Monitoraggio dell'assorbimento e della localizzazione di composti organici nei tessuti vegetali mediante un saggio idroponico di radiomarcatura a 14C e imaging al fosforo

Sommario

Questo articolo delinea un metodo per studiare la bonifica mediata dalle piante utilizzando ¹⁴contaminanti organici marcati con C. Descrive la preparazione idroponica delle piante, l'assorbimento del radiomarcatore e l'imaging dei fosfori per monitorare l'assorbimento, la traslocazione e il metabolismo dei contaminanti. La tecnica offre uno strumento prezioso per valutare il potenziale di fitodepurazione in varie specie vegetali e inquinanti ambientali.

Abstract

La fitodepurazione, l'uso di piante per mitigare i contaminanti ambientali, offre un approccio sostenibile ed economico alla bonifica dei siti contaminati. Lo sviluppo di metodi che aiutino a chiarire i meccanismi alla base dell'assorbimento e del metabolismo degli inquinanti da parte delle piante è fondamentale per migliorare le pratiche di fitodepurazione. Questo articolo descrive un metodo per valutare l'assorbimento e la trasformazione di contaminanti organici da parte delle piante utilizzando composti radiomarcati. ¹⁴I composti organici marcati con C, come gli acidi C-naftenici modello ¹⁴, vengono utilizzati per tracciare il loro assorbimento, traslocazione, localizzazione e metabolismo nei tessuti vegetali. In precedenza abbiamo utilizzato questo metodo con diverse specie vegetali, tra cui Elymus trachycaulus e Salix interior. Queste osservazioni sono corroborate qui con la pianta modello, Arabidopsis thaliana, coltivata idroponicamente in soluzioni Hoagland modificate. L'assorbimento del radiomarcatore è stato monitorato tramite il conteggio a scintillazione liquida e l'imaging al fosforo, che consente la visualizzazione e la quantificazione dei composti radiomarcati all'interno dei tessuti vegetali. Questo metodo descrive in dettaglio la preparazione dei materiali vegetali, l'uso di composti radiomarcati e il processo di analisi della distribuzione e del destino dei contaminanti all'interno delle piante. Il metodo include anche strategie per la valutazione dell'essudazione dei composti e consente di valutare sia l'assorbimento da parte delle piante che la traslocazione dei contaminanti ambientali. Questo approccio fornisce informazioni sui processi di bonifica mediati dalle piante e può essere applicato allo studio di un'ampia gamma di contaminanti ambientali e specie vegetali.

Introduzione

Il biorisanamento è una tecnologia di bonifica mediata da entità biologiche, come piante e microrganismi. Il fitorisanamento, che utilizza piante o prodotti vegetali per rimuovere i contaminanti dall'ambiente, può integrare o fungere da alternativa al risanamento su base microbica, superando alcuni dei limiti dell'uso di soli microrganismi 1,2,3,4. Il fitorisanamento è conveniente grazie ai processi solari delle piante, in cui i contaminanti vengono assorbiti attraverso le loro radici o germogli e trasportati tra cellule e tessuti dove possono essere metabolizzati, sequestrati o volatilizzati⁵. Le piante più efficaci per il fitorisanamento sono in genere specie resilienti, tolleranti allo stress con alti tassi di traspirazione, rapida produzione di biomassa e apparati radicali profondi, come quelli che si trovano nei generi Populus e Salix ⁶. Come organismi sessili, le piante hanno sviluppato diverse vie metaboliche per gestire i composti tossici nel loro ambiente¹. Questo li dota di un'ampia gamma di geni e processi biochimici che migliorano la loro capacità di gestire i contaminanti.

Il quadro di fitodegradazione, proposto per la prima volta da Sandermann et al. (1977)⁷, delinea un processo in tre fasi per la disintossicazione da contaminanti mediata dalle piante: trasformazione, coniugazione e compartimentazione. In ogni fase, i contaminanti subiscono modifiche enzimatiche che ne aumentano l'idrofilia, riducono la loro tossicità e li rendono più suscettibili di sequestro o ulteriore mineralizzazione⁴. Tuttavia, poiché le piante si affidano principalmente all'anidride carbonica atmosferica per la fissazione del carbonio, la loro capacità di mineralizzare completamente i contaminanti organici è potenzialmente limitata. I contaminanti possono invece essere sequestrati nei vacuoli o nelle pareti cellulari (fitosequestro) o volatilizzati nell'atmosfera (fitovolatilizzazione)¹.

Una sfida chiave nella ricerca sul fitodepurazione è rilevare se le piante possono assorbire e trasformare i contaminanti organici dal loro ambiente¹. I metodi di rivelazione tradizionali spesso non riescono a tracciare con precisione i percorsi di assorbimento e traslocazione dei contaminanti, rendendo difficile valutare la capacità di una pianta di rimediare a specifici inquinanti ^1,5. I composti organici radiomarcati con carbonio-14 (¹⁴C) offrono una potente soluzione a questo problema. Esponendo le piante a ¹⁴contaminanti marcati con C, i ricercatori possono tracciare l'incorporazione del carbonio radiomarcato nei tessuti vegetali, fornendo informazioni precise sull'assorbimento, la traslocazione e la trasformazione del contaminante. Questa tecnica consente l'identificazione di specie vegetali in grado di bonificare specifici inquinanti organici e offre un modo affidabile per valutare le vie fisiologiche coinvolte. In definitiva, l'uso di ¹⁴composti marcati con C fa progredire la nostra comprensione del potenziale di fitodepurazione, supportando lo sviluppo di strategie più efficaci e mirate per il risanamento ambientale.

Questo articolo descrive un metodo che utilizza ¹⁴contaminanti organici radiomarcati con C per monitorare l'assorbimento, la traslocazione e il destino di questi contaminanti da una soluzione idroponica da parte delle piante. Una recente pubblicazione ha descritto un metodo simile per tracciare il destino di ¹⁴erbicidi marcati con C dopo l'applicazione fogliare⁸. Tuttavia, il metodo qui descritto delinea come valutare la rimozione e la traslocazione di contaminanti radiomarcati dalla soluzione idroponica, con commenti su come adattare questo metodo all'uso del suolo.

Protocollo

NOTA: Prima di procedere con questo protocollo, è importante consultare le linee guida e i regolamenti istituzionali e nazionali sulla sicurezza dei radioisotopi pertinenti. In breve, maneggiare tutto il materiale radioattivo, o qualsiasi cosa che possa essere entrata in contatto con i radioisotopi, indossando doppi guanti, un camice da laboratorio e occhiali di sicurezza. La procedura è stata eseguita in uno spazio dedicato nel laboratorio con nastro adesivo per delimitare le sezioni che contengono radioisotopi. Inoltre, dopo tutte le procedure, pulire immediatamente la vetreria e gli strumenti, quindi tamponarli e testarli per la presenza di radioisotopi contaminanti tramite conteggi di scintillazione. Tutti i materiali e i liquidi utilizzati in questi test sono stati smaltiti in appositi contenitori per rifiuti radioattivi e smaltiti correttamente seguendo le linee guida dell'Università di Calgary e della Commissione canadese per la sicurezza nucleare.

1. Preparazione della soluzione di Hoagland

1. Preparare una soluzione Hoagland 0,5x (a metà forza) da una miscela commerciale o creare il terreno da zero, composto da 0,5 mM NH₄H₂PO₄, 3 mM KNO₃, 2 mM Ca(NO₃)₂, 1 mM MgSO₄, 23 μM H₃BO₃, 5 μM MnCl₂•4H₂O, 400 nM ZnSO₄•7H₂O, 200 nM CuSO₄•5H₂O, 70 nM H₂MnO₄•1H₂O, 45 μM FeSO₄•7H₂O.
2. Aggiungere MES o un altro tampone appropriato per ottenere una concentrazione finale di 10 mM.
3. Regolare il pH al valore desiderato (in questo caso, il pH era 5,0).

2. Preparazione della soluzione di radiomarcatura

1. Trasferire il volume richiesto di soluzione 0,5x Hoagland (50 mL per replica) in un matraccio pulito.
2. Aggiungere 0,1-0,26 kBq/mL del composto radiomarcato alla soluzione di Hoagland.
   NOTA: In questo studio è stato utilizzato ¹⁴C-AdCA (acido adamantano-1-carbossilico) disciolto in metanolo.
3. Mescolare accuratamente facendo roteare il pallone per 2-3 minuti.
4. Aliquotare 50 mL della soluzione di radiomarcatura in 125 mL di matracci di Erlenmeyer per ogni replica.

3. Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) preparazione delle piante

NOTA: Il protocollo per la coltivazione idroponica di Arabidopsis thaliana è dettagliato in Conn et al. (2013)⁹.

1. Per ogni pianta, rimuovere un tappo da una provetta standard da microfuge da 1,7 ml con le forbici e praticare un foro di 3 mm di diametro al centro del tappo utilizzando un perforatore per cuoio.
2. Sigillare temporaneamente la parte superiore dei tappi con del nastro adesivo e riempire i tappi con terreno Hoagland 0,5x fuso contenente lo 0,8% di agar, quindi posizionare il coperchio di una scatola di puntali modificata (il serbatoio di germinazione) (Figura 1A).
3. Sterilizzare i semi di Arabidopsis in superficie mediante lavaggi consecutivi in etanolo al 70% per 10 minuti, poi 5 minuti e asciugarli nella cappa di flusso su carta da filtro sterile.
4. Seminare i semi nel terreno di coltura agar attraverso il foro praticato nella parte superiore del tappo della microcentrifuga.
5. Stratificare i semi nella rastrelliera a 4 °C per 2-4 giorni.
6. Spostare la vasca di germinazione in una camera di crescita in condizioni di giornata lunga (16 ore di luce, 8 ore di buio a ~150 μmol/m,²s di luce e 22 °C).
7. Riempire i rack dei puntali con una soluzione Hoagland 0,5x.
   NOTA: Assicurarsi che la soluzione tocchi l'agar per evitare che si secchi.
8. Coltiva le piante per 2-3 settimane, rabboccando la soluzione secondo necessità (ogni 3-4 giorni) in modo che l'agar rimanga a contatto con la soluzione idroponica.
9. Trapiantare i cappucci e le piantine in un'apertura di 10 mm di diametro, tagliare il centro di un coperchio di una provetta Falcon da 50 ml con un trapano e una punta per trapano (Figura 1B).
10. Praticare 12 fori nel coperchio della borsa di plastica da 10 L con una punta da trapano da 30 mm di diametro (il serbatoio di maturazione).
11. Posiziona i coperchi del tubo Falcon sopra le aperture nella parte superiore della borsa in modo che le radici passino nella borsa sottostante.
12. Fissare le pietre porose sul fondo del serbatoio di maturazione e riempirle con la soluzione Hoagland fino a quando le radici non sono per lo più sommerse.
13. Rimetti le piante nella camera di crescita e cresci per altre 6-8 settimane (16 ore di luce, 8 ore di buio a ~150 μmol/m²s di luce e 22 °C), fino a quando le rosette hanno un diametro di circa 10 cm.

Figura 1: Vasche idroponiche per la germinazione e la maturazione dell'Arabidopsis e il recipiente di trattamento ¹⁴C-AdCA. (A) La vasca di germinazione utilizzata per germinare i semi di Arabidopsis per la crescita idroponica. (B) Piante di Arabidopsis nella vasca di maturazione pronte per la sperimentazione. (C) Una pianta di Arabidopsis con radici immerse nella soluzione ^{di 14}C-AdCA durante la sperimentazione. I palloni da 50 ml (il recipiente di trattamento da ¹⁴C) sono normalmente coperti con un foglio di alluminio (non mostrato) durante l'esposizione per prevenire la crescita delle alghe. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Giunco baltico (Juncus balticus Willd. ) preparazione delle piante

1. Stratificare i semi tra due pezzi di carta da filtro umidi in una capsula di Petri a 4 °C per 1-2 settimane.
2. Rimuovere la carta da filtro superiore e posizionare il piatto in una camera di crescita in condizioni di giornata lunga (16 ore di luce, 8 ore di buio a ~150 μmol/m,²s di luce e 22 °C) per 1 settimana.
3. Trapiantare le piantine in rack di punte modificate come descritto per l'Arabidopsis (passaggio 3.1-3.4).
4. Coltiva le piante per 2-3 settimane (16 ore di luce, 8 ore di buio a ~150 μmol/m,²s di luce e 22 °C), o fino a quando le radici raggiungono i 3-4 cm di lunghezza.
5. Trapiantare le piante in un contenitore modificato da 10 L con pietre porose, riempire con la soluzione di Hoagland fino a quando le radici non sono per lo più sommerse e crescere per altre 6-8 settimane (16 ore di luce, 8 ore di buio a ~150 μmol/m,²s di luce e 22 °C).

5. Preparazione della piantina di salice sandbar (Salix interior Rowlee)

NOTA: Il protocollo per la coltivazione di piantine di salice Sandbar è descritto in Alberts et al. (2021)¹⁰.

1. Tagliare talee di 10 cm di gambo (5 mm di diametro) e immergerle per una notte a temperatura ambiente in diH₂O per idratare e stimolare la radicazione.
2. Trasferire le talee idratate in vasche idroponiche aerate con 10 L di soluzione Hoagland 0,5x e crescere per 1 mese (16 ore di luce, 8 ore di buio a ~150 μmol/m,²s di luce e 22 °C) per stabilire la crescita delle radici e dei germogli.
   NOTA: Rinfrescare la soluzione Hoagland ogni 2 settimane per prevenire la carenza di nutrienti durante lo sviluppo della piantina.

6. Marcatura con radioisotopi

1. Dopo aver preparato la soluzione di radiomarcatura, prelevare un'aliquota di 100 μl dalla soluzione per il conteggio a scintillazione liquida per determinare la concentrazione isotopica iniziale.
2. Asciugare delicatamente le radici delle piante e trasferire il tappo del tubo Falcon in fiasche di Erlenmeyer da 125 ml (il recipiente di trattamento da ¹⁴C) contenenti 0,5 volte la soluzione di Hoagland con i ¹⁴composti organici marcati con C del passaggio 2.4.
3. Segnare il livello della soluzione sul pallone per assicurarsi che possa essere rabboccato fino al volume iniziale durante l'esperimento, tenendo conto dell'evapotraspirazione.
4. Avvolgere i palloni in un foglio di alluminio e agitare a 40-60 giri/min sotto le luci di coltivazione per tutta la durata del saggio o fino a quando le piante etichettate non vengono trasferite in una soluzione Hoagland 0,5x senza radiomarcatore per un periodo di inseguimento.
5. Rabboccare il volume nel matraccio ogni 1-2 ore fino alla linea effettuata al punto 6.3 con la soluzione di Hoagland senza radiomarcatore prima di raccogliere 100 μl di aliquote. Assicurati di misurare il volume di Hoagland aggiunto a ciascun pallone per confrontare il tasso di evapotraspirazione di ciascuna soluzione. Dopo le prime 6-8 ore, i tempi di campionamento possono aumentare fino a ogni 12-24 ore.
   NOTA: Questo passaggio può durare per giorni, se necessario, ma assicurati di monitorare quotidianamente la radioattività nelle aliquote man mano che l'esperimento procede.
6. Opzionale: per monitorare l'essudazione durante il periodo di inseguimento, trasferire l'impianto e il gruppo del tappo del tubo Falcon in un pallone con 50 ml di soluzione fresca di Hoagland (non contenente ¹⁴composti marcati con C) e rimuovere un'aliquota di 100 μl ogni 2 ore per le prime 6-8 ore, quindi a intervalli di 24 ore dall'inizio dell'esperimento.
   NOTA: Per distinguere tra essudazione passiva diffusa e attiva del composto dalle radici della pianta, è possibile aggiungere un inibitore attivo del trasporto come la ciclosporina A a una concentrazione di 20 μM.
7. Misurare la conta radioattiva di ciascuna aliquota raccolta tra i passaggi 6.1-6.6 utilizzando un contatore a scintillazione liquida.

7. Imaging al fosforo delle piante

1. Sciacquare le radici per 15 minuti in una soluzione Hoagland 0,5x senza radiomarcatore per rimuovere il radioisotopo legato in modo lasco.
2. Raccogliere 100 μl di soluzione di risciacquo per il conteggio della scintillazione liquida.
3. Pesare le piante o il materiale vegetale non legnoso per determinare la massa fresca.
4. Asciugare il materiale vegetale con un essiccatore in gel su un pezzo di carta da filtro etichettata a 50 °C sotto vuoto per 2 ore, quindi lasciare asciugare per una notte a temperatura ambiente.
   NOTA: Una volta essiccate, le piante possono essere conservate per periodi prolungati (4-6 mesi) e l'imaging può avvenire in un secondo momento con un calo minimo del segnale radioattivo.
5. Pulisci lo schermo al fosforo esponendolo alla luce intensa su una gomma al fosforo per 15 minuti.
6. Erogare 2-10 μL di soluzione radiomarcatrice con radioattività nota su un pezzo di carta da filtro e lasciarlo asciugare a temperatura ambiente per una notte.
   NOTA: Qui vengono utilizzati gli standard con le radioattività: 67, 33, 17, 8, 4 e 2 Bq, ma questo può essere modificato per adattarsi alle intensità del segnale dai campioni di piante.
7. Posizionare lo schermo al fosforo sopra i campioni di piante essiccate e gli standard radioattivi al buio o in un contenitore opaco chiuso ed esporli per almeno 24 ore.
   NOTA: Se l'immagine è sottoesposta o sovraesposta, regolare il tempo di esposizione di conseguenza.
8. Immagini degli schermi con un sistema di imaging al fosforo a scansione laser con risoluzione di 50 μm.
9. Analizza l'intensità e la distribuzione del segnale dell'immagine al fosforo utilizzando il software ImageJ¹¹.
   1. Passaggi di ImageJ: Aprire l'immagine selezionando File > Analizza > Imposta misure... Selezionare Area e Valore medio di grigio > OK. Scegli lo strumento di selezione della forma che meglio si adatta al tessuto. Fare clic e trascinare sull'immagine per evidenziare l'area di interesse. Premi Ctrl + M. Copia l'area e il valore medio del grigio in un foglio di calcolo.
10. Convertire i valori medi di grigio in Bq utilizzando gli standard radioattivi in una curva standard.
11. Calcola l'attività totale nei tessuti vegetali (densità integrate) con la seguente equazione:
    Densità integrata (Bq) = (Bq medio del tessuto (Bq/cm²) - Fondo (Bq/cm²)) * Area (cm²)
    1. Facoltativo: convertire l'immagine in scala di grigi in una scala di intensità colore utilizzando il software ImageJ¹¹.

Risultati

La procedura di captazione con marcatura ^{C 14}è applicabile a una varietà di specie vegetali oltre all'Arabidopsis, tra cui Salix interior, Elymus trachycaulus (Link) Gould ex Shinners e specie di zone umide come Juncus balticus^10,12. Tuttavia, a scopo rappresentativo, presentiamo i risultati dell'ecotipo Arabidopsis Columbia-7 (Col-7). In precedenza, abbiamo dimostrato che i contaminanti ambie...

Discussione

La fitodepurazione ha guadagnato attenzione negli ultimi decenni come metodo passivo, economico ed ecologico per la pulizia dei rifiuti industriali e dei siti contaminati¹. L'identificazione delle specie vegetali con un maggiore assorbimento dei contaminanti e la comprensione dei processi molecolari che regolano l'assorbimento delle molecole organiche potrebbero migliorare le strategie di fitodepurazione. A differenza di altri metodi indiretti, la tecnica di assor...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Hoagland Miscela di sale basale modificata	Laboratori Fitotecnologici	H353	Contiene solfato ferroso
Agar	BioShop	AGR001
MES (acido 2-(N-morfinolino) etano solfonico)	BioShop	MES555
Misuratore di pH	Mettler Toledo	CinqueFacile
Metanolo	BioShop	MET302
Acido carbossilico 12C-Adamantano	Sigma Aldrich	106399
Acido carbossilico 14C-Adamantano	ViTrax		Sintesi personalizzata
Palloni di Erlenmeyer da 125 mL	VWR	30623-174
Provette Falcon da 50 mL	VWR	CA21008-940
Tubi microcentifughi	VWR	87003-294
Camere di crescita per piante	Conviron
Scatole per punte	DiaMed	DIATEC530-8376
Borsa shopping Rubbermaid Roughneck 3 Gal	Amazzone	B0B3345MYH
Carta da filtro	VWR	CA28320-020
Petri	VWR	11019-566
Agitatore con portapalloni	Forma Scientifica	Modello 4516
Cocktail di scintillazione	Prodotti di ricerca internazionale	111195
Fiale a scintillazione	VWR	10014-296
Contatore a scintillazione	Beckman Coulter	LS 6000IC	Le fiale utilizzate dipenderanno dal contatore a scintillazione
Essiccatore per gel	Bio-Rad	Modello 583
Imager al fosforo a scansione laser	Bio-Rad	Imager molecolare FX