3D Flipwell Engineering per lo sviluppo di sistemi asincroni per terapie tossicologiche e immunomodulatorie in cellule batteriche, intestinali e immunitarie

Maria A. Beamer; Saori Furuta

doi:10.3791/68701

Method Article

3D Flipwell Engineering per lo sviluppo di sistemi asincroni per terapie tossicologiche e immunomodulatorie in cellule batteriche, intestinali e immunitarie

DOI:

10.3791/68701

⸱

October 17th, 2025

Maria A. Beamer¹ , Saori Furuta²

¹Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, ²MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato con i passaggi chiave per guidare la progettazione e l'utilizzo di 3D Flipwell. Descriviamo e mostriamo come assemblare le pile di inserti di co-coltura e utilizzarle per la co-coltura di strati stratificati di batteri intestinali, epiteli intestinali e macrofagi per modellare l'ambiente della mucosa intestinale.

Abstract

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Per studiare i ruoli del secretoma batterico nella polarizzazione delle cellule immunitarie e nell'omeostasi della mucosa intestinale, abbiamo sviluppato un modello di co-coltura tridimensionale utilizzando inserti disponibili in commercio in un formato impilato back-to-back. Abbiamo chiamato questo sistema 3D Flipwells e abbiamo co-coltivato con successo batteri, epiteliali del colon e cellule immunitarie in strati stratificati per ricapitolare il microambiente della mucosa intestinale. Questo sistema di co-coltura consente la semina di cellule epiteliali del colon su un lato della membrana e di monociti non aderenti indifferenziati sull'altro, consentendo la progressione sincrona della polarizzazione epiteliale del colon, la formazione di muco e la differenziazione e la polarizzazione monociti-macrofagi all'interno di una singola co-coltura senza la necessità di staccare e riplaccare i macrofagi pre-differenziati. Questo sistema è facile da costruire e richiede solo pochi materiali e strumenti prontamente disponibili. Abbiamo testato la sua utilità analizzando le risposte dei componenti di co-coltura alla sepiapterina (SEP), il precursore endogeno di BH₄ (tetraidrobiopterina), un cofattore dell'ossido nitrico sintasi (NOS). Abbiamo dimostrato che il trattamento SEP di 3D Flipwell ha indotto la formazione di biofilm da parte dei batteri intestinali, la produzione di muco da parte dell'epitelio del colon e la polarizzazione pro-immunogenica dei macrofagi. Ciò ha indicato che il SEP ha innescato l'attivazione di un meccanismo di difesa della mucosa attraverso il crosstalk tra diversi componenti cellulari. Sono necessari ulteriori esperimenti per studiare il ruolo delle comunicazioni della mucosa che portano alla riprogrammazione delle cellule immunitarie e per valutare l'utilità di questo sistema di co-coltura per lo screening di nuove terapie immunomodulatorie.

Introduction

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Il crosstalk tra cellule immunitarie e microbioma intestinale influenza notevolmente l'efficacia di diversi trattamenti per le malattie. Tale crosstalk è marcatamente modificato da stimoli esterni, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, anomalie metaboliche dell'ospite, cambiamenti nella dieta, manifestazione della malattia e trattamento farmacologico. Questi cambiamenti potrebbero portare a uno squilibrio nella composizione della microflora, una condizione chiamata disbiosi ^1,2,3.

Per comprendere megl....

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Protocol

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1. 3D Ingegneria Flipwell

Tutto il lavoro deve essere svolto all'interno di un armadio per colture cellulari. Posizionare tutte le forniture all'interno dell'armadio.
Aprire il coperchio della capsula di Petri e mettere da parte. Aprire la lama del bisturi dal suo involucro protettivo e posizionarla sul bordo del fondo della capsula di Petri. Garantire la sterilità.
ATTENZIONE: È necessario maneggiare con cura la lama del bisturi. Utilizzare guanti resistenti al taglio e rinforzati con fibre per proteggere le mani, se necessario.
Aprire la confezione protettiva sterile dell'inserto c....

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Results

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Per determinare la rilevanza biologica delle co-colture Flipwell di batteri intestinali, epiteli del colon e macrofagi, abbiamo trattato le co-colture con sepiapterina (SEP), un modulatore del metabolismo dell'arginina, per promuovere la produzione di ossido nitrico ^9,10,11 rispetto al DMSO di controllo. Abbiamo determinato gli effetti del trattamento SEP su ciascun componente delle co-colture u.......

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Discussion

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Per ricreare l'architettura della mucosa intestinale in vitro, abbiamo progettato un semplice sistema di co-coltura che comprende strati stratificati di batteri intestinali, cellule epiteliali del colon che producono muco e macrofagi. Questo sistema multi-co-coltura ci ha permesso di studiare gli effetti del crosstalk tra il secretoma batterico, gli epiteli intestinali e i macrofagi sull'induzione della riprogrammazione immunogenica e sui meccanismi di difesa della mucosa.

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse. Gli autori declinano tutte le garanzie, espresse o implicite, nella misura massima consentita dalla legge. In nessun caso gli autori saranno ritenuti responsabili, sia ai sensi di qualsiasi statuto, contratto, illecito o qualsiasi altra teoria legale, per eventuali danni speciali, incidentali, indiretti, punitivi, multipli o consequenziali derivanti da o correlati all'uso di strumenti nella costruzione dei Flipwell, all'uso di reagenti BSL, linee cellulari, colture batteriche, all'uso del sistema Flipwell in ambiente anaerobico in una camera anaerobica. Questa limitazione di responsabilità include, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, qualsiasi modalità non specificata di utilizzo di Flipwell non esplicitamente descritta nel presente documento.

Acknowledgements

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L'autore principale esprime sincera gratitudine alla dott.ssa Saori Furuta per le sue eccellenti capacità di mentoring, la guida e il supporto continui su lunghe distanze e la progettazione abile e continua dei progetti che favoriscono fantastiche opportunità di apprendimento. Gli autori ringraziano anche la Dott.ssa Vandana Sharma per l'esperienza e la guida in microbiologia e la Dott.ssa Veani R. Fernando per la preparazione dei macrofagi THP-1. Inoltre, gli autori ringraziano i dottori Andrew Kleinhenz e William T. Gunning presso la Electron Microscopy Facility, e Cassandra Zamora e Kristin Kirschbaum presso l'Instrumentation Cent....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
0,4% PFA (vedi ricetta in Reagents and Solutions)	descritto nel testo
Pipetta sierologica da 10 ml	Corning	4488
Placca TC da 12 pozzi, Costar	Corning	3513
Tubi conici da 15 ml, SpectraTube	Alkali Scientific	C2715
200 & micro; l consigli	USA Scientific	1111-1700
Inserti a 24 pozzi - Inserti in coltura per piastre a 24 pozzi, PET 0.4 e micro; m	BrandTech Scientific	782710
Flipwells 3D preconfezionati, sterilizzati UV	Laboratorio Make in
4% PFA (vedi ricetta in Reagents and Solutions)	descritto nel testo
Scorta di Sepiapterin da 50 mM (SEP, vedi la ricetta in Reagents and Solution)	Carriera Henan Chemical Co	CAS#: 17094-01-8
Tubi conici da 50 ml	Greiner Bio-One	227261
Pipetta sierologica da 5 ml	Corning	4487
70-95% etanolo (alcol etilico)	Decon Labs	04-355-151
Alluminio	Fisher Scientific	01-213-100
Aghi per l'alimentazione animale, calibro 20 1.5" lunghezza, uso singolo	Fisher Scientific	01-208-87
Buffer di diluizione degli anticorpi (vedi ricetta in Reagents and Solutions)	descritto nel testo
Camera Cellulare di Attofluor	ThermoFisher Scientific	A7816
Nastro autoclave	Fisher Scientific	15-901-111
Ceppi di Bacillus subtilis wt (3A1T) nello stock di glicerolo ()	Centro di Stocco Genetico Bacillus (https:// bgsc. org/
Guanti BioGrip Pink Nitrile senza polvere senza lattice	Produzione di alta qualità	P2810
Buffer bloccante (vedi ricetta in Reagents and Solutions - 10% Siero normale di capra in PBS)	descritto nel testo
Buffer bloccante (vedi ricetta in Reagents and Solutions)	descritto nel testo
Microscopio a campo chiaro (Nikon o equivalente) Eclipse Ts2	Nikon	TS2
Celle Caco-2	ATCC	HTB-37
Incubatore di colture cellulari, 37° C, 5% CO2 (Eppendorf CellXpert)	Eppendorf	6734010015
Centrifuga (Eppendorf, centrifuga 5804/5804 R o equivalente	Eppendorf	22622501
Tubi centrifughe da 50 ml SpectraTube	Alkali Scientific	C2750
Inserti di coltura per piastre a 12 pozzi, PET, 0,4 & micro; m, sterile	BrandTech Scientific, BRAND Insert 2in1, BIO-CERT	782730
Mezzo di montaggio DAPI VectaShield	Laboratori Vector	H-1000
Fondali profondi in piastra di Petri, piastra di Petri impilabile in polistirene profondo 100 x 25 mm, sterile e nbsp;	USA Scientific	8609-0625
XP di aiuto per pipette di Drummond	Drummond	4-000-101
Centrifuga Eppendorf 5804 con rotore a secchio oscillante per tubi conici da 50 ml	Eppendorf	22622501
Pinzep, acciaio inossidabile, autoclave sterile, 2 set	VWR	82027-438
Pinzep, acciaio inossidabile, autoclave sterile, 2 set, pinza per campioni	VWR	82027-438
Fiaschetta di vetro 500 ml	Corning	4980-500
Ematocitometro (Neubauer con scappi di copertura)	Thermo Fisher Scientific	50-312-90
Celle HT-29-MTX-E12	Millipore Sigma	12040401
ImmunoPen (opzionale)	Fisher Scientific	4021761EA
Guanti a base di Kevlar o altri guanti resistenti ai tagli (opzionale)	Ferramenta o Amazon
Nastro da laboratorio o nastro da spedizione	Fisher Scientific	159015R
Cappa a flusso laminare Serie 1300 A2 BSC Classe II	ThermoFisher Scientific	1375
Cappa a flusso laminare con luce UV SterilGARD	La Baker Company	SG403A-HE
Marcatori a prova di solventi	VWR	52877-310 o 95042-566
Mezzi per cellule Caco-2 (DMEM ad alto livello di glucosio, vedi ricetta in Reagents and Solutions)	descritto in Testo
Mezzi per cellule HT-29 (DMEM High Glucosio, vedi la ricetta in Reagents and Solutions)	descritto nel testo
Mezzi per celle THP-1 (RPMI, vedi ricetta in Reagents and Solutions)	descritto nel testo
Tubo microcentrifuga, 1,7 ml, sterile e nbsp;	Alkali Scientific	C3017-ST
Tubi microcentrifughe	Thermo Fisher	3451
Substrati Miller LB (vedi ricetta in Reagents and Solutions)	Sigma-Aldrich	L3522
Pinze a becco fine, 2 serie	Ferramenta o Amazon
Guanti Aurelia Amazing senza polvere di nitrile senza lattice	MidSci	92885
Coperchi per piastre di Petri, sterili Falcon Petri Dish stile 100x15 mm	Corning Inc	351029
Phorbol myristate acetato (PMA) (100 ng/μ l, vedi la ricetta in Reagents and Solutions) e nbsp;	InvivoGen	Tlrl-pma
Punte per pipette (10 & micro; L, 200 & micro; 1000 & micro; l) PurePoint o equivalente	Alkali Scientific	ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS
Pellicola trasparente	Supermercato
Soluzione di collagenasi lavorativa Purecol (100 & micro; g/mL)	Advanced BioMatrix	5005-100ML
Slip di copertura rotonda #1 1 oz (Corning Float Glass o Fisherbrand)	Corning o Fisherbrand	50143822 o 12-546-2 25CIR-2
Bisturi, sterili, usa e getta...	Mopec o Feather #10	AJ136 o 2975#10
Sepiapterina (settembre, 100 & micro; M, vedi la ricetta in Reagents and Solution)	Carriera Henan Chemical Co	CAS#: 17094-01-8
Incubatore a scuotimento impostato per 220 giri/min 37° C	Eppendorf New Brunswick Scientifico	M12990080
Adesivo in silicone Loctite Silicone trasparente IDH o 3M Marine Grade Silicone Garden con punta al naso	Loctite o 3M	1745658 o PN08019
Pipetta a canale singolo Eppendorf Research Plus, 200 & micro; l	Eppendorf
Pipette a canale singolo (10 & micro; L, 200 & micro; 1000 & micro; l)	Eppendorf	2231001122
Spettrofotometro NanoDropOneC	Thermo Fisher Scientific	13-400-519
Acqua deionizzata sterile
Serina tamponata con fosfato sterile (PBS) senza calcio né magnesio	Fisher Scientific	BSS-PBS-1X6
Siringa 3 ml o 5 ml con punta Luer-Lok	BD	309585 o 309603
Celle THP-1	ATCC	TIB-202
Pipette da trasferimento, sterili	Fisherbrand	13-711-20
Triton X-100	Millipore Sigma	X100
Soluzione blu di tripano	VWR	97063-702
Tripsina-EDTA 0,25%	Thermo Fisher Scientific	25200-056
Cancella Kimwipes Professional con Poliureshield Anti-Stato LintGuard	Kimberly-Clark	34120
Anticorpi primari:
Anti-umano CD163	Abcam	156769
Anti-umano CD68	Novus Biologicals	NB100-683-0,1 mg
Anti-umano CD80, E3Q9V	Tecnologie di segnalazione cellulare	15416
Anti-umani CK20	Life Technologies	PA5-82875
MUC2 anti-umano (996/1)	ThermoFisher	MA5-12345
Anticorpi secondari:
Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit IgG (per CD80 e CK20)	ThermoFisher	A11008
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (per MUC2 e CD68 o CD163)	ThermoFisher	A11005
Reagenti e Soluzioni:
Caco-2 Medio:
DMEM con glucosio alto (4,5g/L) e 1% (v:v) di GlutaMax	Thermo Fisher Scientific	35050061
FBS 10% (v:v) inattivato dal calore	Sigma	F2242-500ML
Amminoacidi non essenziali all'1% per il substrato Caco-2	Thermo Fisher Scientific	11140076
Streptococco della penna 1% (v:v)	Sigma	F2242-500ML
HT-29-MTX Medio
DMEM con glucosio alto (4,5g/L) e 1% (v:v) di GlutaMax	Thermo Fisher Scientific	35050061
FBS 10% (v:v) inattivato dal calore	Sigma	F2242-500ML
HEPES (concentrazione finale di 10 mM)	Thermo Fisher Scientific	15630080
Streptococco della penna 1% (v:v)	Sigma	F2242-500ML
THP-1 Medio:
FBS (10% v:v) siero fetale inattivato al calore	Sigma	F2242-500ML
Glucosio (concentrazione finale di 4,5 g/L)	Thermo Fisher Scientific	A249001
GlutaMax 1% (v:v) Concentrazione finale di 2 mM	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES (concentrazione finale di 10 mM)	Thermo Fisher Scientific	15630080
Streptococco della penna 1% (v:v)	Sigma	F2242-500ML
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 media	Thermo Fisher Scientific	11875119
Piruvato di sodio (1 mM di concentrazione finale)	Thermo Fisher Scientific	11360070
Purecol (diluizione a 1:30 100 & micro; g/ml):
Purecol 3 mg/ml 1:30 a 100 & micro; g/ml	Advanced BioMatrix	5005-100ML
Acqua sterile deionizzata
L-Sepiapterin forte (50 mM):
L-Sepiapterina (SEP)	Carriera Henan Chemical Co	CAS#: 17094-01-8
5 mg/mL)	InvivoGen	Tlrl-pma
BSA 1% albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	5470
DMSO	Sigma	D2650
Miller LB	Sigma-Aldrich	L3522
Siero normale della stessa specie dell'anticorpo secondario	Sigma	NS02L-1ML
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	441244

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
Xuan, C., et al.

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