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Articolo metodologico

Transsezione del legamento crociato anteriore e lavaggio del liquido sinoviale in un modello di roditore per studiare l'infiammazione articolare e l'osteoartrite post-traumatica

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⸱

DOI:

10.3791/68713

⸱

2 settembre 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

In questo articolo, descriviamo un metodo chirurgico per sezionare il legamento crociato anteriore (LCA) come un modello affidabile per indurre l'artrosi del ginocchio nei roditori e le metodologie per la raccolta del liquido sinoviale del ginocchio, la misurazione dell'edema del ginocchio e la valutazione della gravità dell'osteoartrite.

Abstract

L'osteoartrite (OA) è una malattia articolare caratterizzata da dolore cronico e attualmente non ha cura. Un sottogruppo dell'osteoartrite post-traumatica (PTOA) può verificarsi dopo una lesione articolare. Il ginocchio è una delle articolazioni più colpite e, tra le lesioni al ginocchio, le lesioni al LCA sono tra le più comuni. L'artrosi sintomatica, che è accompagnata da cambiamenti nell'articolazione come la degradazione della cartilagine e la formazione di osteofiti, può svilupparsi anni dopo la lesione iniziale, ma i primi cambiamenti articolari possono essere rilevati poco dopo. L'infiammazione è considerata uno dei fattori che contribuiscono allo sviluppo del PTOA e i mediatori pro-infiammatori prodotti in risposta a una lesione possono catalizzare lo sviluppo del PTOA. Nei modelli animali, le strutture che danneggiano chirurgicamente il ginocchio sono un metodo ampiamente utilizzato per l'induzione dell'OA e una tecnica chirurgica comune è la transezione del LCA (ACLT). Lo scopo di questo studio è descrivere la nostra tecnica ACLT per l'induzione dell'OA, nonché i metodi per monitorare l'infiammazione articolare e quantificare la gravità dell'OA. Per valutare l'infiammazione post-operatoria, descriviamo una tecnica per misurare l'edema del ginocchio e una tecnica per la raccolta e l'analisi del liquido sinoviale del ginocchio. Per valutare le alterazioni articolari a lungo termine associate all'OA, presentiamo un sistema di punteggio semiquantitativo che abbiamo sviluppato per valutare la gravità dell'OA tramite imaging microCT.

Introduzione

Il legamento crociato anteriore (LCA) è una struttura critica nell'articolazione del ginocchio, che fornisce stabilità e impedisce un eccessivo movimento in avanti della tibia rispetto al femore1. Le lesioni del LCA sono tra le lesioni del ginocchio più comuni, in particolare negli sport che comportano arresti improvvisi, salti o cambi di direzione2. Queste lesioni possono variare da lacerazioni parziali a rotture complete e spesso richiedono un intervento chirurgico per un recupero ottimale3. Tuttavia, anche dopo il trattamento chirurgico, le lesioni del LCA spesso portano a cambiamenti articolari a lungo termine, tra cui usura condrale, formazione di osteofiti e alterazioni strutturali dell'osso subcondrale. Questi cambiamenti contribuiscono collettivamente alla degenerazione articolare, comunemente indicata come osteoartrite post-traumatica (PTOA)4,5.

Mentre la progressione dalla lesione iniziale del LCA al PTOA sintomatico può estendersi da un minimo di 2 anni a un massimo di 20 anni dopo la lesione, i primi cambiamenti articolari possono essere rilevati entro poche settimane 6,7,8,9. Una caratteristica chiave di questi cambiamenti precoci è l'elevata presenza di citochine infiammatorie (ad esempio, interleuchina (IL)-1, IL-6, fattore di necrosi tumorale (TNF)) e marcatori di rottura della matrice extracellulare (ad esempio, metalloproteinasi (MMP) e CTX-II). Le valutazioni del liquido sinoviale di questi marcatori di infiammazione e degradazione forniscono informazioni cruciali sulle fasi acute e croniche della patologia articolare. Ad esempio, i livelli di IL-1 e IL-6 raggiungono il picco nel liquido sinoviale dell'articolazione lesionata entro il primo mese dopo l'infortunio. Sebbene questi livelli diminuiscano nel tempo, raramente tornano al livello normale di base, anche anni dopo il trattamento 10,11,12. Questa risposta pro-infiammatoria iniziale innesca una cascata di danni articolari, tra cui infiammazione sinoviale, degradazione della cartilagine e alterazioni biomeccaniche, perpetuando la disgregazione dei tessuti e accelerando la degenerazione articolare13. Inoltre, l'infiammazione acuta a seguito di lesione del LCA spesso provoca versamento articolare ed edema del ginocchio, esemplificato dal gonfiore e dall'accumulo di liquidi all'interno dell'articolazione14.

Per replicare la lesione del LCA e studiare la progressione del PTOA, il modello di transsezione del LCA indotta chirurgicamente (ACLT) nei topi è ampiamente utilizzato15,16. Questo modello prevede il taglio del LCA per simulare la lesione e la valutazione delle conseguenze biologiche e meccaniche risultanti. Il modello ACLT è uno strumento prezioso per studiare la risposta infiammatoria, la degradazione della cartilagine e le alterazioni biomeccaniche post-infortunio, consentendo di comprendere i meccanismi molecolari e cellulari che guidano il PTOA. Inoltre, consente di valutare strategie terapeutiche volte a mitigare la degenerazione articolare e a preservarne la funzione. Nell'uomo, l'analisi del liquido sinoviale è ampiamente utilizzata per monitorare l'infiammazione e la degradazione della cartilagine nel tempo, poiché ottenere il liquido sinoviale è relativamente semplice17,18. Tuttavia, nei topi, la raccolta del liquido sinoviale dopo i modelli di lesione è impegnativa. In questo manoscritto, descriviamo la nostra tecnica chirurgica per l'ACLT e un metodo di lavaggio del ginocchio per la raccolta del liquido sinoviale per valutare i marcatori infiammatori e degradativi. Presentiamo anche un metodo per misurare le dimensioni del ginocchio per quantificare l'edema a seguito di lesioni articolari. Inoltre, descriviamo il nostro metodo di valutazione microCT per classificare la gravità del PTOA post-ACLT. Questi approcci forniscono strumenti complementari per valutare gli effetti acuti e cronici della lesione del LCA in un contesto preclinico.

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Protocollo

Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con le Linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Brigham and Women's Hospital.

1. Preparazione degli animali

NOTA: La scelta del sesso del topo dovrebbe essere in linea con gli obiettivi dello studio, poiché anche se l'ACLT induce in modo affidabile il PTOA in entrambi i sessi, la gravità e la progressione possono differire.

  1. Preparazione dell'anestesia: preparare in anticipo la soluzione anestetica di ketamina-xilazina (KX).
    NOTA: Può essere utilizzata anche l'anestesia inalante (isoflurano al 2%).
  2. Controlli chirurgici: utilizzare un gruppo separato di pari età e operato come controllo chirurgico.
    NOTA: Il ginocchio controlaterale non deve fungere da controllo fittizio, in quanto ciò potrebbe sollevare preoccupazioni per il benessere degli animali. Tuttavia, può essere utilizzato come controllo sano e illeso per stabilire le condizioni articolari di base in analisi accoppiate.
  3. Selezione dell'età dell'animale: utilizzare topi di 8 settimane per riflettere l'età tipica in cui si verificano più comunemente le lacerazioni del LCA. Tuttavia, qualsiasi topo scheletricamente maturo può sottoporsi a questa procedura.

2. Assistenza preoperatoria

NOTA: Se i topi vengono trasportati da una struttura diversa, attendere almeno 1 settimana affinché si acclimatino al nuovo ambiente prima di eseguire l'intervento chirurgico.

  1. Assicurarsi che l'intervento chirurgico venga eseguito in modo asettico, con tutte le superfici sterilizzate (ad esempio, utilizzando teli sterili per coprire le aree chirurgiche) e garantire l'uso di strumenti sterili e dispositivi chirurgici di protezione individuale (DPI) adeguati.
  2. Indurre l'anestesia somministrando un'iniezione intraperitoneale di ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
  3. Una volta anestetizzato, applicare il lubrificante per gli occhi e radere il pelo sopra il ginocchio da operare, coprendo i lati anteriori e laterali da metà tibia a metà coscia utilizzando piccoli tagliacapelli.
    NOTA: La selezione del ginocchio dell'arto posteriore è a discrezione del ricercatore, in base alla facilità dell'intervento chirurgico
  4. Assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato e non risponda al riflesso di pizzicamento delle dita.
  5. Disinfettare la pelle esposta applicando un detergente antibatterico (ad es. betadina e alcol al 70%).
  6. Somministrare un analgesico oppioide (ad es. 0,05 mg/kg di buprenorfina) per via sottocutanea per l'analgesia preventiva.
    NOTA: L'analgesico deve essere una formula a rilascio prolungato per fornire un effetto analgesico per 72 ore dopo l'intervento chirurgico o deve essere somministrato regolarmente durante questo lasso di tempo per mitigare il dolore durante il recupero.
  7. Somministrare un FANS (ad es. 5 mg/kg di meloxicam) come raccomandato, a meno che la somministrazione di FANS non interferisca con l'esito di interesse.
  8. Posizionare il topo sul lato dorsale sotto un microscopio da dissezione. Assicurarsi che il ginocchio da operare sia rivolto verso l'alto e all'interno del campo visivo del microscopio.
  9. Copri il mouse con un telo sterile, lasciando una piccola apertura per il buco della serratura.
  10. Posizionare la gamba da operare con il ginocchio flesso a circa 90° con la rotula rivolta verso l'alto. Utilizzare un nastro chirurgico per mantenere il ginocchio in posizione flessa.

3. Sezione del legamento crociato anteriore

  1. Regolare il microscopio per mettere a fuoco la rotula.
  2. Usando una pinza, pizzica la pelle sopra la rotula e fai una piccola incisione longitudinale sulla linea mediana sopra il ginocchio usando le forbici chirurgiche. Estendere l'incisione a circa 1 cm e ritrarre la pelle per esporre il tendine rotuleo (Figura 1A).
  3. Fletti il ginocchio a circa 120°. Utilizzare la mano non dominante per mantenere la flessione del ginocchio e per mantenere i bordi della pelle retratti, facilitando la visualizzazione del tendine rotuleo (Figura 1B).
  4. Identificare il bordo mediale del tendine rotuleo e praticare un'incisione con una lama n. 11 lungo questo margine, che si estende dal suo punto medio al polo superiore della rotula per aprire la capsula articolare (Figure 1C-E).
    NOTA: In caso di sanguinamento, applicare una leggera pressione con un batuffolo di cotone sterile per 5-10 s per controllare l'emostasi.
  5. Usando una pinza a punta smussata, afferrare delicatamente il tendine rotuleo, sollevandolo leggermente verso l'alto e spostandolo lateralmente per dislocare la rotula ed esporre completamente l'articolazione del ginocchio (Figura 1F).
  6. In questa fase, il cuscinetto adiposo infrarotuleo (IFP) sarà visibile (Figura 2A). Utilizzando una pinza a punta smussata, spostare delicatamente la parte mediale dell'IFP per esporre l'ACL preservando l'integrità dell'IFP (Figura 2B).
    NOTA: Si evita la rimozione completa dell'IFP, poiché svolge un ruolo nella produzione di marcatori infiammatori. Poiché questo modello si concentra sullo studio della risposta infiammatoria a seguito di una lesione che porta al PTOA, è preferibile mantenere l'IFP. In caso di sanguinamento, applicare una leggera pressione con un batuffolo di cotone sterile per 5-10 s per controllare l'emostasi.
  7. Mantenendo il ginocchio a una flessione di 120°, identificare il LCA, che si estende dalla superficie interna del condilo femorale laterale al centro del piatto tibiale (Figura 2C, D).
  8. Utilizzando le forbici microchirurgiche, sezionare attentamente l'ACL sotto la visualizzazione al microscopio, assicurandosi che la cartilagine, il menisco e gli altri legamenti circostanti rimangano intatti (Figura 2E). Il modello ACLT è completo in questa fase. In alcuni casi, è possibile visualizzare i resti dell'ACL sezionato (Figura 2F).
  9. Confermare la resezione del LCA eseguendo un test del cassetto antero-posteriore. Flettere il ginocchio a circa 90°, stabilizzare la tibia prossimale con le dita e utilizzare una pinza a punta smussata per applicare delicatamente una forza posteriore al femore distale. La traduzione posteriore del femore distale conferma il successo dell'ACLT (Figura 3).
  10. Riposizionare la rotula e il tendine rotuleo nella loro posizione anatomica sollevandoli leggermente e spostandoli medialmente (Figura 4A, B). Chiudere la capsula articolare con un singolo punto utilizzando suture 6-0 riassorbibili, fissando il muscolo che circonda la rotula al tessuto muscolare mediale adiacente. Quindi, chiudere la pelle con 2-3 punti di sutura utilizzando suture 6-0 riassorbibili (Figura 4C).
  11. Per la chirurgia fittizia, eseguire la stessa procedura, ma senza sezionare il LCA. Aprire la capsula articolare e dislocare la rotula e l'IFP come descritto. Visualizza l'ACL senza sezionarlo, quindi sostituisci la rotula e l'IFP e chiudi la capsula articolare e la pelle.

4. Assistenza post-operatoria

  1. Dopo l'intervento chirurgico, posizionare il mouse su un termoforo e lasciarlo riprendersi dall'anestesia fino a quando non è completamente cosciente.
  2. Una volta che il topo è completamente deambulante, trasferiscilo in una gabbia pulita con lettiera fresca per il recupero.
  3. Per le prime 72 ore dopo l'intervento, monitorare attentamente il topo per segni di dolore o angoscia, tra cui: variazioni del peso corporeo (in genere non più di una diminuzione del 5%), toelettatura ridotta o eccessiva toelettatura intorno al sito di incisione, segni di deterioramento generale della salute (come postura curva, smorfie facciali o respirazione anormale) e infezione della ferita (incluso gonfiore, secrezione o deiscenza della ferita). Se si utilizza meloxicam, somministrarlo ogni 24 ore per 48 ore.
  4. Dopo le prime 72 ore dopo l'intervento, mantenere il topo come al solito fino all'endpoint di interesse in base al disegno dello studio.

5. Valutazione delle dimensioni del ginocchio (edema)

  1. Valutare l'edema del ginocchio misurando la larghezza medio-laterale del ginocchio utilizzando un calibro a corsoio (si consiglia un calibro digitale con rotella di regolazione fine per misurazioni precise e controllate). Misura un animale vivo o post mortem. Chiudere gradualmente la pinza fino a quando non tocca delicatamente i bordi mediale e laterale del ginocchio.
    NOTA: Sebbene la pinza debba essere aderente, è necessario prestare attenzione per evitare di applicare una pressione eccessiva, in quanto ciò potrebbe comprimere il ginocchio e ridurre artificialmente la larghezza misurata, portando a risultati imprecisi. L'obiettivo è quello di mantenere la pinza correttamente montata senza comprimere visibilmente il ginocchio. Il serraggio dovrebbe interrompersi una volta che iniziano ulteriori regolazioni per ridurre la misura delle dimensioni del ginocchio (Figura 5).
  2. Posizionare l'animale anestetizzato o soppresso dorsalmente su una superficie piana, assicurandosi che il ginocchio sia rivolto verso l'alto. Flettere il ginocchio a circa 90° e mantenere questa posizione. Per mantenere il ginocchio in flessione, fissare la gamba con nastro chirurgico o, se si esegue l'eutanasia post-eutanasia, un perno di dissezione. Misurare la larghezza del ginocchio utilizzando il calibro come descritto.
  3. In alternativa, se l'anestesia non è preferita, prendere le misure con più persone in modo che un individuo possa trattenere delicatamente l'animale mentre l'altro ottiene le misure della larghezza del ginocchio.
  4. Per garantire l'affidabilità, misurare ogni ginocchio almeno due volte. Applicare la stessa tecnica sia alle ginocchia infortunate che a quelle controlaterali (non lesionate). Riporta i dati come differenza tra le due ginocchia (dimensione delta del ginocchio), non come valori assoluti, il che riduce la variabilità dovuta alla tecnica di misurazione e alle variazioni delle dimensioni dei singoli topi.

6. Prelievo di liquido sinoviale (lavaggio dell'articolazione del ginocchio)

  1. Sopprimere l'animale utilizzando un metodo approvato, seguendo le normative nazionali sulle licenze, le linee guida locali e i protocolli sperimentali. In questo studio, l'eutanasia è stata eseguita utilizzando l'asfissia da CO2 seguita da lussazione cervicale.
  2. Esporre l'articolazione del ginocchio praticando un'incisione longitudinale anteriore sopra il ginocchio, sezionando la pelle e i tessuti sottostanti per esporre completamente il tendine rotuleo e la rotula.
  3. Utilizzando una lama n. 11, aprire la capsula articolare lungo il lato mediale del legamento rotuleo che si estende dal suo punto medio al bordo superiore della rotula (Figura 6A, B).
  4. Spostare la rotula spostandola delicatamente lateralmente per accedere allo spazio articolare, facendo attenzione a non danneggiare le strutture circostanti.
  5. Flettere il ginocchio a circa 120° per assicurarsi che la cavità articolare sia ben posizionata per il lavaggio per facilitare la raccolta del liquido sinoviale (Figura 6C).
  6. Preriempire una provetta con 100 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a temperatura ambiente.
  7. Utilizzando una pipetta P10, eseguire lavaggi seriali del ginocchio con 2,5 μl di PBS a temperatura ambiente (Figura 6D-F) e aggiungere alla provetta preriempita, per un totale di 8 ripetizioni. Il volume cumulativo del liquido di lavaggio del ginocchio deve raggiungere i 120 μl.
  8. Centrifugare il liquido di lavaggio del ginocchio a 4 °C per 5 minuti a 240 g per separare i componenti cellulari dal surnatante.
    NOTA: I componenti cellulari possono essere utilizzati per la conta cellulare, l'analisi CytoSpin o la citometria a flusso. Per l'analisi di citometria a flusso, può essere necessario raggruppare campioni da più animali per ottenere un numero sufficiente di cellule per un'analisi accurata.
  9. Conservare il surnatante a -80 °C per analisi future.
    NOTA: In questo studio, il surnatante è stato utilizzato per l'analisi multiplex delle citochine pro-infiammatorie e delle metalloproteasi della matrice (MMP).

7. Analisi MicroCT (gravità del PTOA nel femore distale)

  1. Preparazione del campione: Dopo aver raccolto il liquido sinoviale, prelevare le articolazioni tibio-femorali sezionando accuratamente il femore distale e la tibia prossimale, garantendo la preservazione dell'integrità articolare.
    NOTA: Rimuovere il tessuto muscolare in eccesso che circonda il ginocchio, ma prestare attenzione per preservare l'integrità della struttura ossea. Conservare il tessuto sinoviale se la sinovite viene analizzata mediante istologia; raccogliere in modo indipendente se i marcatori pro-infiammatori vengono valutati tramite qPCR.
  2. Fissare i campioni in paraformaldeide al 4% (PFA) a 4 °C per 5 giorni. Trasferirli in etanolo al 70% e conservarli a 4 °C.
  3. Esecuzione di scansioni microCT ad alta risoluzione utilizzando i seguenti parametri: dimensione del voxel isotropo di 7 μm, tensione del tubo a raggi X di 55 kVp, corrente di 0,145 mA, tempo di integrazione di 600 ms per proiezione.
  4. Dopo la scansione, esportare i dati microCT come file DICOM per ulteriori analisi.
  5. Carica i file DICOM in un software di elaborazione delle immagini per la visualizzazione, la ricostruzione 3D e l'analisi.
  6. Utilizzare lo strumento di ricostruzione 3D per valutare tutte le regioni del ginocchio e, nella vista sagittale del femore distale, identificare quattro regioni di interesse (ROI) dalla parte posteriore a quella anteriore per il punteggio (Figura 9)19 La depressione posteriore della cartilagine di accrescimento, l'aspetto posteriore del picco della cartilagine di accrescimento, l'aspetto anteriore del picco della cartilagine di accrescimento, e depressione anteriore della cartilagine di accrescimento.
  7. Una volta identificata una ROI, selezionare un'immagine corrispondente nella vista coronale. Ripetere per ogni ROI per un totale di quattro immagini per ogni articolazione tibiofemorale.
  8. Salva le immagini come file in cieco per un'analisi imparziale.
  9. Grado di gravità del PTOA sulle immagini microCT coronali come precedentemente riportato19. In breve, questo sistema di punteggio semiquantitativo valuta l'asimmetria femorale, la presenza e le dimensioni degli osteofiti e l'appiattimento del condilo femorale in quattro posizioni anatomiche. Quindi, assegna un punteggio a ciascun sito su una scala da 0 a 6, dove 6 è il più grave, per un punteggio totale possibile di 24. Chiedi ad almeno due esaminatori indipendenti in cieco di valutare il sito e di calcolare la media dei punteggi per il punteggio finale.
    NOTA: Due esaminatori indipendenti dovrebbero valutare le immagini microCT e gli esaminatori devono essere all'oscuro delle condizioni sperimentali per ridurre i bias. Il punteggio PTOA finale è determinato facendo la media dei punteggi di entrambi gli esaminatori.

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Risultati

La procedura ACLT è un metodo chirurgico efficace e riproducibile per indurre l'osteoartrite nel ginocchio del roditore. Dopo che la procedura ACLT è stata eseguita in condizioni sterili, i topi non hanno mostrato segni di sofferenza o infezione nel sito di incisione e si sono mossi liberamente senza segni di zoppia nell'arto operato.

Le dimensioni del ginocchio sono state misurate per monitorare l'edema del ginocchio dopo ACLT (Figura 7A). Per controllare la vari...

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Discussione

Questa descrizione della tecnica fornisce un metodo chirurgico dettagliato per indurre lesioni del LCA nei topi mediante sezionamento del LCA, offrendo un modello controllato per lo studio del PTOA. Il modello chirurgico ACLT è un approccio preclinico ampiamente utilizzato per indurre il PTOA e replica efficacemente le principali caratteristiche patologiche osservate nelle lesioni del LCA umano, tra cui l'alterazione della biomeccanica articolare, l'infiammazione sinoviale e la degradazi...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)CitivaSH30256.02
4% paraformaldeideFisher ScientificoAAJ19943K2
70% EtanoloFisher ScientificoBP82031GAL
Suture 6-0 riassorbibiliForniture veterinarie Patterson07-893-1916
Pinze a punta smussata Strumenti per la scienza11051-10
Tamponi di cotoneFisher Scientifico22-029-685
Microscopio di dissezioneLeica MicrosystemsM165 FC
Rasoio elettricoBraintree Scientific CLP-9961
Salviette all'etanoloFisher Scientifico22-246073
Ethiqa XR (Buprenorfina SR)Covertus721171,3 mg/mL
Lubrificante per gli occhiForniture veterinarie PattersonNC1701236 
Forbici finiStrumenti per la scienza14061-10
TermoforoFisher ScientificoNC1061604
HorosHoroshorosproject.org
Isoflurano Forniture veterinarie Patterson07-890-8115
KetaminaForniture veterinarie Patterson07-890-8598
MeloxicamForniture veterinarie Patterson07-893-75655 mg/mL
Saggio multiplexScoperta su MesoScaleK15069M-1
Porta aghiCodman36-2000
N. 11 bisturiStrumenti per la scienza10011-00
Pipetta P10GilsonF144055M
Puntali per pipette P10Fisher Scientifico02-707-439
Tampone povidone-iodioMedlineMDS093901ZZ
Scanco Medicale & micro; Sistema CT-35Scancohttps://www.scanco.ch/systems-overview.html7&sottile; µ m dimensione voxel, 55 kVp, 0,145  mA, 600&sp; ms
Teli steriliMedicina generale McKessonNC2032042
Mascherina chirurgicaFisher Scientifico18-048-010
Guanti chirurgiciBis7823PF
Nastro chirurgicoForniture veterinarie Patterson07-888-0614
SiringheBD3096231 ml
Forbici a molla VannasStrumenti di precisione mondiali501778Lame da 3 mm
Capiler VernierNeiko Codice 01407A
Xilazina Forniture veterinarie Patterson07-893-8424

Riferimenti

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