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Articolo metodologico

3D Flipwell Engineering per lo sviluppo di sistemi asincroni per terapie tossicologiche e immunomodulatorie in cellule batteriche, intestinali e immunitarie

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DOI:

10.3791/68701

⸱

17 ottobre 2025

 , 
1Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, 2MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

In questo articolo

Sommario

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato con i passaggi chiave per guidare la progettazione e l'utilizzo di 3D Flipwell. Descriviamo e mostriamo come assemblare le pile di inserti di co-coltura e utilizzarle per la co-coltura di strati stratificati di batteri intestinali, epiteli intestinali e macrofagi per modellare l'ambiente della mucosa intestinale.

Abstract

Per studiare i ruoli del secretoma batterico nella polarizzazione delle cellule immunitarie e nell'omeostasi della mucosa intestinale, abbiamo sviluppato un modello di co-coltura tridimensionale utilizzando inserti disponibili in commercio in un formato impilato back-to-back. Abbiamo chiamato questo sistema 3D Flipwells e abbiamo co-coltivato con successo batteri, epiteliali del colon e cellule immunitarie in strati stratificati per ricapitolare il microambiente della mucosa intestinale. Questo sistema di co-coltura consente la semina di cellule epiteliali del colon su un lato della membrana e di monociti non aderenti indifferenziati sull'altro, consentendo la progressione sincrona della polarizzazione epiteliale del colon, la formazione di muco e la differenziazione e la polarizzazione monociti-macrofagi all'interno di una singola co-coltura senza la necessità di staccare e riplaccare i macrofagi pre-differenziati. Questo sistema è facile da costruire e richiede solo pochi materiali e strumenti prontamente disponibili. Abbiamo testato la sua utilità analizzando le risposte dei componenti di co-coltura alla sepiapterina (SEP), il precursore endogeno di BH4 (tetraidrobiopterina), un cofattore dell'ossido nitrico sintasi (NOS). Abbiamo dimostrato che il trattamento SEP di 3D Flipwell ha indotto la formazione di biofilm da parte dei batteri intestinali, la produzione di muco da parte dell'epitelio del colon e la polarizzazione pro-immunogenica dei macrofagi. Ciò ha indicato che il SEP ha innescato l'attivazione di un meccanismo di difesa della mucosa attraverso il crosstalk tra diversi componenti cellulari. Sono necessari ulteriori esperimenti per studiare il ruolo delle comunicazioni della mucosa che portano alla riprogrammazione delle cellule immunitarie e per valutare l'utilità di questo sistema di co-coltura per lo screening di nuove terapie immunomodulatorie.

Introduzione

Il crosstalk tra cellule immunitarie e microbioma intestinale influenza notevolmente l'efficacia di diversi trattamenti per le malattie. Tale crosstalk è marcatamente modificato da stimoli esterni, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, anomalie metaboliche dell'ospite, cambiamenti nella dieta, manifestazione della malattia e trattamento farmacologico. Questi cambiamenti potrebbero portare a uno squilibrio nella composizione della microflora, una condizione chiamata disbiosi 1,2,3.

Per comprendere meglio le interazioni tra i microbi e le cellule immunitarie dell'ospite nell'intestino, sono stati sviluppati elaborati sistemi di co-coltura da diversi gruppi nel tentativo di ricapitolare l'ambiente della mucosa intestinale. Dal sistema gut-on-chip sviluppato da Kim et al.4 a un assemblaggio più complesso che utilizza un substrato assorbente specializzato5, questi sistemi di co-coltura non sono semplici da costruire e non sono in grado di trattenere l'intero spettro di componenti secreti a causa del loro assorbimento da parte del substrato di co-coltura. Noel et al. hanno quindi sviluppato un sistema di co-coltura alternativo per modellare la mucosa intestinale che è relativamente più facile da fabbricare6. Questo nuovo sistema utilizza un singolo inserto di coltura con cellule epiteliali del colon seminate su un lato della membrana e macrofagi pre-differenziati sull'altro lato6. Tuttavia, la semina di macrofagi pre-differenziati richiede la loro pre-differenziazione da qualche altra parte e la loro dissociazione e riplaccatura in una co-coltura, influenzando potenzialmente la loro integrità e vitalità cellulare.

Incorporando miglioramenti a questi sistemi precedenti, abbiamo sviluppato un nuovo sistema di co-coltura multistrato tridimensionale (3D) che abbiamo chiamato sistema 3D Flipwell 7,8. Questo sistema è composto da inserti per colture cellulari impilati schiena contro schiena, consentendo la progressione sincrona della polarizzazione epiteliale del colon, della formazione del muco, della differenziazione dei macrofagi e della polarizzazione all'interno di una singola co-coltura. Questo sistema ci consente di esaminare i cambiamenti nell'ambiente della mucosa intestinale e le interazioni tra batteri intestinali, cellule epiteliali e cellule immunitarie. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato per esaminare gli effetti di stimoli esterni, inclusi metaboliti batterici, tossine, nutrienti dietetici e prodotti farmaceutici, sulla mucosa intestinale e sul resto del corpo 7,8.

Utilizzando il nuovo sistema di inserimento di co-coltura, abbiamo esaminato le risposte di diversi componenti cellulari alla sepiapterina (SEP), il precursore endogeno di BH4 (tetraidrobiopterina), un cofattore dell'ossido nitrico sintasi (NOS). In precedenza abbiamo dimostrato che il SEP esercita attività pro-immunogeniche sul microambiente del tumore al seno riprogrammando i macrofagi associati al tumore a un tipo pro-immunogenico 9,10,11,12. Abbiamo dimostrato che SEP induce eventi sincroni di formazione di biofilm da parte dei batteri intestinali, produzione di muco da parte dell'epitelio del colon e polarizzazione pro-immunogenica dei macrofagi in co-colture, indicando l'attivazione di un meccanismo di difesa della mucosa7. Questi risultati supportano l'utilità di questo nuovo sistema di co-coltura nella modellazione del microambiente della mucosa intestinale7.

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire istruzioni dettagliate per la costruzione di questa nuova co-coltura di batteri intestinali, epiteli intestinali, muco e cellule immunitarie per modellare l'ambiente della mucosa intestinale. Dimostriamo anche come potremmo visualizzare il crosstalk di cellule co-coltivate sotto l'influenza di uno stimolo esterno, ad esempio il trattamento SEP. Sono necessarie ulteriori ricerche che utilizzano questo sistema di co-coltura per determinare i componenti cellulari secreti che facilitano le interazioni tra le diverse cellule in co-coltura, nonché per testare l'utilità di questo modello di co-coltura per lo screening ad alto rendimento di nuove terapie. Inoltre, per raggiungere la condizione fisiologica dell'ambiente della mucosa intestinale, questo sistema di co-coltura richiederebbe ulteriori modifiche. Ad esempio, per co-coltivare cellule di mammifero aerobico con batteri anaerobi, questi batteri dovrebbero essere coltivati separatamente in terreni anaerobici che rimuovono l'ossigeno o sovrapposti con paraffina liquida che impedisce l'ingresso di ossigeno, come riportato altrove. Tale utilità avanzata e l'applicazione di questo sistema di co-coltura giustificherebbero ulteriori indagini.

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Protocollo

1. 3D Ingegneria Flipwell

  1. Tutto il lavoro deve essere svolto all'interno di un armadio per colture cellulari. Posizionare tutte le forniture all'interno dell'armadio.
  2. Aprire il coperchio della capsula di Petri e mettere da parte. Aprire la lama del bisturi dal suo involucro protettivo e posizionarla sul bordo del fondo della capsula di Petri. Garantire la sterilità.
    ATTENZIONE: È necessario maneggiare con cura la lama del bisturi. Utilizzare guanti resistenti al taglio e rinforzati con fibre per proteggere le mani, se necessario.
  3. Aprire la confezione protettiva sterile dell'inserto commerciale a 12 pozzetti. Garantire la sterilità. Prendi un set di pinzette sterili. Afferrare delicatamente l'inserto e rimuoverlo dalla confezione.
  4. Tenere l'inserto in modo che la parte inferiore sia rivolta verso l'alto. Con l'altra mano, prendi la lama del bisturi sterile e portala fino all'inserto.
  5. Con un movimento a forma di C, forare la membrana sul bordo e far scorrere delicatamente la lama del bisturi attorno al fondo dell'inserto, rimanendo vicino alla parete di plastica.
  6. Taglia la membrana in PET e usa il secondo set di pinzette per rimuovere la membrana. Scartare la membrana.
  7. Utilizzare la lama del bisturi per raschiare eventuali trucioli di membrana bianca per pulire il bordo e il bordo dell'inserto. Riposizionare con cura l'inserto appena preparato nella sua confezione sterile originale.
  8. Quindi prendi il tubo adesivo in silicone e taglia la punta dell'ugello con la lama del bisturi per fare un'apertura. Questa apertura deve essere larga 3 mm.
  9. Testare la dimensione del perline spremendo la colla sul tovagliolo di carta. Il tallone deve avere uno spessore di 2-3 mm. Regolare l'ugello se il cordone è inferiore a 2 mm ed è difficile da spremere dal tubo.
    1. Un altro modo per applicare e stendere il cordone di colla è utilizzare un puntale per pipetta da 200 μl con il puntale tagliato. Ritagliare 3-4 mm con le forbici e utilizzare una spatola per stendere la colla attorno al bordo dell'inserto.
  10. Staccare il coperchio protettivo dal secondo inserto e metterlo da parte. Prendi la pinza sterile, prendi il secondo inserto dalla confezione con la membrana rivolta verso l'alto.
  11. Stendere delicatamente una sottile perlina di silicone di 2-3 mm intorno al fondo dell'inserto, facendo attenzione a non toccare la membrana.
  12. Prendi il secondo set di pinze sterili e solleva con cautela il primo inserto (senza la membrana) dalla sua confezione protettiva.
  13. Unire i due inserti dal basso verso il basso in modo che i cerchi inferiori siano allineati. La colla in eccesso può essere espulsa dal giunto. Lasciare asciugare la colla. Può essere tagliato dopo che la colla è completamente asciutta (24-72 h). Questo è facoltativo.
    NOTA: Lo stack finale di Flipwell Co-culture Insert (FCI) dovrebbe avere una sola membrana in PET al centro. È meglio posizionare le maniglie a forma di L degli inserti commerciali in modo che si trovino a 180° di distanza l'una dall'altra (a ore 3 e 6). Seguire le raccomandazioni del produttore della colla siliconica per il tempo di asciugatura, che può essere di 24-72 ore a seconda della marca. Per la maggior parte delle colle a base di silicone, è preferibile un tempo di asciugatura di 72 ore. La colla può anche essere asciugata per sole 24 ore con sterilizzazione UV.
  14. Quando la pila FCI è incollata, posizionarla all'interno della confezione sterile originale per asciugarla o all'interno di una capsula di Petri profonda. Utilizzare il coperchio delle piastre di Petri specificate per coprire il gruppo pila.
  15. Per sterilizzare i gruppi di pile, aprire il coperchio della capsula di Petri. Utilizzare una pinza sterile per consegnare la pila FCI sul bordo del bordo profondo della piastra di Petri specificato.
  16. Chiudere l'anta in vetro dell'armadio BSC. Accendi la luce UV. Allontanarsi dall'armadio per sicurezza e sterilizzare ogni lato della membrana 30 min-1 h. Spegnere la luce UV al termine di ogni ciclo di sterilizzazione.
  17. Posizionare il coperchio della capsula di Petri (come specificato) sulla piastra di Petri con le pile di inserti e mettere da parte.

2. Test per perdite prima del rivestimento di collagene

  1. Rimuovere il coperchio della capsula di Petri. Aggiungere 500 μl di PBS sterile o acqua deionizzata sterile.
    NOTA: Per l'aiuto visivo, il DMEM è stato utilizzato per aiutare a visualizzare l'integrità degli stack FCI.
  2. Coprire la capsula di Petri. Lasciate riposare per una notte. Controllare l'integrità FCI al mattino. Eliminare le FCI se viene rilevata una perdita. Crea nuove pile di inserti secondo necessità.
  3. Aspirare il liquido (PBS o acqua) utilizzato per il test. Coprite la capsula di Petri con un coperchio.
  4. Lasciare asciugare le pile (1-2 ore) all'interno del BSC. Conservare le FCI in una BSC fino al momento dell'uso o procedere a rivestirle con collagene per seminare le cellule aderenti.

3. Rivestimento in collagene della membrana Flipwell

  1. Preparare una riserva di lavoro della soluzione di collagene diluendo la soluzione di collagene fornita a 3 mg/mL con diluizione 1:30 a 100 μg/mL. Aggiungere 33 μL di soluzione di collagene prodotta in commercio a 1 mL di acqua deionizzata sterile in una provetta da microcentrifuga. Mescolare a vortice.
    NOTA: Per un volume maggiore, aumentare la scala e utilizzare una provetta conica da 15 mL a seconda del numero di pile di inserti da rivestire su entrambi i lati della membrana. Fallo fresco ogni volta. Non riutilizzare il materiale di lavoro.
  2. Aprire il coperchio della capsula di Petri. Lascia che il Flipwell penda dal bordo della piastra di Petri. Aggiungere con cautela 200 μl di soluzione di collagene su un lato della pila di inserti.
  3. Lasciare riposare 1 ora. Aspirare la soluzione di collagene. Aggiungere 200 μl di PBS sterile. Aspirare PBS.
  4. Coprire la capsula di Petri con il coperchio e lasciare asciugare la membrana per 60 minuti all'interno dell'armadio. Quando la membrana è asciutta, prendi il forcipe/pinzetta sterile e capovolgi il Flipwell sul lato opposto e lascialo pendere dal bordo della piastra di Petri.
  5. Aggiungere 200 μL di soluzione di collagene sul lato non rivestito (ora superiore) della membrana. Lasciare riposare 1 ora.
  6. Aspirare la soluzione di collagene. Aggiungere 200 μl di PBS sterile. Aspirare PBS. Coprire la capsula di Petri con un coperchio e lasciare asciugare la membrana per 60 minuti all'interno dell'armadio. Lasciare asciugare la pila FCI durante la notte o seminare lo stesso giorno.
    NOTA: L'integrità del rivestimento in collagene non è stata testata in condizioni di conservazione prolungate. Una volta prerivestiti, i Flipwell devono essere utilizzati entro 24 ore.

4. Costruzione dell'inserto batterico per colture batteriche

  1. Posizionare due serie di pinze sterili e gli inserti a 24 pozzetti all'interno del BSC. Aprire con cautela gli inserti e lasciarli all'interno della loro confezione sterile.
  2. Con una pinzetta sterile, sollevare l'inserto dalla sua confezione sterile. Con il secondo set di pinzette/pinze, rompere i piedini di plastica nella parte inferiore dell'inserto.
  3. Testare l'inserto a 24 pozzetti inserendolo all'interno di uno degli stack FCI sterili o degli inserti originali a 12 pozzetti.
  4. Se l'inserto non scivola nel pozzo, usa di nuovo una pinzetta per staccare più materiale plastico dal bordo dove il bordo e i piedini si incontrano.
  5. Testare nuovamente l'accoppiamento fino a quando l'inserto a 24 pozzetti non è in grado di scorrere all'interno del pozzetto dell'inserto a 12 pozzetti. Posizionare l'inserto all'interno della sua confezione sterile o all'interno di una capsula di Petri sterile.
  6. Sterilizzare con raggi UV o etanolo l'inserto (opzionale). Coprire nuovamente la confezione o coprire con il coperchio della capsula di Petri fino al momento dell'uso.

5. Costruzione dell'ago

  1. Porta gli strumenti e tutte le forniture all'interno di una BSC. Tenere con cura un ago con le pinze a becco.
  2. Misura la posizione di ogni curva sull'ago usando un righello. Con il secondo set di pinze a becchi tondi, afferrare l'ago nella posizione selezionata e piegare l'ago.
  3. Create la seconda piega. Per torcere l'ago, afferrare l'ago con una pinza alla base e alla curva a forma di U e ruotare nella direzione opposta per creare una torsione di 4-5 mm. Questo passaggio è fondamentale per inserire facilmente l'ago all'interno del Flipwell per la rimozione delle bolle d'aria.
  4. Fissare l'ago su una siringa sterile da 3 o 5 mm. Sterilizzare l'ago e la base della siringa in 20 mL di etanolo al 70%-95% all'interno di una provetta conica da 50 mL.
  5. Tirare l'etanolo attraverso l'ago e la siringa per assicurarsi che l'ago e la base della siringa siano sterilizzati.
  6. Rimuovere la siringa e l'ago dal tubo conico con etanolo e lasciare asciugare all'aria appoggiandoli su una capsula di Petri. Spurgare l'ago con aria per farlo asciugare e lasciarlo asciugare per alcuni minuti.

6. Semina delle linee cellulari Caco-2:HT29-MTX-E12 epiteliale del colon

  1. Iniziare a coltivare le linee cellulari Caco-2 e HT29-MTX 2-3 settimane prima dell'esperimento in piastre separate rivestite di TC da 100 mm nei rispettivi terreni di crescita.
    1. Per i terreni HT-29-MTX, utilizzare 440 mL di DMEM ad alto contenuto di glucosio (4,5 g/L) e terreni Glutamax all'1% (v:v) con 50 mL di FBS inattivato a caldo al 10% (v:v), 5 mL di Pen Strep all'1% (v:v) e 5 mL di HEPES 10 mM a concentrazione finale.
    2. Per i terreni Caco-2, utilizzare 440 ml di DMEM ad alto contenuto di glucosio (4,5 g/L) e terreni Glutamax all'1% (v:v) con 50 ml di FBS inattivato termicamente al 10% (v:v), 5 ml di pennastropatococco all'1% (v:v) e 5 ml di aminoacidi non essenziali.
      NOTA: Determinare la densità di semina per la linea cellulare Caco-2 utilizzando pozzetti per piastre a 12 pozzetti rivestiti in coltura tissutale. Calcola il numero di giorni per raggiungere la confluenza del 100% a seconda della densità di semina iniziale. Forniamo una densità di semina come linea guida; tuttavia, ciò varierà a seconda della formulazione dei terreni di crescita, del fornitore e dell'FBS utilizzato. Questo passaggio è fondamentale per garantire un monostrato per il lato epiteliale intestinale del Flipwell dopo che le cellule THP-1 sono state piastrate e sono stati eseguiti i trattamenti batterici/SEP.
  2. Per far passare le cellule Caco-2 e HT-29, aspirare il terreno di coltura. Lavare con 10 ml di PBS.
  3. Tripsinizzare le cellule aggiungendo 2 mL di tripsina-EDTA allo 0,25%. Incubare 5-10 minuti a 37 °C con CO2 al 5%.
  4. Aggiungere 7 mL del terreno di coltura appropriato per il tipo di cellula alle piastre. Trasferire le cellule in provette coniche sterili da 15 mL separate.
  5. Pellettare per centrifugazione per 5 min a 500 x g a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare.
  6. Risospendere il pellet in 1 mL di terreno HT-29 preriscaldato a base di DMEM. Contare le cellule con un ematocitometro o un contatore di cellule.
  7. Combina i due tipi di cellule Caco-2:HT-29 con un rapporto di 9:1 in una nuova provetta conica da 15 mL o 50 mL, a seconda del numero di cellule necessarie per il numero desiderato di Flipwell.
  8. Usa Flipwells prerivestiti di collagene per i passaggi seguenti. Appendere le pile FCI prerivestite di collagene al bordo della profonda capsula di Petri.
  9. Seme 500 μL di 7,5 x 104 cellule per cm2 (2,6 x 105 cellule/inserto da 12 pozzetti) per il lato apicale di Flipwell. Calcola il numero di celle iniziali in base al numero di pile utilizzate. Ciò includerà entrambi i tipi di cellule con un rapporto 9:1.
  10. Coprire i gruppi con un coperchio per piastre di Petri. Incubare a 37 °C con il 5% di CO2 per una notte fino a quando le cellule non si attaccano. Le cellule iniziano a produrre muco circa 7-10 giorni in coltura. Cambia i media a giorni alterni per mantenere le culture.
    NOTA: Il totale dei giorni di coltura con trattamenti deve essere calcolato in anticipo. Il capovolgimento e la densità di semina iniziale dipenderanno da tale durata.

7. Capovolgere il Flipwell 3D in preparazione per la semina delle cellule THP-1

  1. Quando le cellule Caco-2:HT-29 si attaccano e iniziano a proliferare (l'esatta confluenza deve essere stimata in base al terreno/FBS utilizzato e alla durata della coltura) ma non sono al 100% di confluenza, capovolgere il Flipwell per seminare le cellule THP-1 sull'altro lato della membrana.
    NOTA: A questo punto, le cellule THP-1 devono essere state espanse in una coltura separata e il numero esatto di cellule necessarie sarà stimato in base al numero di stack FCI utilizzati.
  2. Aprire il coperchio della capsula di Petri e aspirare il terreno DMEM dal lato apicale (epiteliale intestinale) della pila FCI.
  3. Utilizzando una pinza sterile, prelevare con cautela il Flipwell per il gancio e ruotarlo di 180°. Con la seconda serie di pinze sterili, afferrare la pila FCI per l'altro gancio che ora è rivolto verso l'alto.
  4. Abbassare nuovamente il gruppo nella piastra di Petri e appendere il gancio sopra il bordo della piastra di Petri. Se non sei pronto per seminare le cellule THP-1, aggiungi abbastanza terreno alla capsula di Petri profonda per portare il livello del terreno verso l'alto e appena fino alla parte superiore della membrana.
    NOTA: Il Flipwell dovrebbe essere stabile in questa posizione e la semina con cellule THP-1 e l'aggiunta di terreno dovrebbero essere prese in considerazione fin da ora. Questi passaggi vengono eseguiti rapidamente. Le cellule THP-1 devono essere contate e pronte per essere piastre. Le cellule THP1 sono state seminate per prime per appesantire lo stack FCI per una maggiore stabilità e peso finale. Il terreno DMEM è stato quindi aggiunto alla piastra di Petri profonda per portare il livello del fluido fino alla parte inferiore della membrana. L'ago su misura è stato quindi utilizzato per rimuovere la bolla d'aria, che ha ulteriormente stabilizzato la pila FCI e ha consentito le regolazioni finali del volume.
  5. Utilizzare l'ago per rimuovere la bolla d'aria come descritto nel passaggio seguente.

8. Rimozione delle bolle d'aria

  1. Presterilizzare l'ago e la siringa in etanolo e asciugare all'aria prima dell'uso (vedere la fase 5). Immergere lo stantuffo della siringa.
  2. Tenere la pila FCI per il braccio con una pinza sterile. Abbassare con cautela l'ago dentro e sotto il gruppo inserto e posizionare molto delicatamente la punta morbida dell'ago per la sonda gastrica fino alla bolla d'aria.
  3. Tirare con cautela e molto lentamente lo stantuffo della siringa verso l'alto e osservare la bolla d'aria scomparire lentamente. Fermati quando la bolla d'aria ha un diametro di circa 2 mm, che è sufficiente per mantenere una buona copertura di DMEM per le cellule epiteliali del colon.
  4. Rimuovere con cautela l'ago e la siringa dal Flipwell. Procedere all'altro assemblaggio dell'inserto nella piastra di Petri profonda.

9. Semina THP-1 e trattamento con PMA

  1. Preparare terreni THP1 con 420 mL di terreno del Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640, 50 mL di FBS inattivato termicamente al 10% (v:v), 5 mL di Glutamax 1% (v:v), 5 mL di HEPES (concentrazione finale 10 mM), 11 mL di glucosio (4,5 g/L di concentrazione finale) e 5 mL di Pen-Strep (1% v:v).
    NOTA: Le cellule THP-1 devono essere coltivate in terreno di coltura a base di RPMI per diversi giorni prima di essere seminate negli inserti. Effettua calcoli sul conteggio delle celle prima del seeding e aumenta in base al numero di stack FCI da utilizzare.
  2. Preparare la sospensione cellulare sulla base di un volume di 500 μl e a 0,5 x 106 cellule per 500 μl di terreno THP-1. Se il PMA deve essere utilizzato per la differenziazione e la polarizzazione, aggiungerlo al mezzo RPMI a 100 ng/μL.
    1. Per produrre il PMA, ricostituire 5 mg di forbolo miristato acetato (PMA) in 1 mL di DMSO per ottenere una soluzione madre da 5 mg/mL. Mescolare a vortice. Aliquotare in provette per microcentrifuga da 20 μl ciascuna e conservare a -20 °C.
    2. Per utilizzare il PMA, creare un materiale lavorante a 50 μg/mL diluendo 1 μL di 5 mg/mL in 99 μL (1:100) di terreno di coltura completo. Aggiungere 1 μL di materiale di lavoro a 500 μL di terreno di coltura o 20 μL di materiale di lavoro a 10 mL di terreno.
  3. Centrifugare le celle THP-1 a 94 x g per 5 minuti a RT su pellet. Risospendere in 5-10 mL di supporto RPMI. Conta le cellule THP-1 con qualsiasi metodo di conteggio preferito.
  4. Centrifugare nuovamente a 94 x g per 5 minuti a RT. Risospendere a 0,5 x 106 celle per 500 μl di terreno THP-1.
  5. Aggiungere 500 μl di sospensione cellulare THP-1 al lato apicale della pila di inserti di co-coltura. Regolare il terreno HT-29 per le cellule epiteliali del colon aggiungendo il terreno alla capsula di Petri a pozzetto profondo.
  6. Rimuovere la bolla d'aria con un ago per sonda gastrica come indicato al punto 8, se necessario. Coltivare entrambi i tipi di cellule nell'incubatore per colture cellulari a 37°C, 5% CO2, 100% di umidità fino a quando le cellule THP-1 si attaccano (durante la notte) e proliferano per 1-2 giorni.
  7. Prepararsi a fare trattamenti con SEP o altri farmaci o prepararsi per inserti batterici (vedi passaggio 4). Inizia a coltivare i batteri 1 giorno prima del prossimo capovolgimento dello stack FCI.

10. Secondo Flipwell Flip e rimozione delle bolle d'aria per SEP e inserti batterici

  1. Aprire il coperchio della capsula di Petri. Aspirare il media RPMI dal lato apicale. Tenere il Flipwell per il braccio con una pinzetta sterile e sollevare la pila.
  2. Ruota la pila a testa in giù. Usando il secondo set di pinzette, tieni il gruppo stack sul braccio disponibile.
  3. Abbassare la pila in una nuova capsula di Petri sterile a pozzetti profondi e appenderla sopra il bordo. Aggiungere 500 μl di terreno DMEM al lato epiteliale epiteliale epicrale/intestinale.
  4. Aggiungere una quantità sufficiente di terreni RPMI alla piastra di Petri profonda fino a quando il supporto non raggiunge la parte superiore della membrana. Il volume RPMI è stato stimato in circa 40-55 mL, ma cambierà a seconda del numero di stack FCI utilizzati per piastra di Petri profonda.
  5. Rimuovere la bolla d'aria utilizzando il passaggio 8 lasciando una bolla di 2-3 mm. Se necessario, regolare i supporti RPMI. Copri il piatto.
  6. Coltura fino a quando le cellule epiteliali del colon iniziano a produrre muco. Cambia parzialmente i media a giorni alterni.
    NOTA: Se le cellule epiteliali del colon sono state coltivate abbastanza a lungo e hanno già prodotto muco, possono procedere all'inserto batterico o ai trattamenti. Evitare che il supporto nello scomparto inferiore penetri sotto la parte inferiore della membrana dell'inserto. Aggiungere altri supporti DMEM per mantenere il livello del supporto sulla membrana. Il metodo ideale per la sostituzione del terreno consiste nel rimuovere metà del terreno dal compartimento basolaterale e lasciare un piccolo volume di terreno nel compartimento apicale per evitare infiltrazioni d'aria.
  7. Per i trattamenti SEP, aggiungere SEP alla concentrazione finale di 100 μM ai pozzetti in questo momento se la coltura batterica non viene utilizzata. Se si utilizzano la coltura batterica e l'inserto, aggiungere SEP alla coltura batterica. Per la coltura batterica, vedere il passaggio 11.
    1. Per preparare il SEP, aggiungere 100 mg di L-Sepiapterina a 84,3 ml di DMSO e mescolare a vortice. Aliquotare in provette da microcentrifuga da 100 μl ciascuna. Conservare a -20 °C. Utilizzare aliquote SEP a 1 μl per 500 μl di terreno per assemblaggio di inserti (concentrazione finale di 100 μM).

11. Avvio della coltura batterica (opzionale)

  1. Per studiare l'effetto dei metaboliti batterici sulle cellule immunitarie, sul muco e sull'epitelio del colon, aggiungere un inserto batterico sul lato apicale dell'inserto. Per la costruzione dell'inserto batterico, seguire il passaggio 4. Abbiamo coltivato il Bacillus subtilis il giorno prima dell'uso dell'inserto batterico.
  2. Preparare e sterilizzare in autoclave il Miller LB 2 giorni prima dell'uso dell'inserto batterico. Per fare LB, unire 6,25 g di Miller LB con 250 ml di acqua deionizzata in un pallone di vetro da 500 ml. Coprire con un foglio di alluminio. Autoclave, raffreddamento a RT. Può conservare LB sterile a 4 °C o RT.
  3. Inizia a coltivare i batteri Bacillus subtilis dal ceppo di glicerolo il giorno prima dell'uso dell'inserto batterico.
  4. Per avviare la coltura batterica, inoculare 10 ml di Miller LB con Bacillus subtilis da uno stock di glicerolo congelato all'interno di una provetta conica sterile da 50 ml. Non lasciare che lo stock di glicerolo si scongeli.
  5. Utilizzando un puntale sterile da 200 μl, prelevare una piccola quantità di batteri dal brodo di glicerolo. Espellere il puntale in 10 mL di LB nella provetta conica sterile da 50 mL.
  6. Se si utilizza SEP, iniziare il trattamento con 20 μL di stock SEP (la concentrazione finale deve essere di 100 μM). Aggiungere direttamente alla coltura batterica da 10 mL nella coltura starter in provetta conica da 50 mL.
  7. Coltura di Bacillus subtilis per 8 ore in un'incubatrice agitata a 220 giri/min e 37 °C. Aggiungere il secondo trattamento di SEP alla fine della giornata - aggiungere 20 μL di SEP alla concentrazione finale di 100 μM ai 10 mL di LB con batteri.
  8. Coltura notturna a 220 giri/min, 37 °C. Aggiungere il terzo trattamento di 20 μL di SEP a 10 mL di LB con Bacillus subtilis la mattina seguente e continuare ad agitare fino al momento di eseguire gli inserti batterici.

12. Aggiunta di inserto batterico al Flipwell (opzionale)

  1. Eseguire la costruzione dell'inserto batterico come descritto al punto 4. Eseguire la coltura batterica come descritto al punto 11.
    NOTA: Se è disponibile un armadio per colture cellulari separato, funzionerà meglio. In caso contrario, dividere a metà l'area di lavoro all'interno di una cella per colture cellulari. Mantenere separate le colture batteriche e cellulari. Le colture cellulari non devono essere rimesse nell'incubatore per colture cellulari. Il BSC dovrà essere sterilizzato ed esposto ai raggi UV per 24 ore o più dopo l'esecuzione di questo metodo.
  2. Utilizzare due paia di pinze sterili per i passaggi seguenti. Tutti i passaggi seguenti devono essere eseguiti nella BSC.
  3. Con una pinza, sollevare l'inserto sterile a 24 pozzetti prefabbricato dalla confezione. Inserire l'inserto all'interno di una capsula di Petri sterile e coprire il coperchio.
  4. Ripetere per il numero di inserti batterici necessari. Trasferire la capsula di Petri con i Flipwells dall'incubatrice nella BSC e metterla da parte sul lato opposto della capsula con gli inserti batterici.
  5. Estrarre 300 μl di terreno DMEM dal lato apicale (superiore) del Flipwell per consentire l'inserimento batterico. Lasciare circa 200 μl nella parte superiore della pila FCI. Posizionare il coperchio della capsula di Petri sui gruppi di inserti.
  6. Aggiungere 50-100 μl di coltura di B.subtilis agli inserti batterici a 24 pozzetti. Fare attenzione a non versare o contaminare la parete esterna e il bordo dell'inserto batterico. OD600 può essere utilizzato per monitorare la fase di crescita della coltura.
  7. Con una pinza sterile, sollevare l'inserto batterico con coltura e inserirlo con cura all'interno del lato superiore di Flipwell. Ruota il braccio e appendilo al bordo della pila FCI. Tenere la pila con la seconda serie di pinze sterili.
  8. Ripetere l'operazione per il resto degli stack FCI. Coprire la capsula di Petri e far riposare all'interno della BSC 3 h. Non portare all'interno dell'incubatrice.
  9. Dopo 3 ore, utilizzare una pinza sterile per rimuovere l'inserto batterico dal Flipwell. Ripetete l'operazione per il resto degli assiemi di inserti. Scartare gli inserti batterici.
    NOTA: Scartare batteri e inserti batterici secondo le politiche di smaltimento dei rifiuti a rischio biologico e le linee guida per la sicurezza e la salute dell'istituto. I componenti batterici o i batteri stessi non sono stati esaminati.
  10. Per analizzare le alterazioni dei compartimenti cellulari della mucosa, dell'epitelio e del sistema immunitario, procedere al lavaggio delle membrane e alla loro preparazione per l'imaging.
  11. Aspirare il supporto DMEM dalla parte superiore Flipwell. Lavare con 500 μl di PBS sterile. Usando una pinza, sollevare la pila FCI dalla piastra di Petri e trasferirla in una nuova piastra di Petri.
  12. Capovolgi il Flipwell e appendilo sopra il bordo della piastra di Petri. Lavare la membrana con 500 μL di PBS sterile.
  13. Se è necessario conservarlo, conservare le pile FCI a breve termine (30 minuti durante la notte) in PBS sterile all'interno di una provetta conica da 50 ml.
    NOTA: È importante determinare quale metodo di imaging verrà utilizzato successivamente e se la membrana verrà tagliata a metà sia per la microscopia elettronica che per la marcatura degli anticorpi fluorescenti.

13. Smontaggio del Flipwell per la microscopia elettronica a scansione (SEM)

NOTA: Per esaminare i cambiamenti morfologici nelle cellule epiteliali del colon e nei macrofagi dopo trattamenti SEP/batterici, abbiamo fissato le membrane in un tampone di fissazione e quindi smontato i Flipwells per la microscopia elettronica a scansione (SEM). Il PFA era usato come fissativo; Tuttavia, può essere utilizzata anche la glutaraldeide. È importante consultare il nucleo di microscopia in merito al tampone di fissazione preferito, alle fasi specifiche di disidratazione e alle concentrazioni iniziali del tampone di fissazione. Le membrane possono essere conservate nel tampone di fissazione se è necessario conservarle. Il lavoro può essere svolto al di fuori della BSC. Se il nucleo di imaging incolla la membrana, può essere tagliata a metà e posizionata per visualizzare entrambi i lati separatamente.

  1. Utilizzando un marcatore a prova di solvente, etichettare i lati in plastica della pila FCI con un simbolo che codifica per il tipo di cella utilizzato. In alternativa, etichettare la membrana direttamente con un punto, un segno di spunta o una x per etichettare il tipo di cellula utilizzata.
  2. Posizionare il Flipwell all'interno di una provetta conica da 50 ml senza smontarlo. Aggiungi il 4% di PFA quanto basta per sommergere la pila. Conservare il 4% di PFA durante la notte.
    1. Per ottenere il 4% di PFA (senza metanolo), sciogliere 40 g di paraformaldeide in 800 ml di 1x PBS. Per produrre PFA allo 0,4%, sciogliere 4 g di paraformaldeide in 800 mL di 1x PBS o diluire il 4% di PFA 1:10 con 1x PBS aggiungendo 100 mL di PFA al 4% a 900 mL di 1x PBS.
  3. Sostituisci PFA con lo 0,4% per uno storage più lungo. Consultare il nucleo di microscopia per la durata di conservazione e i buffer.
  4. Per smontare il Flipwell, tienilo con entrambe le mani e svita ogni parte incollata della pila. La pila si smonterà in due parti: una parte avrà la membrana e l'altra sarà l'inserto senza la membrana. Scartare l'inserto senza la membrana.
  5. Ruotare l'inserto con la membrana e appoggiarlo con la membrana rivolta verso l'alto. Può etichettare la membrana con un piccolo punto o una x sul bordo della membrana per sapere quale lato ha quale tipo di cellula.
  6. Tenere l'inserto per il muro con una pinza. Ritagliare con cura la membrana con una lama di bisturi e posizionarla all'interno di una provetta da 1,7 ml o di una bottiglietta di vetro con 500 μL-1 ml di soluzione di PFA allo 0,4%-4%.
  7. Inviare al nucleo di microscopia per le fasi di disidratazione e l'imaging. Le fasi di disidratazione sono descritte in Beamer et al7.
  8. Scartare PFA o altri fissativi secondo le politiche di smaltimento dei rifiuti pericolosi prescritte dall'organizzazione e le linee guida per la salute e la sicurezza.

14. Metodo a goccioline grandi per smontare il Flipwell per la microscopia confocale

NOTA: È stato creato un nuovo metodo per colorare e visualizzare le membrane. La pila di inserti di co-coltura è stata mantenuta intatta con le fasi iniziali di fissazione, permeabilizzazione e blocco eseguite all'interno di una provetta conica da 50 mL. La marcatura immunofluorescente e la microscopia confocale sono state utilizzate per visualizzare entrambi i lati della membrana. Per le fasi di incubazione notturna è stato utilizzato il nuovo metodo della piastra a 12 pozzetti e un metodo a goccioline di grandi dimensioni per colorare il fondo dell'inserto smontato. Lo Z-stack confocale è stato utilizzato per l'imaging di entrambi i lati con la membrana. Le membrane colorate sono state inserite tra due vetrini circolari di vetro e l'assemblaggio a sandwich è stato posizionato al centro tra due anelli metallici della camera rotonda prodotta commercialmente per l'immagine. Il microscopio confocale a scansione laser multi-fotone è stato utilizzato con software di imaging commerciali.

  1. Per lavare la membrana, posizionare la pila di inserti di co-coltura direttamente in una provetta conica da 50 mL e aggiungere 15 mL di PBS sterile o lavare ogni lato separatamente (descritto di seguito).
  2. Aspirare il DMEM e aggiungere 300 μL di PBS sterile sul lato apicale. Aspirare il PBS e rimuovere con cautela la pila dalla piastra di Petri.
  3. Capovolgere il Flipwell e aggiungere 300 μl di PBS all'RPMI ora rivolto verso l'alto dello stack FCI. Aspirare il PBS.
  4. Utilizzando un pennarello resistente ai solventi, etichettare il lato superiore e inferiore della pila per sapere quale lato ha quale tipo di cella.
  5. Posizionare il Flipwell all'interno di una provetta conica sterile da 50 mL. Aggiungere 15 mL di PFA sterile al 4% come tampone di fissazione iniziale per 10 minuti. Se è necessaria un'incubazione notturna, sostituire con 15 mL di PFA allo 0,4% in PBS, coprire e lasciare riposare per una notte.
  6. Per procedere con l'immunocolorazione, creare uno spazio sul banco per il metodo delle goccioline grandi.
    Strappa pezzi di pellicola trasparente da 10 x 14 pollici e fissali alla panca agli angoli per creare una superficie liscia.
  7. Utilizzando una pipetta da 200 μl, creare una gocciolina di grandi dimensioni con 200 μl di PBS. Svitare il gruppo inserto per separarlo negli inserti.
  8. Utilizzando un pennarello resistente ai solventi, posizionare un piccolo punto vicino al bordo di un lato della membrana per sapere quale tipo di cellula viene utilizzato per la colorazione e l'imaging.
  9. Rimuovere eventuali residui di guarnizione in silicone dal fondo dell'inserto se l'inserto con la membrana presenta ancora residui di colla. Questo viene fatto per garantire che l'inserto rimanga in posizione verticale per i passaggi seguenti.
  10. Posizionare con cautela la pila FCI (con le cellule THP-1) sopra la grande goccia di PBS da 200 μl. Aggiungere 200 μL di tampone di permeabilizzazione sul lato superiore con le cellule epiteliali del colon e conservare per 10 minuti.
    1. Per preparare il tampone di permeabilizzazione, utilizzare Triton-X100 allo 0,1% v/v in PBS.
  11. Aspirare e aggiungere 200 μL di PBS. Ripetere questo lavaggio 2 volte. Creare una nuova gocciolina con 250 μL di tampone bloccante.
    1. Per preparare il tampone bloccante, aggiungere 250 μL di siero di capra normale in 5 mL di 1x PBS (siero finale al 5%). Aggiungere 15 μl di Triton-X100 (0,3% v:v). Mescolare bene e conservare a 4 °C per 1-2 giorni.
  12. Posizionare l'inserto sopra il tampone di bloccaggio. Bloccare per 30 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il PBS dal lato apicale e aggiungere 200 μl di tampone bloccante sulla parte superiore dell'inserto. Entrambi i lati della membrana sono ora pronti per la colorazione degli anticorpi durante la notte.

15. Colorazione immunofluorescente (IF)

NOTA: La colorazione viene eseguita durante la notte utilizzando un metodo su piastra a 12 pozzetti o su banco utilizzando un metodo a goccioline grandi.

  1. Preparare gli anticorpi necessari da utilizzare per colorare entrambi i lati della membrana durante la notte a 4 °C o sul banco a RT. Diluire tutti gli anticorpi 1:100 in 1% BSA in PBS. In alternativa, seguire le raccomandazioni del produttore e ottimizzare la colorazione per determinare le concentrazioni ideali e il tampone di diluizione degli anticorpi.
  2. Metodo a goccioline grandi
    1. Crea un grande rettangolo usando un involucro di plastica sopra la panca e fissa gli angoli con del nastro adesivo. Pipetta 200 μL di anticorpo diluito sopra la plastica per creare una grande gocciolina. Posizionare la membrana di inserimento sopra la gocciolina grande.
    2. Aggiungere 200 μl di Ab primario sulla parte superiore dell'inserto. Incubare a RT per 2 ore.
  3. Metodo della piastra a 12 pozzetti
    1. Se si utilizza un metodo con piastra a 12 pozzetti durante la notte, aggiungere 300 μl di anticorpo primario alla parte superiore dell'inserto.
    2. Aggiungere 300 μl di anticorpo primario al pozzetto della piastra a 12 pozzetti. Posizionare l'inserto all'interno del pozzetto della piastra a 12 pozzetti sopra la gocciolina. Coprire il piatto con un coperchio e metterlo a 4 °C per una notte.
  4. Al termine della colorazione, lavare entrambi i lati della membrana con PBS. Utilizzando una pipetta e un puntale da 200 μl, sciacquare accuratamente il lato inferiore dell'inserto 3 volte con 200 μl di PBS. Per la parte superiore dell'inserto, lavare aggiungendo 200 μl di PBS sulla parte superiore, aspirando e ripetendo il lavaggio 3 volte.
  5. Preparare tutti gli anticorpi secondari (vedere la Tabella dei materiali per gli anticorpi specifici utilizzati) secondo le raccomandazioni del produttore o diluizione 1:1000 in BSA all'1% in PBS o altro. La colorazione secondaria degli anticorpi deve essere eseguita al buio; Usa una scatola di cartone o un cassetto di un armadio per creare un ambiente privo di luce.
  6. Utilizzando un metodo a goccioline grandi o un metodo a piastra a 12 pozzetti, preparare una nuova piastra sterile. Incubare per 2 ore a RT in ambiente buio. Lavare come descritto al punto 15.4.

16: Preparazione per l'imaging confocale

  1. Se la membrana non è stata ancora etichettata come descritto nel passaggio 14, etichettarla per conoscere la posizione del tipo di cellula. Posizionare un piccolo segno (punto, x, segno di spunta, ecc.) con un pennarello resistente ai solventi in qualsiasi punto (preferibilmente il bordo).
  2. Rimuovere con cautela i vetrini di copertura rotondi dal contenitore di stoccaggio e appoggiarli delicatamente sulla superficie del banco.
  3. Diluire DAPI in PBS a diluizione 1:100. Per erogare DAPI con l'erogatore di gocce, aggiungere 1-3 goccioline al centro del vetrino coprioggetto. In caso contrario, pipettare 1-3 goccioline di DAPI al centro del vetrino coprioggetto.
  4. Tenere l'inserto con una pinza. Ritagliare con cura la membrana con una lama di bisturi con un movimento circolare lungo tutto il bordo/bordo inferiore. Non lasciare che la membrana cada sul banco. Appoggia l'inserto di plastica sul banco e tieni la membrana con una pinza mentre tagli le fibre finali con la lama del bisturi.
  5. Posizionare l'inserto sopra il DAPI. Erogare 1-3 goccioline di DAPI (diluizione 1:100) sulla parte superiore della membrana in modo che entrambi i lati della membrana abbiano DAPI.
  6. Sollevare il vetrino coprioggetto del secondo giro con le dita (indossare i DPI). Non usare il forcipe poiché il vetrino coprioggetto è molto fragile.
  7. Allineare il secondo vetrino coprioggetti sul primo vetrino coprioggetti e abbassarlo con cautela sopra la membrana.
  8. Utilizzando un pennarello resistente ai solventi, etichettare accuratamente il lato del vetrino coprioggetto, se necessario, per codificare il tipo/orientamento della cella (opzionale). Se la membrana è stata etichettata, saltare questo passaggio.
  9. A seconda del numero di vetrini coprioggetti da visualizzare e del numero di anelli metallici disponibili, montare i vetrini coprioggetti tra gli anelli metallici prodotti in commercio per tenere insieme i vetrini coprioggetti rotondi per l'imaging o conservarli al buio fino all'imaging.
  10. Per l'immagine, montare il vetrino coprioggetto con la membrana tra gli anelli metallici della camera cellulare e posizionarlo nel supporto del microscopio confocale. Contattare il nucleo della microscopia confocale prima di vedere quale supporto potrebbe essere necessario per l'imaging dei vetrini rotondi.
  11. Quando sei pronto per l'immagine, avvolgi ogni panino in un foglio di alluminio e portalo alla struttura.
  12. Utilizzando la funzione Z-stack, è possibile eseguire la scansione di ciascun lato della membrana singolarmente utilizzando la lunghezza d'onda appropriata a seconda dei fluorofori utilizzati. Capovolgi e immagina il secondo lato. Per conservare i vetrini, tenerli al buio a 4 °C.

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Risultati

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Discussione

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse. Gli autori declinano tutte le garanzie, espresse o implicite, nella misura massima consentita dalla legge. In nessun caso gli autori saranno ritenuti responsabili, sia ai sensi di qualsiasi statuto, contratto, illecito o qualsiasi altra teoria legale, per eventuali danni speciali, incidentali, indiretti, punitivi, multipli o consequenziali derivanti da o correlati all'uso di strumenti nella costruzione dei Flipwell, all'uso di reagenti BSL, linee cellulari, colture batteriche, all'uso del sistema Flipwell in ambiente anaerobico in una camera anaerobica. Questa limitazione di responsabilità include, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, qualsiasi modalità non specificata di utilizzo di Flipwell non esplicitamente descritta nel presente documento.

Ringraziamenti

L'autore principale esprime sincera gratitudine alla dott.ssa Saori Furuta per le sue eccellenti capacità di mentoring, la guida e il supporto continui su lunghe distanze e la progettazione abile e continua dei progetti che favoriscono fantastiche opportunità di apprendimento. Gli autori ringraziano anche la Dott.ssa Vandana Sharma per l'esperienza e la guida in microbiologia e la Dott.ssa Veani R. Fernando per la preparazione dei macrofagi THP-1.  Inoltre, gli autori ringraziano i dottori Andrew Kleinhenz e William T. Gunning presso la Electron Microscopy Facility, e Cassandra Zamora e Kristin Kirschbaum presso l'Instrumentation Center dell'Università di Toledo per i suggerimenti costruttivi per l'imaging EM. Questo lavoro è stato supportato dal fondo di avvio dell'Università di Toledo Health Science Campus, College of Medicine and Life Sciences, Dipartimento di Biologia del Cancro a SF; Sovvenzione per la ricerca sul cancro dell'Ohio (Progetto #: 5017) a S.F; Premio della Società di Ricerca Medica (Fondazione Toledo, #206298) a S.F; Borsa di studio per la ricerca dell'American Cancer Society (RSG-18-238-01-CSM) a S.F; e National Cancer Institute Research Grant (R01CA248304) a SF.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,4% PFA (vedi ricetta in Reagents and Solutions)descritto nel testo
Pipetta sierologica da 10 mlCorning4488
Placca TC da 12 pozzi,   CostarCorning3513
Tubi conici da 15 ml, SpectraTubeAlkali ScientificC2715
200 & micro; l consigli  USA Scientific1111-1700
Inserti a 24 pozzi - Inserti in coltura per piastre a 24 pozzi, PET 0.4 e micro; m BrandTech Scientific782710
Flipwells 3D preconfezionati, sterilizzati UV  Laboratorio Make in
4% PFA (vedi ricetta in Reagents and Solutions)descritto nel testo
Scorta di Sepiapterin da 50 mM (SEP, vedi la ricetta in Reagents and Solution)Carriera Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
Tubi conici da 50 mlGreiner Bio-One227261
Pipetta sierologica da 5 mlCorning4487
70-95% etanolo (alcol etilico)Decon Labs04-355-151
AlluminioFisher Scientific01-213-100
Aghi per l'alimentazione animale, calibro 20 1.5" lunghezza, uso singolo Fisher Scientific01-208-87
Buffer di diluizione degli anticorpi (vedi ricetta in Reagents and Solutions)descritto nel testo
Camera Cellulare di Attofluor  ThermoFisher ScientificA7816
Nastro autoclaveFisher Scientific15-901-111
Ceppi di Bacillus subtilis wt (3A1T) nello stock di glicerolo ()Centro di Stocco Genetico Bacillus (https:// bgsc. org/
Guanti BioGrip Pink Nitrile senza polvere senza latticeProduzione di alta qualitàP2810
Buffer bloccante (vedi ricetta in Reagents and Solutions - 10% Siero normale di capra in PBS)descritto nel testo
Buffer bloccante (vedi ricetta in Reagents and Solutions)descritto nel testo
Microscopio a campo chiaro (Nikon o equivalente) Eclipse Ts2NikonTS2
Celle Caco-2ATCCHTB-37
Incubatore di colture cellulari, 37° C, 5% CO2 (Eppendorf CellXpert)Eppendorf6734010015
Centrifuga (Eppendorf, centrifuga 5804/5804 R o equivalenteEppendorf22622501
Tubi centrifughe da 50 ml SpectraTubeAlkali ScientificC2750
Inserti di coltura per piastre a 12 pozzi, PET, 0,4 & micro; m, sterileBrandTech Scientific, BRAND Insert 2in1, BIO-CERT782730
Mezzo di montaggio DAPI VectaShieldLaboratori VectorH-1000
Fondali profondi in piastra di Petri, piastra di Petri impilabile in polistirene profondo 100 x 25 mm, sterile e nbsp;USA Scientific8609-0625
XP di aiuto per pipette di DrummondDrummond 4-000-101
Centrifuga Eppendorf 5804 con rotore a secchio oscillante per tubi conici da 50 mlEppendorf22622501
Pinzep, acciaio inossidabile, autoclave sterile, 2 setVWR82027-438
Pinzep, acciaio inossidabile, autoclave sterile, 2 set, pinza per campioniVWR82027-438
Fiaschetta di vetro 500 mlCorning 4980-500
Ematocitometro (Neubauer con scappi di copertura)Thermo Fisher Scientific50-312-90
Celle HT-29-MTX-E12Millipore Sigma12040401
ImmunoPen (opzionale)Fisher Scientific4021761EA
Guanti a base di Kevlar o altri guanti resistenti ai tagli (opzionale)Ferramenta o Amazon
Nastro da laboratorio o nastro da spedizioneFisher Scientific 159015R
Cappa a flusso laminare Serie 1300 A2 BSC Classe IIThermoFisher Scientific1375
Cappa a flusso laminare con luce UV SterilGARDLa Baker CompanySG403A-HE
Marcatori a prova di solventiVWR52877-310 o 95042-566
Mezzi per cellule Caco-2 (DMEM ad alto livello di glucosio, vedi ricetta in Reagents and Solutions)descritto in   Testo
Mezzi per cellule HT-29 (DMEM High Glucosio, vedi la ricetta in Reagents and Solutions)descritto nel testo
Mezzi per celle THP-1 (RPMI, vedi ricetta in Reagents and Solutions)descritto nel testo
Tubo microcentrifuga, 1,7 ml, sterile e nbsp;Alkali ScientificC3017-ST
Tubi microcentrifugheThermo Fisher3451
Substrati Miller LB (vedi ricetta in Reagents and Solutions)Sigma-Aldrich  L3522
Pinze a becco fine, 2 serieFerramenta o Amazon
Guanti Aurelia Amazing senza polvere di nitrile senza latticeMidSci92885
Coperchi per piastre di Petri, sterili Falcon Petri Dish stile 100x15 mmCorning Inc351029
Phorbol myristate acetato (PMA) (100 ng/μ l, vedi la ricetta in Reagents and Solutions) e nbsp;InvivoGenTlrl-pma
Punte per pipette (10 & micro; L, 200 & micro; 1000 & micro; l) PurePoint o equivalenteAlkali Scientific ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS
Pellicola trasparenteSupermercato
Soluzione di collagenasi lavorativa Purecol (100 & micro; g/mL)Advanced BioMatrix5005-100ML
Slip di copertura rotonda #1 1 oz (Corning Float Glass o Fisherbrand)Corning o Fisherbrand50143822 o 12-546-2 25CIR-2
Bisturi, sterili, usa e getta...Mopec o Feather #10AJ136 o 2975#10
Sepiapterina (settembre, 100 & micro; M, vedi la ricetta in Reagents and Solution)Carriera Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
Incubatore a scuotimento impostato per 220 giri/min 37° CEppendorf New Brunswick ScientificoM12990080
Adesivo in silicone Loctite Silicone trasparente IDH o 3M Marine Grade Silicone Garden con punta al nasoLoctite o 3M1745658 o PN08019
Pipetta a canale singolo Eppendorf Research Plus, 200 & micro; lEppendorf
Pipette a canale singolo (10 & micro; L, 200 & micro; 1000 & micro; l)Eppendorf2231001122
Spettrofotometro NanoDropOneCThermo Fisher Scientific13-400-519
Acqua deionizzata sterile    
Serina tamponata con fosfato sterile (PBS) senza calcio né magnesioFisher Scientific  BSS-PBS-1X6
Siringa 3 ml o 5 ml con punta Luer-LokBD309585 o 309603
Celle THP-1ATCCTIB-202
Pipette da trasferimento, steriliFisherbrand13-711-20
Triton X-100Millipore SigmaX100
Soluzione blu di tripanoVWR97063-702
Tripsina-EDTA 0,25%Thermo Fisher Scientific25200-056
Cancella Kimwipes Professional con Poliureshield Anti-Stato LintGuardKimberly-Clark34120
Anticorpi primari: 
Anti-umano CD163Abcam156769
Anti-umano CD68Novus BiologicalsNB100-683-0,1 mg
Anti-umano CD80, E3Q9VTecnologie di segnalazione cellulare15416
Anti-umani CK20 Life TechnologiesPA5-82875
MUC2 anti-umano (996/1)ThermoFisherMA5-12345
Anticorpi secondari:
Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit IgG (per CD80 e CK20)ThermoFisherA11008
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (per MUC2 e CD68 o CD163)ThermoFisherA11005
Reagenti e Soluzioni:   
Caco-2 Medio:
DMEM con glucosio alto (4,5g/L) e 1% (v:v) di GlutaMax Thermo Fisher Scientific35050061
FBS 10% (v:v) inattivato dal caloreSigmaF2242-500ML
Amminoacidi non essenziali all'1% per il substrato Caco-2Thermo Fisher Scientific11140076
Streptococco della penna 1% (v:v)SigmaF2242-500ML
HT-29-MTX Medio
DMEM con glucosio alto (4,5g/L) e 1% (v:v) di GlutaMax Thermo Fisher Scientific35050061
FBS 10% (v:v) inattivato dal caloreSigmaF2242-500ML
HEPES (concentrazione finale di 10 mM)Thermo Fisher Scientific15630080
Streptococco della penna 1% (v:v)SigmaF2242-500ML
THP-1 Medio:
FBS (10% v:v) siero fetale inattivato al caloreSigma F2242-500ML
Glucosio (concentrazione finale di 4,5 g/L)Thermo Fisher ScientificA249001
GlutaMax 1% (v:v)  Concentrazione finale di 2 mMThermo Fisher Scientific35050061
HEPES (concentrazione finale di 10 mM)Thermo Fisher Scientific15630080
Streptococco della penna 1% (v:v)SigmaF2242-500ML
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 mediaThermo Fisher Scientific11875119
Piruvato di sodio (1 mM di concentrazione finale)Thermo Fisher Scientific11360070
Purecol (diluizione a 1:30 100 & micro; g/ml):
Purecol 3 mg/ml 1:30 a 100 & micro; g/ml Advanced BioMatrix5005-100ML
Acqua sterile deionizzata
L-Sepiapterin forte (50 mM):
L-Sepiapterina (SEP)Carriera Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
5 mg/mL)InvivoGenTlrl-pma
BSA 1% albumina sierica bovina  Sigma-Aldrich5470
DMSO Sigma D2650
Miller LBSigma-Aldrich  L3522
Siero normale della stessa specie dell'anticorpo secondarioSigma NS02L-1ML
ParaformaldeideSigma-Aldrich441244

Riferimenti

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