Articolo metodologico

Navigazione dei dati proteomici basati sulla spettrometria di massa utilizzando strumenti computazionali gratuiti

DOI:

10.3791/68707

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19 agosto 2025

 , 
1School of Life Sciences, Westlake University, 2Molemuse Biotech Studio

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I dati proteomici basati sulla spettrometria di massa sono disponibili in database aperti e accessibili utilizzando strumenti gratuiti. Data la complessità delle ricerche e delle descrizioni nei database, molti biologi non hanno le conoscenze per utilizzare questi set di dati. Qui, forniamo una guida sull'utilizzo di strumenti gratuiti per le ricerche di dati proteomici di base.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I dati proteomici basati sulla spettrometria di massa (MS), tra cui l'acquisizione dipendente dai dati (DDA) e l'acquisizione indipendente dai dati (DIA), sono ampiamente utilizzati nella ricerca biologica. Tuttavia, l'applicazione di questi set di dati negli studi di validazione è ancora limitata a causa della mancanza di dimostrazioni chiare su come cercare e analizzare efficacemente i dati proteomici. Per colmare questa lacuna, abbiamo selezionato un set di dati DDA e uno DIA depositati nel repository di dati PRoteomics IDEntifications Database (PRIDE) per illustrare meglio il flusso di lavoro dell'analisi dei dati proteomici e la post-elaborazione a valle dei risultati della ricerca proteica. A scopo dimostrativo, abbiamo utilizzato due strumenti computazionali gratuiti: FragPipe (v22.0) per i set di dati DDA e DIA-NN (2.1.0) per i set di dati DIA. Le fasi di post-elaborazione, come la generazione di grafici vulcanici ed elenchi di proteine disregolate, sono state dimostrate utilizzando il codice R. Questo studio fornisce protocolli di base per la ricerca e l'analisi dei dati proteomici, fungendo da guida essenziale per principianti per gestire efficacemente i set di dati proteomici. Attraverso questo lavoro, miriamo a fornire ai ricercatori le conoscenze necessarie per sfruttare i dati proteomici nelle loro indagini biologiche.

Introduzione

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Il campo della proteomica è stato rivoluzionato dall'adozione diffusa di archivi di dati ad accesso aperto e strumenti software gratuiti1, che sono stati determinanti per far progredire le capacità di ricerca e promuovere una cultura della condivisione dei dati. La creazione di risorse centralizzate, come PRIDE2, e lo sviluppo di formati di dati standardizzati da parte della Human Proteome Organization (HUPO) Proteomics Standards Initiative (PSI)3 hanno creato un'opportunità senza precedenti per il riutilizzo e l'integrazione dei dati. Tuttavia, l'analisi e l'interpretazione dei dati proteomici presentano ancora notevoli barriere tecniche, in particolare per i biologi e i medici scienziati che desiderano eseguire la convalida ortogonale dei propri risultati sperimentali4. Questo manoscritto affronta direttamente questa sfida presentando un flusso di lavoro computazionale indipendente dal fornitore per fornire un quadro accessibile ai ricercatori per interrogare, analizzare e integrare in modo indipendente i dati di proteomica pubblica con i propri risultati, facilitando così una solida convalida ortogonale senza la necessità di ulteriori esperimenti di laboratorio umido. Questo lavoro è particolarmente appropriato per i ricercatori che cercano di convalidare ortogonalmente l'espressione differenziale di proteine specifiche identificate nei loro esperimenti e generare nuove ipotesi esplorando i modelli di espressione delle loro proteine di interesse in un'ampia gamma di studi pubblicati. Fornendo una guida passo dopo passo, miriamo a consentire a una gamma più ampia di scienziati di sfruttare appieno il potenziale dei dati di proteomica pubblica, migliorando in ultima analisi la robustezza e l'impatto della loro ricerca.

Nella proteomica basata sulla spettrometria di massa (MS), le scansioni MS1 e MS2 sono fondamentali per l'acquisizione dei dati. Le scansioni MS1, o scansioni di indagine, rilevano e misurano i rapporti massa/carica (m/z) di tutti gli ioni in un campione, fornendo una panoramica completa della popolazione ionica5. Le scansioni MS2, chiamate anche scansioni a frammentazione, comportano l'isolamento e la frammentazione di specifici ioni precursori scelti dalla scansione MS1, generando spettri di ioni frammento per l'identificazione dei peptidi6.

L'acquisizione dipendente dai dati (DDA) seleziona gli ioni più abbondanti dalle scansioni MS1 per la frammentazione MS2, producendo spettri più semplici che semplificano l'analisi. Tuttavia, la DDA può portare a un campionamento stocastico e a valori mancanti in campioni complessi, limitando la riproducibilità7. Al contrario, l'acquisizione indipendente dai dati (DIA) frammenta sistematicamente tutti gli ioni all'interno di finestre m/z predefinite, garantendo una copertura completa e riducendo al minimo i valori mancanti. Ciò migliora l'accuratezza quantitativa e la riproducibilità8, sebbene la DIA richieda strumenti computazionali avanzati per deconvolgere i suoi spettri MS2 9 altamentecomplessi.

PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride)2è un repository leader all'interno del ProteomeXchange Consortium (https://www.proteomexchange.org)10, una piattaforma globale per la condivisione di dati di proteomica. Gli utenti possono navigare in modo efficiente in questa vasta risorsa utilizzando ricerche per parole chiave per individuare i set di dati di interesse.

DIA-NN11, una suite software che sfrutta le reti neurali profonde, è uno strumento gold standard per l'analisi dei dati di proteomica di acquisizione indipendente dai dati (DIA). Eccelle nell'accuratezza dell'identificazione e della quantificazione, il che lo rende particolarmente efficace per l'elaborazione di set di dati DIA complessi12. Per i flussi di lavoro di acquisizione dipendenti dai dati (DDA), MSFragger13, integrato nella pipeline FragPipe, offre un'identificazione ultrarapida dei peptidi. Il suo innovativo approccio di indicizzazione frammento-ione consente una rapida corrispondenza spettrale, superando le prestazioni degli strumenti tradizionali di oltre 100 volte in termini di velocità.

Dotati di questi database completi e strumenti avanzati, i ricercatori possono facilmente riutilizzare i dati proteomici per la convalida di studi incrociati e nuove scoperte biologiche. Questa accessibilità ha portato all'identificazione di numerosi biomarcatori proteici in diverse malattie14,15, ha migliorato la previsione della prognosi16 e ha consentito la classificazione dei sottotipi molecolari basata sui profili proteomici17.

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Protocollo

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NOTA: Vedere la Figura 1per una panoramica del flusso di lavoro e la Tabella dei materiali per descrizioni dettagliate del software utilizzato.

figure-protocol-1
Figura 1: Panoramica del disegno dello studio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Esempio di configurazione del file e del software

NOTA: Tutte le applicazioni sono gratuite per l'uso di ricerca individuale e possono essere eseguite su un personal computer (Windows e Linux sono supportati).

  1. Creare una nuova directory per un progetto.
  2. Scarica JMU_LM2_8526_55.raw, JMU_LM2_8568_51.raw, JMU_LM2_8696_37.raw, JMU_LM2_2112_87.raw, JMU_LM2_2195_91.raw, JMU_LM2_2377_73.raw, 20150127_liver_XH03_T_01.raw, 20150127_liver_XH03_T_02.raw, 20150127_liver_XH03_T_03.raw, 20150127_liver_XH03_P_01.raw, 20150127_liver_XH03_P_02.raw, 20150127_liver_XH03_P_03.raw dal PRIDE.
    NOTA: I due gruppi di file possono essere scaricati separatamente da https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD039273 e https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD006512 (Figura 2).
  3. Scarica e installa gli strumenti software necessari.
    1. Scarica l'ultima versione di DIA-NN come file .msi. DIA-NN è disponibile gratuitamente come file .msi per Windows o come file .zip per Linux da https://github.com/vdemichev/DiaNN/releases/tag/2.0
    2. Scaricare la versione più recente di MSFileReader come file .exe. MSFileReader è disponibile gratuitamente come file .exe da https://github.com/thermofisherlsms/MSFileReader/blob/main/MSFileReader_x64.exe, necessario per elaborare i dati DIA Thermo Fisher formattati non elaborati.
    3. Scaricare la versione più recente di .NET SDK come file .exe. .NET SDK è disponibile gratuitamente come file .exe da https://dotnet.microsoft.com/en-us/download, necessario in Windows per eseguire MSFileReader.
    4. Scarica l'ultima versione di FragPipe come file .zip. FragPipe è disponibile gratuitamente come file .zip da https://github.com/Nesvilab/FragPipe/releases. Il file zip con jre è consigliato in quanto contiene un runtime Java per Windows, necessario per eseguire FragPipe. MSFragger è incorporato in FragPipe.
  4. Scaricare la versione più recente di R e Rstudio e i file di script R da File supplementare 1 e File supplementare 2. R e RStudio possono essere scaricati gratuitamente da https://cran.rstudio.com/bin/windows/base/R-4.5.0-win.exe e https://posit.co/download/rstudio-desktop/.
  5. Decomprimere i file compressi e fare clic sul pulsante . exe o .msi File per installare le applicazioni.

2. Analisi dei dati DIA utilizzando DIA-NN

  1. Scarica il file proteome fasta di riferimento da UniProt. Per scaricare il proteoma di riferimento dell'Homo sapiens (informazioni sull'isoforma non incluse) vai alla https://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640 (Figura 3A).
  2. Fare clic sul pulsante Aggiungi FASTA per caricare il file del proteoma di riferimento in DIA-NN.
  3. Seleziona le due opzioni FASTA digest per la ricerca/generazione di librerie senza libreria e Spectra, RT e lMs basati sul deep learning nella parte Generazione di ioni precursori. Fare clic sul pulsante Esegui per generare una libreria spettrale prevista (Figura 3B).
    1. Una volta generato il file della libreria spettrale prevista, riutilizzarlo per altri esperimenti all'interno delle stesse impostazioni di acquisizione sperimentale facendo clic sul pulsante Spettrale per aggiungere la libreria prevista.
  4. Deselezionare le due opzioni nella parte Generazione di ioni precursori e fare clic sul pulsante Tipo correlato al formato del file nella parte di input per caricare i dati DIA.
  5. Impostate Precisione di massa (Mass Accuracy) e Accuratezza MS1 (MS1) in Algoritmo (Algorithm) su 0,0 ppm.
  6. Regolare le impostazioni dell'intervallo di massa del precursore e del frammento in Parte di generazione di ioni precursori in base alle impostazioni sperimentali.
  7. Mantieni le altre impostazioni predefinite.
    1. La generazione di precursori di DIA-NN utilizza la tripsina/P (si sfalda dopo K/R a meno che non sia seguita da prolina) con 1 scissione mancata per modellare la digestione parziale; disabilitare l'escissione di M a N-termine per peptidi non canonici (ad esempio, immunopeptidomica) o aumentare le scissioni mancate a 2 per i peptidi più lunghi.
    2. Abilita esplicitamente le modifiche alle variabili (disabilitate per impostazione predefinita) per gli studi di modifica post-traduzionale (PTM) (ad esempio, Ox (M) per l'ossidazione, K-GG per l'ubiquitinazione) ed espandi i filtri peptidici (lunghezza: 7-30 aa; carica: 1-4+; precursore m/z: 300-1800) in base alle impostazioni sperimentali (ad esempio, lunghezza: 5-50 aa, carica=1-6) per PTM di grandi dimensioni o digest non triptici.
    3. Le impostazioni dell'algoritmo sfruttano la calibrazione automatica (precisione della massa = 0,0 ppm) per un allineamento preciso della massa, con l'override con tolleranze manuali (ad esempio, 10 ppm) per gli strumenti a bassa risoluzione, e la corrispondenza tra le esecuzioni (MBR) trasferisce gli ID tra le esecuzioni (disabilitata per campioni eterogenei).
    4. Il punteggio della rete neurale aumenta la sicurezza dell'identificazione (conserva a meno che non sia di scarsa qualità dei dati), mentre la spettrometria di massa quantistica senza etichetta (UMS) consente una quantificazione ad alta precisione senza marcature; passare alla quantificazione MS2 per i tag isobarici (ad esempio, TMT). Utilizza la ricerca senza libreria solo con dati DIA ad alta risoluzione per aggirare i requisiti della libreria spettrale.
  8. Fare clic sul pulsante Esegui . Attendere i risultati fino a quando nell'interfaccia operativa non viene visualizzato Finito a indicare che l'esecuzione è terminata (Figura 3C).

3. Analisi dei dati DDA utilizzando FragPipe

  1. Fare clic sull'icona Fragpipe nella cartella ~\FragPipe\fragpipe\bin dopo l'installazione. Tutte le impostazioni dipendenti possono essere visualizzate nella scheda Config. Verificate se i tre moduli (MSFragger, IonQuant, diaTracer, DIA-NN e Python) sono presenti sul vostro computer. In caso contrario, scaricarli facendo clic su Download/Update o Download (Figura 4A).
  2. Passa alla scheda successiva, Flusso di lavoro. Seleziona Predefinito per il flusso di lavoro e fai clic su Carica flusso di lavoro. Fare clic su Aggiungi file per aggiungere i percorsi dei file. Assegnare il nome dell'esperimento e il numero di bioreplica in Assegna file o lasciarlo (Figura 4B).
  3. Ora, fai clic su Database e vai a quella scheda. Carica un file fasta o scarica qualsiasi file fasta in base alla specie dei campioni. Durante il download, scegliere Solo sequenze revisionate, Aggiungi esche e Aggiungi opzioni di contaminanti comuni per un'esecuzione semplice (Figura 4C).
  4. Quindi fare clic su MSFragger per modificare la scheda. Scegli la configurazione predefinita di Ricerca chiusa e fai clic su Carica.
    NOTA: La ricerca chiusa è fondamentalmente una ricerca delle modifiche che hai impostato, mentre la ricerca aperta esplorerà tutte le possibili modifiche dai dati, il che richiede più tempo e memoria.
  5. Per la corrispondenza dei picchi, mantenere le impostazioni predefinite, ad eccezione del fatto che si consiglia di scegliere Nessuno per Calibrazione e ottimizzazione, in quanto consente di risparmiare tempo.
  6. Per la digestione delle proteine, regolare i parametri in base alle condizioni sperimentali. Mantenere le seguenti impostazioni predefinite (Figura 5A).
    NOTA: Le tolleranze di massa dei precursori e dei frammenti (± 20 ppm) definiscono l'errore di massa massimo consentito per abbinare gli spettri sperimentali ai peptidi teorici, con valori più stretti raccomandati per gli strumenti ad alta risoluzione. Le regole enzimatiche (tripsina stretta) specificano la specificità della scissione (dopo K/R, a meno che non sia seguita da P), con le mancate scissioni (2) che consentono peptidi parzialmente digeriti. I filtri per peptidi di lunghezza (5-50 residui) e massa (500-5000 Da) escludono candidati improbabili. Modifiche variabili (ad esempio, +15,9949 Da su metionina per l'ossidazione, +79,96633 Da su S/T/Y per fosforilazione) consentono il rilevamento di alterazioni chimiche, mentre le combinazioni Max (5) limitano le modifiche simultanee per peptide per gestire lo spazio di ricerca. Il numero massimo di modifiche variabili per sito (ad esempio, 3 su M) controlla la frequenza di modifica. Il database diviso migliora l'efficienza per i proteomi di grandi dimensioni e l'errore isotopico (0/1/2) tiene conto dei picchi isotopici assegnati in modo errato. Queste impostazioni bilanciano collettivamente sensibilità, specificità e carico computazionale nell'identificazione dei peptidi.
  7. Passare alla scheda Convalida. Deselezionare Prevedi RT e Prevedi spettri, che è per i dati DIA (Figura 5B).
  8. Fare clic sulla scheda Quant (MS1). Selezionare Esegui MS1 quant e fare clic su Carica valori predefiniti quant. Selezionate IonQuant e mantenete le impostazioni predefinite (Figura 6A). Disabilitare l'MBR per tempi di ritenzione instabili o disabilitare la normalizzazione dell'intensità se si verificano distorsioni di scalabilità globale; abilitare Mantieni indice su disco per conservare la RAM con set di dati di grandi dimensioni.
    NOTA: Quant (MS1) ottimizza per impostazione predefinita la quantificazione senza marcatura utilizzando MaxLPQ (MaxLFQ-based Protein Quantification, un algoritmo che estende il metodo MaxLFQ ai gruppi proteici), richiedendo ≥1 ione unico per proteina (aumento a ≥2 per una maggiore rigorosità a scapito della copertura). La corrispondenza tra le esecuzioni (MBR) trasferisce le identificazioni tra le esecuzioni utilizzando la tolleranza del tempo di ritenzione (RT) (impostazione predefinita 0,4 min; riduzione a 0,2 min per cromatografia stabile o allentamento per variabilità del gradiente) e la tolleranza alla mobilità ionica (IM) (impostazione predefinita 0,05 1/k0 [mobilità ridotta inversa]; regolazione in base alla precisione IM), filtrata in base all'≤1% FDR (False Discovery Rate; impostazione predefinita dello ione MBR FDR=0,01; inferiore a 0,005 per rigore). L'inferenza proteica utilizza uniquer+rascor (assegnazione del peptide del rasoio per il raggruppamento proteico). Il rilevamento delle caratteristiche utilizza una tolleranza di massa di 10 ppm (aumento a 20 ppm per MS a bassa risoluzione o diminuzione a 5 ppm per alta risoluzione).
  9. Ora, fai clic sulla scheda Esegui . Seleziona Directory di output. Fare clic su RUN per avviare l'analisi dei dati (Figura 6B).
    NOTA: Per i dati di proteomica senza marcatura che non si concentrano sulle modifiche o che utilizzano la quantificazione basata su etichetta, le schede PTM, Glyco e Quant (isobariche) non vengono utilizzate.

4. Analisi a valle DIA-NN/FragPipe

NOTA: I codici dettagliati utilizzati in questo studio sono inclusi come File supplementare 1 e File supplementare 2. Le versioni dei pacchetti utilizzati in questo studio possono essere trovate nel file supplementare 3.

  1. Apri RStudio e leggi i dati di espressione proteica generati da DIA-NN o FragPipe. Per l'analisi vengono normalmente utilizzati i dati della matrice del gruppo proteico che terminano con .pg_matrix.tsv da DIA-NN e i dati proteici combinati che terminano con .tsv da FragPipe.
  2. Rimuovi i valori mancanti senza compilare NA e filtra i gruppi proteici identificati e quantificati con meno di due peptidi unici.
    NOTA: I dati DIA in questo studio sono stati generati da gruppi proteici filtrati, mentre i dati DDA provenivano da gruppi proteici non filtrati.
  3. Normalizzare l'intensità delle proteine utilizzando la scala mediana o la normalizzazione dei quantili tra i campioni. I dati DIA in questo studio sono stati normalizzati mediante normalizzazione mediana mentre i dati DDA mediante normalizzazione quantilica per dimostrare meglio i due metodi.
    NOTA: La normalizzazione mediana è robusta contro i valori anomali e adatta per scenari in cui la maggior parte delle proteine rimane invariata tra i campioni, rendendo l'abbondanza proteica mediana un punto di riferimento stabile. Tuttavia, potrebbe fallire in scenari con proteine altamente differenzialmente espresse18. La normalizzazione quantilica garantisce una distribuzione uniforme delle abbondanze proteiche tra i campioni, il che è utile quando si confrontano campioni con distribuzioni disparate. È stato dimostrato che riduce la potenza statistica e può normalizzare eccessivamente i dati, mascherando potenzialmente le vere differenze biologiche18. In proteomica, la normalizzazione mediana è ampiamente utilizzata negli studi label-free per rimuovere le distorsioni sistematiche relative alle prestazioni dello strumento SM. La normalizzazione quantilica è preferita per set di dati su larga scala, analisi di espressioni differenziali e analisi di cluster19,20.
  4. Calcola le variazioni di log2 volte (ad esempio, PDAC Serum versus Normal) e i valori p del test t. Calcola i valori p corretti utilizzando il metodo Benjamini-Hochberg. Definire le soglie di significatività (ad esempio, |log2FC| > 1, p_adj (FDR) < 0,05).
    NOTA: I valori p di cutoff utilizzati nelle figure di questo studio rappresentano valori grezzi, poiché l'impiego di valori p aggiustati (p_adj) eliminerebbe tutte le proteine rilevabili all'interno della potenza statistica di questi set di dati limitati.
  5. Verificare l'esistenza di valori mancanti/NA ed escluderli. Genera un grafico del vulcano per visualizzare i colpi significativi.
  6. Selezionare proteine significativamente disregolate. Applicare la normalizzazione dello Z-score ai valori di espressione proteica. Traccia una mappa termica raggruppata con annotazioni di gruppi di esempio.
  7. Mappare le proteine agli ID di Entrez utilizzando org. Hs.eg.db. Eseguire l'arricchimento OB (processo biologico) e l'analisi del percorso KEGG.
    NOTA: Le categorie di processi biologici (BP) sono comunemente selezionate nell'analisi dell'ontologia genica (GO) perché descrivono i processi più ampi o i programmi biologici realizzati da più attività molecolari20. Questi termini si concentrano sulle funzioni cellulari che vanno storte in malattie come il cancro, compresi i processi essenziali come la regolazione del ciclo cellulare, i processi metabolici, ecc. Oltre alla BP, l'analisi OB include anche le categorie di funzione molecolare (MF) e componente cellulare (CC). I termini MF delineano le attività biochimiche dei prodotti genici, come il trasporto ionico o le capacità di legare il DNA. I termini CC definiscono le posizioni cellulari in cui i prodotti genici svolgono le loro funzioni, come il nucleo, la membrana mitocondriale o il citoscheletro.
  8. Eseguire una query su STRINGdb per le interazioni (punteggio di attendibilità ≥ 400). Genera una rete interattiva utilizzando visNetwork.

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Risultati

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Per illustrare meglio la ricerca di set di dati proteomici, abbiamo selezionato due tipi di set di dati per questa analisi. Con l'obiettivo di dimostrare le proteine disregolate in contesti clinici, abbiamo cercato in PRIDE utilizzando parole chiave come clinica. In particolare, abbiamo selezionato un set di dati adatto per l'analisi DIA dal Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC)21 e un altro adatto per l'analisi DDA dal Chinese Human Proteome Project...

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Discussione

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Il protocollo presentato illustra l'analisi dei dati proteomici integrando strumenti gratuiti come DIA-NN e FragPipe. Il successo dipende da passaggi critici come l'accurata selezione degli ioni precursori e le impostazioni di accuratezza di massa per la generazione di librerie spettrali in DIA-NN (passaggio 2.3)27, che dipendono dallo strumento e sono cruciali per l'identificazione completa dei peptidi. Allo stesso modo, la meticolosa configurazione del database ...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

F.Z. è il fondatore di Molemuse Biotech Studio.

Ringraziamenti

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Questo progetto è supportato da Molemuse Biotech Studio.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
.NET SDK v. 9.0.203Valentinahttps://dotnet.microsoft.com/en-us/download
DIA-NN v. 2.1.0https://github.com/vdemichev/DiaNN/releases/tag/2.0 
FragPipe v. 22.0https://github.com/Nesvilab/FragPipe/releases
MSFileReader v. 3.1 Thermo Fisherhttps://github.com/thermofisherlsms/MSFileReader/blob/main/MSFileReader_x64.exe
R 4.5.0https://cran.rstudio.com/bin/windows/base/R-4.5.0-win.exe
Rstudio v. 2024.12.1+563https://posit.co/download/rstudio-desktop/

Riferimenti

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