ritorno, poiché ciò può causare ulteriori infiammazioni chirurgiche.
   2. Assicurati che l'intestino non sia contorto sul mesenterio confermando che l'intestino rimanga brillante/rosa (perfuso) invece che opaco/grigio/viola (ischemico).
2. Inietta 1 mL di soluzione salina sterile a temperatura corporea nell'addome poco prima della chiusura per completare la perdita/evaporazione insensibile di liquidi. Chiudi l'addome in due strati (parete addominale e pelle) con una sutura monofilamenta in polipropilene 6-0 in modo fluido.
3. Applica una colla chirurgica sterile sulla ferita.
   NOTA: In alternativa, si possono usare suture interrotte o clip per ferite per la chiusura della pelle.

5. Cure post-operatorie

1. Spostate l'animale in una gabbia pulita, metà su e metà su un tappetino di circolazione ad acqua calda con accesso a cibo e acqua ad free.
2. Lascia che l'animale si riprenda dall'anestesia e monitora attentamente i segni di disagio. Se gli animali non si riprendono prontamente dall'anestesia con comportamenti appropriati (ad esempio, aumento della frequenza respiratoria, auto-raddrizzazione, camminata, tosatura), sopportare l'animale in modo umano.
3. Quando tutti gli animali si sono ripresi dall'anestesia, restituire le gabbie alla struttura di cura animale con accesso ad libium ad libium ad libium ad ad libri,
4. Valuta i topi post-operatoriamente ogni 12 ore per 3 giorni per segni di dolore o disagio (ad esempio, postura curva, ridotta attività, ridotto coinvolgimento, scarsa toelettatura). Eutanasiare umanamente i topi che mostrano segni di disagio.
5. Se si utilizzano suture permanenti (come il polipropilene monofilamento 6-0), esaminare le incisioni al giorno 10 postoperatorio e rimuovere qualsiasi materiale residuo per la sutura.

6. Gestione dei linfonodi

1. Esegui immediatamente un test di galleggiamento inserendo il tessuto espulso in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL con 500 μL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS). Confermare l'escissione dei linfonodi osservando l'affondamento del tessuto nel PBS rispetto all'addiso resezionato involontariamente, che galleggerà (Figura 5A).
   NOTA: La stazione/le dei linfonodi espulsi è immediatamente pronta per un ulteriore processo a valle.
2. Per le tecniche a cellule vive, posizionare una o più stazioni linfonodaliche espulse in substrati di coltura cellulare (ad esempio DMEM, RPMI) o PBS su ghiaccio. Per l'istologia pianificata, inserire una o più stazioni linfonodaliche espulse in un fissativo (ad esempio, formalina tamponata neutra al 10%, 4% paraformaldeide).

Risultati

Per confermare l'accuratezza di questa procedura, sono state eseguite linfadezectomie mesenteriche su undici fratelli di cucciolata C57BL/6J di 4-6 settimane di età, sesso e genotipo abbinati. I tempi delle procedure variavano da 5 a 15 minuti per topo. Tutti i topi hanno tollerato bene la procedura, con una sopravvivenza perioperatoria del 100%. I campioni essiccati sono stati depositati in PBS su ghiaccio. Tutti i campioni sono subito affondati, confermando un basso contenuto adiposo. ...

Discussione

Qui descritta una procedura di sopravvivenza per una linfadenectomia mesenterica murina sicura e ben tollerata in ciascuna delle quattro stazioni dei linfonodi. Il principale limite di questa procedura è la relazione indiretta tra l'esposizione e la progressione dei linfonodi lungo la catena mesenterica. La prima stazione linfonodale è facilmente e facilmente esposta nella sua interezza. La seconda stazione linfonodare è spesso visibile e l'esposizione alle^{seconde e quart...}

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Circuito anestesiico	Qualsiasi		O anestetico iniettabile
Citometro di flusso BD LSRII (o equivalente)	BD in Biologia		Dotato di software FACS Diva (per la citometria a flusso) e nbsp;
Buprenorfina XR	Qualsiasi		Per l'analgesia
Mezzi per coltura cellulare	Qualsiasi		(per le tecniche a cellule vive; cioè DMEM o RPMI)
DAPI	Biolegend	422801	Concentrazione di lavoro: 15 ug/mL
Etanolo (70% in acqua)	Qualsiasi		Per la pulizia
CD45.2 (104) con FITC coniugato anti-mouse	Biolegend	109806	Concentrazione di lavoro: 5 ug/mL
Pinze: Pinze inclinate e con punta fine	Roboz	RS-5058	Materiale: Dumoxel; Schema #5, angolo di 45 gradi; Dimensione della punta 0,1 x 0,06mm
Pinzep: Pinze a punta fine	Roboz	RS-4960	Materiale: Dumostar; Modello #1; Dimensione della punta: 0,20 x 0,12mm
Pinzep: Pinze a punta fine	Roboz	RS-4966	Materiale: Dumostar, punta Biologie; Schema #3; Dimensione della punta: 0,08 x 0,04mm
Lidocaina	Qualsiasi		Per l'analgesia
Ago a gavage in metallo	Qualsiasi		Ago gavage orale dritto riutilizzabile calibro 20/22, acciaio inox.
Conduttore a ago	Roboz	RS-6410	Portaaghi Castroviejo; Dritto
OPTIONAL:      Luci LED a doppio o doppio collo d'oca	Qualsiasi
OPTIONAL: Evans Blue dye	Sigma	E2129-10G	Per il tracciamento linfático opzionale.
OPTIONAL: Microscopio operativo	Leica	MZ9.5	Microscopio estero a testa funzionante Leica Mz9.5
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Qualsiasi
Soluzione di povidone/iodio	Qualsiasi		Per la preparazione/sterilizzazione della pelle
Forbici: Forbici con punta extra fine	Roboz	RS-5605	McPherson-Vannas; filo da taglio da 3mm; curve (per i nodi stazione 3/4)
Forbici: Forbici a punta fine	Roboz	RS-5650SC	Forbici Castroviejo Surecut (per i nodi stazione 1/2/3)
Forbici: Forbici medie	Roboz	RS-5676	Noyes; filo da taglio da 13mm; retto
Colla chirurgica	Qualsiasi		Adesivo tissulare 3M Vetbond
Sutura: 6-0 monofilamento blu polipropilenex	Qualsiasi
Sutura: sutura in nylon monofilamento nero 9-0	Qualsiasi		(opzionale) Può anche usare il leggermente più grande 8-0 Punto di sutura di dimensione.
Fissativo tissutale	Qualsiasi		(per istologia programmata; cioè 10% formalina neutrale tamponata o 4% paraformaldeide)
Cuscina riscaldante a circolazione di acqua calda	Qualsiasi