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Articolo metodologico

La senescenza indotta da farmaci nelle cellule epatiche promuove la polarizzazione dei macrofagi M2: implicazioni per l'epatotossicità associata all'inibitore della tirosin-chinasi

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DOI:

10.3791/68725

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17 ottobre 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, Shiv Nadar Institution of Eminence, 2Independent Researcher, 3Servier Institute of Translational Medicine

In questo articolo

Sommario

Qui, studiamo l'epatotossicità causata da lapatinib e neratinib attraverso la polarizzazione dei macrofagi guidata da SASP, che offre una comprensione meccanicistica più profonda oltre i tradizionali test di tossicità. Questo approccio dimostra come gli epatociti senescenti influenzino le risposte immunitarie. Ciò è particolarmente utile per valutare gli effetti a lungo termine dei farmaci e scoprire nuovi bersagli terapeutici per la gestione dell'epatotossicità indotta da farmaci.

Abstract

Lapatinib e neratinib sono inibitori della tirosin-chinasi (TKI) approvati per il trattamento del carcinoma mammario metastatico HER2-positivo, ma il loro uso clinico è limitato dall'epatotossicità. All'interno degli epatociti, gli enzimi del citocromo P450 producono metaboliti reattivi di questi farmaci, causando danni al DNA, disfunzione mitocondriale e stress ossidativo, che portano a lesioni agli epatociti. Questo stress cellulare innesca la senescenza degli epatociti, uno stato di arresto della crescita accompagnato dalla secrezione di fattori pro-infiammatori e di rimodellamento tissutale chiamati fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP). La SASP modifica in modo significativo il microambiente epatico, influenza il comportamento delle cellule immunitarie e peggiora il danno tissutale. Abbiamo dimostrato che lapatinib e neratinib inducono senescenza e SASP nella linea cellulare epatica HepG2. Inoltre, SASP da queste cellule senescenti promuove la polarizzazione M2-like dei macrofagi RAW264.7. Sebbene i macrofagi M2 siano associati a risposte antinfiammatorie e alla riparazione dei tessuti, la loro attività eccessiva o prolungata può portare a danni tissutali e fibrosi. I nostri risultati evidenziano un meccanismo attraverso il quale la senescenza degli epatociti indotta da TKI e SASP modulano la risposta immunitaria e possono contribuire alla tossicità epatica nei pazienti con carcinoma mammario. Ciò sottolinea l'importanza di mirare alle cellule senescenti o ai fattori SASP per ridurre la tossicità epatica e migliorare i risultati del trattamento, rendendo l'identificazione di senotherapeutics efficaci un obiettivo vitale della ricerca. Non c'è stato alcun rapporto in letteratura che dimostri l'effetto del secretoma delle cellule epatiche indotto da TKI sulla polarizzazione dei macrofagi.

Introduzione

Lapatinib e neratinib, entrambi inibitori della tirosin-chinasi (TKI) a piccole molecole, hanno ricevuto l'approvazione della FDA nel 2007 e nel 2017 per il trattamento del carcinoma mammario metastatico1. Questi farmaci sono noti per inibire il recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano, HER22, un recettore tirosin-chinasi che è sovraespresso in alcuni tumori al seno3. Nonostante il loro successo clinico, lapatinib e neratinib sono anche associati a effetti avversi, in particolare epatotossicità 4,5. Il danno epatico acuto, manifestato da elevati livelli di aminotransferasi, si verifica in circa il 14% dei pazienti sottoposti a trattamento con lapatinib o neratinib6. L'epatotossicità è in gran parte attribuita al metabolismo epatico di questi farmaci, che coinvolge gli enzimi del citocromo P450 (CYP), prevalentemente CYP3A4/5 7,8. Questi enzimi catalizzano la formazione di intermedi chinone-immina, che sono elettrofili e altamente reattivi 9,10. Questi metaboliti reattivi, tra cui O-dealchilato lapatinib, N-dealchilato lapatinib e N-idrossi lapatinib, O-dealchilato neratinib e N-demetilato neratinib, possono formare addotti covalenti con macromolecole cellulari, interrompendo così le normali funzioni cellulari e provocando infine danno epatico11.

I metaboliti reattivi di lapatinib e neratinib possono anche indurre stress ossidativo, un fattore chiave per la senescenza cellulare12. La senescenza cellulare è uno stato di arresto della crescita ma metabolicamente attivo, caratterizzato dalla secrezione di varie citochine pro-infiammatorie, fattori di crescita e proteasi. Questo fenotipo secretorio è noto come fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP)13,14,15. Il SASP può influenzare profondamente il microambiente circostante, spesso promuovendo l'infiammazione e il rimodellamento dei tessuti. Nel contesto della terapia del cancro, il SASP può arricchire la popolazione di cellule staminali tumorali e modificare la risposta immunitaria per favorire la sopravvivenza del tumore16. Inoltre, le citochine infiammatorie possono esacerbare il danno tissutale. Abbiamo ipotizzato che nei pazienti trattati con lapatinib e neratinib, il danno epatico sia in parte contribuito dalla senescenza indotta da TKI e dalla produzione di SASP pro-infiammatoria.

I nostri esperimenti hanno dimostrato che lapatinib e neratinib inducono la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) nelle cellule epatiche, portando a danni al DNA e disfunzione mitocondriale, che a sua volta innesca la senescenza cellulare. Questa senescenza può contribuire all'epatotossicità indotta da lapatinib/neratinib rilasciando fattori SASP, che possono influenzare la polarizzazione dei macrofagi.

I macrofagi svolgono un ruolo fondamentale nella risposta immunitaria e il loro fenotipo funzionale può cambiare in risposta a vari stimoli17,18. Il fenotipo classico dei macrofagi M1 è tipicamente associato a risposte pro-infiammatorie, inclusa la produzione di citochine come TNF-α e IL-1β, ed è generalmente considerato un marcatore di infiammazione acuta19,20. Al contrario, il fenotipo macrofagico M2 è associato a fibrosi, riparazione tissutale21, immunosoppressione e risposta all'infiammazione cronica 22,23. Le citochine infiammatorie nel SASP possono influenzare la polarizzazione dei macrofagi, promuovendo la conversione dei macrofagi M1 in un fenotipo23 simile a M2. Questo cambiamento di polarizzazione può avere implicazioni significative per il microambiente immunitario, portando potenzialmente all'immunosoppressione, alla progressione tumorale e al rimodellamento dell'architettura tissutale.

Per studiare la polarizzazione dei macrofagi indotta da lapatinib e neratinib, abbiamo utilizzato la linea cellulare RAW264.7, una linea cellulare murina simile ai macrofagi comunemente utilizzata nella ricerca immunologica24,25. Le cellule RAW264.7 derivano da topi BALB/c e sono ampiamente utilizzate per studiare l'infiammazione, la fagocitosi e le risposte immunitarie25. Rispondono a vari stimoli, tra cui i lipopolisaccaridi (LPS), e sono particolarmente preziosi per studiare la funzione dei macrofagi, la produzione di citochine e la biologia del cancro26. In questo studio, HepG2, una linea cellulare umana di epatoma, è stata trattata con lapatinib e neratinib per imitare gli effetti epatotossici osservati nei pazienti. La linea cellulare HepG2 è spesso utilizzata come modello di studio del metabolismo dei farmaci e dell'epatotossicità a causa della sua origine umana e del lignaggio del carcinoma epatocellulare27. Dopo aver trattato le cellule HepG2 con i TKI, i terreni condizionati sono stati raccolti e aggiunti alle cellule RAW264.7. Sono stati monitorati i successivi cambiamenti fenotipici dei macrofagi, concentrandosi sul fatto che il trattamento induca un passaggio dal fenotipo M1 pro-infiammatorio al fenotipo M2 immunosoppressivo.

L'epatotossicità indotta da farmaci è generalmente studiata attraverso saggi di citotossicità, valutazione dei marcatori infiammatori e l'uso di modelli animali. Rispetto a questi, il nostro metodo di esame dell'epatotossicità indotta da TKI lapatinib e neratinib attraverso fattori del fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP) e la loro influenza sulla polarizzazione dei macrofagi presenta diversi vantaggi. In primo luogo, il nostro metodo stabilisce una connessione tra i fattori SASP prodotti dalle cellule epatiche senescenti indotte da farmaci e l'immunità innata, che può essere ulteriormente collegata al rimodellamento dei tessuti, all'infiammazione cronica e alla carcinogenesi 28,29,30,31. Gli screening di tossicità convenzionali non possono aiutarci a catturare le interazioni a breve termine tra il fegato e le cellule immunitarie, né possono rivelare l'impatto a lungo termine dei TKI sull'infiammazione e la fibrosi epatica, in particolare nel contesto dell'esposizione cronica ai farmaci. Se combinata con un approccio proteomico adeguato per identificare i costituenti SASP, questa tecnica può aiutare a identificare i biomarcatori predittivi dell'epatotossicità indotta da TKI e informare la progettazione di interventi terapeutici per mitigarla 29,30,31.

Per l'implementazione, i ricercatori dovrebbero utilizzare sistemi di co-coltura o terreni condizionati con linee cellulari epatiche e immunitarie, come descritto, e valutare i biomarcatori della senescenza e i macrofagi M1 e M2. Questo metodo è più efficace per la valutazione del danno epatico acuto o cronico indotto da farmaci o per esplorare strategie per ridurre al minimo gli effetti off-target delle terapie antitumorali 29,30,31.

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Protocollo

1. Coltura cellulare

  1. Colture di cellule HepG2 in Modified Eagle Medium (MEM) ad alto glucosio con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e cellule RAW264.7 in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ad alto glucosio con il 10% di FBS a 37 °C con 5% di CO 2 e aggiornamento ogni 3 giorni.
    NOTA: L'uso di antibiotici non è raccomandato a meno che non vi sia alcuna contaminazione fungina o batterica. Le cellule RAW264.7 crescono molto rapidamente e devono essere espulse dopo 2 giorni.

2. Saggio MTT

  1. Conteggio e placcatura delle celle
    1. Coltivare cellule HepG2 in una piastra di coltura da 60 mm in un incubatore per colture cellulari in terreno di crescita completo (MEM + 10% FBS).
    2. Quando le cellule erano confluenti per circa l'80%, rimuovere il terreno di coltura, lavare rapidamente con 1 mL di 1x PBS e aggiungere 600 μL di 0,5x Tripsina. Incubare per 5-6 min.
      NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguiti in una cella per colture cellulari BSL 2.
    3. Neutralizzare la tripsina aggiungendo 1,2 mL di terreno di coltura completo all'interno del BSL 2.
      NOTA: Per evitare un'eccessiva tripsinizzazione, è necessario aggiungere un supporto completo, il doppio del volume di tripsina aggiunta.
    4. Prendere la sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga (MCT) da 5 mL e pellettare centrifugando a 180 g (1000 giri/min) per 3-4 minuti a temperatura ambiente (RT).
    5. Scartare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno, pipettare per miscelare in sospensione di una singola cellula e contare utilizzando un emocitometro al microscopio.
    6. Successivamente, piastrate le cellule HepG2 in una piastra a 96 pozzetti a 5000-7000 cellule per pozzetto, in terreno di crescita completo, in triplicato per ogni dose di farmaco e conservate nell'incubatore per 12-16 ore.
      NOTA: La confluenza cellulare dovrebbe essere del 50-60% per il trattamento farmacologico e questo passaggio dovrebbe essere eseguito all'interno della cappa.
  2. Trattamento della tossicodipendenza
    1. Preparare concentrazioni di lavoro gradualmente crescenti di lapatinib e neratinib in dimetilsolfossido (DMSO) dalla concentrazione madre (30 mM e 3,5 mM, rispettivamente) all'interno della cappa. Le concentrazioni finali sono 1, 2,5, 5, 10, 15, 25, 50 μM per lapatinib e 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10 μM per neratinib in terreni di crescita (MEM + 5% FBS). Mantieni un controllo senza trattamento per entrambi i farmaci.
    2. Scartare il terreno precedente dalla piastra a 96 pozzetti contenente le cellule, aggiungere 100 μL di terreno con il farmaco e incubare per 48 ore all'interno dell'incubatore.
  3. Colorazione e quantificazione
    1. Dopo 48 ore, aggiungere 10 μL di colorante 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT; 5 mg/mL), sciogliere in 1x soluzione salina tampone fosfato (PBS) in ciascun pozzetto e incubare per almeno 2 ore all'interno dell'incubatore fino alla comparsa di cristalli di colore viola.
      NOTA: Aggiungere il colorante direttamente nel terreno contenente il farmaco e non incubare le cellule con il colorante per più di 4 ore.
    2. Dopo l'incubazione, rimuovere il colorante, sciogliere i cristalli in 100 μL di DMSO in ciascun pozzetto e incubare per 15 minuti, quindi prendere la densità ottica (OD) a 595 nm.
      NOTA: Questo passaggio può essere eseguito all'esterno del cofano.

3. Saggio SA-β galattosidasi

  1. Trattamento della tossicodipendenza
    1. Piastra di cellule HepG2 in piastre da 35 mm a una densità di 40 x 104 cellule per piastra in tre set, una per lapatinib, una per neratinib e una di controllo non trattata.
      NOTA: Le fasi di conteggio e placcatura delle celle sono descritte nel passaggio 2.1.
    2. Aggiungere 1 μL di lapatinib da 5 mM di materiale lavorativo e 1,43 μL di neratinib da 3,5 mM di stock principale in 2 mL di terreno per ottenere una concentrazione finale di 2,5 μM (dose subletale) di lapatinib e neratinib.
      NOTA: La dose subletale del farmaco viene selezionata seguendo il grafico della sopravvivenza cellulare nel test MTT.
    3. Rimuovere il terreno precedente dalle stoviglie e lavare con 500 μL di 1x PBS una volta, quindi aggiungere il terreno contenente il farmaco (all'interno della cappa) e conservare per 48 ore all'interno dell'incubatore.
  2. Fissaggio e colorazione
    1. Dopo 48 ore, rimuovere il farmaco, lavare rapidamente con 500 μL di 1x PBS una volta e fissare con 1,5 mL di formaldeide al 2% e glutaraldeide allo 0,2% in 1x PBS per 10 minuti a RT.
    2. Dopo il fissaggio, lavare due volte le piastre con 1 mL di 1x PBS e assicurarsi che la soluzione fissativa sia rimossa correttamente. Aggiungere 1,5 mL di soluzione colorante (40 mM di tampone acido citrico/Na-fosfato, 5 mM di K4[Fe(CN)6], 5 mM di K3[Fe(CN)6], 150 mM di NaCl, 2 mM di MgCl 2, 1 mg/mL di X-gal in acqua sterilizzata in autoclave) e incubare per 8 ore a 37 °C senza CO2.
      NOTA: Il periodo di incubazione può variare a seconda del tipo di cellula; per HepG2, il periodo di incubazione non deve superare le 8 ore.
    3. Dopo la colorazione, lavare rapidamente le piastre in 1 mL di PBS 1x due volte e acquisire immagini in campo chiaro con un ingrandimento di 20x e 40x con un microscopio a epifluorescenza. Acquisire un minimo di quattro o cinque campi per ogni gruppo di trattamento.
      NOTA: Il volume del fissativo e della soluzione colorante varia in base alle dimensioni della lastra e tutti i passaggi possono essere eseguiti al di fuori della cappa.
  3. Quantificazione delle immagini
    1. Scatta una foto da un campo, conta il numero totale di celle e le celle che mostrano un segnale blu. Calcola manualmente la percentuale di celle con un segnale blu. Calcola almeno quattro immagini, fai la media, traccia in un foglio di calcolo e conduci un test t.

4. Rilevamento ROS

  1. Placcatura cellulare e trattamento farmacologico
    1. Piastra di cellule HepG2 in piastre con fondo di vetro da 35 mm a una densità di 40 x 104 cellule per piastra in tre set: una per lapatinib, una per neratinib e una di controllo non trattata.
      NOTA: Le fasi di conteggio e placcatura delle celle sono descritte nel passaggio 2.1.
    2. Seguire la stessa strategia di trattamento descritta al punto 3.1.
  2. Colorazione e imaging
    1. Dopo 48 ore di trattamento, aggiungere 2 μM di reagente ROX rosso intenso (5 mM), 1 μM di Mito Tracker Green (1 mM) per 30 minuti e controcolorare con 500 nM di colorante nucleare Hoechst (500 μM).
      NOTA: Il colorante deve essere aggiunto all'interno della cappa e deve essere evitata l'esposizione diretta alla luce. La controcolorazione viene eseguita aggiungendo il colorante nucleare Hoechst durante la somministrazione di altri coloranti.
    2. Dopo 30 minuti, rimuovere il colorante e lavare con 1x PBS per rimuovere il colorante in eccesso e visualizzare con un microscopio confocale a ingrandimento 100x (emersione dell'olio, lunghezza d'onda di eccitazione 640 nm, 488 nm e 405 nm, rispettivamente).
  3. Quantificazione delle immagini
    1. Quantificare il segnale della cellula ROX rosso utilizzando il software Fiji ImageJ e confrontarlo con il segnale del controllo non trattato. Utilizzare MitoTracker verde per indicare che il segnale proviene dai mitocondri. Dopo aver tracciato i grafici a barre con i valori medi, eseguire un test t.

5. Raccolta di media condizionati (CM)

  1. Trattare le cellule HepG2 con 2,5 μM di lapatinib o neratinib per 48 ore (strategia di trattamento simile alla fase 3.1, ad eccezione di questo esperimento, piastra 70 x104 cellule in un piatto da 60 mm).
  2. Dopo 48 ore, rimuovere il farmaco e lavare con 500 μl di 1x PBS una volta.
  3. Il giorno massimo della senescenza (dopo 48 ore di trattamento farmacologico), aggiungere 4 ml di terreno MEM privo di siero (senza FBS o altri integratori) alle cellule trattate con il farmaco e al controllo non trattato per 48 ore.
    NOTA: Il volume dei terreni privi di siero dipenderà dalle dimensioni della piastra.
  4. Successivamente, raccogliere il terreno privo di siero contenente tutto il secretoma, definito terreno condizionato, e conservarlo a -80 °C per un uso futuro.
    NOTA: Dopo aver raccolto il CM, deve essere centrifugato per 5 minuti a 2800 g (4000 giri/min) per rimuovere le cellule morte e altri detriti cellulari. Le cellule RAW264.7 sono tipicamente coltivate in DMEM, ma il CM viene raccolto in MEM secondo le condizioni di coltura di HepG2. Per mantenere la compatibilità, i terreni condizionati devono essere miscelati con DMEM privo di siero in rapporto 1:1 prima dell'incubazione di RAW264.7.

6. Polarizzazione M1/M2 in RAW264.7

  1. Placcatura delle celle
    1. Seguire il conteggio e la placcatura delle cellule come descritto al punto 2.1, ad eccezione della fase di tripsinizzazione. Durante la tripsinizzazione delle cellule RAW264.7, aggiungere 600-700 μL di tripsina 0,5x, incubare per 15-20 minuti nell'incubatore e, per neutralizzare la tripsina, aggiungere 2 mL di terreno di crescita (DMEM + 10% FBS) e piastra 70 x104 cellule in un piatto da 60 mm in tre set: lapatinib, neratinib e un controllo non trattato.
  2. RAW264.7 a induzione
    1. Rimuovere il normale terreno di coltura, lavare con 1 mL di 1x PBS una volta e aggiungere il CM corrispondente per 48 ore.
      NOTA: Prima di aggiungere il CM, assicurati di condizionarlo con DMEM privo di siero in un rapporto 1:1, poiché le cellule RAW264.7 crescono in DMEM, quindi mantenere le cellule in MEM causerà stress, che potrebbe ostacolare il risultato. Anche la coltura di RAW264.7 in CM (terreno privo di siero) per 48 ore può causare stress; In tal caso, è possibile effettuare un'incubazione di 24-30 ore prima di raccogliere i dati.
    2. Dopo l'incubazione, scartare il CM, lavare con 1 mL di 1x PBS, aggiungere 600 μL di tripsina in ciascuna piastra, incubare per 10 minuti e poi pellettare a 180 g (1000 giri/min) per 3 minuti a RT. Utilizzare il pellet per la purificazione delle proteine o conservarlo a -80 °C per un uso futuro.
      NOTA: Il tempo di tripsinizzazione varia a seconda del tipo di cellula e la centrifugazione non è consigliata oltre i 180 g.
  3. Isolamento delle proteine e western blotting
    1. Preparare il tampone di lisi mescolando il tampone di lisi del saggio di radioimmunoprecipitazione (RIPA) e il cocktail di inibitori della proteasi in un rapporto di 100:1. Aggiungere il tampone di lisi al pellet cellulare, risospendere e incubare su ghiaccio per 30 minuti.
      NOTA: Il volume del tampone di lisi varia in base alle dimensioni della tavolozza cellulare e la lisi può essere eseguita al di fuori della cappa. Se il pellet viene conservato a -80 °C, scongelare prima il pellet con ghiaccio, eseguire una breve centrifuga e rimuovere eventuali residui di liquido.
    2. Dopo l'incubazione, centrifugare il lisato cellulare a 20.000 g per 30 minuti a 4 °C. Raccogliere il surnatante e procedere con il western blot, oppure conservare a -20 °C per un uso futuro.
    3. Preparare il campione proteico prelevando 35-40 μg di proteine, aggiungere 1 colorante di caricamento, riscaldare per 5-6 minuti a 95 °C, eseguire SDS-PAGE (gel di acrilammide al 10% e 12%) a 90 V e trasferire sulla membrana di nitrocellulosa.
    4. NOTA: Per informazioni più dettagliate sul western blot, fare riferimento a Joubert et al.32.
    5. Controllare l'espressione dei marcatori di polarizzazione M1 e M2, sviluppando il blot utilizzando uno sviluppatore di perossidasi di rafano (HRP), iNOS (M1) e arginasi1 (M2), rispettivamente, utilizzando anticorpi anti-NOS2 e anti-ARG1.
      NOTA: La concentrazione per entrambi gli anticorpi primari, anti-NOS2 e anti-ARG1 è 1:1000 e l'anticorpo secondario anti-coniglio è 1:10.000.
  4. Polarizzazione dei macrofagi con LPS e IFN-γ
    1. Piastra 70 x 104 celle RAW264.7 in due piastre da 60 mm.
      NOTA: La procedura di placcatura è simile al passaggio 6.1.
    2. Dopo 12-16 ore, miscelare 4 μL di 1 μg/mL di lipopolisaccaride (LPS, la concentrazione madre è 1 mg/mL) e 1,33 μL di interferone-γ 33 ng/mL (IFN-γ, la concentrazione madre è 100 μg/mL) in 4 mL di terreno di crescita (DMEM + 10% FBS) e aggiungere al RAW264.7 pre-placcato, mantenendo un controllo non indotto.
    3. Dopo 48 ore, raccogliere il pellet cellulare tramite tripsinizzazione, isolare la proteina, eseguire un western blot e controllare l'espressione di iNOS (M1) e ARG1 (M2), rispettivamente, utilizzando anticorpi anti-iNOS e anti-ARG1.
      NOTA: Tutti i rifiuti di colture cellulari e biochimici devono essere gettati in un contenitore a rischio biologico, adeguatamente sterilizzati in autoclave e quindi smaltiti.

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Risultati

È stata condotta una serie di test per valutare l'impatto di TKI lapatinib e neratinib sulle cellule di carcinoma epatocellulare (HepG2) e i loro effetti paracrini a valle sui macrofagi. Le cellule HepG2 sono state trattate con concentrazioni variabili di lapatinib o neratinib e la vitalità cellulare è stata misurata a 48 ore utilizzando il test MTT (Figure 1A, B). Sulla base delle curve di sopravvivenza, è stata scelta u...

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Discussione

Il presente studio esplora gli effetti indiretti del trattamento con lapatinib o neratinib sulla polarizzazione dei macrofagi attraverso terreni condizionati raccolti da cellule epatiche HepG2 trattate con TKI. Utilizzando i macrofagi RAW264.7, osserviamo un fenotipo M2 dopo l'esposizione al mezzo condizionato, come indicato dalla sovraregolazione di ARG1. Morfologicamente, i macrofagi trattati mostravano una caratteristica forma ingrandita e allungata, supportando ulteriormente l'induzi...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano la Shiv Nadar Institution of Eminence per il supporto alle infrastrutture. Questo studio è finanziato dalla sovvenzione del Dipartimento di Scienze e Tecnologie CRG/2022/003242.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Linea cellulare di HepG2NCCSLinea cellulare aderente
Linea cellulare RAW264.7NCCSLinea cellulare aderente
DMEM (Eagle Medium Modificato di Dulbacco)HimediaAT066Alto livello di glucosio, polvere
MEM (Eagle Medium ModificatoGibco611100-053Polvere
PBS (Soluzione salina tampone di fosfato)HimediaTS1101Polvere
Soluzione tripsina-EDTAHimediaTCL007Soluzione
FBS (Siero Fetale Bovino)HimediaRM1112Liquido
Tintura MTTHimediaTC191Polvere
LapatinibSelleckchemS2111Polvere
NeratinibAzienda Chimica delle Cayman18404Polvere
DMSO (Dimetil Solfosdo) HimediaTC185Soluzione
Formaldeide RankemF0080Soluzione
GlutaraldeideSigma-aldrich340855Soluzione
Acido Citrico monoidrato, PuroHimediaGRM229Polvere
Fosfato di sodio dibase anidroso HimediaMB024Polvere
Ferrocianuro di potassio, K4[Fe(CN)6]Fisher Scientific P-236-500
Ferricianuro di potassio, K3[Fe(CN)6]Fisher Scientific P-232-500
NaClSRL41721Polvere
MgCl2 esaidratoHimediaGRM-1068Polvere
X-GalSRL45904Polvere
LipopolisaccarideSigma-aldrichL6529
Interferone ricombinante umano-γHimediaCF040-20MCG
Reagente rosso profondo Cell ROXThermo fisher scientificoC10422
HoechstInvitrogen, Thermo Fisher ScientificH3570Polvere
MitoTRACKER VerdeInvitrogen, Thermo Fisher Scientific1842298Polvere
Anticorpo anti-ARG1AffinitàDF6657Soluzione, Calcolato MW - 35kDa, MW osservato - 65kDa
Anticorpo anti-NOS2Cloudo Clone Corp.PAA837Hu01Soluzione, Calcolata MW - 130kDa, MW osservata - 65kDa
Anticorpo anti-iNOSAffinitàSoluzione, Calcolata MW - 130kDa, MW osservata - 120kDa
Anticorpi anti-GAPDHBiobharati LifeScience Pvt.LtdBB-AB0060Soluzione
Anticorpo Anti-ConiglioAzienda Chimica delle Cayman10004301Soluzione
Membrana di nitrocellulosa  Merck Millipore Ltd. HATF00010 (Numero del prodotto)
femtoLUCENTTMPLUS HRPG Bioscienze  786-003
Antenne da 60mmNUCK150462
piastra a 96 pozzi,  NUCK165306
Incubatore di colture cellulari  Thermo Fisher Scientific371
Microscopio  1. Microscopio Rovesciato LEICA    2. Microscopio Confocale Nikon 1. LED DMIL & nbsp;       2. Ti2E, A1R  Entrambi sono numerati dal modello
Sistema di imaging iBrightInvitrogen, Thermo Fisher ScientificCL1500 (numero di modello)
Lettore di targheBio-RADLettore di microplacche iMark
Centrifuga Thermo Fisher ScientificSorvall ST 8R (numero di modello)

Riferimenti

  1. Xuhong, J. C., Qi, X. W., Zhang, Y., Jiang, J. Mechanism, safety and efficacy of three tyrosine kinase inhibitors lapatinib, neratinib and pyrotinib in HER2-positive breast cancer. Am J Cancer Res. 9 (10), 2103-2119 (2019).
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