Ottimizzazione e valutazione del disegno a mano e della filatura a umido per la produzione di fibre di seta di ragno ricombinanti

Sommario

Il protocollo presentato fornisce un insieme versatile di metodi per ottimizzare la solubilizzazione delle proteine della seta ricombinanti per la filatura; testare la filabilità mediante disegno a mano; produrre fibre lunghe e continue con filatura a umido automatizzata; e valutare comparativamente la morfologia, l'allineamento molecolare, il comportamento meccanico e il contenuto strutturale secondario delle proteine di o all'interno delle fibre.

Abstract

Le sete di ragno sono rinomate per le loro proprietà meccaniche, con l'elevata resistenza, l'elevata estensibilità o una combinazione di queste che porta a un'elevata tenacità. Una tipica femmina di ragno tessitore di sfere produce sette diversi tipi di seta, ognuno tipicamente filato da proteine specifiche del tipo e adattato meccanicamente per una funzione di sopravvivenza distinta. La produzione di seta di ragno ricombinante fornisce un percorso promettente per ottenere questi materiali, eludendo le sfide nell'ottenere grandi quantità di seta naturale e fornendo vantaggi nel consentire la personalizzazione delle proteine, ad esempio, attraverso la mutagenesi sito-specifica o la costruzione di proteine di fusione.

Nel protocollo presentato, delineiamo una metodologia per valutare l'idoneità delle proteine alla filatura attraverso approcci sia di trafilatura manuale che di filatura a umido. A partire da una polvere proteica liofilizzata opportunamente purificata, vengono descritti in dettaglio i metodi per ottimizzare lo stato iniziale della proteina solubilizzata per fornire uno stato di "droga rotante" ad alta concentrazione. Successivamente, vengono confrontati gli approcci di trafilatura a mano e di filatura a umido, inclusa una discussione sui metodi per modulare il comportamento delle fibre utilizzando un prelievo post-spin come parte del processo di filatura. Viene quindi dettagliato un flusso di lavoro tipico per caratterizzare le fibre di seta risultanti e prendere una decisione su quali condizioni di filatura hanno maggiori probabilità di essere fruttuose, inclusa la microscopia ottica per valutare il diametro della fibra e la sua uniformità; microscopia a luce polarizzata per stimare il grado di allineamento (sopra)molecolare raggiunto all'interno della fibra; prove di trazione per valutare la resistenza, l'estensibilità, il modulo di Young e la tenacità; e spettromicroscopia infrarossa a trasformata di Fourier (FTIR) per valutare la strutturazione secondaria delle proteine all'interno della fibra.

Questo protocollo si è dimostrato adatto a diverse proteine ricombinanti della seta di ragno basate su domini ripetitivi e non ripetitivi della seta aciniforme (avvolgente); seta piriforme; e proteine di fusione comprendenti seta aciniforme, piriforme e/o ampullata maggiore (dragline). Un'applicabilità più ampia è fornita da diversi passaggi evidenziati in cui le condizioni e i parametri possono essere variati per adattarsi al comportamento di una singola proteina e per ottenere differenze nel risultato funzionale.

Introduzione

I ragni producono sete per vari compiti specializzati, tra cui la costruzione di ragnatele, la cattura delle prede e la protezione delle uova¹. Le sete di ragno presentano eccezionali proprietà meccaniche che superano quelle dei materiali naturali e sintetici più noti², spingendo notevoli sforzi verso la produzione di materiali di seta di ragno ingegnerizzati e migliorati per diverse applicazioni industriali e biomediche. La spidroina, la proteina che forma la seta di ragno, è composta da un dominio relativamente grande e ripetitivo delimitato dai domini N-terminale e C-terminale³ non ripetitivi, con le proprietà meccaniche uniche di alcuni tipi di seta che sono state collegate alla ripetizione di brevi motivi all'interno del dominio ripetitivo ^4,5,6. A differenza del baco da seta di gelso (Bombyx mori), coltivato commercialmente, che produce grandi quantità di seta in un formato di bozzolo coerente adatto alla raccolta, i ragni sono organismi intrinsecamente cannibali e territoriali che producono seta in quantità limitate, ponendo così una sfida per la produzione agricola e la raccolta⁷. Date queste limitazioni, la produzione di seta di ragno ricombinante è stata sviluppata come alternativa più fattibile e sostenibile per ottenere in modo controllabile quantità sufficienti di seta di ragno per l'applicazione.

La produzione di seta di ragno ricombinante richiede la selezione di un ospite adatto per l'espressione proteica. La seta di ragno è stata espressa in vari sistemi ospiti, tra cui batteri ^8,9, lieviti^10,11, cellule di insetti¹², piante^13,14 e cellule di mammiferi^15,16, con Escherichia coli che è il sistema ospite più comunemente usato. Gli alti pesi molecolari delle spidroine, che possono raggiungere fino a 700 kDa⁷, presentano sfide significative per l'espressione di costrutti a lunghezza intera. Per produrre seta di ragno ricombinante con proprietà comparabili o migliorate rispetto a quelle delle sete di ragno naturali, la strategia primaria impiegata è l'espressione di varianti troncate, come costrutti con un numero limitato di unità ripetute (con o senza domini non ripetitivi), chimere costituite da combinazioni di diversi tipi di seta e sete ibride fuse con proteine non della seta. Ad esempio, la spidroina ampulata maggiore ricombinante (284,9 kDa) è stata espressa con successo in un E. coli metabolicamente ingegnerizzato, e la seta risultante ha mostrato proprietà meccaniche paragonabili a quelle della seta ampulata maggiore naturale⁹. Inoltre, una fibra di seta ingegnerizzata composta da due unità ripetute di spidroina piriforme e due unità ripetute di spidroina aciniforme ha dimostrato un'estensibilità superiore a una delle sete piriformi o aciniformi costituenti, paragonabile a quella della seta flagelliforme naturale¹⁷.

La produzione di proteine ricombinanti consente inoltre l'incorporazione diretta di peptidi funzionali o segmenti proteici nelle proteine della seta, consentendo la fabbricazione di biomateriali con proprietà su misura per applicazioni specifiche. Ad esempio, la fusione genetica e chimica di motivi di legame cellulare RGD con una seta geneticamente modificata derivata da importanti spidroine ampullate ha portato a film che hanno migliorato significativamente l'adesione e la proliferazione dei fibroblasti¹⁸. In uno studio separato, è stato dimostrato che un costrutto ibrido di seta costituito da un motivo legante il fattore di crescita nervoso β (NGF) fuso a una proteina chimerica comprendente due unità ripetute di spidroina aciniforme e il dominio C-terminale di una spidroina ampullata maggiore supporta la crescita e la differenziazione cellulare neuronale¹⁹.

Data l'espressione e la purificazione di una proteina della seta ricombinante, può quindi essere trasformata in varie forme come idrogel, film, fibre, nanoparticelle, schiume e spugne, a seconda dell'applicazione prevista^20,21. Per consentire la produzione di fibre di seta artificiale, sono stati sviluppati metodi di filatura che imitano alcuni aspetti del processo di filatura delle fibre naturali altamente complesso e strettamente regolamentato dei ragni. Nella seta ampullata maggiore naturale, le spidroine sono prodotte dalle cellule epiteliali nella ghiandola ampullata principale e immagazzinate in uno stato solubile all'interno del lume ad alte concentrazioni (fino al 50% (p/v))²², formando una droga rotante acquosa. Mentre la droga rotante si muove attraverso il condotto rotante, subisce cambiamenti nel pH, nella concentrazione di ioni, nel contenuto d'acqua e nelle forze di taglio sia dal restringimento del dotto che dal processo di pultrusione delle fibre, che induce la trasformazione delle proteine della seta liquida in fibre solide^23,24. L'identificazione di un solvente adatto in grado di solubilizzare o sospendere le proteine della seta ricombinanti ad alta concentrazione per formare una droga di filatura è, quindi, un primo passo fondamentale nel processo di filatura delle fibre artificiali.

Un'ampia gamma di solventi è stata impiegata per la formulazione di farmaci per la filatura delle proteine della seta e la scelta del solvente ha dimostrato di influenzare la formazione delle fibre e le proprietà meccaniche^25,26. Di conseguenza, un'attenta considerazione della selezione del solvente drogato è essenziale per ottimizzare le caratteristiche della fibra risultante. I farmaci per la filatura possono essere formulati utilizzando solventi organici o acquosi, come l'1,1,1,3,3,3-esafluoroisopropanolo (HFIP)²⁷, l'esafluoroacetone (HFA)²⁸, le miscele di acido trifluoroacetico (TFA) e 2,2,2-trifluoroetanolo (TFE)²⁶, l'acido formico²⁹ e il fosfato di sodio/tampone Tris³⁰. Poiché la solubilità delle proteine è tipicamente influenzata da fattori quali il pH, la forza ionica e la concentrazione, l'identificazione di un solvente drogato appropriato comporta generalmente la valutazione sistematica di vari solventi, l'ottimizzazione del pH e delle concentrazioni proteiche e, in alcuni casi, l'uso di miscele solvente-acqua per determinare le condizioni ottimali della droga di filatura. Inoltre, la viscosità della droga da filatura è un parametro importante da valutare prima del processo di filatura perché una soluzione di droga altamente viscosa può ostacolare il flusso del fluido durante la filatura, mentre una droga non sufficientemente viscosa in genere non sarà adatta per la formazione di fibre^31,32. Va notato che l'uso di condizioni di spin dope dure può alterare la struttura proteica in caso di esposizione prolungata; Pertanto, lo sviluppo di solventi dopanti ecologici rimane un'area attiva di ricerca.

Il disegno a mano e la filatura a umido sono due metodi comuni di filatura della fibra di seta ricombinante. Le proprietà meccaniche delle fibre prodotte con ciascun metodo dipendono fortemente sia dalle condizioni di filatura stesse che dalla lavorazione post-spin. Il disegno a mano, noto anche come filatura a disegno, è un semplice metodo di produzione di fibre in cui le fibre vengono estratte da soluzioni di proteine purificate, normalmente utilizzando una punta di pipetta, una pinza o una pinzetta, seguito dall'essiccazione all'aria e dalla caratterizzazione 33,34,35,36,37. Mentre il disegno a mano fornisce un approccio eccellente per vagliare rapidamente una varietà di condizioni di formazione delle fibre di seta e generalmente classificare il comportamento meccanico delle fibre risultante, questa tecnica non è facilmente scalabile a fibre continue lunghe (cioè di più metri di lunghezza). In alternativa, impieghiamo la filatura a umido, che applica l'estrusione continua di un farmaco di filatura a velocità costante in un bagno di coagulazione, tipicamente un solvente acquoso o organico costituito da una miscela di acqua ed etanolo o metanolo 9,15,31,38,39,40 . L'immersione della droga di filatura nel bagno di coagulazione provoca una rapida desolvatazione delle proteine, con conseguente formazione di fibre continue²⁴. Successivamente, le fibre vengono prelevate dal bagno di coagulazione a una velocità costante, abbinate alla velocità di estrusione per fornire fibre as-spun (AS) o sottoposte a un prelievo post-centrifuga per fornire fibre post-filatura (PS) che in genere hanno proprietà meccaniche migliorate. L'estrazione post-centrifuga comporta tipicamente l'allungamento delle fibre a un rapporto di 2-8 volte la loro lunghezza originale in aria, in un solvente o dopo l'immersione nel solvente, con ogni parametro che contribuisce a specifiche proprietà meccaniche 15,17,31,38.

Sebbene questo protocollo si concentri sui metodi di trafilatura a mano e a umido, è importante collocare questi metodi nel contesto. Sono stati riportati metodi di elettrofilatura per sete di ragno ricombinanti sia in condizioni acquose che organiche, consentendo la produzione di stuoie in fibra, fibre allineate e filati, con fibre tipicamente su scala nanometrica con diametro⁴¹. Ciò fornisce il potenziale vantaggio delle fibre su scala nanometrica e la sfida corrispondente se si desiderano fibre su scala micron, in genere con la necessità di eseguire l'elaborazione post-spin per indurre la trasformazione in una struttura a β fogli per migliorare la meccanica e la compatibilità con l'acqua. Nastri di seta di ragno ricombinanti multimetro di larghezza e spessore su scala micron sono stati ottenuti mediante filatura a secco da solvente organico⁴², con la recente dimostrazione che l'incorporazione di ioni metallici allo stadio di droga di spin migliora la meccanica⁴³. La filatura⁴⁴ basata sulla microfluidica, che include una recente combinazione di tecnologia di stampa 3D con filiere a microaghi progettate per imitare la filiera naturale⁴⁵, è adatta per la filatura di fibre di seta ricombinanti altamente controllabili. Nonostante l'ampia varietà di metodi segnalati come adatti per la produzione di fibre di seta (o simili alla seta), il presente protocollo descrive in dettaglio la produzione di fibre di seta ricombinanti mediante trafilatura a mano e filatura a umido poiché questi metodi si sono dimostrati traducibili in diverse varianti di seta ricombinante nelle nostre mani e forniscono un punto di partenza trattabile per lo sviluppo di biomateriali e la valutazione comparativa.

Dopo la filatura e la raccolta delle fibre, una combinazione di tecniche ottiche, meccaniche e spettroscopiche viene utilizzata di routine per caratterizzare le proprietà dopo la filatura. Ogni metodo fornisce informazioni chiave sul processo di formazione delle fibre e sulla sua correlazione con le prestazioni dei materiali. Qui, ci concentriamo su un sottoinsieme di questi metodi, notando che ci sono molte altre metodologie che forniscono informazioni chiave sulle proprietà e le prestazioni della fibra di seta. La microscopia ottica viene utilizzata per valutare la morfologia delle fibre, consentendo il confronto dei diametri delle fibre filate sia in condizioni identiche che variabili 17,31,38,46. Questa tecnica è importante anche per identificare ed eliminare i segmenti di fibra con difetti o anomalie prima della successiva caratterizzazione. Inoltre, la microscopia a luce polarizzata può essere impiegata per valutare il grado di allineamento molecolare all'interno della fibra, poiché livelli più elevati di allineamento sono tipicamente associati a proprietà meccaniche migliorate 17,26,47. La caratterizzazione meccanica viene condotta attraverso prove di trazione, in cui le curve sforzo-deformazione vengono misurate e utilizzate per quantificare parametri quali resistenza alla trazione, estensibilità, modulo di Young e tenacità, fornendo informazioni essenziali per valutare l'idoneità delle fibre in applicazioni strutturali o biomediche 17,33,48. L'ultima tecnica qui trattata, la spettromicroscopia infrarossa in trasformata di Fourier (FTIR), viene applicata per studiare la struttura secondaria delle proteine, in particolare il grado di formazione di β-sheet, poiché questo svolge un ruolo cruciale nella stabilità delle fibre e nella resistenza meccanica 17,46,49. Insieme, queste tecniche forniscono una comprensione completa della morfologia, della struttura e del comportamento meccanico delle fibre di seta prodotte in modo ricombinante.

Protocollo

In questo protocollo, partiamo dal presupposto che il punto di partenza sia una polvere proteica della seta liofilizzata. Questa sarebbe più tipicamente una proteina ricombinante della seta di ragno nel nostro lavoro. Una panoramica del protocollo è fornita nella Figura 1, con ciascuna delle seguenti cinque fasi descritte di seguito: (1) preparazione e ottimizzazione della droga per lo spinning; (2) trafilatura a mano o filatura a umido in fibra di seta; (3) valutazione del diametro delle fibre e morfologica mediante microscopia ottica; (4) valutazione meccanica mediante prove di trazione; e (5) valutazione della struttura secondaria mediante spettromicroscopia FTIR.

Figura 1: Panoramica schematica dei passaggi chiave del protocollo per la produzione, la raccolta e la caratterizzazione delle fibre proteiche di seta di ragno ricombinante. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.

1. Preparazione e ottimizzazione della droga da spinning

NOTA: Per l'ottimizzazione della soluzione di droga per la filatura delle fibre, tentare di solubilizzare concentrazioni variabili di proteina di seta di ragno ricombinante in diversi solventi per preparare soluzioni di droga (Tabella 1). Solo i solventi che dissolvono la proteina, fornendo una soluzione di droga chiara e priva di precipitati, dovrebbero essere impiegati per i tentativi di filatura delle fibre.

1. Preparazione di solventi
   1. Per ottenere 8:1:1 TFA/TFE/H₂O, misurare 800 μL di TFA, 100 μL di TFE e 100 μL di acqua ultrapura di tipo 1 in un tubo di vetro all'interno di una cappa aspirante. Mescolare accuratamente tutti i componenti. Tappare il tubo di vetro e coprirlo con parafilm per evitare l'evaporazione dei componenti volatili.
      NOTA: Preparare sempre una soluzione fresca per la filatura delle fibre.
      ATTENZIONE: Maneggiare TFA e TFE con cura, il TFA è altamente corrosivo e volatile, mentre il TFE è infiammabile e tossico. Indossare DPI adeguati, inclusi guanti, camici da laboratorio e occhiali protettivi, per evitare il contatto con la pelle e la possibilità di inalazione.
   2. Per produrre 3:1:1 TFA/TFE/H₂O, all'interno di una cappa aspirante, trasferire 300 μL di TFA, 100 μL di TFE e 100 μL di acqua ultrapura di tipo 1 in un tubo di vetro e mescolare i componenti. Tappare il tubo di vetro e coprirlo con parafilm per ridurre al minimo l'evaporazione dei componenti volatili.
      NOTA: Preparare sempre una soluzione fresca per la filatura delle fibre.
   3. Per ottenere un HFIP/H₂O 7:3, miscelare 700 μL di 1,1,1,3,3,3-esafluroro-2-propanolo (HFIP) con 300 μL di acqua ultrapura di tipo 1 per ottenere una soluzione da 1 mL. Preparare la soluzione appena quando necessario.
      ATTENZIONE: Maneggiare l'HFIP all'interno di una cappa aspirante ed evitare l'inalazione o il contatto con la pelle.
   4. Per produrre 50 mM di tampone fosfato di potassio (pH 7,5), prelevare 800 mL di acqua deionizzata in un becher e sciogliere 1,199 g di fosfato monobasico di potassio (KH₂PO₄- MW. 136,09 g/mol) e 7,173 g di fosfato di potassio bibasico (K₂HPO₄- MW. 174,18 g/mol) in esso. Miscelare accuratamente tutti i componenti e regolare il pH della soluzione con NaOH o HCl. Rabboccare il volume a 1 L con acqua deionizzata e conservare a temperatura ambiente.
   5. Per preparare 10 mM di tampone Tris-Cl (pH 8,0), sciogliere 1,21 g di Tris-cloridrato (MW. 157,60 g/mol) in 800 mL di acqua deionizzata. Regolare il pH con NaOH e rabboccare il volume finale a 1 L con acqua deionizzata. Conservare la soluzione a temperatura ambiente.
   6. Per preparare 20 mM di tampone Na-acetato (pH 5,0), in 450 mL di acqua deionizzata, sciogliere 0,55 g di acetato di sodio (MW. 82,03 g/mol) e 0,02 M (6 mL) di acido acetico. Rabboccare il volume a 500 ml con acqua deionizzata e conservare a temperatura ambiente.
   7. Per preparare 1 tampone fosfato citrato M (pH 7,0), sciogliere 11,69 g di idrogeno fosfato disodico (Na₂HPO₄- MW. 141,96 g/mol) e 1,85 g di acido citrico (MW. 192,12 g/mol) in 400 mL di acqua deionizzata. Regolare il pH della soluzione utilizzando HCl o NaOH e regolare il volume finale a 500 ml utilizzando acqua deionizzata.
   8. Per ottenere_{la soluzione di} acido formico al 98%, diluire l'acido formico al 98% mescolando 98 mL di acido formico con 2 mL di acqua deionizzata per un totale di 100 mL di soluzione. Ora, aggiungere 4 g di CaCl₂ a 100 ml di soluzione di acido formico al 98% per preparare una soluzione di acido formico al 4% p/v-CaCl₂ . Conservare la soluzione a temperatura ambiente.
      NOTA: Vedere la Tabella 1. Solo i solventi che dissolvono la proteina, fornendo una soluzione di droga chiara e priva di precipitati, dovrebbero essere impiegati per i tentativi di filatura delle fibre.
2. Preparazione della soluzione di droga per la filatura delle fibre
   1. Pesare la proteina di seta di ragno liofilizzata in base alla concentrazione desiderata (ad esempio, 10 mg per una soluzione al 10% (p/v) in 100 μl di solvente) e miscelare con il volume appropriato di solvente (ad es. 100 μl per una concentrazione del 10% (p/v)).
   2. Agitare la miscela fino a quando la polvere proteica non è completamente disciolta nel solvente.
   3. Poiché la solubilità delle proteine della seta di ragno varia a seconda del solvente e del tipo di proteina, iniziare con una bassa concentrazione proteica (10% p/v) e aumentare gradualmente la concentrazione (25-30% p/v) secondo necessità.
   4. Dopo la completa dissoluzione della proteina, valutare qualitativamente la viscosità della soluzione di droga. Se la soluzione di droga appare non sufficientemente viscosa, aumentare gradualmente la concentrazione proteica fino ad ottenere una soluzione limpida e viscosa. Utilizzare l'acqua come standard di riferimento.

Solvente	Concentrazione proteica (% - p/v)	Riferimento
8:1:1 TFA/TFE/H2O	10 – 25	19
3:1:1 TFA/TFE/H2O	10 – 30	26
7:3 HFIP/H2O	15 – 30	31
50 mM di tampone fosfato di potassio (pH 7,5)	10 – 25	50
10 mM di tampone Tris-Cl (pH 8,0)	10 – 20	34
20 mM di tampone Na-acetato (pH 5,0)	10 – 25	49
1 tampone citrato fosfato 1 M (pH 7,0)	10 – 25	51
Acido formico al 98% – CaCl2	20 – 25	52

Tabella 1: Solventi e concentrazioni proteiche raccomandati per la preparazione di farmaci per la filatura delle fibre.

2. Filatura e raccolta delle fibre

NOTA: Fare riferimento alla Figura 2 per una rappresentazione schematica del disegno a mano e alla Figura 3 per le varie configurazioni del dispositivo di filatura a umido descritte di seguito.

Figura 2: Disegno a mano di fibre di seta di ragno. (A) Una cornice di carta a forma di C viene preparata e fissata a un vetrino con nastro trasparente a sinistra e nastro biadesivo a destra per consentire il disegno delle fibre da sinistra a destra. (B) Una goccia di droga da filatura viene posizionata sul nastro trasparente e una singola fibra viene tirata a mano sul nastro biadesivo attraverso l'apertura del telaio a forma di C utilizzando una punta di pipetta in plastica. (C) La fibra è fissata al telaio di carta sul vetrino utilizzando del nastro adesivo sui lati sinistro e destro. (D,E) Dimostrazione del processo rappresentativo ( D) di trafilatura a mano per una seta di ragno ricombinante efficacemente solubilizzata in una droga di spin e (E) la fibra risultante prima di essere fissata con nastro adesivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Filatura a umido di fibre di seta di ragno. In tutti i casi, la droga rotante viene posta in una siringa ermetica di vetro ed estrusa a una velocità costante utilizzando una pompa a siringa attraverso un ago metallico con estremità smussata (cioè la filiera) in un bagno di coagulazione (ad esempio, etanolo al 95%). (A) Le fibre non filate vengono raccolte sul rullo 1, ruotando sotto il controllo del computer a una velocità corrispondente alla velocità di estrusione. (B) Lo stiramento post-centrifuga in aria si ottiene guidando le fibre attraverso il rullo 1 e raccogliendole sul rullo 2, che ruota a un multiplo della velocità del rullo 1 (ad esempio, il doppio della velocità per un rapporto di trazione 2x). Analogamente, le fibre possono essere prodotte (C) dopo l'immersione in solvente (ad esempio, etanolo al 40%, acqua, ecc. a seconda di una data seta) guidando le fibre dal rullo 1 al rullo 3 (immerse in un bagno di solvente e ruotanti alla stessa velocità del rullo 1) prima di guidarle sul rullo 2 (ruotando a un multiplo della velocità dei rulli 1 e 3); o (D) in solvente guidando le fibre dal rullo 1 al rullo 3 (immerse in un bagno di solvente e rotanti alla stessa velocità del rullo 1), quindi al rullo 4 (anch'esso immerso nel solvente e rotante a un multiplo della velocità dei rulli 1 e 3) prima della raccolta sul rullo 2 (velocità corrispondente a quella del rullo 4). La configurazione modulare significa che varie permutazioni nelle condizioni di filatura delle fibre possono essere facilmente testate, certamente non limitate alle quattro mostrate schematicamente qui. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Disegno a mano
   1. Preparare una cornice di carta a forma di C con una finestra di 1 cm x 0,5 cm (l x p) e posizionarla su un vetrino (Figura 2). Fissare la parte superiore del telaio di carta al vetrino utilizzando del nastro adesivo. Applicare del nastro trasparente a un braccio del telaio di carta per creare una superficie idrofobica per la deposizione della soluzione di droga e attaccare il nastro biadesivo al braccio opposto per il fissaggio delle fibre.
   2. Depositare 10-20 μL di soluzione di droga rotante sul nastro trasparente a temperatura ambiente (22 ± 2 °C).
   3. Immergere un puntale per pipetta in plastica da 200 μl nella gocciolina di soluzione di droga ed estrarlo verticalmente dalla soluzione con una velocità costante (~6 mm/s), consentendo l'estrazione delle fibre dalla soluzione.
   4. Guida la fibra tirata a mano attraverso il finestrino del telaio e attaccala al nastro biadesivo. Asciugare la fibra all'aria a temperatura ambiente, quindi fissare entrambe le estremità delle fibre con del nastro adesivo aggiuntivo.
   5. Concentrarsi sulla parte di fibra che attraversa il telaio di carta per la successiva caratterizzazione.
2. Filatura a umido
   1. Costruire un dispositivo di filatura a umido, con l'apparato qui descritto che ha capacità di controllo del motore migliorate rispetto alle precedenti iterazioni^31,38.
      1. Fabbricare una piastra di montaggio in metallo rigido tenuta verticalmente e lavorata con una configurazione appropriata per collegare un set di motori passo-passo (vedere la Figura 3). Ogni montaggio del motore richiede fori praticati per consentire l'imbullonamento sicuro dei motori passo-passo sul retro della piastra di montaggio (ad esempio, quattro fori adeguatamente distanziati e dimensionati) e un quinto foro per consentire il passaggio dell'albero motore.
      2. Scegli motori passo-passo bipolari con passo di 1,8°, coppia di tenuta di 45 N∙cm, albero lungo 24 mm e diametro 5 mm con taglio a "D" lungo 15 mm, corpo 39 mm, corrente nominale 1,50 A, resistenza di fase 2,3.
      3. Sviluppare un sistema per controllare la velocità e la direzione di rotazione per ciascun motore, come quello utilizzato in precedenza per una varietà di tipi di fibra di seta 17,53,54, che utilizza un'interfaccia utente grafica (GUI) codificata in Python per un Raspberry Pi collegato a diversi controller per motori passo-passo come descritto in https://github.com/raineylab/MotorController.git.
      4. Per la filatura, collegare ciascun motore utilizzato in una data configurazione di filatura a un cilindro metallico lavorato (diametro 6 cm, lunghezza 8 cm per quelli nelle posizioni 1 e 2 nella Figura 3, rulli scanalati con diametro di 9 cm alle due estremità che si assottigliano fino a un diametro di 6 cm al centro del rullo, lunghezza di 7 cm nelle posizioni 3 e 4 nella Figura 3; vedere, ad esempio, la Figura 4 per una configurazione di esempio).
      5. Per la filiera (Figura 3), utilizzare una siringa di vetro da 0,25 ml con un ago metallico fissato in modo permanente con un'estremità smussata (diametro interno 0,127 mm) montato in una pompa a siringa che estrude la droga di centrifuga a una velocità controllata in un bagno di coagulazione.
   2. Centrifugare la soluzione di droga a 20.000-21.000 × g per 30 minuti a temperatura ambiente e raccogliere il surnatante per la filatura delle fibre.
      NOTA: Rimuovere il particolato residuo per evitare l'intasamento dell'ago di estrusione durante la filatura a umido.
   3. Caricare 50-80 μL di soluzione di droga rotante nella siringa che funge da filiera.
   4. Fissare la siringa in una pompa a siringa e impostare l'estrusione a una velocità di 600 μL/h.
      NOTA: Regolare e ottimizzare la velocità di estrusione per consentire la formazione di fibre per una data condizione di droga di filatura delle proteine.
   5. Preparare il bagno di coagulazione (95% etanolo/5% acqua deionizzata, v/v).
   6. Posizionare la pompa a siringa in modo che l'ago della siringa contenente la soluzione di droga sia immerso nel bagno di coagulazione.
   7. Collegare i rulli all'apparato di filatura, regolare la velocità dei rulli utilizzando il software di controllo del motore e accendere i motori necessari per una determinata configurazione di rotazione.
      NOTA: Far corrispondere la velocità di rotazione del rullo 1 alla velocità di estrusione. Le velocità di estrusione di 400 μL/h o 600 μL/h corrispondono a 6 giri/min o 9 giri/min per il rullo 1. Se viene impartita un'estrazione post-giro, uno o più rulli 2-4 devono essere impostati per ruotare corrispondentemente più velocemente.
   8. Avviare la pompa a siringa e utilizzare una pinzetta per guidare la fibra che si forma nel bagno di coagulazione in uno dei seguenti modi.
      1. Per raccogliere le fibre AS, guidare la fibra formata nel bagno di coagulazione sul primo rullo (velocità uguale alla velocità di estrusione) per la raccolta.
      2. Per eseguire lo stretching post-centrifuga in aria, impostare la velocità di rotazione del rullo 2 su un multiplo di quella del rullo 1. Guidare la fibra dalla coagulazione sul rullo 1 senza avvolgere il rullo 1 e raccoglierla sul rullo 2.
         NOTA: Un rapporto di trazione post-centrifuga di 2x richiede che la velocità di rotazione del rullo 2 sia doppia rispetto a quella del rullo 1; 3x, triplo; e così via.
      3. Per eseguire lo stretching post-centrifuga dopo l'immersione nel solvente, riempire il bagno di solvente con il solvente desiderato (ad es. acqua deionizzata; etanolo 2:3 v/v/H₂O; ecc.) e guidare la fibra dal bagno di coagulazione attorno al rullo 1 (velocità di rotazione abbinata alla velocità di estrusione), attorno al rullo 3 (velocità di rotazione uguale al rullo 1) nel bagno di solvente, e raccogliere la fibra sul rullo 2 in aria (che ruota a una velocità maggiore rispetto ai rulli 1 e 3).
         NOTA: La velocità di rotazione del rullo 2 rispetto ai rulli 1 e 3 determinerà il rapporto di trazione post-centrifuga come al punto 2.2.8.2.
      4. Per eseguire lo stiramento post-centrifuga nel solvente, riempire il bagno di solvente con il solvente desiderato (ad es. acqua deionizzata; etanolo 2:3 v/v/H₂O; ecc.) e guidare la fibra dal bagno di coagulazione attorno al rullo 1 (velocità di rotazione abbinata alla velocità di estrusione), intorno al rullo 3 (velocità di rotazione uguale al rullo 1) nel bagno di solvente, attorno al rullo 4 nel bagno di solvente (velocità di rotazione multipla di quella dei rulli 1 e 3) e raccogliere la fibra sul rullo 2 in aria (velocità di rotazione abbinata al rullo 2).
         NOTA: La velocità di rotazione dei rulli 2 e 4 rispetto a quella dei rulli 1 e 3 determinerà il rapporto di trazione post-centrifuga come al punto 2.2.8.2.
         Raccogliere le fibre in condizioni ambientali controllate per evitare l'influenza dell'umidità e della temperatura sul comportamento delle fibre. Puntiamo a un'umidità relativa ~ 28,2 ± 2,4% e una temperatura ~ 28,0 ± 2,2 °C.

Figura 4: Passaggi chiave nella filatura a umido delle fibre di seta di ragno. (A) Estrusione di droga in bagno di coagulazione seguita dalla raccolta delle fibre (il rettangolo rosso a sinistra evidenzia l'ago utilizzato per l'estrusione della droga; il rettangolo rosso a destra è il percorso della fibra di seta filata a umido. (B) Illustrazione della fibra sottoposta a stiramento post-centrifuga in aria (rettangolo rosso per guidare l'occhio). (C) Illustrazione dello stiramento post-centrifuga della fibra dopo l'immersione in acqua (rettangolo rosso per guidare l'occhio). (D) Fibra di seta ricombinante continua raccolta su un rullo (ad esempio, fibra avvolta alla freccia rossa). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Valutazione al microscopio ottico delle fibre

1. Montaggio in fibra
   1. Crea un portacarta a forma di C tagliando un quadrato di 1 x 1 cm da un foglio di carta rettangolare di 3 x 2 cm (Figura 5).
   2. Fissare il supporto a forma di C a un vetrino da microscopio utilizzando del nastro adesivo.
   3. Applicare due pezzi di nastro biadesivo su entrambi i lati della fessura di 1 cm del portarotolo a forma di C.
   4. Togliete una fibra dal rullo su cui è stata raccolta e tagliate un segmento lungo circa 2 cm.
      NOTA: Evitare l'uso di una forza eccessiva durante la manipolazione delle fibre per evitare la deformazione del materiale o altre alterazioni delle proprietà.
   5. Posizionare il segmento di fibra sulla parte superiore del nastro biadesivo, assicurandosi che l'asse lungo della fibra sia allineato parallelamente al bordo inferiore del supporto (Figura 5).
   6. Fissare la fibra con del nastro adesivo sopra il nastro biadesivo su entrambi i lati.
   7. Attaccare un ulteriore pezzo di nastro adesivo per fissare saldamente la parte inferiore del portacarta al vetrino per evitare il movimento della fibra fino all'uso.
   8. Conservare le fibre montate in una scatola di stoccaggio per vetrini fino al momento dell'uso per l'imaging e le prove di trazione.
2. Determinazione del diametro e valutazione dei difetti
   1. Esaminare le fibre montate utilizzando la microscopia ottica. Innanzitutto, setacciare l'intera lunghezza della fibra per individuare eventuali imperfezioni visibili, come strizioni, torsioni, rigonfiamenti o doppie fibre. Se si osservano difetti, escludere tali fibre dai test meccanici.
   2. Per le fibre che sembrano prive di difetti, eseguire tre micrografie con ingrandimento 10x lungo l'asse lungo della fibra, una al centro e una vicino a ciascuna estremità della fibra.
   3. Misura del diametro delle fibre utilizzando il software ImageJ⁵⁵ :
      1. In ImageJ, andare al menu Analizza e selezionare Imposta scala (File supplementare 1 - Figura supplementare S1). Regolare la scala in base alle impostazioni di calibrazione del microscopio e impostare l'unità di misura su micrometri (μm) (File supplementare 1 - Figura supplementare S2).
      2. Utilizzando lo strumento linea, disegna una linea retta perpendicolare all'asse lungo della fibra che si estende da un bordo all'altro della fibra.
      3. Per ogni micrografia, misurare il diametro della fibra in sei diverse regioni lungo la fibra.
      4. Dopo aver disegnato ciascuna linea, fare clic su Misura nel menu Analizza per visualizzare il diametro della fibra (File supplementare 1 - Figura supplementare S3).
3. Valutazione qualitativa dell'allineamento molecolare mediante microscopia a luce polarizzata
   1. Utilizzare la microscopia a luce polarizzata per valutare l'allineamento molecolare all'interno della fibra dopo la valutazione del diametro e del difetto mediante microscopia ottica.
      1. Esamina la fibra utilizzando un microscopio ottico invertito dotato di un tavolino girevole, un cursore dell'analizzatore fisso e un polarizzatore ruotabile di 90°.
      2. Posizionare la fibra a circa 45° rispetto alla luce polarizzata sul piano incidente per massimizzare la luminosità dovuta alla birifrangenza, migliorando la visibilità della struttura molecolare.
      3. Scatta un'immagine della fibra in queste condizioni per valutarne la birifrangenza.
         NOTA: Un'elevata birifrangenza suggerisce una struttura molecolare ben allineata, mentre una birifrangenza bassa o assente suggerisce una struttura più amorfa o orientata in modo casuale.

Figura 5: Montaggio della fibra di seta di ragno su un vetrino che consente l'analisi a valle utilizzando un supporto di carta a forma di C e una serie di strati di nastro adesivo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Prove di trazione

NOTA: Un dispositivo per prove di trazione adatto per una valutazione accurata delle fibre di seta può essere facilmente prodotto a un costo relativamente basso^25,56. In breve, fabbricare una coppia di morsetti in acciaio inossidabile per consentire una presa salda di ciascuna estremità di ciascuna fibra in un telaio a forma di C che viene testato (ad esempio, Figura 6). Collegare uno di questi morsetti a un peso posto su una bilancia analitica e l'altro a una pompa a siringa. La pompa a siringa deve essere configurata in modo da consentire una trazione costante a una velocità di deformazione impostata. La bilancia analitica deve essere interfacciata con un computer per la raccolta dei dati di peso/massa registrati in funzione del tempo.

Figura 6: Diagramma schematico che mostra le fasi preparatorie per la prova di trazione. (A) Il portacarta con fibra (vedere la Figura 5 per la configurazione) viene staccato dal vetrino e montato verticalmente utilizzando una clip fissata a un peso. (B) Questo morsetto ponderato è posizionato sulla bilancia analitica e la parte superiore del supporto della carta è fissata a un morsetto fissato a un'asta fissata saldamente in una pompa a siringa. Il portacarta viene tagliato orizzontalmente al centro prima di iniziare la prova di trazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Acquisizione dati curva sforzo-deformazione
   1. Dopo aver misurato il diametro della fibra, eseguire la prova di trazione sulla stessa fibra con un apparecchio costruito in casa (Figura 6).
      1. Staccare il telaio di carta a forma di C che tiene la fibra dal vetrino e fissarlo a un morsetto fissato a un peso (Figura 6A).
      2. Collegare la bilancia analitica al software di registrazione/controllo dei dati e accedere al Workbench (File supplementare 1 - Figura supplementare S4).
      3. Imposta l'esperimento nel software di controllo dell'equilibrio facendo clic sul pulsante Start . Immettere il nome dell'esperimento quando richiesto (File supplementare 1 - Figura supplementare S5).
      4. Assicurarsi che la bilancia analitica sia vuota e posizionare il morsetto ponderato con la fibra su di essa.
      5. Fissare la parte superiore del telaio di carta a un morsetto collegato alla pompa a siringa e tagliare un lato del supporto della carta per consentire alla fibra di muoversi liberamente (Figura 6B).
         NOTA: Assicurarsi che entrambi i morsetti siano paralleli tra loro e che la fibra sia centrata all'interno del morsetto a una lunghezza del calibro di 10 mm.
      6. Tarare la bilancia per azzerare la massa del peso e bloccare, quindi premere il pulsante Run sulla pompa a siringa e fare clic su OK nel software di controllo della bilancia (File supplementare 1 - Figura supplementare S6).
      7. Quando la fibra si rompe, premere Stop sulla pompa a siringa e il pulsante Sì nel software di controllo della bilancia (File supplementare 1 - Figura supplementare S7) per registrare il peso misurato in funzione del tempo.
      8. Trasferisci i dati su un foglio di calcolo o su un altro pacchetto software di elaborazione dati adatto per l'elaborazione. Copiare il registro dei dati relativi al peso rispetto al tempo negli appunti e incollarlo nel foglio di calcolo delle prove meccaniche fornito (file supplementare 2) o esportando i dati come file di testo e importandoli con l'analisi appropriata.
2. Elaborazione dei dati della curva sforzo-deformazione
   NOTA: Il seguente protocollo si basa sul foglio di calcolo per le prove meccaniche formattato per l'uso in Microsoft Excel (File supplementare 2).
   1. Assicurarsi che i parametri sperimentali siano corretti (Colonna C).
   2. Aggiungi le registrazioni di massa in funzione del tempo al foglio di calcolo (la "Massa netta" nella colonna F). Se sono stati registrati valori di massa prima dell'inizio dell'allungamento, rimuovere questi valori eliminando le celle corrispondenti con uno spostamento dei dati verso l'alto. Se sono presenti valori di massa registrati dopo la rottura della fibra, eliminare queste celle di dati.
   3. Compila automaticamente i valori di indice nella colonna E aggiungendo incrementi di 1 in modo che il numero totale di indici corrisponda al numero totale di valori di massa misurati nella colonna F.
   4. Riscalare la massa netta in modo che inizi a 0 g e aumenti durante l'esperimento di stretching sottraendo la massa netta iniziale da ciascun valore di massa netta e moltiplicando questa differenza per -1 (colonna G).
   5. Calcolare la variazione della lunghezza della fibra ad ogni misurazione moltiplicando l'indice di misurazione per la velocità di trazione della pompa a siringa e il ritardo tra le misurazioni di massa registrate (colonna H).
   6. Calcolare la deformazione ingegneristica dividendo la variazione della lunghezza della fibra per la lunghezza originale (Colonna I).
      NOTA: Questo calcolo fornisce la deformazione ingegneristica in mm/mm. Per convertire i valori di deformazione ingegneristica in %, moltiplicare i valori nella colonna I per il 100%.
   7. Registrare l'estensibilità come valore massimo di deformazione ingegneristica (cella T3).
   8. Calcolare la forza (in N) necessaria per ottenere ogni variazione di lunghezza registrata convertendo la massa da g a kg e moltiplicandola per la gravità standard (9,81 m/s²; Colonna J).
   9. Calcolare la sollecitazione ingegneristica (in Pa) dividendo la forza determinata a un dato grado di estensione per l'area della sezione trasversale della fibra e moltiplicare per ^10-6 per convertire in MPa (colonna K).
   10. Registrare la sollecitazione massima osservata come sollecitazione ultima (cella U3) e la sollecitazione a rottura come valore di sollecitazione finale registrato prima della rottura della fibra (cella V3).
   11. Calcolare l'area sotto la curva sforzo-deformazione per ottenere la tenacità utilizzando la regola trapezoidale per calcolare l'area sotto la curva dopo ogni misurazione (Colonna L). Somma queste aree per trovare la tenacità (Cella W3).
   12. Calcola il modulo di Young (in MPa) determinando la pendenza della regione lineare iniziale della curva sforzo-deformazione utilizzando la funzione LINEST. Converti in GPa moltiplicando per 10³ (Cella X3).

5. Spettromicroscopia infrarossa in trasformata di Fourier (FTIR)

1. Preparare un campione per FTIR fissando un secondo vetrino sul fondo di un vetrino preparato per la microscopia ottica.
2. Immagine ottica e raccolta spettrale FTIR
   1. Riempire il dewar del rivelatore con azoto liquido per raffreddare il rilevatore.
   2. Aprire il software di controllo dello strumento FTIR.
   3. Nella finestra Visualizza e raccogli (File supplementare 1 - Figura supplementare S8) aprire la scheda Raccolta , impostare Modalità raccolta su ATR e Rivelatore su Raffreddato (File supplementare 1 - Figura supplementare S9).
   4. Posizionare la diapositiva nel supporto per diapositive e posizionare il supporto sul tavolino.
   5. Impostare l'illuminazione superiore su 100 e l'apertura e l'illuminazione inferiore su 0.
   6. Focalizzare il centro del campo visivo per l'immagine del campione al microscopio ottico sulla fibra utilizzando il joystick fisico o il joystick digitale nel software per controllare la posizione del centro del campo visivo e il piano focale.
   7. Impostare la modalità di raccolta su Mappa (File supplementare 1 - Figura supplementare S8).
   8. Selezionare la regione da riprendere e misurare utilizzando lo strumento Vista mappa - Area. Fare clic e trascinare il cursore per specificare la regione per la quale gli spettri devono essere acquisiti nell'anteprima della micrografia (File supplementare 1 - Figura supplementare S8). Ogni cerchio sull'immagine rappresenta uno spettro acquisito in quella posizione. Se necessario, modificare i bordi di questa casella passando il cursore sopra un determinato bordo della casella, quindi facendo clic e trascinando nella posizione desiderata. Traslare l'intera casella facendo clic e trascinando all'interno del rettangolo. Modificate l'area della casella e il numero di punti dati in Stage, Apertura e Visualizzazione (File supplementare 1 - Figura supplementare S10).
   9. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'anteprima della micrografia e selezionare Cattura mosaico per salvare l'immagine (File supplementare 1 - Figura supplementare S8).
   10. Impostare la pressione ATR facendo clic sul menu a discesa Profilo di pressione corrente . Per le fibre proteiche, utilizzare una pressione del 2% (cioè la pressione ATR più bassa possibile) per ridurre al minimo i danni alla fibra (File supplementare 1 - Figura supplementare S8).
   11. Inserire la punta ATR FTIR.
   12. Fare clic sul pulsante Raccogli (File supplementare 1 - Figura supplementare S8) per acquisire uno spettro di fondo e quindi lo spettro in ciascuno dei punti selezionati. Al termine della raccolta, i dati verranno visualizzati in una nuova finestra.
3. Preparazione dei dati per l'analisi a valle
   1. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sulla mappa di calore o sulla micrografia per visualizzare lo spettro acquisito nella posizione corrispondente (File supplementare 1 - Figura supplementare S11).
   2. Fare clic con il pulsante destro del mouse su uno spettro da analizzare e selezionare Copia (File supplementare 1 - Figura supplementare S11).
   3. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla barra di Windows nella parte superiore dello schermo e selezionare Nuova finestra (File supplementare 1 - Figura supplementare S11).
   4. Fare clic sul pulsante Incolla nella parte superiore dello schermo quando si apre la nuova finestra (File supplementare 1 - Figura supplementare S11).
   5. Utilizzare lo stesso approccio per copiare e incollare qualsiasi altro spettro desiderato per l'analisi in questa finestra.
   6. Evidenziare uno o più spettri premendo Ctrl mentre si fa clic su ciascuno spettro desiderato o evidenziando gli spettri desiderati nel menu a discesa.
   7. Fare clic su Salva con nome... e salvare i file come file .spa per analizzare i dati nel software di controllo dello spettrometro o come .csv per analizzare i dati in un altro pacchetto software (File supplementare 1 - Figura supplementare S12).
4. Analisi della derivata seconda con software specifico per lo strumento
   1. Aprire gli spettri da analizzare nel pacchetto software di elaborazione e analisi spettrale specifico dello strumento.
   2. Per convertire tra le modalità % di trasmittanza e assorbanza, utilizzare Ctrl+A (% di trasmittanza in assorbanza) o Ctrl+T (da assorbanza a % di trasmittanza).
   3. Seleziona la regione di interesse facendo clic su Visualizza | Limiti di visualizzazione (o, Ctrl+D) (File supplementare 1 - Figura supplementare S13A). Per visualizzare le bande dell'ammide I (1.700-1.600 ^cm-1) e dell'ammide II (1.600-1.500 ^cm-1), in particolare, impostare i limiti dell'asse X iniziale e finale sui numeri d'onda appropriati. Se si analizzano più spettri, selezionare Applica a tutti gli spettri. Fare clic su OK (File supplementare 1 - Figura supplementare S13B).
   4. Per tracciare la derivata seconda, fare clic su Elabora | Derivato... e scegliere Secondo dal menu a discesa (File supplementare 1 - Figura supplementare S14A). Selezionate la derivata di Norris con una lunghezza del segmento di 5 e uno spazio tra i segmenti di 5 (File supplementare 1 - Figura supplementare S14B). I minimi dello spettro della derivata seconda coincidono con i picchi delle componenti all'interno dello spettro di assorbanza originale.
      1. Se lo spettro è troppo rumoroso per valutare i minimi, attenuare lo spettro facendo clic su Elabora>Livellamento automatico (File supplementare 1 - Figura supplementare S15). Quindi, calcola la derivata seconda e trova i minimi.
   5. Mettere in relazione i numeri d'onda ai minimi della derivata seconda con le posizioni delle bande caratteristiche per le strutture secondarie utilizzando una tabella di riferimento (ad esempio, Tabella 2) per ottenere informazioni sulla struttura secondaria della proteina.
5. Deconvoluzione dei picchi utilizzando un software di analisi specifico per lo strumento
   1. Impostare l'area di visualizzazione sull'area da decontorcere come al punto 5.4.3. Solo questa regione sarà deconvoluta.
   2. Linea di base Correggere la regione spettrale selezionata utilizzando uno dei seguenti metodi:
      1. Fare clic su Elabora | Correzione automatica della linea di base (File supplementare 1 - Figura supplementare S16); o
      2. Fare clic su Elabora | Linea di base corretta (File supplementare 1 - Figura supplementare S17A), quindi selezionare Lineare dal menu a discesa e specificare la regione spettrale da correggere con la linea di base sullo spettro di posizione facendo clic e trascinando i due punti che specificano i limiti inferiore e superiore della regione da correggere ai fini della deconvoluzione. Quindi, selezionare Aggiungi alla finestra nel secondo menu a discesa e fare clic sul pulsante Aggiungi (File supplementare 1 - Figura supplementare S17B).
   3. Con lo spettro corretto della linea di base selezionato, fare clic su Analizza | Picco di risoluzione... per aprire la finestra Peak Resolve (File supplementare 1 - Figura supplementare S18).
   4. Selezionare gli spettri e le curve da analizzare utilizzando la barra di selezione sul lato sinistro dello schermo.
   5. Scegliere Gaussiano/Lorentziano con un'impostazione di sensibilità di Basso e FWHH di 2 nella scheda Trova picchi , quindi fare clic sul pulsante Trova picchi (File supplementare 1 - Figura supplementare S19).
   6. Fare clic sul pulsante Picchi per aprire una tabella che descrive i picchi.
      1. Se sono stati selezionati più picchi di quanto sia fisicamente ragionevole, fare clic su Elimina picco fino a ottenere il numero corretto di picchi per l'analisi (File supplementare 1 - Figura supplementare S20). Ad esempio, per la regione dell'ammide I, in letteratura sono tipicamente riportati 5-11 picchi (Tabella 2).
      2. Per assicurarsi che tutti i picchi siano positivi dopo l'adattamento, fare clic su Modifica picco e impostare l'altezza minima su 0. Quindi, fare clic su Avanti e ripetere per ogni picco, quindi su OK per chiudere la finestra di modifica (File supplementare 1 - Figura supplementare S21).
      3. Se nella deconvoluzione finale devono essere presenti numeri d'onda specifici, fare clic su Modifica picco e fissare il centro del picco sul numero d'onda specificato nella casella Valore selezionando Fisso oppure fornire un intervallo utilizzando le caselle Limite inferiore e Limite superiore . Fare clic su OK per applicare queste impostazioni al picco specificato.
         NOTA: In questa fase, è ottimale utilizzare le posizioni dei picchi rilevate durante l'analisi della derivata seconda o i picchi da una tabella di riferimento delle strutture secondarie FTIR, idealmente annotate per un tipo di campione di seta simile (ad esempio, Tabella 2).
   7. Fare clic sul pulsante Adatta picchi (File supplementare 1 - Figura supplementare S22).
      1. Se l'algoritmo di adattamento dei picchi non converge correttamente, fare nuovamente clic su Adatta picchi per continuare ad adattare i picchi in modo iterativo.
   8. Fai clic sul pulsante Picchi... per ottenere informazioni su posizione, altezza, FWHH e l'area di tutte le cime che erano adatte.
      1. Questi picchi possono essere copiati negli Appunti facendo clic su Appunti per consentirne l'incollaggio in un'altra finestra o file (File supplementare 1 - Figura supplementare S23).
      2. Copiare i picchi e gli spettri in un'altra finestra selezionando la destinazione nel menu a discesa di selezione della finestra accanto al pulsante Aggiungi (File supplementare 1 - Figura supplementare S24).
      3. Fare clic sul pulsante Seleziona tutto e utilizzare File | Salva con nome per salvare i picchi e gli spettri come file .spa e/o .csv (File supplementare 1 - Figura supplementare S25).
   9. Mettete in relazione ogni picco componente con una struttura secondaria utilizzando una tabella di riferimento. L'area relativa dei picchi corrispondenti a una data struttura secondaria rispetto all'area totale di tutti i picchi assegnati fornisce la proporzione della proteina che ha quella struttura secondaria.
6. Preparazione dei dati per l'analisi a valle utilizzando software di terze parti
   1. Aprire una cartella di lavoro e caricare i dati spettrali nel software di elaborazione e analisi spettrale di terze parti selezionando l'icona Dati | Connetti al file | Voce di menu Testo/CSV (File supplementare 1 - Figura supplementare S26). Seleziona il file desiderato in Esplora file e fai clic su Apri.
   2. Tracciare lo spettro evidenziando le colonne da tracciare e selezionando l'icona Traccia | Base 2D | Voce di menu Riga (File supplementare 1 - Figura supplementare S27).
   3. Fare doppio clic sull'asse x e utilizzare la scheda Scala per regolare l'intervallo in modo che si adatti al picco dell'Amide I (File supplementare 1 - Figura supplementare S28).
   4. Se i dati sono molto rumorosi, smussare la curva scegliendo il pulsante Analisi | Elaborazione del segnale>Smooth>Apri finestra di dialogo... voce di menu (File supplementare 1 - Figura supplementare S29A).
      1. Impostare l'opzione Ricalcola su Auto, il Metodo su Savitzky-Golay, i Punti della finestra su 5, la Condizione al contorno su Nessuno e l'Ordine polinomiale su 2 (File supplementare 1 - Figura supplementare S29B).
      2. Fare clic su OK per elaborare.
7. Analisi delle derivate seconde con software di terze parti
   1. Seleziona l'icona Analisi | Matematica | Differenziare | Apri finestra di dialogo... (File supplementare 1 - Figura supplementare S30).
   2. Impostare l'opzione Ricalcola su Auto, impostare l'ordine delle derivate su 2, selezionare l'opzione Traccia curva derivata e fare clic su OK (File supplementare 1 - Figura supplementare S31).
   3. Se la curva della derivata seconda risultante è molto rumorosa, seguire i passaggi 5.7.1. e 5.7.2, selezionando Savitzky-Golay Smooth nella scheda Smooth della finestra di dialogo Differenzia .
   4. Come in 5.4.5, mettere in relazione i numeri d'onda ai minimi della derivata seconda con le strutture secondarie.
8. Deconvoluzione dei picchi utilizzando software di terze parti
   1. Dopo aver cliccato sul grafico dello spettro di assorbanza dell'ammide I, selezionare l'icona Analisi | Picchi e linea di base | Analizzatore di picco | Apri finestra di dialogo... (File supplementare 1 - Figura supplementare S32).
   2. Nella finestra di dialogo Obiettivo - Adatta picchi (Pro), impostare l'opzione Ricalcola su Auto, selezionare Adatta picchi e fare clic su Avanti. (File supplementare 1 - Figura supplementare S33A).
   3. Nella finestra di dialogo Modalità linea di base , impostare il parametro Modalità linea di base su Linea retta e fare clic su Avanti (File supplementare 1 - Figura supplementare S33B).
   4. Nella finestra di dialogo Trattamento di base , selezionare Sottrai automaticamente linea di base, fare clic sul pulsante Sottrai ora , quindi fare clic su Avanti (File supplementare 1 - Figura supplementare S33C).
   5. Nella finestra di dialogo Trova picchi , disabilitare Abilita ricerca automatica e fare clic su Aggiungi.
      1. Fare doppio clic sulla finestra contenente il grafico di uno spettro con i picchi da adattare.
      2. Selezionare i picchi in base ai minimi osservati nella derivata seconda (passaggio 5.7.4) o nelle tabelle di riferimento (ad esempio, Tabella 2).
      3. Fare clic su Fine , quindi su Avanti (File supplementare 1 - Figura supplementare S33D).
   6. Nella finestra di dialogo Adatta picchi (Pro), selezionate Genera report dal risultato del raccordo corrente (Generate Report from Current Fitting Result ) e fate clic su Adatta (Fit). seguito da Fine (File supplementare 1 - Figura supplementare S33E).
   7. Valutare la scheda PeakProperties1 della cartella di lavoro per visualizzare il centro, l'area integrata e l'FWHM di ogni picco (File supplementare 1 - Figura supplementare S34). Come nel passaggio 5.5.9, mettere in relazione ogni picco componente con un tipo di struttura secondaria e valutare la percentuale della struttura proteica con quella struttura secondaria.

Intervallo del numero d'onda (cm-1)	Incarico
1605-1615	Catene laterali Tyr/Filamenti β aggregati
1616-1621	Filamenti di β aggregati/Fogli di β intramolecolari [debole]
1622-1627	Fogli di β intermolecolari [forte]
1628-1637	Fogli di β intramolecolari [strong]
1638-1646	Bobina casuale/Catene estese
1647-1655	Bobina casuale
1656-1662	α-eliche
1663-1696	Si trasforma
1697-1703	Fogli β intermolecolari [debole]

Tabella 2: Assegnazioni delle bande vibrazionali della regione ammidica I per la seta di Bombyx mori sulla base della valutazione comparativa di diversi studi di Hu et ^al.57.

Risultati

Una soluzione di droga filabile ideale è una soluzione limpida, priva di precipitati e viscosa, che indica la completa dissoluzione delle proteine (Figura 7A). Al contrario, la dissoluzione incompleta provoca una sospensione lattiginosa o precipitati visibili (Figura 7B, C). Il tempo necessario per la completa dissoluzione delle proteine varia in funzione del solvente, con alcuni solventi, come le miscele TFA/TFE/H₂O, che in genere dissolvono completamente le proteine entro un intervallo di tempo di 30 minuti, mentre altri, come l'HFIP, possono richiedere un'agitazione notturna insieme a vortici occasionali.

Figura 7: Ottimizzazione della soluzione di droga rotante. (A) Un solvente in grado di sciogliere completamente la proteina fornisce una soluzione di droga limpida e viscosa che può essere filata. La dissoluzione parziale o la sospensione della proteina mediante una scelta di solvente non ottimale può provocare (B) uno stato eccessivamente viscoso, solitamente con precipitato visibile o (C) una sospensione lattiginosa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La Figura 2E mostra una fibra rappresentativa disegnata a mano, mentre la Figura 4D mostra una fibra filata a umido avvolta. Prima di qualsiasi analisi a valle, la microscopia ottica è essenziale per valutare la qualità delle fibre. Nella Figura 8 sono mostrate micrografie ottiche rappresentative di fibre di seta ricombinanti filate a umido adatte per l'analisi a valle e filate utilizzando due diverse condizioni (vedere la Figura 3 per le configurazioni di filatura a umido del campione). Al microscopio ottico (Figura 8A), è chiaro che queste fibre mostrano un diametro uniforme, con un diametro diminuito apparente dopo l'applicazione di un prelievo post-spin (cioè, as-spun (AS) vs. post-spun allungato a un rapporto 4x in etanolo al 40% (4x-EtOH)). Il maggior grado di birifrangenza che si traduce in un maggiore contrasto nella microscopia a luce polarizzata (Figura 8B) è coerente con un migliore allineamento molecolare nella fibra come risultato del processo di estrazione post-spin. Infine, va notato che molto probabilmente si osserveranno difetti in una frazione delle fibre valutate, rendendo un dato segmento di fibra inadatto per l'analisi a valle. Due esempi di questo tipo sono illustrati nella Figura 9.

Figura 8: Micrografie ottiche rappresentative di fibre di seta di ragno ricombinanti filate a umido. Le fibre allo stato AS e a seguito di un allungamento post-spin 4x in etanolo (EtOH) sono illustrate per un costrutto chimerico di seta piriforme-aciniforme (Py₂W₂) osservato mediante microscopia ottica (colonna di sinistra) e microscopia a luce polarizzata (colonna di destra). Le immagini sono riprodotte con il permesso di Ghimire et ^al.17. Barre di scala = 30 μm. Abbreviazioni: AS = as-spun; EtOH = etanolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Esempio di potenziali difetti delle fibre osservabili con la microscopia ottica. (A) Un esempio di difetto di "rigonfiamento". (B) Un esempio di difetto di "strizione". Barre di scala = 20 μm Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dopo aver verificato che non siano presenti difetti in un determinato segmento di fibra e dopo aver determinato il diametro (sezione 3.2 del protocollo), è possibile eseguire prove di trazione (ad esempio, Figura 6). Le curve sforzo-deformazione rappresentative ottenute per una seta di ragno ricombinante chimerica filata utilizzando diverse condizioni sono mostrate nella Figura 10. A seconda delle condizioni di filatura, le fibre risultanti variano da fragili (stato AS) a altamente estensibili con una resistenza simile allo stato AS (stato 2x-air) a fibre molto più forti e meno estensibili (stato 4x-EtOH). Va notato che è necessario valutare più segmenti di fibre e lotti di fibre filate per valutare in modo inequivocabile e rigoroso il comportamento meccanico.

Figura 10: Curva rappresentativa sforzo-deformazione di fibre filate da varie condizioni. Le fibre sono state analizzate allo stato as-spun (AS) o attraverso la produzione utilizzando lo stiramento automatizzato post-centrifuga (rapporto di trazione e condizione di allungamento (aria vs. solvente) indicati). Figura adattata con il permesso di Ghimire et al.(2024)¹⁷. Abbreviazione: AS = as-spun. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Infine, la struttura secondaria dello stato delle fibre può essere valutata utilizzando la spettromicroscopia ATR-FTIR. Gli spettri tipici delle fibre di seta acquisiti con questa metodologia (Figura 11A, B) avrebbero bande proteiche caratteristiche, tra cui un picco di ammide a largo (centrato intorno a ~3.300 ^cm-1), un picco di ammide I (~1.600-1.700 ^cm-1) e un picco di ammide II (~1.500-1.600 ^cm-1). Qui, ci concentriamo sulla valutazione della regione ammidica I (ad esempio, Figura 11C, D). L'analisi della derivata seconda è utile come mezzo per identificare i componenti chiave del picco dell'ammide I (Figura 11E, F), fornendo credito alla deconvoluzione quantitativa del picco (Figura 11G-J) che consente la valutazione e il confronto delle proporzioni del tipo di struttura secondaria osservate in una fibra di seta filata in una data condizione.

Figura 11: Spettri FTIR e analisi della struttura secondaria. (A,B) Spettri FTIR di fibre Py₂W₂ prodotte mediante filatura a umido nello stato (A) as-spun (AS) e (B) che incorporano un tratto 4 post-spin in etanolo. (C, D) Regioni ammidiche I degli spettri FTIR mostrate rispettivamente in A e B. (E-F) Seconda derivata delle regioni ammidiche I mostrate rispettivamente in C e D, calcolate utilizzando il pacchetto software indicato. (G-J) Deconvoluzione del picco di ammide I eseguita utilizzando i pacchetti software (G e I) OMNIC o (H e J) OriginPro, con i pannelli G e I che rappresentano la deconvoluzione corrispondente a C e H e J a D . Abbreviazioni: FTIR = infrarosso in trasformata di Fourier; AS = as-spun. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Andando oltre le singole tecniche, la correlazione tra la strutturazione secondaria, le prestazioni meccaniche e i dati di orientamento (supra)molecolare è tipicamente essenziale sia per comprendere le influenze dei diversi parametri di filatura sul materiale risultante sia per l'ottimizzazione razionale del processo di filatura. Nelle deconvoluzioni FTIR mostrate in Figura 11, ad esempio, confrontando le condizioni AS con 4×-EtOH per una seta chimerica, i contributi sostanziali di β-sheet alla banda ammidica I sono chiari per entrambe le condizioni, ma comprendono una percentuale maggiore della struttura secondaria totale per lo stato allungato post-filato rispetto allo stato AS, indipendentemente dal metodo di deconvoluzione (ad esempio, Figura 11G,H vs. Figura 11I,J). Ciò è coerente sia con la forza sostanzialmente più elevata osservata per la condizione di 4×-EtOH rispetto allo stato AS (Figura 10) sia con il miglioramento dell'allineamento molecolare nella condizione di 4×-EtOH rispetto allo stato AS (Figura 9). La caratterizzazione e l'analisi dettagliate, che coprono la gamma di condizioni mostrate nella Figura 10, sono state riportate in precedenza¹⁷. Non abbiamo quindi riassunto l'intera analisi qui, ma abbiamo usato questo confronto a coppie come dimostrazione del modo in cui queste tre classi di dati sono complementari l'una all'altra e consentono lo sviluppo di una comprensione molto più completa del comportamento delle fibre rispetto a qualsiasi tecnica isolata.

File supplementare 1: un file contenente le figure supplementari S1-S34 che illustrano la misurazione del diametro delle fibre, l'elaborazione dei dati meccanici e l'acquisizione e l'elaborazione dei dati FTIR. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: un foglio di calcolo che consente di determinare le principali proprietà meccaniche (ad esempio, sollecitazione, deformazione, modulo di Young e tenacità) dai dati di massa rispetto al tempo. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

La produzione di proteine ricombinanti offre l'entusiasmante potenziale di fabbricare materiali in un'ampia varietà di formati, con recenti progressi che implicano che questi materiali a base di proteine si stanno avvicinando a un uso industriale più diffuso⁵⁸. Qui, ci siamo concentrati sulla produzione di fibre dalla seta ricombinante in quanto questo è il formato di seta ricombinante direttamente correlato alle sete di ragno fibrose native. Le fibre di seta sono state pubblicizzate come aventi numerose potenziali applicazioni grazie alle rinomate proprietà meccaniche delle sete di ragno naturali e al potenziale di produrre fibre ad alte prestazioni in modo sostenibile³². Le applicazioni proposte spaziano dai tessuti ad alte prestazioni ai materiali che assorbono l'energia, dai prodotti per la cura personale all'uso sanitario^58,59. Anche i dispositivi e i materiali a base di seta di ragno in formati indossabili o in altri contesti in cui la conduttività elettrica è migliorata sono in fase di esplorazione attiva sia per applicazioni biomediche che per applicazioni più ampie⁶⁰. C'è quindi un ampio interesse per lo sviluppo, l'ottimizzazione e la personalizzazione di materiali a base di seta di ragno. In questo protocollo, delineiamo una serie di procedure mirate alla produzione rapida di fibre sia in seguito alla preparazione di una nuova proteina della seta ricombinante sia per modulare le proprietà dei materiali di una seta ricombinante che è già stata stabilita per essere filabile.

Indipendentemente dal metodo di filatura impiegato, è fondamentale determinare le condizioni che consentono la produzione di spin dope attraverso lo screening delle condizioni di solvente/tampone e della concentrazione proteica, come descritto nel presente documento. L'obiettivo finale è la solubilizzazione della proteina a una concentrazione sufficientemente alta da consentire una rapida conversione in una fibra senza l'autoassemblaggio fuori percorso in aggregati o altre specie insolubili che impediranno la filatura "produttiva". Si tratta tipicamente di una soluzione trasparente, relativamente viscosa, molto probabilmente composta da specie autoassemblate come micelle/nanoparticelle^26,61 e/o separazione di fase liquido-liquido⁶². Questo protocollo non descrive in dettaglio i metodi per valutare in modo completo lo stato di spin dope, poiché il successo della filatura delle fibre può essere ottenuto attraverso la valutazione iterativa di vari spin dope e configurazioni di spinning. Una visione molecolare e supramolecolare dettagliata dello stato di droga di spin può essere ottenuta attraverso tecniche come la viscosimetria, la diffusione della luce, la spettroscopia di dicroismo circolare nel lontano UV, la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare e/o la microscopia elettronica²⁶. Va anche notato che la proteina ricombinante stessa può essere modificata per migliorare il suo comportamento per la rotazione, con l'inclusione dei domini globulari N- e C-terminali non ripetitivi che sono un esempio di un metodo per aumentare la solubilità della spidroina³². In breve, senza un'adeguata identificazione della droga di spin, non è possibile procedere a test comparativi delle condizioni di filatura.

Una volta identificate una o più condizioni di spin dope, il disegno a mano fornisce un percorso rapido per valutare le proprietà della fibra di seta. Poiché sono necessari volumi sostanzialmente inferiori di droga per l'estrazione a mano produttiva, sono necessarie masse molto più basse di proteine pure, il che lo rende un eccellente precursore degli approcci automatizzati di filatura a umido. Questo fornisce anche un metodo molto trattabile e semplice per confrontare direttamente le proprietà delle fibre di diversi spidroine³³, ancora una volta con il vantaggio che la produzione di fibre è relativamente semplice con piccole quantità di proteine. Ciò significherebbe che l'ottimizzazione dell'espressione proteica e dei protocolli di purificazione per ottenere le rese più elevate necessarie per la filatura a umido può essere focalizzata sulle spidroine più promettenti. Il rovescio della medaglia, naturalmente, è che il disegno a mano non è suscettibile di produrre né lunghe fibre continue né di notevoli quantità di fibre in modo snello.

Data una quantità sufficiente di proteine, la filatura a umido offre quindi vantaggi per una produzione semplificata di fibre lunghe e continue³². Non solo, ma le proprietà delle fibre possono essere facilmente modulate attraverso il processo di filatura. La scelta delle condizioni di droga per la filatura, ad esempio, fornisce un percorso chiaro per migliorare la meccanica delle fibre. Nel caso di una proteina della seta aciniforme ricombinante di ~60 kDa, ad esempio, il passaggio da una droga di spin all'altra con tutti gli altri parametri di spin rimasti costanti ha portato a cambiamenti drammatici nell'estensibilità delle fibre²⁶. Questo era, a sua volta, correlato al modo in cui lo spidroina aciniforme si assemblava nello spin dope prima della filatura, con una migliore omogeneità delle nanoparticelle auto-assemblate nello spin dope correlata a una migliore meccanica delle fibre. L'incorporazione di un prelievo post-spin, notando che il rapporto di estrazione deve essere ottimizzato per un dato tipo di fibra, migliora tipicamente anche la meccanica della fibra di seta attraverso una combinazione di un migliore allineamento molecolare e una migliore conversione, ad esempio, di cristalliti a β fogli che rafforzano le fibre³². Infine, l'uso di diverse condizioni durante la fase di estrazione post-spin fornisce un mezzo per modulare le proprietà delle fibre. L'esposizione al solvente, immediatamente prima o durante il prelievo, può modificare sostanzialmente le proprietà meccaniche e strutturali della fibra^17,38, notando che diverse spidroine avranno preferenze e tolleranze diverse per i solventi (ad esempio, con fibre aciniformi ricombinanti altamente compatibili con l'acqua^26,31 rispetto alle fibre piriformi ricombinanti che subiscono contrazione in acqua³⁸ rispetto alle fibre di spidroina piriforme-aciniforme chimerica che mostrano la compatibilità in acqua della spidroina aciniforme nonostante questa sia meno della metà della proteina in massa¹⁷).

Il protocollo descritto fornisce un approccio altamente personalizzabile e versatile per valutare e ottimizzare la filabilità e le proprietà delle fibre delle sete di ragno ricombinanti. In tutti i casi, le proprietà delle fibre risultanti devono essere analizzate e confrontate in modo coerente e robusto. Qui, proponiamo l'uso della microscopia ottica, inclusa la microscopia a luce polarizzata, le prove di trazione e la spettromicroscopia FTIR come "kit di strumenti standard" di tecniche per questo scopo. Ulteriori tecniche biofisiche e di caratterizzazione dei materiali possono essere applicate per ampliare la comprensione delle fibre risultanti, ma questo insieme di tecniche fornisce un'eccezionale copertura delle proprietà chiave della morfologia, dell'allineamento/anisotropia intrafibrillare, delle prestazioni meccaniche e della strutturazione secondaria delle proteine. In particolare, sebbene la spettromicroscopia FTIR fornisca un mezzo relativamente semplice per valutare la strutturazione secondaria della fibra di seta e la microscopia a luce polarizzata consenta inferenze sul grado di allineamento molecolare potenziato che è stato raggiunto, altre metodologie come la spettroscopia NMR allo stato solido^63,64, la diffrazione di raggi X⁶⁴, la spettromicroscopia Raman polarizzata⁶⁵ e/o la microscopia ottica non lineare⁵⁴ dovrebbe essere preso in considerazione al fine di valutare in modo più completo la cristallinità, l'allineamento e la strutturazione all'interno delle fibre di seta per una completa delucidazione della relazione struttura-meccanica. Data l'idoneità della filatura a umido per altri tipi di proteine⁶⁶, prevediamo che questo protocollo sarà generalmente applicabile oltre le sete ricombinanti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1,1,1,3,3,3-esafluroropropanolo (HFIP)	Thermo Fisher Scientific	445820500	Utilizzato per la preparazione di droga
Siringa 1725LTSN con ago cementato con punta Luer	Hamilton	81100	Utilizzato per la filatura a umido
di 2,2,2-trifluoroetanolo (TFE)	Sigma-Aldrich	T63002-500G	Utilizzato per la preparazione di dope
Etanolo assoluto	Fisher Scientific	BP28184	Utilizzato per il bagno di coagulazione
Acido acetico	Fisher Scientific	A38-212	Utilizzato per la preparazione di farmaci
Bilancia analitica	Mettler Toledo	XS105 Dispositivo	prove di trazione
Cloruro di calcio (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C-3881	Utilizzato per la preparazione di droga
Acido citrico	Millipore Sigma	77-92-9	Utilizzato per la preparazione di droga
Computer	Raspberry Pi	Raspberry Pi 4 Modello B	Dispositivo di filatura a umido: offre la possibilità di utilizzare l'interfaccia utente grafica per controllare i motori passo-passo
Idrogeno fosfato disodico (Na2HPO4)	Millipore Sigma	7558-79-4	Utilizzato per la preparazione di droga
Acido formico	Fisher Scientific	A118-500	Utilizzato per la preparazione di
farmaci Vetrini	Millipore Sigma	S8902-1PAK	Utilizzato per il montaggio su fibra
Acido cloridrico (HCl)	EM Science	HX0603-53	Utilizzato per la preparazione di dromi
MCT-A Rivelatore raffreddato	Thermo Fisher Scientific	840-199300	Valutazione FTIR della struttura secondaria della fibra
Piastra di montaggio	Fabbricato internamente		Dispositivo di filatura
a umido Motore passo-passo biopolare NEMA 17 STEPPERONLINE		17HS15-1504S-X1	Dispositivo di filatura a umido - nota: sono necessari più motori per eseguire l'allungamento post-rotazione
Spettromicroscopio Nicolet iN10 FTIR	Thermo Fisher Scientific	912A0604	Valutazione FTIR della struttura secondaria della fibra
Nicolet iN10 Mapping Stage	Thermo Fisher Scientific	840-198800	Valutazione FTIR della struttura secondaria della fibra
Nicolet iN10 Joystick motorizzato dello stadio	Thermo Fisher Scientific	840-199800	Valutazione FTIR della struttura secondaria della fibra
Nicolet Slide-On Ge Micro Tip ATR 350	Thermo Fisher Scientific	840-194800	Valutazione FTIR della struttura secondaria della fibra
1.7.224	Thermo Fisher Scientific	INQSOF018	Software di controllo dello strumento FTIR
OMNIC ver. 9.11.745	Thermo Fisher Scientific	INQSOF018	Software di elaborazione e analisi dei dati specifico per lo strumento FTIR
Microscopio ottico/a luce polarizzata	Zeiss Canada	Axio Observer A1	Microscopio ottico invertito
OriginPro 2025 10.2 SR1	OriginLab Corporation	OriginPro 10.200196	Software di elaborazione e analisi dei dati FTIR di terze parti
Diidrogeno fosfato di potassio (KH2PO4)	Fisher Scientific	P285-10	Utilizzato per la preparazione di droga
Fosfato di potassio bibasico (K2HPO4)	Fisher Scientific	BP363-500	Utilizzato per la preparazione di droga
Alimentatore	ALITOVE	ALT-1205	Dispositivo di filatura a umido - Adattatore di alimentazione 12V 5A Convertitore AC 100-240V Ingresso con jack di uscita CC 5,5x2,5 mm - nota: per prestazioni ottimali, potrebbe essere necessaria un'alimentazione separata per ciascun motore
Acetato di sodio.	Sigma-Aldrich	S2889-1KG	Utilizzato per la preparazione di drome
Idrossido di sodio (NaOH)	Millipore Sigma	1310-73-2	Utilizzato per la preparazione di dope
Rulli rotanti	Fabbricato internamente		Utilizzato per
i cavi del motore passo-passo	a umido XMSJSIY	B0BD5FV3R2	Dispositivo di filatura a umido - fornisce il collegamento dai controller del motore passo-passo ai motori passo-passo
Controller del motore passo-passo (Pi HAT)	Adafruit	DC & Motore passo-passo HAT per Raspberry Pi	Permutazione del controller del motore del dispositivo di filatura a umido 1 - notare la velocità di rotazione del motore limitata di ~46 giri/min
Controller del motore passo-passo (USB)	Polulu	Tic T249	Permutazione del controller del motore del dispositivo di rotazione a umido 2 - utilizzare quando potrebbe essere necessaria una rotazione superiore a 46 giri/min
Pompa a siringa	KD Scientific	Model 100	Dispositivo per prove di trazione e dispositivo di filatura a umido
Acido trifluoroacetico (TFA)	Millipore Sigma	TX1276-7	Utilizzato per la preparazione di droga
Tris-cloridrato	EMD Millipore	9310-500GM	Utilizzato per la preparazione di droga
Hub USB	Acasis B07Q3TYF15		Dispositivo a rotazione a umido - Hub USB alimentato da 48 W - ACASIS 10 porte Hub dati USB 3.0 - con interruttori on/off individuali e adattatore di alimentazione 12V/4A Splitter USB - interfaccia tra i controller per motori passo-passo Raspberry Pi e Tic T249