Articolo metodologico

Miglioramento dell'editing del genoma tramite la somministrazione di acidi nucleici oviduttali Tecnica di elettroporazione in vivo basata sulla somministrazione per la generazione di topi knockout

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DOI:

10.3791/68704

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26 agosto 2025

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1Center of Transgenesis and Genome Editing, St. Petersburg State University, 2Resource Center Molecular and Cell Technologies, St. Petersburg State University, 3Amyloid Biology Laboratory, St. Petersburg State University, 4DNA-Nanosensoric laboratory, ITMO University, 5Laboratory of Toxinology and Molecular Systematics, L.A. Orbeli Institute of Physiology, National Academy of Sciences of the Republic of Armenia

In questo articolo

Sommario

L'efficienza del metodo I-GONAD (Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery) è paragonabile alla microiniezione tradizionale, che richiede la raccolta di zigoti da femmine donatrici e il trasferimento a femmine pseudo-gravide. Questo protocollo dimostra la sua efficacia introducendo mutazioni indotte da CRISPR/Cas9 nel locus ROSA26 sul cromosoma 6.

Abstract

I metodi per la creazione di topi knockout in genere prevedono tre passaggi principali: (1) raccolta di embrioni da femmine donatrici, (2) microiniezione di costrutti genetici negli zigoti ex vivo e (3) trasferimento chirurgico nell'ovidotto di femmine pseudo-gravide. Questo processo richiede un numero significativo di animali, in quanto coinvolge non solo femmine donatrici ma anche maschi vasectomizzati e femmine pseudo-gravide. Inoltre, le microiniezioni nel citoplasma o nel pronucleo degli zigoti di topo presentano sfide come l'intasamento dell'ago, problemi di permeabilità della membrana dovuti all'elevata elasticità e potenziale morte dell'embrione. Lo sviluppo di elettroporatori avanzati, come il Nepa21, offre un'opportunità unica per generare topi con knockout genici mirati in un unico passaggio attraverso un metodo noto come Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery (I-GONAD). Questa tecnica prevede la microiniezione di componenti CRISPR-Cas (proteina Cas9 e RNA guida) negli ovidotti di femmine gravide a 0,7 giorni dopo il concepimento, seguita da elettroporazione in vivo per fornire questi componenti direttamente negli zigoti. Dopo la procedura I-GONAD, la topolina incinta porta e dà alla luce cuccioli con il knockout genico mirato. Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato e passo dopo passo per l'implementazione del metodo I-GONAD nei topi, offrendo un'alternativa più efficiente e accessibile alle tradizionali tecniche di generazione di topi knockout.

Introduzione

Comprendere le basi genetiche delle malattie è fondamentale per identificare i meccanismi molecolari alla base della loro eziologia e patogenesi. Un passo fondamentale in questa ricerca è lo sviluppo di modelli animali con knockout genici mirati che simulano malattie umane. I topi sono particolarmente preziosi per questi studi a causa della loro somiglianza genomica generale con gli esseri umani, delle piccole dimensioni, della breve durata della vita e dell'elevata fertilità. I modelli murini sono importanti sia per la ricerca di base che per i test preclinici1.

Per creare un topo knockout utilizzando il sistema CRISPR-Cas9, i ricercatori in genere iniettano un complesso di RNA guida e nucleasi Cas9 in uno zigote, causando una rottura a doppio filamento nel DNA bersaglio e quindi attivando il sistema di riparazione della cellula per causare una mutazione nel sito della rottura 1,2. La microiniezione negli zigoti rimane il gold standard per questo scopo. Tuttavia, questo metodo richiede diversi passaggi: l'isolamento degli embrioni dalle femmine donatrici, l'esecuzione di microiniezioni di costrutti genetici negli zigoti e il loro trasferimento chirurgico negli ovidotti delle femmine pseudo-gravide. Di conseguenza, è necessario mantenere un gran numero di animali, comprese le femmine donatrici, i maschi vasectomizzati e le femmine pseudo-gravide. Inoltre, l'isolamento degli zigoti richiede l'eutanasia delle femmine donatrici. Pertanto, sono preferibili protocolli che minimizzino l'uso di animali, in linea con i principi delle 3R (Replacement, Reduction, Refinement)3.

I progressi nella tecnologia dell'elettroporazione, come l'uso del sistema Nepa21, offrono un'opportunità unica per generare topi knockout genici mirati in un unico passaggio utilizzando una tecnica nota come editing del genoma migliorato tramite somministrazione di acidi nucleici oviduttali (I-GONAD)4. Il Super Electroporator NEPA21 Type II impiega un sistema di elettroporazione multi-impulso a 4 fasi, che garantisce un'elevata efficienza di elettroporazione pur mantenendo un'elevata vitalità dell'embrione. I-GONAD prevede la microiniezione di componenti CRISPR-Cas (proteina Cas9 (500-600 ng/μl) e RNA guida (80-100 ng/μl)) negli ovidotti di topi gravidi 0,7 giorni dopo il concepimento, seguita da elettroporazione in vivo per fornire questi componenti direttamente negli zigoti5. Dopo la procedura I-GONAD, la topolina incinta dà alla luce cuccioli con il knockout genico mirato 6,7,8. L'efficacia di questo metodo varia a seconda del target desiderato, ma è paragonabile alle tecniche standard basate sulla microiniezione (circa il 50%)9,10. Inoltre, I-GONAD potrebbe potenzialmente essere adattato per l'editing del genoma in altre specie.

Questo articolo presenta un protocollo passo-passo per l'implementazione del metodo I-GONAD per generare topi knockout. Ad esempio, la sua efficacia è stata dimostrata prendendo di mira il locus del genoma ROSA26 sul cromosoma 6 del topo. Questo locus è stato scelto poiché subisce una trascrizione costitutiva senza successiva traduzione. Pertanto, è improbabile che l'introduzione di una mutazione in questo locus abbia un effetto negativo sulla salute dei cuccioli risultanti.

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Protocollo

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato etico per la ricerca animale dell'Università statale di San Pietroburgo (approvazione n. 131-03-5, 11 ottobre 2022). Tutte le procedure hanno rispettato rigorosamente le linee guida delineate nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. I comuni topi CD1 di ceppo outbred di laboratorio sono stati ottenuti dal Centro di Uso Collettivo dell'Istituto di Composti Fisiologicamente Attivi dell'Accademia Russa delle Scienze (IPAC RAS). Topi CD1 femmina di età compresa tra 2 e 3 mesi (peso medio 27-30 g) sono stati utilizzati per l'accoppiamento con topi CD1 maschi di età compresa tra 2,5 e 4 mesi (peso medio 35-37 g). I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Progettazione di RNA a guida singola (sgRNA) e sua preparazione per la trasfezione

  1. Utilizza strumenti di analisi computazionale come CHOPCHOP, SYNTHEGO Knockout Guide Design o CRISPOR per identificare potenziali sequenze di sgRNA mirate al gene selezionato di interesse.
    NOTA: Il software è in grado di identificare potenziali sequenze di sgRNA in tutto il gene e suggerisce più varianti all'output. Questi strumenti suggeriranno le opzioni di sgRNA più ottimali e consentiranno all'utente di scegliere tra tutte le varianti identificate, se necessario. Quando si effettua una selezione, considerare i seguenti criteri:
    1. Prossimità dell'esone: scegli sequenze situate negli esoni che siano il più vicino possibile al punto di mutazione desiderato. Per ottenere risultati migliori, considerare le isoforme di splicing alternative e selezionare la sequenza target presente nella maggior parte delle isoforme. Prendere in considerazione i browser del genoma (ad esempio, Ensembl) per una selezione accurata dell'esone.
    2. Considerazioni fuori bersaglio: analizza i potenziali effetti fuori bersaglio utilizzando il sistema di punteggio dello strumento, selezionando le sequenze che mostrano l'attività fuori bersaglio prevista più bassa.
      NOTA: Strumenti computazionali come CHOPCHOP o Synthego sono molto efficaci per valutare la prossimità dell'esone e gli effetti fuori bersaglio, aiutando a identificare sequenze di sgRNA ottimali per un editing preciso del genoma. Quando si progettano gli RNA guida, è importante considerare la sequenza specifica del gene di interesse nel ceppo di topo utilizzato. Per alcuni ceppi di topo (ad esempio, C57Bl, CBA, C3H), è disponibile la sequenza genomica completa. Se tali dati non sono disponibili, può essere consigliabile eseguire il sequenziamento preliminare del gene bersaglio nella regione di editing pianificata. Singole discrepanze nell'RNA guida, causate da polimorfismi, possono compromettere l'efficienza dell'editing. Il locus del genoma del topo ROSA 26 è stato preso di mira con la sequenza sgRNA: 5'-ACTCCAGTCTTTCTAGAAGA-3'.
  2. Ordinare un set di primer per l'amplificazione PCR con stampo di sgRNA come descritto nella Tabella 1.
    NOTA: il gRNA può essere ordinato altrove, sia come sgRNA che come crRNA:tracrRNA duplex.
  3. Produrre un modello di dsDNA lineare.
    1. Preparare il master mix come indicato nella Tabella 1. Aggiungere la polimerasi alla fine e mantenere la miscela master sul ghiaccio per mantenere la stabilità.
    2. Eseguire la PCR nelle seguenti condizioni: Denaturazione iniziale: 30 s a 95 °C; 30 cicli di: 20 s a 95 °C (denaturazione), 20 s a 55 °C (ricottura), 15 s a 72 °C (estensione); Allungamento finale: 2 min a 72 °C; Mantenere a 4 °C.
  4. Utilizzare la miscela di reazione PCR in un'ulteriore reazione di trascrizione in vitro (IVT).
    1. Preparare la master mix IVT come indicato nella Tabella 2 e incubare per 1,5 ore a 37 °C. Utilizzare un termociclatore per un controllo costante della temperatura.
    2. Aggiungere 2 μL di DNasi I e incubare per altri 30 minuti a 37 °C per rimuovere il modello di DNA.
    3. Inattivare la DNasi I incubando la miscela di reazione a 75 °C per 5 minuti.
    4. Purificare l'RNA utilizzando il reagente TRIZOL secondo il protocollo del produttore.
      NOTA: Lo smaltimento del reagente TRIZOL e della DNAse1, delle sue soluzioni o di qualsiasi sottoprodotto deve essere collocato in appositi contenitori per rifiuti chimici.
    5. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro (la resa tipica di una reazione è di 3-5 μg). Controllare i rapporti A260/A280 e A260/A230. A260/A280 deve essere almeno 2,0 e anche il rapporto A260/A230 deve essere almeno 2,0 (il che significa che non vi è contaminazione da proteine o solventi organici). Conservare gli sgRNA a -80 °C fino al momento dell'uso.
  5. Preparare la miscela RNP per la trasfezione
    1. La miscela di trasfezione è costituita da un complesso RNP, che è una miscela della proteina Cas9 e dell'sgRNA. Segui questi passaggi per preparare la miscela RNP:
    2. Diluire 1 M di tampone Tris-HCl (pH 7,5) a 100 mM utilizzando acqua priva di nucleasi e filtrare utilizzando un filtro per siringa con pori di 0,022 μM, aliquotare in porzioni da 10 μL e conservare a 4 °C fino al momento dell'uso.
    3. In una provetta priva di nucleasi, preparare la miscela di trasfezione dei seguenti componenti nelle concentrazioni finali: 500 ng/μL di nucleasi spCas9, 80 ng/μL di sgRNA, 10 mM di Tris-HCl diluito con acqua trattata con DEPC.
      NOTA: Per garantire la corretta efficienza del protocollo, sono necessarie alte concentrazioni dei componenti della miscela RNP.
    4. Incubare la miscela di trasfezione a 37 °C per 10 minuti per consentire la formazione del complesso RNP.
    5. Aliquotare la miscela in piccoli volumi (2 μL) adatti per una singola sessione I-GONAD.
    6. Mantenere le aliquote a 4 °C durante la sessione I-GONAD. La miscela viene preparata fresca per ogni sessione di elettroporazione I-GONAD per mantenerne la stabilità.
      NOTA: La miscela RNP deve essere preparata fresca per ogni sessione I-GONAD per garantire un'attività e un'efficienza ottimali.

2. Preparazione di topi femmina per l'editing del genoma tramite rilascio di acido nucleico oviduttale

  1. Accoppiamento e selezione di topi femmine: accoppiare topi femmine CD1 con topi maschi CD1 alloggiati singolarmente durante la notte. Al mattino, verificare la presenza di tappi di copulazione nei topi femmine. Seleziona le femmine con tappi di copulazione e trasferiscile in una nuova gabbia per ulteriori procedure.
    NOTA: Per ridurre al minimo il mosaicismo genetico, il momento ottimale per la consegna del costrutto genetico è di 0,7 giorni dopo l'accoppiamento allo stadio10 di singola cellula (zigote). Ciò corrisponde approssimativamente alle 16:00 del giorno in cui è stato rilevato il tappo di copulazione. In questa fase, la dissezione dell'ovidotto rivela che gli zigoti hanno meno cellule cumulistiche, sebbene rimangano nell'ampolla. In particolare, le cellule del cumulo possono anche assorbire acidi nucleici esogeni o proteine durante l'elettroporazione. Se la procedura viene eseguita prima, ad esempio a 10 ore dopo l'accoppiamento, le cellule del cumulo circondano ancora strettamente gli zigoti, il che può ostacolare un'efficiente somministrazione elettroforetica di acidi nucleici negli zigoti. Non utilizzare i topi stimolati ormonalmente, poiché potrebbero dare un numero eccessivo di ovociti e questo potrebbe portare ad aborto spontaneo.
  2. Preparazione degli strumenti chirurgici: Autoclavare tutti gli strumenti chirurgici in acciaio inossidabile per garantire la sterilità.
  3. Anestesia e preparazione dei topi: pesare le femmine di topo selezionate e anestetizzarle tramite iniezione intraperitoneale utilizzando una miscela di ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) (seguendo protocolli istituzionalmente approvati).
    1. Monitorare i topi per la perdita del riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi per confermare un'anestesia adeguata. Posizionare il mouse anestetizzato su un termoforo per mantenere la temperatura corporea durante la procedura. Proteggi gli occhi del topo dalla secchezza durante l'anestesia applicando un unguento veterinario.

3. Procedura chirurgica

  1. Disinfettare la zona dorsale (posteriore) del topo utilizzando etanolo al 70%.
  2. Praticare un'incisione cutanea longitudinale di 0,7 cm nella regione lombare.
  3. Pulire il sito dell'incisione con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70% e rimuovere i peli intorno all'incisione.
  4. Estendere l'incisione a 1,3 cm spingendo lateralmente con le punte delle forbici leggermente aperte.
  5. Praticare con cura una piccola incisione (0,7 cm) nel peritoneo per accedere alla cavità addominale.
  6. Estendere l'incisione a 1,1 cm spingendo lateralmente con le punte delle forbici leggermente aperte.
  7. Individua il cuscinetto adiposo attaccato all'ovaio ed estrailo delicatamente usando una pinza fino a quando l'ovaio, l'ovidotto e l'utero sono chiaramente visibili.
  8. Fissare il cuscinetto adiposo in posizione utilizzando un morsetto per vasi.
  9. Visualizzare l'ovidotto al microscopio stereoscopico per una manipolazione precisa (Figura 1).
  10. Caricare 2 μl della miscela di iniezione in un capillare di plastica utilizzando un pipettatore stripper.
    NOTA: Il pipettatore Stripper con capillari in plastica, originariamente progettato per le manipolazioni con embrioni nelle cliniche di fecondazione in vitro, può supportare molteplici applicazioni, tra cui il trasferimento di embrioni e la consegna di costrutti CRISPR/Cas9 nelle procedure I-GONAD. Il pipettatore funziona come un dosatore di liquidi di precisione; In combinazione con capillari flessibili monouso, consente la sterilità e previene la contaminazione incrociata. I capillari in plastica sono preferibili al vetro per iniettare la miscela di RNP per la trasfezione nell'ovidotto, poiché sono meno traumatici per i tessuti delicati. A differenza dei capillari in vetro, quelli in plastica monouso non richiedono la lucidatura a fiamma per levigare gli spigoli vivi prima dell'inserimento, riducendo i tempi di preparazione e il rischio di danni.
  11. Con l'aiuto di microforbici, praticare una piccola incisione (0,2 cm) nella parete dell'ovidotto pochi millimetri a monte dell'ampolla.
  12. Inserire con cautela il pipettatore Stripper con capillare di plastica nell'incisione ed espellere la miscela per iniezione nell'ovidotto.
    NOTA: Assicurarsi che l'aria non entri nell'ovidotto, poiché ciò potrebbe influire sull'efficienza dell'elettroporazione.
    Per evitare ciò, riempire il capillare di plastica per iniezione con più miscela per iniezione del necessario ed evitare l'iniezione completa. I capillari in plastica sono adatti sia per il trasferimento dell'infundibolo che per la dissezione diretta della parete dell'ovidotto tra l'infundibolo e l'ampolla. Il metodo di dissezione diretta della parete dell'ovidotto potrebbe essere meno traumatico del trasferimento dell'infundibolo, poiché quest'ultimo richiede un'incisione iniziale attraverso la sottile membrana della borsa che copre l'ovidotto e l'infundibolo. Nei topi CD1, questa membrana è altamente vascolarizzata e tagliarla può causare sanguinamento minore, che può ostruire la visibilità e complicare la microiniezione della miscela di RNP.
  13. Rimuovere delicatamente il capillare di plastica dall'ovidotto.

4. Elettroporazione e sutura

  1. Accendere l'elettroporatore premendo l'interruttore sul pannello frontale.
  2. Impostare i parametri di elettroporazione: Impulso poroso: Tensione: 50 V, Lunghezza dell'impulso: 5 m, Intervallo di impulso: 50 ms, Numero di impulsi: 3, Velocità di decadimento - 10%, Polarità: +/-; Impulso di trasferimento: Tensione: 10 V, Lunghezza dell'impulso: 50 ms, Intervallo dell'impulso: 50 ms, Numero di impulsi: 3, Velocità di decadimento - 40%, Polarità: +/-; Limite di corrente: in vivo.
  3. Utilizzando gli elettrodi a pinzetta, afferrare con cautela l'ovidotto e controllare il valore della resistenza premendo il pulsante kΩ sull'elettroporatore. Assicurarsi che gli elettrodi siano sufficientemente compressi in modo che la resistenza rimanga nell'intervallo ottimale di 350-400 Ω.
    NOTA: Ciò può essere ottenuto regolando la distanza tra i due elettrodi quando l'ovidotto intatto è inserito tra di loro.
    1. Subito dopo aver misurato la resistenza, premere il pulsante Start per avviare l'elettroporazione. Questo passaggio è fondamentale per garantire una somministrazione efficiente dei componenti CRISPR-Cas negli zigoti4. Attendere che il pulsante Ω visualizzi un segnale di "fine". Annotare i valori mostrati nel riquadro Misure.
      NOTA: Il valore dell'impedenza deve essere di circa 250-400 Ω/150-250 mA del valore della tensione per garantire un equilibrio ottimale tra vitalità ed efficienza di trasferimento. Per mantenere questo equilibrio, evitare la copertura delle regioni dell'ovidotto con un pezzo di carta bagnata imbevuto di soluzione salina tamponata con fosfato modificato di Dulbecco (DPBS), raccomandato in alcuni protocolli, poiché questo passaggio può ridurre significativamente la resistenza oltre l'intervallo ottimale. La diminuzione della resistenza può aumentare la tensione a più di 250 mA, portando alla morte delle celle.
  4. Dopo aver completato l'elettroporazione su un ovidotto, riposizionare con cura il tratto riproduttivo nella cavità addominale. Sutura l'incisione utilizzando sutura chirurgica all'acido poliglicolico 4-0.
  5. Ripetere l'operazione e l'elettroporazione sul secondo ovidotto. Una volta completato, riportare il tratto riproduttivo nella cavità addominale e suturare l'incisione come descritto sopra.
  6. Monitoraggio post-procedura: posizionare il mouse in una gabbia calda (37 °C) e pulita per il recupero e monitorare fino a quando non si riprende completamente dall'anestesia.
    NOTA: Dopo l'intervento, alloggiare i topi in gabbie contenenti due topi per gabbia. Se solo un topo è stato sottoposto a un intervento chirurgico, forniscigli un topo femmina da compagnia. Questa pratica aiuta a ridurre lo stress inutile per il topo chirurgico e promuove un ambiente sociale più naturale.

5. Genotipizzazione

  1. Design del primer
    1. Per la genotipizzazione, progettare primer per amplificare un prodotto PCR di lunghezza compresa tra 300 e 600 bp. I primer devono essere lunghi 18-21 nucleotidi con una temperatura di fusione (Tm) di circa 60 °C.
    2. Evitare sequenze che formano strutture secondarie o dimeri di primer. Utilizza strumenti software come PerlPrimer 1.1.2111, In-Silico PCR V39x1 o simili per garantire la qualità del primer.
    3. Eseguire una ricerca BLAST nel database del genoma del topo per confermare la specificità del primer ed evitare l'amplificazione non specifica11.
      NOTA: I seguenti primer sono stati progettati per la genotipizzazione della sequenza target: Primer in avanti: 5'-CTCTCCCAAAGTCGCTCTGA-3'; Primer inverso: - 5'-TCTGTGGGAAGTCTTCCC-3', lunghezza prevista del prodotto PCR: 320 bp e Tm 62°C. Per il sequenziamento Sanger, progettare un primer di sequenziamento che ricotti a 150-200 bp di distanza dal sito di taglio Cas9.
  2. Eseguire l'estrazione del DNA. Per l'estrazione rapida del DNA, il protocollo di isolamento Hotshot12 è il più semplice.
    1. Usando un punzone per l'orecchio, raccogliere un piccolo frammento di tessuto (circa 2 mm) dall'orecchio del topo.
    2. Aggiungere 100 μL di tampone di lisi (25 mM NaOH, 0,2 mM EDTA, pH = 12).
    3. Incubare a 95 °C per 60 minuti, agitando la miscela ogni 20 minuti.
    4. Aggiungere 100 μl di tampone neutralizzante (40 mM Tris-HCl, pH = 5) e agitare accuratamente.
    5. Utilizzare 1-5 μl della preparazione finale per la PCR.
  3. Amplificazione e sequenziamento della PCR. Preparare la miscela master PCR come descritto nella Tabella 3. Utilizzare una DNA polimerasi di correzione di bozze per garantire un'alta fedeltà. Aliquotare la miscela master nel numero richiesto di provette e aggiungere il DNA genomico.
    NOTA: Includere sempre un campione di DNA wild-type come controllo per l'analisi di sequenziamento.
  4. Eseguire la PCR per la genotipizzazione di ROSA26 . Sono state utilizzate le seguenti condizioni: Denaturazione iniziale: 30 s a 95 °C; 28 cicli di: 20 s a 95 °C (denaturazione), 20 s a 62 °C (ricottura), 20 s a 72 °C (estensione); Allungamento finale: 2 min a 72 °C; Mantenere a 4 °C.
    NOTA: Il protocollo fornito è accurato per l'amplificazione del frammento di locus ROSA26 (dimensione stimata 320 bp) utilizzando i primer del passaggio 1.1.2. Per un'amplificazione più specifica e accurata, limitare il numero di cicli di amplificazione a 28-30.
  5. Sequenziamento e analisi
    1. Eseguire il sequenziamento Sanger dei frammenti di PCR ottenuti (passaggio 5.4).
    2. Analisi dei risultati del sequenziamento
      NOTA: Il successo della trasfezione si tradurrà in animali a mosaico, identificabili dall'emergere di ulteriori sequenze di DNA vicino al sito di taglio della nucleasi nel cromatogramma di sequenziamento. Utilizza strumenti computazionali come EditCo ICE Analysis o TIDE13 per identificare e quantificare gli indels esatti nel genoma.
      1. Per utilizzare l'analisi ICE, è sufficiente caricare i file di sequenziamento Sanger ottenuti (file .ab1 di controllo per la sequenza di prodotti PCR su topo wt senza editing e file .ab1 per la sequenza di prodotti PCR su topo sperimentale), inserire la sequenza di RNA guida e selezionare la nucleasi utilizzata nell'esperimento CRISPR.
        NOTA: Lo strumento ICE Analysis calcolerà l'efficienza complessiva dell'editing e determinerà i profili e le abbondanze relative di tutti i diversi tipi di modifiche presenti nel campione.
      2. Per utilizzare TIDE, inserire la sequenza di RNA guida, caricare i file di sequenziamento Sanger ottenuti (file .ab1 di controllo per la sequenza di prodotti PCR del topo wt senza modifiche e file .ab1 dell'esperimento per la sequenza del prodotto PCR del topo sperimentale) e controllare i parametri (in alcuni casi, le impostazioni avanzate possono aiutare a trovare indels più grandi di 10 bp).

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Risultati

Se l'elettroporazione ha avuto successo, i topi sperimentali: (1) daranno alla luce una manciata di cuccioli e (2) alcuni animali avranno diversi indels nel genoma. Se i primer di genotipizzazione sono ben progettati e il programma PCR è ottimale, il prodotto PCR sarà presente sul gel di agarosio come una banda trasparente della dimensione desiderata. Se la nucleasi taglia con successo il DNA bersaglio, allora gli animali ottenuti saranno probabilmente a mosaico e avranno una serie di in...

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Discussione

L'efficienza della generazione di topi knockout utilizzando il metodo I-GONAD è paragonabile a quella delle tecniche di microiniezione tradizionali. Tuttavia, i metodi tradizionali prevedono l'isolamento di zigoti da femmine donatrici, l'esecuzione di microiniezioni e il trapianto di embrioni negli ovidotti di femmine pseudo-gravide. Al contrario, il metodo I-GONAD semplifica questo processo fornendo componenti di editing del genoma direttamente negli ovidotti delle femmine gravide, elim...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Gli autori sono grati al St Peterburg University Research Park, Center for Molecular and Cell Technologies. Il sequenziamento è stato eseguito utilizzando un analizzatore genetico ABI 3500 xL (Thermo Fisher Scientific, USA) presso il Resource Center of Molecular and Cell Technologies, Saint Petersburg State University Scientific Park. Gli autori sono grati a Maria Rubel per il suo aiuto nella redazione e nella presentazione dei documenti. Questa ricerca è stata finanziata dall'Università Statale di San Pietroburgo, il progetto di ricerca ID: 129658320, e Luibov Shkodenko è stato sostenuto dalla Fondazione Scientifica Russa (progetto 25-26-00247).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0.5– 5 uL pipette Thermo Scientific4642020
Tubo da 1,5 mLAptaca1003/G
100-1000 uL pipette  Thermo Scientific4642090
Tubo da 200 uLAssigenoPCR-02-C
20-200 uL pipetta  Thermo Scientific4642080
2-20 uL pipetta Thermo Scientific4642060
4x Colorante di Carico in GelBiolabmixD-3002
AgaroseAppliChemA8963,0500
DNasi I, senza RNasi (1 U/μ L)Thermo FisherEN0521
Set dNTP, soluzione da 100 mMThermo ScientificR0181
DreamTaq Green DNA Polimerasi (5 U/μ L)Thermo ScientificEP0713
Dulbecco' s soluzione salina tamponata fosfato modificataSigma AldrichD8537
Analisi ICE di EditCohttps://ice.editco.bio/#/consultato il 06.04.2025
Soluzione EDTA 0,5M, pH = 8AppliChemA4892.0500
Ensembl  https://www.ensembl.org/index.htmlconsultato il 09.06.2025
Bromuro di etidioBiolabmixEtBr-10
Gocce per gli occhi " Oftagel"URSAPHARM204604
Sistema di documentazione gel ChemiDoc XRS+Bio-Rad1708265
In-Silico PCR V39x1 https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr  consultato il 09.06.2025
Tecnologie Integrate del DNA & nbsp;https://eu.idtdna.comconsultato il 09.06.2025
Forbici microchirurgicheMedin URALM124
Elettroporatore NEPA21Nepa GeneNEPA21Con un elettrodo CUY652P2,5X4
NTP Set, soluzione da 100 mMThermo ScientificR0481
OligonucleotidiEvrogenPurificazione standard a ordine diretto e desalinizzazione
Opti-MEM I Medium Siero RidottoThermo Fisher31985070
PerlPrimerhttps://perlprimer.sourceforge.netVersione 1.1.21.
Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà (2 U/μ L)Thermo ScientificF530L
Punte da 10 uL per pipettaUlplastHT-10-960
Pipette 1000 uLUlplastHT-1000-576
Punte pipette da 200 uLUlplastHT-200-960
Alimentazione " Elf-4"Tecnologia del DNAPS-400 NUOVO
Acqua priva di RNAsi/DNAsiInvitrogen10977049
Soluzione salinaPanEcoP011n
Sistema di elettroforesi horisontale SE-1EliconSE-1
Idrossido di sodioSigma-AldrichS5881-500G
Scala del DNA Step100BiolabmixS-8100
Stereomicroscopio SMZ1000Nikon5-363376
Micropipetter sfilatoreCooperSurgicalMXL3-STR
Punte per spogliarellisteORIGIOMXL3-125
Ago chirurgico  KMIZ4A1- 0,6 e volte; 20
Pinze per sutureMedin URALM302.2
Pinze per sutureMedin URALM303
Filo di sutura POLYCON Nfigure-materials-10Tonzos 95234
Guida SYNTHEGO Knockout Design & nbsp;https://design.synthego.com/#/consultato il 09.06.2025
Amplificatore T100BioRad10014822
T7 RNA polimerasi  Thermo ScientificEP0111
Buffer TBE 10xBiolabmixTBE-500
Tide https://tide.nki.nl/consultato il 04.06.2025 
Tris cloruroSuzhou Yacoo ScienzaSYS-S0005-0.5
Soluzione di cloridrato di TrizmaSigma AldrichT2663
Reagente TrizolInvitrogen15596026
Proteina Cas9 TrueCutInvitrogenA36499
Forbici universaliMedin URALM147
XilazinaInterchemie Werken de AdelaarIX2
ZoletilLaboratorio Virbac2000443714739.00

Riferimenti

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CRISPR Cas9Complesso ribonucleoproteicoElettroporazione dello zigoteSequenziamento SangerDesign dell RNA guidaGenotipizzazione PCR

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