In questo studio, una tecnica di instillazione endotracheale non invasiva è dimostrata per sviluppare l'ALI nei ratti utilizzando un laringoscopio di base per garantire una precisa somministrazione di LPS ai polmoni. La LPS viene immessa tramite un tubo endotracheale tramite un laringoscopio. L'entità della lesione polmonare viene valutata in più momenti temporali.
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Articolo metodologico
Somministrazione endotracheale non invasiva di lipopolisaccaridi per indurre lesioni polmonari acute nei roditori
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La lesione polmonare acuta (ALI) è una condizione infiammatoria potenzialmente letali caratterizzata da iposemia arteriosa, edema alveolare, integrità della barriera capillare epiteliale-endoteliale compromessa, seguita dall'infiltrazione di cellule infiammatorie nel tessuto polmonare, spesso progrediendo verso la sua forma più grave, la Sindrome da Difficoltà Respiratoria Acuta (ARDS), che spesso culmina in insufficienza respiratoria acuta. I modelli murini ALI, indotti principalmente dal lipopolisaccaride (LPS), sono uno strumento chiave nella ricerca volta a comprendere i meccanismi dell'infiammazione polmonare e le sue terapie. I modelli di lesione polmonare diretta e indiretta dei roditori offrono vantaggi e limitazioni distintive, in particolare in termini di tasso di sopravvivenza, durata della fase di risoluzione dell'infiammazione, rischi di traumi chirurgici e infezioni. Nel presente studio, è stata utilizzata una tecnica di instillazione endotracheale non invasiva per sviluppare un modello diretto di ALI nei ratti. Questa tecnica garantisce una somministrazione mirata di LPS o materiale di prova nei polmoni tramite la via endotracheale con l'ausilio di un laringoscopio di base. La procedura inizia con l'anestetizzazione del ratto e il posizionamento in una postura semi-sdraiata. Successivamente, la soluzione LPS viene somministrata vicino all'apertura tracheale utilizzando una siringa attaccata a un tubo endotracheale di ratto. Al momento della conclusione dell'esperimento, vengono raccolti campioni di polmoni o lavaggio per valutare i parametri infiammatori e l'architettura polmonare. Questa tecnica supera altri modelli in termini di velocità, specificità e affidabilità, fornendo un targeting specifico con danni tissutali minimi, basso rischio di mortalità e infiammazione trascurabile fuori sito. Questo metodo è particolarmente prezioso negli studi preclinici su ALI, SDRA e condizioni correlate come anafilassi o arresto cardiaco. Al confronto, questo metodo si integra maggiormente con tecniche di imaging avanzate come la microscopia intravitale per monitorare la distribuzione del farmaco e la progressione della malattia in tempo reale.
Introduzione
La lesione polmonare acuta (ALI) è una condizione infiammatoria potenzialmente letali caratterizzata da iposemia arteriosa, edema polmonare, compromessa integrità della barriera endoteliale-epiteliale e massiccia infiltrazione delle cellule immunitarie neipolmoni 1. La fisiopatologia dell'AL è complessa e coinvolge l'interazione e la interruzione di molteplici vie sovrapposte e interagenti, come la coagulazione, le lesioni tissutali e sia l'infiammazione polmonare che sistemica. La soppressione rapida di questa risposta infiammatoria è fondamentale per il ripristino dell'omeostasi tissutale. Se non trattato, questo disturbo in rapida progressione spesso degenera in Sindrome da Difficoltà Respiratoria Acuta (ARDS), una condizione più grave definita da ipossia refrattaria. La patogenesi dell'ALI è stata associata a danni polmonari e danni o morte delle cellule epiteliali alveolari e delle cellule endotelialimicrovascolari 1,2,3,4.
L'eziologia responsabile dell'ALI/ARDS coinvolge una vasta gamma di agenti infettivi e non infettivi, derivanti sia da fonti dirette che indirette di lesionipolmonari 5. Le cause dirette includonopolmonite 6, quasiannegamento 7, aspirazione del contenutogastrico 8, inalazione di tossine come gascloro 9, infezionebatterica 10 e infezione virale come SARS-CoV-2 11,12,13,14. Le cause indirette derivano da processi sistemici che esercitano la loro influenza secondaria sui polmoni, tra cui sepsi15, trauma16,pancreatite 17, overdose di farmaci e trasfusionidi sangue 18.
L'obiettivo principale di questo metodo è stabilire un modello riproducibile e non invasivo di ALI nei roditori tramite somministrazione endotracheale di endotossina. La motivazione per lo sviluppo di questa tecnica deriva dai limiti dei metodi di somministrazione convenzionali. La tecnica è stata dimostrata con l'obiettivo di ottenere una somministrazione diretta e precisa agli alveoli polmonari, minimizzando l'esposizione sistemica e rendendola un approccio promettente per future terapie polmonari mirate. L'instillazione intranasale presenta diverse sfide, alcune delle quali possono influenzare significativamente gli esiti degli studi, come un cattivo targeting verso le regioni polmonari profonde e la variabilità respiratoria tra glianimali 19. Altri fattori, come il volume di dose limitato e la potenziale irritazione nasale, sono meno critici ma possono comunque influire sulla coerenza. In confronto, la somministrazione endotracheale garantisce una somministrazione più precisa e diretta alle vie respiratorie inferiori, garantendo una migliore orientazione polmonare e una migliore uniformità del dosaggio con una minima variabilità tra gli animali, rendendo questa via più efficace e affidabile per l'esposizionepolmonare 20. La via dell'inalazione è clinicamente rilevante per la sua natura non invasiva, ma è anche associata a alcune limitazioni nella ricerca preclinica, come la perdita di farmaci nelle vie aeree superiori e una riduzione dell'efficacia nel colpire le regioni polmonari distali. Queste limitazioni diventano più evidenti nei modelli gravi, inclusi modelli con doppio colpo o modelli geneticamente modificati che coinvolgono topi knock-in o knock-out. Al contrario, la somministrazione endotracheale garantisce maggiore coerenza per la somministrazione diretta del farmaco alle vie respiratorie inferiori, minimizzando la perdita e consentendo un targeting efficace anche in modelli preclinici complessi21. Un'altra via di somministrazione rilevante utilizzata nella ricerca preclinica è la somministrazione intratracheale invasiva. Sebbene sia efficace, è associato al rischio di stress chirurgico, infezioni, variazione della lettura e necessità di mantenimento della temperatura22. Al contrario, il metodo endotracheale offre un'alternativa affidabile e non invasiva, rendendolo ideale per studi che prevedono valutazioni ripetute su lunghi periodi di osservazione.
Questo metodo può essere applicato in modelli animali oltre l'ALI, inclusi asma, fibrosi polmonare, BPCO, polmonite e malattie polmonari infettive. È inoltre rilevante in ambiti di ricerca preclinica come anafilassi, arresto cardiaco e aritmie cardiache. In particolare, il metodo endotracheale è già consolidato nella pratica clinica per la somministrazione di alcuni farmaci, a seconda dell'urgenza e dello scenarioclinico 23,24,25.
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Protocollo
Sono state seguite tutte le linee guida istituzionali e CPCSEA per la cura e l'uso degli animali. Gli animali sono stati monitorati continuamente dopo la procedura per garantirne il benessere e per rispettare le linee guida etiche animali del CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine, Jammu, sotto il numero di approvazione del Comitato Etico Istituzionale degli Animali (IAEC): 468/87/8/2025. Questo protocollo delinea l'instillazione endotracheale non invasiva di lipopolisaccaridi (LPS) utilizzando il metodo di somministrazione visiva diretta, come dimostrato in precedenza, con alcuni miglioramenti metodologici introdotti nell'attualestudio 26,27,28. La tecnica è ottimizzata per indurre l'ALI in modo controllato e costante, garantendo risultati sperimentali robusti mantenendo al contempo elevati standard di cura degli animali. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Preparazione di anestesia e LPS
- Misurazione del peso animale e calcolo della dose LPS
- Pesa ogni animale utilizzando un bilancio calibrato per calcolare la dose precisa di LPS. Seleziona ratti Wistar che pesano tra 140 e 160 g per lo studio.
- Preparare la soluzione di LPS diluendo la LPS liofilizzata di Escherichia coli in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) per ottenere la concentrazione desiderata. Si utilizza soluzione LPS appena preparata (5 μg/g di peso corporeo)29,30.
- Induzione dell'anestesia e tempi critici
- Anestetizzare gli animali tramite iniezione intraperitoneale di un cocktail di ketamina-xilazina appena preparato (ketamina: 75 mg/kg e xilazina: 10 mg/kg) utilizzando una siringa da 1 mL. Dopo l'iniezione, lascia circa 2-5 minuti affinché l'anestesia faccia effetto, senza disturbare gli animali.
- Confermare un'anestesia adeguata assicurandosi che non si muovano spontaneamente e un riflesso negativo di pizzicamento al dito dei piedi. La LPS viene somministrata tramite instillazione endotracheale 5-8 minuti dopo l'induzione dell'anestesia. Il giorno della terminazione dell'esperimento, eseguire procedure come tracheotomia e toracotomia 4-7 minuti dopo l'induzione dell'anestesia.
NOTA: La corretta profondità anestetica è fondamentale per un'instillazione endotracheale di successo. L'anestetismo eccessivo può sopprimere il riflesso del vomito, mentre la sottoanestetizzazione può causare disagio o movimenti durante la procedura. Usa LPS appena preparati per mantenere la coerenza tra gli esperimenti. Monitora attentamente gli animali durante e dopo la procedura per garantire il corretto benessere.
2. Instillazione endotracheale di LPS
- Valutazione dell'adeguatezza anestetica: Dopo la somministrazione del cocktail anestetico, si valuta la profondità dell'anestesia applicando uno stimolo di pizzicamento delicato con la zampa. Al momento della conferma dello stato anestetizzato, procedere con il protocollo di instillazione. Posiziona il topo in posizione semi-reclinata, sospesa da incisivi su una solida piattaforma di supporto.
- Visualizzazione tracheale: Apri la bocca dell'animale anestetizzato, afferra delicatamente la lingua con la pinza e inserisci con cura il laringoscopio, allineandolo con precisione per una visualizzazione ottimale dell'apertura tracheale. Assicurati che la luce sia correttamente diretta per illuminare la regione laringea, facilitando un accesso libero.
- Manipolazione della lingua: Impiega pinze curve con estremità smussata per afferrare delicatamente la lingua e ritraerla delicatamente in direzione verso l'alto e lateralmente.
NOTA: Utilizzare ingranditori portatili per migliorare la chiarezza dell'anatomia laringea e garantire un allineamento meticoloso dell'apparato di instillazione per una maggiore precisione. - Somministrazione LPS: Prelevare 100 μL di soluzione LPS nella siringa e fissarla a un tubo endotracheale di ratto da 16 G; somministrare la soluzione LPS vicino all'apertura tracheale. Immediatamente dopo l'instillazione, occluse delicatamente le narici per 2-4 secondi usando pinze a estremità smussata per promuovere l'aspirazione della soluzione LPS nei polmoni attraverso la trachea. Monitorare continuamente la consegna utilizzando un laringoscopio abilitato da fonte luminosa per confermare l'amministrazione accurata e completa.
- Monitoraggio post-procedurale: Riposizionare con attenzione la lingua nella sua orientazione anatomica normale dopo la consegna successiva del LPS. Trasferisci l'animale nella gabbia e monitora attentamente per almeno 1 minuto per eventuali segni di compromessa respiratoria o soffocamento.
- Considerazioni chiave
- Acuità visiva: Garantire un allineamento ottimale del laringoscopio per una consegna accurata del LPS. Usa strumenti di ingrandimento per aumentare precisione ed efficacia.
- Afferra con attenzione la lingua e tienila contro la mascella inferiore o il bordo della bocca per stabilizzarla.
3. Raccolta di campioni
- Eseguire lavaggio broncoalveolare (BAL) come descritto negli studi precedenti, con modificheminori 31,32,33. Dopo la tracheotomia, infondere delicatamente 2 mL di PBS freddo nei polmoni e prelevare il liquido.
- Centrifugare il fluido di lavaggio raccolto a 5000 x g per 5 minuti a 4 °C e utilizzare il soprannatante per la rilevazione dei marcatori infiammatori. Raccogliere i polmoni per l'esame istopatologico o omogeneizzare per l'attività della mieloperossidasi (MPO). Conservare i campioni sul ghiaccio durante il processo di raccolta per preservare l'integrità del campione.
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Risultati
Il modello è stato convalidato midendo marcatori infiammatori, inclusi livelli di IL-1β, attività MPO, contenuto proteico totale e istopatologia a 24 ore e 120 ore dopo l'instillazione LPS. Lo studio ha incluso tre gruppi sperimentali: un gruppo di controllo (non trattato) e due gruppi sottoposti all'instillazione LPS, uno soppresso a 24 ore e l'altro a 120 ore (seguendo protocolli istituzionalmente approvati).
Rispetto al gruppo di controllo,...
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Discussione
Il metodo di instillazione endotracheale offre un approccio non invasivo, riproducibile e mirato per la somministrazione polmonare, evitando di fatto la necessità di interventi chirurgici. Questo metodo riduce significativamente i rischi associati al trauma chirurgico, come i danni ai tessuti, minimizzando al contempo il rischio di infezioni post-operatorie e danni agli organi involontari che possono derivare da procedure invasive. Somministrando agenti direttamente ai polmoni, la via en...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
L'autore corrispondente, SR, riconosce il sostegno finanziario della Ramalingaswami Fellowship (Ref. No. BT/RLF/Re-entry/13/2019), Dipartimento di Biotecnologie, Governo dell'India. Gli autori ringrazionano il dottor Govind Yadav, il dottor Ramajayan Pandian e il personale della casa degli animali del CSIR-IIIM per il loro supporto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Prisma 8 | Graphpad | https://www.graphpad.com/features | |
| Bradford Reagent | Himedia, India | ML106-500 ML | |
| DL-Ditiotreitolo | Himedia, India e nbsp; | RM525-25G | |
| Eosina & nbsp; | Loba Chemie, India | 3660 | |
| Etilene-Diamine Tetra Acetico (EDTA) | Loba Chemie, India | 6381926 | |
| Pinzeps & nbsp; | - | ||
| Formalin 10% | Sigma Aldrich, USA & nbsp; | HT501320 | |
| Ematossilina | SDFCL | 74108G05 | |
| HEPES | Himedia, India | MB016 | |
| Perossido di idrogeno | Avra, India | 7722841 | |
| Ketamina | Neon Laboratories Ltd, India | - | |
| Laringoscopio | Medical Sources Co., Ltd., Cina & nbsp; | MS-LA500FV | |
| Lipopolisaccaride da Escherichia coli O55:B5 | Sigma Aldrich, USA | L2880 | |
| o-Dianisidina diidrocloruro | Sigma Aldrich, USA | D3252-5G | |
| Soluzione salina tampone di fosfato (PBS) e nbsp; | Invitrogen, USA | 3002 | |
| Ortofosfato di diidrogeno di potassio | Himedia, India | IN26185530500 | |
| Cocktail di inibitori proteici | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Rat IL-1 e beta; Kit ELISA & nbsp; | Thermofisher, USA | BMS630 | |
| Cloruro di sodio | Himedia, India | TC046M | |
| Fluoruro di sodio | Himedia, India | GRM7502 | |
| Ortovanadato di sodio | Sigma Aldrich, USA | S6508 | |
| Pirofosfato di sodio | Merck, USA | MA3M722243 | |
| Acido solforico | Sigma Aldrich, USA | 339741 | |
| Triton X-100 | Thermofisher, USA | T8787 | |
| Xilazina | Indian Immunologicals Ltd, India | - |
Riferimenti
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