Qui presentiamo un metodo per raccogliere un grande volume di sangue dai suini utilizzando l'incannulamento intracardiaco percutaneo collegato a una pompa a vuoto, come procedura terminale.
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Articolo metodologico
Prelievo di sangue di grandi volumi da suini per applicazioni in vitro : uso dell'incannulamento intracardiaco e di una pompa a vuoto come procedura terminale
In questo articolo
Sommario
Abstract
La raccolta di sangue di routine è richiesta in molti studi di ricerca di base e applicata. Sono ben descritti diversi metodi per la raccolta del sangue suino. Questi includono l'uso delle vene auricolari per la raccolta di piccoli volumi di sangue e delle vene giugulari o vena cava cranica per la raccolta di volumi di sangue maggiori. Alcuni esperimenti richiedono grandi volumi di sangue da un singolo animale alla volta per l'analisi o l'uso in colture cellulari primarie, che possono essere ottenuti al meglio attraverso il dissanguamento. Il sangue raccolto per la coltura cellulare primaria deve essere trattato fresco e con cura per mantenere l'integrità cellulare. Descriviamo un metodo di prelievo asettico di sangue dai suini sotto un piano chirurgico di anestesia, utilizzando uno stiletto catetere intravascolare di grande diametro inserito percutaneo nel cuore e una pompa a vuoto, che è efficiente, fornisce una grande resa e riduce al minimo la lisi cellulare. Questa tecnica viene eseguita una sola volta su un animale, su un piano chirurgico di anestesia, come procedura terminale, fornendo un rischio minimo di dolore o angoscia.
Introduzione
I suini sono stati utilizzati nella ricerca in studi che vanno dagli studi cardiovascolari alla guarigione delle ferite e alla tossicologia, nonché alla ricerca agricola, all'immunologia e agli studi sulle malattie1. Il sangue raccolto nella ricerca può essere utilizzato per studiare malattie, farmacologia, genetica, ricerca sul sistema immunitario e scoperta di biomarcatori. La coltura cellulare è una delle procedure più basilari eseguite nella ricerca e consente ai ricercatori di studiare il comportamento e la funzione cellulare, nonché i modelli di malattia e lo sviluppo di vaccini2. La coltivazione di agenti patogeni patogeni, come il virus della peste suina africana, viene spesso effettuata in un terreno di coltura predeterminato in condizioni di laboratorio rigorosamente asettiche. La propagazione della malattia può avvenire attraverso l'invasione, la diffusione o l'attaccamento, che richiedono cellule sane e stabili3. I patogeni studiati possono avere uno specifico tropismo cellulare in cui possono essere propagati, e avere un grande volume di sangue produce una maggiore quantità di cellule da utilizzare.
Per ottenere un'elevata resa di cellule da un singolo animale, per la differenziazione cellulare, un grande volume di sangue deve essere raccolto delicatamente per mantenere l'integrità cellulare prima della separazione cellulare. Nei suini, il volume totale del sangue può essere calcolato a 65 ml/kg 4,5. Nella nostra esperienza con la raccolta di grandi volumi, circa la metà del volume totale del sangue di un animale può essere recuperato. Pertanto, nei suini adulti di grandi dimensioni, che pesano fino a 600 libbre (273 kg), è possibile una resa di 6-8 L. Nei suini, grandi volumi di sangue possono essere raccolti per via percutanea dalla vena cava cranica, dalla vena giugulare esterna, dalla vena safena tramite incannulamento o dal cuore 4,5,6. Tuttavia, la raccolta intracardiaca del sangue con una cannula di grande diametro consente di raccogliere in modo efficiente il maggior volume di sangue con il minimo rischio di lisi cellulare. Essendo una procedura terminale, questa deve essere eseguita sotto un piano chirurgico di anestesia5. Questo articolo descrive un metodo di utilizzo di una pompa a vuoto per raccogliere più litri di sangue dai suini utilizzando un approccio percutaneo al cuore con uno stiletto catetere IV di grande diametro collegato a una pompa a vuoto 7,8.
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Protocollo
Questo studio è stato approvato dal Midwest Veterinary Services Inc. Animal Care and Use Committee. Poiché il metodo principale di eutanasia approvato dall'IACUC durante questa procedura è il dissanguamento, si prevede che alcuni suini raggiungeranno l'arresto cardiaco a causa della perdita di sangue. Quando ciò si verifica, viene eseguito un metodo di eutanasia secondaria, come la toracotomia bilaterale. Dopo aver raccolto il volume di sangue richiesto, se c'è un battito cardiaco palpabile, una siringa con soluzione per eutanasia viene attaccata allo stiletto e somministrata per via intracardiaca come metodo di eutanasia primario, seguito da un metodo fisico secondario. I suini sono mantenuti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali agricoli nella ricerca e nell'insegnamento, la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e l'Animal Welfare Act, a seconda dei casi.
1. Preparazione dei materiali e degli animali (Tabella dei materiali e Figura 1A-C)
- Assemblare il tubo su cannucce in acciaio inossidabile e collegare l'estremità del tubo al tubo a bolle.
- Fissare il tubo alla bottiglia a rullo utilizzando un tappo di gomma con due cannucce di metallo irregolari e una bottiglia di vetro.
NOTA: Il vetro inibisce il collasso del contenitore creato dalla pompa del vuoto, ma può essere utilizzato qualsiasi materiale che non collassi sotto pressione. - Instillare asetticamente 10 mL di eparina sodica (1.000 USP/mL) attraverso il tubo di aspirazione e lo stiletto del catetere per prevenire la coagulazione. Aggiungere asetticamente 50 mL di eparina sodica (1.000 USP/mL) in ciascun flacone a rullo per ottenere una concentrazione finale di 50 UI/mL in ogni litro di sangue e prevenire la coagulazione del sangue durante la raccolta. Assicurarsi che la pompa del vuoto sia impostata su non più di 7 libbre di assorbimento per evitare danni alle celle.
2. Anestesia e posizionamento degli animali
- Pesare l'animale non più di 24 ore prima della procedura per calcolare la dose richiesta dei farmaci di combinazione per anestesia.
- Iniettare Telazol (3,0-5,0 mg/kg), ketamina (8-12 mg/kg) e xilazina (4,0-6,0 mg/kg) per via intramuscolare nel collo o in altri grandi muscoli della pancia (ad es. muscoli epossidici), utilizzando un set di estensione da 30 pollici e un ago da 18 G x 1,5" per indurre l'anestesia profonda.
NOTA: Nei suini di grossa taglia, il volume massimo raccomandato per l'iniezione IM è di 10 mL, quindi potrebbe essere necessario cambiare posizione dopo ogni 10 mL di somministrazione9. Sebbene abbiamo scelto questo cocktail, questa procedura può essere eseguita secondo qualsiasi protocollo di anestesia approvato dall'IACUC che produca un piano chirurgico di anestesia. - Una volta confermato che l'animale si trova in un piano chirurgico di anestesia (~5-8 minuti), senza riflesso palpebrale, tono della mascella allentato e nessuna risposta agli stimoli del dolore, posizionare il maiale su una piattaforma elevatrice, sul pavimento o su un'altra superficie piana, in decubito laterale destro.
- Tagliare i peli sul torace situato sopra il cuore, se necessario, vicino al quarto e quinto spazio intercostale, appena caudale fino alla punta del gomito.
- Se disponibile, utilizzare un'ecografia (Figura 2A) per identificare il ventricolo sinistro. Se non disponibile, il ventricolo sinistro si trova più vicino al quarto o quinto spazio intercostale mediale al punto di impulso massimo8.
- Strofinare asetticamente l'area con spugne di garza da 4 pollici x 4 pollici imbevute di scrub con clorexidina al 2% e spugne di garza da 4 pollici x 4 pollici imbevute di alcol isopropilico al 70%. Preparare la pelle strofinando in modo circolare, partendo dal punto di iniezione e ruotando verso l'esterno, per un minimo di 3x, alternando i due disinfettanti.
3. Prelievo di sangue intracardiaco
- Verificare che l'animale sia rimasto in un piano chirurgico di anestesia controllando il riflesso palpebrale, il tono della mascella e il riflesso del pedale.
NOTA: Controllare la profondità dell'anestesia, nonché la frequenza cardiaca e respiratoria, durante la procedura per assicurarsi che l'animale rimanga su un piano chirurgico di anestesia. - Rimuovere lo stiletto dal catetere endovenoso. Posizionare lo stiletto sopra il ventricolo sinistro e farlo avanzare perpendicolarmente alla pelle per inserire lo stiletto nel ventricolo sinistro (Figura 2B). Quando il sangue inizia a pulsare fuori dallo stiletto, collegarlo al connettore terminale del tubo a bolle d'aria collegato alla bottiglia a rullo, quindi accendere la pompa a vuoto (Figura 1A e Figura 2C).
- Verificare che il sangue scorra in un flusso costante. Quando il sangue viene aspirato nel flacone a rullo, agitare delicatamente il flacone per consentire la miscelazione del sangue con l'anticoagulante per prevenire la formazione di coaguli.
- Una volta raccolto 1 litro di sangue, utilizzare gli emostatici per bloccare il tubo a bolle vicino alla bottiglia a rullo. Scollegare il tappo di gomma e applicarlo alla bottiglia a rullo successiva. Rimuovere l'emostatico e lasciare che il sangue fluisca liberamente facendo roteare delicatamente la bottiglia a rullo.
- Continuare questo processo fino a quando il sangue richiesto non è stato raccolto. Una volta completato, clamp il tubo per evitare fuoriuscite di sangue in eccesso e spegnere la pompa.
- Rimuovere il connettore del tubo dallo stiletto del catetere e collegare la siringa di pentobarbital di sodio allo stiletto. Tirare indietro la siringa per assicurarsi che sia presente un lampo di sangue, quindi iniettare la soluzione per l'eutanasia. Confermare la morte per assenza di battito cardiaco, respirazione, tono muscolare e riflessi. Una volta confermata la morte, rimuovere l'ago dal cuore e metterlo in un contenitore per oggetti taglienti.
- Smaltire i tubi a bolle in un contenitore per rifiuti biologici. Rimuovere il sangue grossolano dai restanti oggetti in acciaio inossidabile (ad es. cannucce in acciaio inossidabile, connettori all'estremità del tubo) utilizzando una spazzola per tubi e quindi sterilizzare in autoclave per un uso futuro.
- Posizionare i tappi di gomma puliti, le cannucce, i connettori delle estremità dei tubi flessibili e gli emostati in una nuova busta per autoclave e sterilizzare prima dell'uso successivo.
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Risultati
Prima del prelievo del sangue, le scrofe sono state sottoposte a screening per Mycoplasma hyopneumoniae, adenovirus suino, parvovirus suino, coronavirus suini (gastroenterite trasmissibile, diarrea epidemica suina), encefalomielite emoagglutinante suina, sindrome riproduttiva e respiratoria suina, influenza di gruppo A, circovirus 1 e 2 e virus Seneca A. Abbiamo ripetuto questa procedura più volte nelle scrofe incrociate femmine dello Yorkshire del peso di 300-600 libbre. La rac...
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Discussione
La procedura qui descrive un gruppo catetere-stiletto-pompa-vuoto per raccogliere un grande volume di sangue dal cuore delle scrofe. A causa del potenziale di dolore e angoscia, questa procedura deve essere eseguita solo in animali che si trovano in un piano chirurgico di anestesia. L'immobilità dovuta all'anestesia consente ai principianti di apprendere questa procedura e di padroneggiarla rapidamente. Più vene possono essere utilizzate per raccogliere il sangue dagli animali. I percors...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Desideriamo ringraziare in particolare il Plum Island Animal Disease Center, l'Animal Health Techs e l'Animal Care per l'eccellente assistenza tecnica. Il finanziamento per il progetto presso l'organizzazione di ricerca a contratto è stato fornito dall'USDA, ARS, Animal Resources Unit presso NBAF.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pompa per diaframma modello laboratorio da laboratorio da 1/8 HP e il quadro; 115 vacan, 60 psi max e nbsp; | Centro di Rifornimento della Base & nbsp; | 80058845 | |
| 10 G x 6 pollici con catetere sopra ago | Covetrus North American Veterinary Supplies | 024616 | |
| Siringa da 50 mL, serratura Luer & nbsp; | Fisher Scientific | 13-689-8 | |
| Aquasonic 100 ultrasound gel blu & nbsp; | Fornitura Veterinaria del Midwest | 001.02109.2 | |
| Tubi a bolle argyl, non conduttivi (¼ ") | Fisher Scientific | NC2282605 (Catalogo fornitori # 8888280412) | |
| Clorexidina Q Scrub 2% | Fornitura Veterinaria del Midwest | 562.30804.3 | |
| Bottiglie a rullo usa e getta Corning. | Fisher Scientific | 06-413 | |
| Fiaschetta Erlenmeyer o simile in vetro a bocca stretta Corning, fiaschetta Erlenmeyer o simile, creazione di aspirazione; | Fisher Scientific | 10-040F | |
| Spazzola per provette in nylon Eisco & nbsp; | Fisher Scientific | S13962 | |
| Tappi in gomma a due fori Fisherbrand | Fisher Scientific | Dipende dalla dimensione e dal nbsp; | |
| Ketamina (10 mg/mL) | Fornitura Veterinaria del Midwest | 275.22100.3 | |
| MLL a 6 mm di estremità tubo (acciaio inox) | Cadence Science | 6547IND | |
| MLL a 8mm fine tubo (acciaio inox) & nbsp; | Cadence Science | 6549IND | |
| Spugna di garza MVet non tessuta, 4 x 4 compensati | Fornitura Veterinaria del Midwest | 000.30156.2 | |
| MVet alcool isopropilico 70% | Fornitura Veterinaria del Midwest | 000.50054.3 | |
| Pinza emostatica MVet Kelly dritta 5,5" | Fornitura Veterinaria del Midwest | 000.36800.2 | |
| Eparina Sodica (1000 U/mL) | Fornitura Veterinaria del Midwest | 191.46701.3 | |
| Pentobarbital di sodio (390 mg/mL) | Fornitura Veterinaria del Midwest | 749.20000.3 | |
| Cannucce in acciaio inossidabile | Lobby Hobby | 1893635 | |
| Telazol (100 mg/mL) | Fornitura Veterinaria del Midwest | 275.40000.3 | |
| Xylazine (100 mg/mL) | Fornitura Veterinaria del Midwest | 310.01150.3 |
Riferimenti
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- Mothes, W., Sherer, N. M., Jin, J., Zhong, P. Virus cell-to-cell transmission. Virol. J. 84 (17), 8360-8368 (2010).
- Stærk, K., Langhorn, L., Palarasah, Y., Andersen, T. E. A method for collecting high numbers of blood samples in standard vacuum tubes from non-heparinized pigs. Lab Anim. 57 (3), 336-340 (2023).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
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Ristampe e permessi
