Procedura di trasezione/risutura del nervo sciatico del topo per studiare la riparazione nervosa e il recupero funzionale

Summary

Questo protocollo descrive un modello di transezione e risutura del nervo sciatico nei topi per studiare la rigenerazione dei nervi periferici utilizzando neuroni ganglionali della radice dorsale adulti. Consente l'analisi in vivo della ricrescita degli assoni, della reinnervazione muscolare e del recupero funzionale dopo una lesione nervosa.

Abstract

La riparazione nervosa è fondamentale per ripristinare la funzione dopo una lesione assonale. Tuttavia, i neuroni maturi nel sistema nervoso centrale (SNC) hanno una capacità limitata di rigenerare i loro assoni dopo una lesione a causa della diminuzione della capacità di crescita intrinseca e di un ambiente ostile. Al contrario, i neuroni del sistema nervoso periferico (SNP) mostrano un potenziale rigenerativo robusto. Tra questi, i neuroni dorsali del ganglio (DRG) adulti sono particolarmente noti per la loro capacità di rigenerarsi efficacemente dopo lesioni ai nervi periferici, rendendoli un modello ideale per studiare i meccanismi cellulari e molecolari alla base della riparazione nervosa. Qui, viene descritta una tecnica di microsutura modificata, chiamata "loop-before-transection", per generare un modello di transezione e risutura del nervo sciatico nei topi, seguita dall'analisi della rigenerazione assonica. Sono inoltre dimostrate valutazioni comportamentali e reinnervazione muscolare per valutare il recupero funzionale. Dopo la tranzione e la ripresa del nervo sciatico, gli animali inizialmente mostrano deficit comportamentali, ma il recupero completo si osserva tipicamente entro 30 giorni dall'infortunio. L'applicazione di farmaci che favoriscono la fusione assonale nel sito della lesione accelera significativamente il recupero funzionale. Questo sistema modello offre uno strumento potente per indagare i meccanismi che regolano la riparazione nervosa in vivo nei mammiferi.

Introduction

La lesione assonale è una conseguenza comune e grave di danni al cervello e al midollo spinale, spesso causata da lesioni traumatiche, neurotossine o disturbi neurologici che compromettono la connettività neurale e compromettono la rigenerazione^{assonale 1,2}. Non tutti i neuroni possiedono una capacità intrinseca di rigenerazione, fondamentale per la riparazione degli assoni recisi. La velocità di rigenerazione assonale è influenzata da molteplici fattori, tra cui il potenziale di crescita intrinseco del neurone, l'efficienza della sintesi proteica, la dinamica del citoscheletro, la rimozione dei detriti di mielina e la disponibilità di fattori^{di crescita 3,4}.

Nel sistema nervoso centrale (SNC) adulto dei mammiferi, la lesione assonale porta a una capacità rigenerativa ridotta ridotta, principalmente a causa della mancanza di fattori intrinseci che favoriscono la crescita e della presenza di segnali estrinseci^{inibitori 1,5}. Al contrario, gli assoni nel sistema nervoso periferico (SNP) possiedono una robusta capacità di rigenerarsi dopo un infortunio, grazie ai meccanismi intrinseci di auto-riparazione dei neuroni periferici e alla rapida riattivazione dei programmi di crescita pro-rigenerativa. Al momento della lesione, il segmento distale dell'assone si disconnette dal soma neuronale e subisce una degenerazione walleriana, caratterizzata da disintegrazione e frammentazione assonale ^6,7. L'eliminazione efficiente dei detriti assonali e mielinici da parte delle cellule gliali è essenziale per una rigenerazione di successo, poiché previene la formazione di cicatrici che potrebbero ostacolare la crescita^{assonale 3,8}. Questo processo, insieme al rimodellamento del citoscheletro degli assoni lesionati, supporta la ricrescita del moncone prossimale e facilita la reinnervazione del bersaglio. Questi eventi si verificano in fasi parzialmente sovrapposte, durante le quali l'attivazione indotta da lesioni di fattori di trascrizione come ATF3 e c-Jun promuove programmi di espressione genica^{pro-rigenerativa 4,9,10}.

La fusione assonale rigenerativa rappresenta un meccanismo efficiente per ripristinare la connettività neuronale dopo una lesione^{assonale 11}. Questo processo è stato descritto per la prima volta nel gambero Procambarus clarkii nel 1967-12 ed è stato successivamente documentato in più specie^{13, 14, 15, 16}, inclusa Caenorhabditis elegans¹⁷. Sebbene le prove dirette della fusione assonale nei mammiferi rimangano limitate, strategie di indotta fusione sono state impiegate con successo per migliorare la riparazione^{nervosa 11}. In particolare, il composto chimico fusogeno polietilenglicole (PEG) favorisce la richiusura della membrana ed è stato dimostrato di facilitare il recupero funzionale dopo lesioni sia ai nervi periferici che al midollo spinale nei modelli^mammiferi 18,19,20,21,22,23,24. Scoperte recenti indicano che la deplezione della perossidasi di glutatione (GPX) è sufficiente a promuovere la fusione assonale in C. elegans²⁵. Analogamente, i topi knockout condizionali con Gpx4 o quelli trattati con l'inibitore GPX ML162 hanno mostrato un recupero funzionale accelerato dopo la transezione del nervo sciatico, potenzialmente tramite fusione assonale^{potenziata 25}.

Il nervo sciatico è un nervo misto composto da assoni sensoriali, somatici motori e^{autonomi motori 26}. Nasce dai segmenti spinali L4 e L5 nei^{ratti 27}, e dai segmenti L3 e L4 nei^{topi 28}. Grazie alla sua accessibilità e alla consistenza anatomica, la lesione del nervo sciatico è diventata uno dei modelli più ampiamente utilizzati per studiare la rigenerazione del nervo^{periferico 29,30}. Questi modelli permettono di indagare sia i meccanismi neuronali intrinseci sia i fattori ambientali estrinseci che influenzano la crescita assonale e il recupero ^{funzionale 3,4,9}. L'uso della schiacciamento del nervo sciatico come paradigma sperimentale nelle neuroscienze risale alla fine del XIX secolo²⁹. Oltre ai modelli di schiacciamento nervoso, la transezione nervosa è ampiamente utilizzata per studiare la rigenerazione degli assoni e il recupero funzionale. Tuttavia, la classica transezione del nervo sciatico seguita da sutura nei topi è spesso meno riproducibile e affidabile rispetto ai ratti, a causa delle dimensioni ridotte del nervo e della sua fragile^consistenza.

Utilizzando un modello modificato di transezione e risutura del nervo sciatico, denominato "loop-before-transection", sono stati generati con successo modelli riproducibili di transezione e risutura del nervo^{sciatico 25}. Questo approccio elimina la necessità di gestire il nervo dopo la transezione inserendo la sutura prima del taglio, riducendo così lo stress meccanico e minimizzando la variabilità dovuta alla tecnica chirurgica. Livelli moderati di modulazione GPX sono stati riscontrati come contributi al recupero funzionale dopo la completa transezione del nervo sciatico^{del muro 25}. Il co-trattamento delle basse concentrazioni ML162 (0,25 μM⁾³², inibitore GPX e del polietilenglicole (PEG, 500 mM)18,19,20,21,22,23,24 sulla lesione da resutura del nervo sciatico (SNT) ha migliorato con successo il punteggio comportamentale valutato dal test di pinpinz, asimmetria della faglia del piede e test di espansione dei diti ^25,33.34. I frammenti di assoni distali amputati dei neuroni gangliosi della radice dorsale (DRG) dei mammiferi degenerano entro 3 giorni, causando la rottura delle giunzioni neuromuscolari (NMJ^)6,35, e i neuroni DRG rigeneranti riinnervano i muscoli per recuperare le loro funzioni. Il gruppo di co-trattamento SNT/risutura-ML162/PEG ha mostrato NMJ innervati e punteggi comportamentali migliorati nel primo periodo (3 giorni dopo l'intervento), indicando un recupero precoce della funzione^{neuromuscolare 25}.

Qui vengono descritti il metodo di microsutura "loop-before-transection" e la somministrazione del farmaco che hanno permesso le osservazioni sopra indicate nei topi. Un protocollo di fusione PEG-consolidato in precedenza, che consente la rapida riparazione dei nervi recisi dei ratti, è stato^{modificato 18}. Il polietilenglicole (PEG) è stato inizialmente riportato come favorendo la riconnessione esogena degli assoni giganti mediali (MGA) tagliati in vitro³⁶. I protocolli di fusione PEG hanno migliorato gli esiti comportamentali nel 25%-30% degli studi che coinvolgevano lesioni da schiacciamento e sepolamento del nervo sciatico del ratto, anche se il recupero funzionale non è stato osservato nei primi^{momenti 34}. Le successive perfezionazioni incorporarono il concetto di sigillatura endogena^{a membrana 37}. Dopo una lesione nervosa, la rapida riparazione del plasmalemmo è neuroprotettiva e previene la neurodegenerazione. L'accumulo indotto da Ca²+ di vescicole legate alla membrana facilita questo processo di^{sigillatura 38}. La transezione nervosa completa interrompe l'axolemma così come le guaine endoneuriale, perineuriale ed epineuriale nel sito della lesione. La microsutura della guaina epineuriale allinea i monconi nervosi prossimali e distali. Durante la fase di sutura, l'uso di soluzione fisiologica ipotonica libera di Ca²+ riduce la formazione di vescicole membrana, mantenendo aperte le guaine endoneuriali e perineuriali e permettendo di approssimarle da vicino tramite le suture epineuriali. Successivamente, l'applicazione di soluzione salina contenente Ca²⁺ induce l'accumulo di vescicole per sigillare la restante interruzione plasmalememica¹⁸.

In questo protocollo sono stati utilizzati topi FVB adulti (8-10 settimane) e topi C57BL/6, senza essere osservata alcuna differenza specifica per ceppo. Il nervo sciatico nei topi si trova circa 1-2 mm sotto il muscolo gluteo a metà coscia ed è notevolmente più sottile e fragile rispetto ai ratti, il che richiede maggiore precisione chirurgica durante la dissezione e la sutura. Bisogna fare attenzione a evitare che i nervi si allunghino troppo o manipolazioni eccessive che possano compromettere il recupero funzionale. Questo approccio prevede di recidere completamente il nervo, creando uno spazio fisico tra i monconi prossimali e distali. Poiché questo gap inibisce la rigenerazione assonale diretta, il recupero riuscito richiede tipicamente intervento microchirurgico o innesto nervoso.

Dato che il nervo sciatico del topo è più sottile e delicato rispetto a quello del ratto, è richiesta una maggiore precisione chirurgica. Sebbene la microsutura sia comunemente utilizzata, può causare involontariamente ulteriori traumi dovuti a manipolazioni eccessive o a ripetuti passaggi con ago^. Queste limitazioni possono introdurre variabilità e potenzialmente compromettere la valutazione di nuove strategie terapeutiche. Pertanto, ottenere risultati chirurgici coerenti minimizzando i danni nervosi indotti da suture è essenziale per valutare in modo affidabile il recupero funzionale nei modelli di transezione nervosa. Utilizzando questo metodo "loop-before-transection", sono stati generati modelli riproducibili di transezione e risutura del nervo sciatico, e sono stati valutati gli effetti del trattamento doppio con PEG e ML162 sul recupero funzionale. Nel complesso, nonostante il suo uso diffuso, il modello di transezione del nervo sciatico nel topo presenta sfide tecniche a causa delle dimensioni ridotte e della fragilità del nervo. Questo metodo di risutura modificato descritto qui risponde a una necessità critica di un protocollo microchirurgico riproducibile e standardizzato che minimizzi i danni meccanici.

Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in conformità con le linee guida del Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali (IACUC) presso il Centro di Scienze della Salute dell'Università del Texas a San Antonio (Numero di protocollo: 20200082AR). Maschi e femmine adulti di topi FVB (8-10 settimane, 20-25 g) sono stati utilizzati per le procedure sperimentali JoVE descritte qui. I topi C57BL/6 (8-10 settimane, 20-25 g) sono stati utilizzati solo in interventi di pratica preliminari condotti prima degli esperimenti formali per ottimizzare la precisione della manipolazione e della sutura. Queste sessioni di prova hanno confermato che la procedura "loop-before-transection" ha prodotto risultati comparabili in entrambi i ceppi; pertanto, tutti i dati formali presentati in questo manoscritto sono stati ottenuti da topi FVB. Un totale di dieci topi FVB (cinque maschi e cinque femmine) sono stati inizialmente inclusi per la transezione del nervo sciatico seguita dal trattamento ML162 + PEG. Un animale ha mostrato una variazione anatomica congenita in cui il nervo sciatico si biforcava in due rami principali prima del sito di transezione, con conseguente intervento chirurgico incompleto ed esclusione dall'analisi. Pertanto, sono state condotte analisi comportamentali e istologiche su nove animali (n = 9). Entrambi i sessi hanno mostrato un recupero rigenerativo e comportamentale comparabile, e non sono state osservate differenze specifiche per sesso. Un altro topo ha subito una doppia penetrazione della sutura senza transezione nervosa (controllo fittizio) per valutare il potenziale impatto della procedura di sutura stessa sugli esiti comportamentali. Non sono state osservate differenze evidenti nella risposta rigenerativa tra i sessi. Gli animali venivano alloggiati in condizioni standard con un ciclo di 12 ore di luce e buio, a 75 °F e umidità relativa del 40%-60%, con accesso ad libitum a cibo e acqua. Sono stati utilizzati sia maschi che femmine, e non sono state osservate differenze evidenti tra maschi e femmine. Le procedure chirurgiche sono state eseguite sotto anestesia isoflurana del sistema di anestesia a basso flusso SomnoSuite. I test comportamentali sono stati effettuati a partire dal secondo giorno post-operatorio e ripetuti nei giorni 4, 7, 10, 14, 18, 22 e 27, come indicato nelle cifre corrispondenti. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Transezione/resutura del nervo sciatico e trattamento farmacologico

1. Posizionare l'animale su un cuscinetto riscaldato dove il nervo sciatico può essere osservato sotto un microscopio stereo dissezionale (Figura 1A).
2. Anestetizzare il topo utilizzando il sistema di anestesia a basso flusso SomnoSuite.
   NOTA: Confermare la profondità dell'anestesia in assenza di risposte riflesse, come la reazione a una pizzicatura del dito del piede, prima di iniziare l'intervento. Applica un unguento oftalmico veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza corneale.
3. Radi i peli sulla coscia e intorno.
   NOTA: Rimuovi i peli rasati e caduti nel modo più pulito possibile. Altrimenti, i peli si attaccheranno alla sutura in nylon 10-0 e contamineranno il nervo sciatico. I peli residui possono essere rimossi delicatamente con nastro adesivo da laboratorio o nastro adesivo dopo la rasatura per garantire un campo chirurgico pulito. Disinfettare il sito chirurgico pulendo sequenzialmente l'area rasata con etanolo al 70%, betadina e una salvietta finale con etanolo al 70% usando palline di cotone autoclaviata.
4. Individuare l'osso femorale e eseguire una piccola incisione cutanea di circa 1,0 cm (intervallo 0,8-1,2 cm) a metà coscia, circa ~1 mm posteriore e parallela all'osso femorale utilizzando forbici chirurgiche fine.
   1. Ritrae delicatamente il gluteo maggiore per esporre il bicipite femorale sottostante. Poi, usa le punte delle forbici per separare delicatamente le teste anteriore e posteriore del bicipite femorale, senza tagliare, per esporre il nervo sciatico sotto la tacca sciatica. Questi passaggi vengono eseguiti sotto osservazione visiva diretta, non al microscopio.
5. Estrai il nervo sciatico dal corpo usando pinze micro-dissezionanti per facilitare l'intervento chirurgico sul nervo sciatico (Figura 1A).
   NOTA: Fissare le pinze con del nastro adesivo per evitare che si diffondano oltre un certo livello e minimizzare i danni al nervo sciatico. Posiziona la punta della pinza sotto il nervo sciatico e solleva il nervo sciatico verso l'alto usando la coscia del topo come fulcro. Fai attenzione a sollevare il nervo solo quanto necessario per facilitare la sutura ed evita di applicare tensione o di tirarlo verso l'esterno, poiché un eccesso di allungamento può danneggiare gli assoni o le strutture circostanti.
6. Mettere a fuoco il microscopio sul nervo sciatico esposto. Da questo passaggio, prosegui attraverso il Passaggio 15 usando un microscopio (Figura 1A).
7. Penetrare il doppio del nervo sciatico con sutura in nylon 10-0 (Figura 1B, C). Vai al Step 1-8 per il controllo non tagliato. Vai ai Passaggi 1-11 per la tranzione nervosa.
   NOTA: Due penetrazioni sono state effettuate a circa una larghezza di nervo (~0,7 mm), posizionate simmetricamente ai lati del sito di transezione previsto. Questa distanza garantiva un corretto allineamento dei monconi prossimali e distali minimizzando allo sforzo meccanico sulla lesione. Effettua la penetrazione attraverso il centro del nervo sciatico con la sutura, assicurandoti che le due penetrazioni effettuate dalla sutura siano esattamente parallele. I punti 10-0 sono piccoli e devono essere controllati con pinzette super fine. Il nylon 10-0 non assorbibile è stato utilizzato perché offre un'eccellente stabilità alla trazione e una minima reattività tissutale durante il periodo di osservazione di 30 giorni. Questo materiale è ampiamente utilizzato in modelli microchirurgici di riparazione nervosa su topi e^{ratti 18,31}. Non sono state utilizzate suture assorbibili perché il degrado graduale potrebbe compromettere l'allineamento dei monconi nervosi tagliati prima che il recupero funzionale sia completo. Per minimizzare la variabilità dipendente dall'operatore, tutte le procedure chirurgiche sono state eseguite da un singolo chirurgo formato dopo un'estesa pratica microchirurgica sotto stereomicroscopio. Il metodo "loop-before-transection" riduce ulteriormente la variabilità eliminando la necessità di manipolazione nervosa post-transection, garantendo così un allineamento e una tensione costanti tra gli animali. Questo richiede molta pratica e un alto livello di abilità di controllo. Prima di eseguire interventi chirurgici sugli animali, i principianti possono trovare utile esercitarsi nel movimento di sutura utilizzando fili sottili come il filo interdentale per sviluppare destrezza e controllo sotto uno stereomicroscopio.
8. Fai un nodo con cura con la sutura in nylon.
9. Posiziona il nervo sciatico esposto sotto lo strato muscolare e chiudi la pelle usando suture in nylon 4-0.
10. Determinare che la doppia penetrazione del nervo sciatico con una sutura in nylon 10-0 non influisce sul comportamento del topo.
    NOTA: Per confermare ciò, i topi che hanno subito doppia penetrazione di sutura senza transezione sono stati sottoposti agli stessi test comportamentali utilizzati nei gruppi sperimentali, tra cui pinpuntura, asimmetria della faglia del piede e espansione delle dita. Questi topi hanno costantemente ottenuto punteggi completi equivalenti a controlli di tipo selvatico non operati, indicando che la procedura di sutura da sola non comprometteva la funzione del nervo sciatico.
11. Taglia il nervo sciatico a metà strada tra le due suture di nylon 10-0 usando un bisturi (Figura 1D).
    NOTA: Per minimizzare la variabilità, tutti gli interventi sono stati eseguiti dallo stesso sperimentatore formato utilizzando una procedura standardizzata. Inoltre, il design "loop-before-transection" minimizza intrinsecamente la variabilità evitando la gestione dei nervi post-transection, garantendo una posizione e una tensione costanti delle suture su tutti gli animali. La posizione delle suture è stata verificata al microscopio dissezionale per garantirne l'uniformità tra gli animali.
12. Metti via le pinzeps.
13. Lavare il nervo tagliato con soluzione salina tamponata con fosfato senza Ca²+ (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM_{Na 2}HPO₄/NaH₂PO₄, pH 7,4), preparata senza cloruro di calcio.
    NOTA: Risciacqua il moncone nervoso reciso con PBS privo di calcio per circa 10-20 secondi per liberare il sangue e prevenire la chiusura prematura. La risutura dovrebbe essere completata tempestivamente entro 1-2 minuti per mantenere l'allineamento e la vitalità dei tessuti.
14. Rimuovi il PBS libero di Ca²⁺ assorbendolo con un fazzoletto.
15. Fai un nodo con attenzione con la sutura in nylon (Figura 1E). Procedi al Passo 20 se non è previsto o richiesto un trattamento farmacologico.
    NOTA: Per la microsutura veniva utilizzato un nodo quadrato standard, composto da due spostamenti opposti delicatamente stretti con pinze sottili sotto uno stereomicroscopio. I due assoni recisi collegati dalla sutura tornano a una forma vicina alla loro forma originale. La riconnessione di un vaso sanguigno reciso può essere un indicatore visivo che i monconi prossimali e distali sono correttamente allineati. Durante la procedura, il tessuto dovrebbe apparire fresco e umido, senza pallore o compressione. Evita di legare troppo strettamente la sutura, poiché ciò potrebbe collassare i vasi sanguigni o deformare il nervo. Prima di fare il nodo finale, assicurati che le estremità nervose siano approssimate senza tensione. Se necessario, riposizionare delicatamente l'arto per facilitare l'allineamento naturale invece di tirare il nervo, poiché una tensione eccessiva può aumentare il rischio di neuroma o fibrosi.
16. Inserire 0,25 μM di ML162 in DMSO diluito in PBS sul nervo sciatico suturato con una siringa. Lascia immergere il nervo sciatico suturato nel farmaco per 1 minuto.
17. Rimuovi il ML162 absorbendolo con un cotton fioc sterile.
18. Inserire 500 mM di PEG in acqua distillata, preriscaldati a 37 °C, sul nervo sciatico suturato con una siringa. Lascia immergere il nervo sciatico suturato nel farmaco per 1 minuto.
    NOTA: 500 mM di PEG sono una soluzione densa che può diventare solida a temperatura di sala operatoria. Posizionare la siringa su un assorbente riscaldato durante l'uso per assicurarsi che il PEG rimanga liquido. Si pensa che il PEG promuova la fusione a membrana rimuovendo molecole d'acqua tra i due strati lipidici adiacenti, permettendo così un contatto stretto con la membrana e la fusione spontanea. Sebbene il meccanismo molecolare preciso sia ancora oggetto di studio, questo approccio ha dimostrato di facilitare la continuità assonale e migliorare il recupero funzionale nei modelli di lesioni del nervo periferico.
19. Rimuovi il PEG assorbendolo con un fazzoletto.
20. Lavare il nervo suturato con PBS contenente Ca²⁺ (PBS integrato con 1 mM di_{CaCl 2}; 137 mM di NaCl, 2,7 mM di KCl, 10 mM fosfato tampon, pH7,4).
21. Rimuovere il PBS contenente Ca²⁺ assorbendolo con un frustetto.
22. Posiziona il nervo sciatico esposto sotto lo strato muscolare e chiudi la pelle usando suture in nylon 4-0.
23. Una volta che l'animale si è ripreso dall'anestesia, si riporta nella gabbia.
    NOTA: Dopo la chiusura della pelle, il sito chirurgico è stato trattato con un antidolorifico antibiotico topico. Ogni animale veniva monitorato su una borsa riscaldante finché non recuperava abbastanza coscienza per mantenere la reclinazione sternale. Gli animali venivano poi ospitati individualmente e restituiti al loro gruppo solo dopo il pieno recupero della funzione motoria. Sebbene l'ambiente chirurgico non fosse mantenuto sotto una cappa a flusso laminare, tutti gli strumenti chirurgici venivano sterilizzati e le procedure venivano eseguite con tecniche asettiche con mani guantate e strumenti sterili.

2. Test comportamentale - Puntura

NOTA: Per valutare la sensibilità meccanica ad alta soglia di risposta dopo l'infortunio³³.

1. Metti il mouse in una griglia metallica e lascialo muoversi liberamente per 30 minuti per abituarsi al nuovo ambiente.
2. La parte più laterale della superficie plantare della zampa posteriore era divisa in 5 aree (da A a E). Applica delicatamente l'Austerlitz (taglia 000) sulla superficie plantare della zampa ipsilaterale. La puntura è stata applicata due volte dal dito più laterale (area A) al tallone (area E).
   NOTA: Non penetrare la pelle.
   NOTA: Una risposta è stata considerata positiva quando l'animale ha rimosso rapidamente la zampa dai due stimoli a punti. Il topo è stato valutato 1 per quest'area e poi testato per la successiva (massimo 5). Se nessuna delle domande riceveva una risposta positiva, il voto complessivo era 0. Usa il territorio safeno dello stesso lato ipsilaterale come controllo positivo. Susciterà sempre una risposta positiva.

3. Test comportamentale - Asimmetria di falla del piede (FF)

NOTA: Per misurare quanto bene gli assoni sciatici innervano muscoli prossimali³⁴.

1. Lascia che gli animali si muovano liberamente su una griglia metallica rialzata sulla gabbia per abituarsi all'ambiente. Una prova consiste in un totale di 50 passi per arto posteriore.
2. Segna quando gli animali sbagliano. I criteri di punteggio sono i seguenti.
   Punteggio 1: Colpa parziale. Tirata indietro prima che la gamba cadesse completamente fino alla coscia.
   Punteggio 2: Colpa totale. È caduto completamente fino all'inguine.
3. Calcola il punteggio composito di fagli del piede da tutti gli arti posteriori feriti e non feriti di tutti gli animali in ogni momento post-operatorio.
   Punteggio composito dei falli del piede = (# errori parziali x 1) + (# errori pieni x 2)
4. Dividere il punteggio composito di faglia del piede per 50 (passi totali per arto) per ottenere la percentuale di faglia per ciascun arto posteriore.
   % falla del piede = Punteggio composito del fallo del piede/50 (passi totali) x 100%
5. Si sottraggono le faglie del piede nell'arto posteriore lesionato dalla proporzione di faglie nel membro posteriore intatto per ottenere un punteggio di asimmetria per ciascun animale in un dato momento post-operatorio.
   Punteggio di asimmetria per faglia del piede (FF ) = %FF (arto intatto) - %FF (arto lesionato)

4. Test comportamentale - Diffusione delle dita dei piedi

NOTA: Per valutare il recupero motorio dopo una lesione nervosa. Secondo uno studio precedente, il test motorio della diffusione delle dita è più sensibile rispetto all'analisi dell'andatura per rilevare il recupero della funzione motoria dopo una lesione del nervo^{sciatico 30}.

1. Copri delicatamente l'animale con un pezzo di stoffa e solleva la coda per osservare chiaramente le zampe posteriori.
   NOTA: Alternativa: Afferra delicatamente la nuca del topo, sistema la coda, gira e fai dimenare il topo per osservare il movimento delle dita dei piedi.
2. Assegna il punteggio di apertura dei piedi come segue:
   Punteggio 2: Diffusione completa. Definisci come una dilatazione completa, ampia e sostenuta di tutte le dita per almeno 2 secondi.
   Punteggio 1: Diffusione intermedia. Qualsiasi movimento che non raggiunga un punteggio completo di spreading. Tremare leggermente, o muovere parziale.
   Punteggio 0: Nessuna diffusione. Nessun movimento.
   NOTA: Tutte le valutazioni comportamentali (puntura, difetto del piede e diffusione delle dita) sono state ricontrollate da un sperimentatore cieco rispetto ai gruppi di trattamento. Gli animali sono stati assegnati casualmente ai gruppi di trattamento al momento dell'intervento secondo il disegno utilizzato nel nostro studio precedente (Ko et ^al.25), che includeva quattro condizioni sperimentali (solo resutura, PEG, ML162, ML162 + PEG). L'articolo attuale presenta dati del gruppo ML162 + PEG, analizzati indipendentemente mantenendo il rigore sperimentale originale.

5. Perfusione e lavorazione dei tessuti per istologia

1. Anestetizzare profondamente l'animale ed eseguire la perfusione transcardica con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) tramite il ventricolo sinistro.
2. Incisci l'atrio destro per permettere il completo drenaggio del sangue.
3. Immergi i tessuti raccolti nel paraformaldeide (PFA) al 4% a 4 °C durante la notte per la fissazione.
4. Lava i tessuti fissi tre volte con PBS, poi incubali in PBS a 4 °C durante la notte.
5. Crioproteggi i tessuti immergendoli nel 30% di saccarosio a 4 °C durante la notte.
6. Immergi i tessuti in un composto OCT, congelali e sezionali a uno spessore di 12 μm usando un criostato.
7. Conservare i blocchi di tessuto a -80 °C e le criosezioni a -20 °C fino all'uso.
8. Per la sola raccolta del nervo sciatico, si evita la perfusione, poiché il contenuto sanguigno non influisce significativamente sulla qualità dell'immunocolorazione in questi tessuti periferici.

Results

Il precedente protocollo^{PEG-fusion 18} è stato modificato per mantenere risultati chirurgici coerenti e minimizzare i danni ai nervi causati dalla sutura²⁵. Posizionando la sutura per penetrare attraverso il nervo prima della transezione, si minimizzano i danni causati da pizzicamenti con pinzette o pungenti con un ago dopo la transezione. Per testare l'effetto del legare una sutura che penetra un nervo sulla sua funzione, la sutura veniva f...

Discussion

Gli studi sulla rigenerazione nervosa utilizzando modelli di transezione nervosa sono ampiamente condotti sul nervo sciatico^{del topo 31,39}. Tuttavia, a causa delle sue dimensioni ridotte e della consistenza morbida, il nervo sciatico del topo è difficile da gestire delicatamente con strumenti chirurgici e il tessuto è soggetto a strappi durante la sutura. Il processo di microsutura, spesso che comporta manipolazioni eccessive, pu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pinza #55	Dumostar-Biologia	11295-51	Uno per mano. Ne avrai bisogno due per afferrare una sutura in nylon 10-0.
Sutura in nylon 10-0	DemeTECH	NL761000,4F0P
Sutura in nylon 4-0	Mago della Matrice	0197
Anti-beta-tubulina	R& Sistemi D	MAB1195
Anti-NF-200	Millipore Sigma	N4142
Austerlitz taglia 000			Per il test della puntura
CF488 alfa-bungarotossina coniugata	Biotium	00005
Forbici dissezionatrici	Kent Scientific & nbsp;
Forbici fine per sutura	Kent Scientific & nbsp;
Pinza dell'iride	Kent Scientific & nbsp;
K& Pad riscaldante per piccoli animali H	K& Prodotti per animali H
ML162	Millipore Sigma	SML2561
Kit chirurgico per topi	Kent Scientific & nbsp;
Portaaghi	Kent Scientific & nbsp;
Polietilenglicole (PEG)	Millipore Sigma	P5413
SCG10	Novus Biologicals	NBP1-49461
SomnoSuite	Kent Scientific & nbsp;		Per l'anestesia isoflurana
Pinza splitter			Usato per esporre il nervo sciatico.