Riprogrammazione trattabile in vivo di cellule tumorali in cellule dendritiche convenzionali di tipo 1

Sommario

Questo protocollo descrive la riprogrammazione in vivo di cellule tumorali di topo in cellule dendritiche di tipo 1 all'interno del microambiente tumorale attraverso l'espressione forzata dei fattori di trascrizione PU.1, IRF8 e BATF3.

Abstract

L'efficacia dell'immunoterapia del cancro si basa sul reclutamento e l'attivazione di risposte citotossiche delle cellule T contro i tumori solidi da parte delle cellule dendritiche convenzionali di tipo 1 (cDC1). Tuttavia, la generazione di cDC1 per l'immunoterapia del cancro deve affrontare limitazioni significative, tra cui la scarsa resa cellulare, l'eterogeneità funzionale e la suscettibilità all'immunosoppressione nel microambiente tumorale (TME). Recentemente abbiamo sviluppato una modalità di immunoterapia basata sulla riprogrammazione in vivo di cellule tumorali in cellule immunogeniche cDC1-like, che ha permesso alle cellule tumorali di presentare antigeni tumorali come cDC1 e di suscitare risposte citotossiche policlonali delle cellule T e un'immunità antitumorale sistemica duratura. Qui, descriviamo un protocollo trattabile per generare cellule simili a cDC1 all'interno del TME sovraesprimendo la rete di regolazione genica minima specifica per cDC1-PU.1, IRF8 e BATF3 (collettivamente denominate PIB) - nelle cellule tumorali, seguita dall'impianto sottocutaneo di una miscela di cellule trasdotte e parentali. La sovraespressione di PIB guida l'acquisizione graduale del marcatore ematopoietico CD45 e del complesso professionale di presentazione dell'antigene MHC di classe II su cellule tumorali, fungendo da letture della superficie cellulare per la riprogrammazione in vivo di cDC1. Rispetto al processo di riprogrammazione in vitro, la riprogrammazione del modello di melanoma murino YUMM1.7 in vivo ha dimostrato una cinetica più veloce e una maggiore efficienza. Le cellule simili a cDC1 hanno indotto un rapido rimodellamento del TME reclutando cellule immunitarie dell'ospite entro i primi 3 giorni e portando alla formazione di una struttura linfoide terziaria entro il giorno 9. Le cellule cDC1-like riprogrammate persistevano nei tumori per almeno 9 giorni, ma non sono state rilevate al giorno 15. Il protocollo di riprogrammazione in vivo cDC1 qui descritto fornisce un metodo trattabile e robusto per trasformare efficacemente i tumori "immuno-freddi" in "immuno-caldi". Nel complesso, offre una potente piattaforma per studiare i meccanismi alla base dell'immunità antitumorale mediata da cDC1 e scoprire combinazioni sinergiche con altre modalità di immunoterapia del cancro.

Introduzione

I recenti progressi nelle modalità di immunoterapia del cancro, tra cui il blocco del checkpoint immunitario (ICB), la terapia cellulare adottiva (ACT) e i vaccini, hanno cambiato il panorama del trattamento del cancro¹. Nel melanoma, i tassi di risposta all'inibizione della proteina 1 della morte cellulare programmata (PD-1) e della proteina 4 associata ai linfociti T citotossici (CTLA-4) possono raggiungere fino al 60%². Tuttavia, oltre il 40% dei pazienti con melanoma non risponde all'ICB e i tassi di risposta nei tumori meno immunogenici, come il cancro al seno, il cancro colorettale stabile ai microsatelliti e il glioblastoma, rimangono al di sotto del 5%, evidenziando lacune cliniche ^3,4,5. Uno dei principali ostacoli al successo clinico è la scarsa attivazione delle risposte citotossiche delle cellule T, che dipendono da un'efficiente presentazione dell'antigene all'interno del microambiente tumorale (TME)⁶.

Le cellule dendritiche convenzionali di tipo 1 (cDC1) sono rare, ma indispensabili per l'inizio dell'immunità tumore-specifica, offrendo tre segnali chiave per innescare le risposte delle cellule T: (1) elaborazione e presentazione professionale di antigeni su complessi maggiori di istocompatibilità (MHC) di classe I e II, (2) co-stimolazione tramite CD80 e CD86 e (3) segnalazione pro-infiammatoria delle citochine tra cui IL-12 ^7,8. Tra i sottogruppi di cellule dendritiche (DC), i cDC1 eccellono nella presentazione incrociata di antigeni associati alle cellule tumorali per innescare cellule T CD8⁺ naive o riattivare la memoria o guidare la differenziazione delle cellule T CD4⁺ in cellule T helper (T_H1) di tipo 1⁹. Inoltre, i cDC1 sono i principali produttori di chemochine, ligandi 9 e 10 delle chemochine con motivo C-X-C (CXCL9/10), che mediano il reclutamento delle cellule T nel tessuto tumorale 10,11,12,13. Negli ultimi anni, numerosi studi hanno evidenziato che il rigetto del tumore e le risposte efficaci a ICB o ACT sono fortemente correlate con la presenza di cDC1s^12,13 intratumorali. Pertanto, le cDC1 si sono sviluppate come un bersaglio attraente per l'immunoterapia del cancro e sfruttare con successo le loro caratteristiche uniche può avere un potenziale traslazionale significativo.

Gli attuali metodi per generare cDC1 si basano sull'isolamento o la differenziazione del sangue da progenitori CD34⁺ o cellule staminali pluripotenti 14,15,16. Le strategie cliniche predominanti si basano sull'isolamento di una miscela di sottogruppi autologhi di DC dal sangue e sulla loro stimolazione ex vivo con agonisti del recettore toll-like o citochine pro-infiammatorie per indurre un programma immunogenico maturo prima della reinfusione¹⁶. Tuttavia, queste strategie sono limitate dalla scarsa maturazione cellulare, dalle barriere immunosoppressive nel TME e dall'eterogeneità dei sottoinsiemi nella miscela di DC infusa, dove è presente solo una piccola percentuale di cDC1⁷. Inoltre, isolare solo i cDC1 per l'immunoterapia o la vaccinazione del cancro è difficile a causa della loro bassissima abbondanza nel sangue periferico (<0,3%)¹⁶. Inoltre, i cDC1 possono essere prodotti da cellule progenitrici CD34⁺ o da cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando citochine e segnalazione NOTCH. Tuttavia, questi metodi richiedono protocolli complessi e lunghi e producono numeri bassi e popolazioni eterogenee di sottogruppi DC 17,18,19.

Per affrontare queste limitazioni, la riprogrammazione in vivo fornisce una strategia adatta all'immunoterapia del cancro per generare cellule simili a cDC1, che assomigliano alle proprietà fenotipiche, trascrizionali e funzionali di cDC1s²⁰. Attraverso la sovraespressione della rete di regolazione genica minima specifica per cDC1 - PU.1, IRF8 e BATF3 (collettivamente denominate PIB) - i fibroblasti, le cellule stromali e le cellule tumorali sono stati gradualmente riprogrammati in cellule simili a cDC1 consentendo l'elaborazione e la presentazione dell'antigene tumorale su MHC di classe I e II, la segnalazione co-stimolatoria tramite CD80 e CD86 e la secrezione di citochine/chemochine, inclusi CXCL9/10 e IL-12^20, 21,22,23. La riprogrammazione di cDC1 è progredita più velocemente e in modo più efficiente tra xenotrapianti umani in vivo e indipendentemente dall'immunosoppressione, generando cellule simili a cDC1 con una firma immunogenica matura²⁰. Nei tumori del melanoma singenico, abbiamo osservato che le cellule simili a cDC1 rimodellano il loro TME, inducono la formazione di struttura linfoide terziaria (TLS) e reclutano ed espandono le cellule T_H1 policlonali e le cellule T di memoria citotossiche, portando a un'immunità sistemica a lungo termine²⁰. Infine, abbiamo sviluppato una nuova modalità di immunoterapia del cancro basata sulla riprogrammazione in situ di cellule tumorali in cellule simili a cDC1 mediante iniezione intratumorale di vettori adenovirali²⁰. Questi risultati aprono la strada alla traduzione clinica della riprogrammazione di cDC1 come una nuova modalità di immunoterapia del cancro in grado di sfruttare le proprietà funzionali di cDC1.

Qui, presentiamo un protocollo trattabile per generare cellule cDC1-like all'interno del TME basato sulla riprogrammazione in vivo di cDC1. La somministrazione lentivirale di PIB alle cellule tumorali e il successivo impianto come mix definito di cellule tumorali trasdotte con cellule tumorali parentali non trasdotte consente la riprogrammazione in vivo di una frazione controllata di cellule tumorali all'interno della TME. Inoltre, questo metodo non è limitato dall'efficienza di somministrazione in situ dei vettori virali²⁰. Descriviamo i passaggi per un'efficiente produzione di vettori lentivirali, titolazione funzionale e riprogrammazione in vivo di cDC1 utilizzando il modello di melanoma singenico, YUMM1.7, come esempio. Descriviamo in dettaglio la configurazione sperimentale e la strategia di gating per l'analisi in vivo di cellule cDC1-like riprogrammate mediante citometria a flusso dopo dissociazione tumorale. Forniamo anche le fasi per valutare le variazioni nel TME eseguendo la crioconservazione, il sezionamento e la colorazione in immunofluorescenza delle sezioni tumorali, seguite dalla microscopia confocale. Infine, affrontiamo come monitorare l'immunità indotta da cDC1 misurando la crescita e la sopravvivenza del tumore. Questo approccio trattabile e scalabile offre ai ricercatori uno strumento prezioso per valutare le strategie di trattamento combinatorio con la riprogrammazione in vivo di cDC1, per caratterizzare i cambiamenti nella neogenesi di TME e TLS in modelli tumorali o per eseguire screening di grandi dimensioni che modificano l'espressione di varie vie immunitarie, ad esempio la presentazione dell'antigene o la secrezione di citochine/chemochine, e svelare il loro impatto sull'immunità antitumorale.

Protocollo

Le procedure sperimentali sugli animali sono state eseguite in conformità con le normative svedesi dopo l'approvazione del Consiglio svedese per l'agricoltura.

1. Preparazione del reagente

1. Per preparare il terreno completo Eagle's medium modificato (DMEM) di Dulbecco, aggiungere il 10% (v/v) di siero fetale bovino (FBS), 1 mM di piruvato di sodio, 100 U/mL di penicillina (Pen), 2 mM di sostituto della glutammina e 100 mg/mL di streptomicina (Strep).
2. Per preparare i terreni completi RPMI 1640, aggiungere il 10% (v/v) di FBS, 2 mM di sostituto della glutammina, 1 mM di piruvato di sodio, 50 mM di 2-mercaptoetanolo, 100 U/mL di penna e 100 mg/mL di streptococco.
3. Per preparare il terreno completo DMEM/F12, aggiungere il 10% (v/v) di siero fetale bovino (FBS), 1 mM di piruvato di sodio, 0,1 mM di aminoacidi non essenziali e 100 U/mL di Pen e 100 mg/mL di streptococco.
4. Per preparare 1 mg/mL di polietilenimmina (PEI), sciogliere 100 mg di polvere di PEI in 100 mL di acqua deionizzata sterile in un becher di vetro o in una provetta conica. Posizionare il becher su un agitatore magnetico e mescolare a temperatura ambiente (RT) per creare un vortice fino a completa dissoluzione. Regolare il pH a 6,9-7,1, aggiungendo acido cloridrico (HCl)/idrossido di sodio (NaOH) goccia a goccia, e filtrare la soluzione attraverso un filtro a membrana PES da 0,22 μm.
5. Per preparare 1 mM di butirrato di sodio, sciogliere 1,10 mg in 10 mL di acqua deionizzata sterile.
6. Per preparare 8 mg/mL di Polybrene, sciogliere 80 mg di polvere di Polybrene in 10 mL di acqua deionizzata sterile.
7. Per preparare il tampone FACS, aggiungere il 2% di FBS e 1 mM di EDTA alla soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).

2. Produzione di lentivirus

1. Scongelare le cellule HEK 293T aggiungendo 1 mL di cellule a 9 mL di terreno completo DMEM preriscaldato e centrifugare le cellule a 350 × g per 5 min. Risospendere il pellet cellulare in 20 mL di terreno completo DMEM e le cellule di coltura in una piastra da 150 mm a 37 °C con CO₂ al 5%.
2. Espandi e dividi le celle HEK 293T quando raggiungono l'80-90% di confluenza. Per dividere le cellule, lavare una volta con PBS, aggiungere 5 mL di tripsina per dissociarle dalla piastra e incubare 5-10 minuti a 37 °C con CO₂ al 5%.
3. Raccogliere le cellule con 5 mL di terreno completo DMEM, centrifugarle a 350 × g per 5 minuti e dividerle 1:6 in nuove piastre da 150 mm, 48 ore prima della trasfezione.
   NOTA: La qualità della linea cellulare produttrice di lentivirus è fondamentale per la produzione di titoli elevati. Non permettere alle cellule di superare il 95% di confluenza ed evitare di seminarle al <30% di confluenza.
4. Dopo 48 ore, o quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, preparare la miscela di trasfezione in una provetta conica da 50 mL. Utilizzare il seguente plasmide di trasferimento: 1) SFFV-PIB-IRES-eGFP-un vettore lentivirale policistronico contenente i fattori di trascrizione PU.1, IRF8, BATF3, un sito di ingresso ribosomiale interno (IRES) e una proteina fluorescente verde potenziata (eGFP) come reporter di trasduzione fluorescente; o 2) SFFV-eGFP, un vettore lentivirale di controllo con un sito di clonazione multiplo ed eGFP; o 3) SFFV-mCherry, un vettore lentivirale che esprime mCherry. Aggiungere 10 μg di plasmide di trasferimento, 7,5 μg di plasmide di imballaggio psPAX2 e 2,5 μg di plasmide di involucro pMD2.G. Rabboccare la provetta con Opti-MEM per raggiungere un volume totale di 2 mL. Infine, aggiungere 60 μl del reagente di trasfezione PEI (dallo stock di 1 mg/mL) alla miscela di trasfezione.
   NOTA: Il vettore lentivirale SFFV-eGFP viene utilizzato come controllo di trasduzione per esperimenti di riprogrammazione per tenere conto dell'immunogenicità mediata da lentivirali, mentre SFFV-mCherry viene utilizzato per generare linee cellulari tumorali marcate in fluorescenza.
5. Vortex, la trasfezione si mescola accuratamente per 1 minuto e incuba per 15 minuti a RT per consentire la formazione di complessi DNA-lipidi.
   NOTA: La confluenza influenza in modo significativo i titoli virali. La trasfetzione di cellule a meno del 70% di confluenza si tradurrà in titoli virali più bassi a causa del minor numero di cellule che ricevono i plasmidi.
6. Aspirare il terreno delle cellule HEK 293T e aggiungere 10 mL di DMEM senza Pen/Step e con il 10% di FBS filtrato sterile.
7. Aggiungere la miscela di trasfezione goccia per goccia alle piastre da 150 mm e incubare per 16 ore a 37 °C con CO₂ al 5%.
8. Dopo la trasfezione, sostituire il terreno con 20 mL di terreno completo DMEM integrato con 1 mM di butirrato di sodio e incubare le cellule per 24 ore a 37 °C con CO₂ al 5%.
   NOTA: Il butirrato di sodio è un inibitore dell'istone deacetilasi (HDAC) di classe 1 e può migliorare l'espressione genica nelle cellule HEK 293T inducendo l'iperacetilazione degli istoni, che apre la struttura della cromatina e facilita la trascrizione dell'impacchettamento virale e il trasferimento dei plasmidi. L'efficienza della trasfezione può essere valutata controllando l'espressione di eGFP utilizzando un microscopio a fluorescenza.
9. Raccogliere il surnatante contenente lentivirus 48 ore e 60 ore dopo la trasfezione in provette coniche da 50 mL. Dopo la prima raccolta, aggiungere 12 mL di terreno completo DMEM preriscaldato per piastra da 150 mm per la seconda raccolta. Conservare le collezioni a 4 °C, filtrarle attraverso un filtro PES a basso contenuto proteico da 0,45 μm e combinarle.
10. Per concentrare il virus, pipettare 37 g di terreno contenente lentivirus in provette di polipropilene a parete sottile open-top da 38,5 mL. Misurare il peso dei tubi utilizzando una bilancia da banco.
    NOTA: Misurare il peso del terreno contenente lentivirus piuttosto che il suo volume, poiché il peso fornisce una maggiore precisione per il bilanciamento. Il peso delle provette deve essere ben bilanciato per evitare di danneggiare l'ultracentrifuga.
11. Posizionare le provette nei secchi di ultracentrifugazione, chiudere i coperchi e posizionare i secchi in un rotore a secchio oscillante. Centrifugare a 25.000 × g per 90 min a 4 °C.
12. Dopo la centrifugazione, rimuovere le provette dai secchi e aspirare il surnatante.
    NOTA: Le stesse provette possono essere riempite ripetutamente e utilizzate per un numero totale di tre cicli di centrifugazione per produrre un pellet di lentivirus più grande per provetta.
13. Posizionare le provette in polipropilene a parete sottile aperte capovolte per 5 minuti su una salvietta da laboratorio o materiale assorbente simile per consentire al liquido in eccesso di defluire e asciugare il pellet.
14. Aggiungere 200 μl di DMEM ghiacciato integrato con HEPES o PBS a ciascun pellet. Posizionare le provette per microcentrifuga in provette coniche da 50 mL e chiudere il coperchio per mantenere la sterilità.
15. Incubare il pellet per una notte a 4 °C per consentire la risospensione.
16. Unire i pellet risospesi, aliquotarli e conservarli a -80 °C per un massimo di un anno.
    NOTA: Per evitare la perdita di titolo dovuta a cicli ripetuti di congelamento-scongelamento, utilizzare volumi di aliquote più piccoli (ad es. 50-200 μl).

3. Titolazione funzionale del virus

NOTA: Questo passaggio deve essere ripetuto per ogni lotto di lentivirus per determinare la dose virale ottimale necessaria per ottenere un rapporto 1:1 tra cellule trasdotte (eGFP⁺) e non trasdotte (eGFP^-).

1. Scongelare ed espandere le cellule tumorali in terreni di coltura appropriati (ad esempio, la linea cellulare di melanoma murino YUMM1.7 in terreno completo DMEM/F12).
   NOTA: Le cellule dovrebbero essere sottoposte ad almeno un ciclo di divisione prima di un esperimento di riprogrammazione. I passaggi delle cellule dovrebbero essere simili tra gli esperimenti.
2. Un giorno prima dell'insediamento del tumore, allevare le cellule tumorali aspirando i loro terreni di coltura, lavando una volta con PBS e aggiungendo 2 mL o 5 mL di tripsina per piastra da 100 mm o piastra da 150 mm. Incubare per 5-10 minuti a 37 °C con CO₂ al 5% e raccogliere le cellule aggiungendo 8 mL o 5 mL di terreno completo per piastra da 100 mm o 150 mm, rispettivamente, in provette coniche da 50 mL.
3. Centrifugare le celle a 350 × g per 5 minuti per rimuovere la tripsina e risospendere in terreno completo.
4. Prelevare un'aliquota di 10 μl di cellule, aggiungere 10 μl di blu di tripano e contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro.
5. Trasferire 6 × 10⁵ cellule in una nuova provetta conica da 50 mL contenente 12 mL di terreno completo e aggiungere 12 μL di polibrene da 8 mg/mL alla sospensione cellulare per raggiungere una concentrazione di lavoro di 8 μg/mL.
6. Pipettare 2 mL della sospensione cellulare in ciascun pozzetto su una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti.
   NOTA: Se necessario, aumentare il numero di celle a 1,2-1,8 x 10⁶ per piastra a 6 pozzetti.
7. Aggiungere volumi crescenti di lentivirus a ciascun pozzetto per determinare il volume ottimale necessario per ottenere un rapporto 1:1 tra cellule trasdotte (eGFP⁺) e non trasdotte (eGFP^-).
   NOTA: Aggiungere i volumi raccomandati di lentivirus di lentivirus di 1, 2, 4, 8, 16 e 32 μl in triplicati. Eseguire la titolazione funzionale per il vettore lentivirale di controllo vuoto SFFV-eGFP e SFFV-mCherry.
8. Incubare le cellule per 24 ore a 37 °C con CO₂ al 5%.
9. Il giorno 0, rimuovere il terreno contenente lentivirus, sostituirlo con terreno fresco e incubare per 72 ore a 37 °C con CO₂ al 5%.
10. Il giorno 3, controllare le cellule per l'espressione di eGFP al microscopio a fluorescenza.
    NOTA: Questo passaggio fornisce una rapida verifica della trasduzione cellulare ma non sostituisce l'analisi eseguita con la citometria a flusso nel passaggio 3.14 per determinare l'esatto rapporto tra cellule eGFP⁺ ed eGFP^- .
    In alcune cellule tumorali (ad esempio, le cellule di melanoma di topo B16) il segnale eGFP può essere basso e difficile da rilevare utilizzando un microscopio a fluorescenza. Si consiglia di procedere direttamente alla citometria a flusso.
11. Aspirare il terreno, lavare le cellule una volta con PBS e aggiungere 500 μl di tripsina per pozzetto. Incubare per 5-10 minuti a 37 °C con CO₂ al 5%.
12. Sollevare le cellule in ciascun pozzetto con 1,5 mL di tampone FACS e pipettare la sospensione cellulare in provette di polistirene da 5 mL. Prelevare un'aliquota e contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro e la colorazione con blu di tripano.
13. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 × g per 5 minuti, risospendere il pellet in 100 μL di tampone FACS e procedere con l'analisi della citometria a flusso.
14. Quantificare il rapporto preciso tra cellule trasdotte (eGFP⁺) e non trasdotte (eGFP^-) mediante citometria a flusso. Per i test in vivo , utilizzare il volume del lentivirus che produce il rapporto più vicino a 1:1.
    NOTA: Per determinare con precisione il rapporto tra le cellule eGFP⁺ e le cellule eGFP^- , includere le cellule tumorali non trasdotte come controlli negativi per il gating.

4. Insediamento di tumori sottocutanei per la riprogrammazione in vivo

1. Scongelare ed espandere le cellule tumorali nel loro terreno di coltura appropriato per generare cellule che esprimono mCherry.
   NOTA: L'espressione di mCherry facilita la distinzione delle cellule tumorali durante l'analisi della citometria a flusso da altre popolazioni del tumore, ad esempio cellule stromali e immunitarie endogene.
2. Eseguire i passaggi 3.2-3.4 e risospendere le cellule in un terreno completo a una concentrazione di^10-5 cellule per mL.
3. Aggiungere 8 μg/mL di polibrene e il volume determinato di SFFV-mCherry lentivirus alla sospensione cellulare per raggiungere un'efficienza di trasduzione del >90%.
   NOTA: In alternativa, se il raggiungimento del >90% di trasduzione compromette la vitalità cellulare, selezionare le cellule mCherry⁺ mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) 72 ore dopo la trasduzione ed espandere le cellule selezionate in coltura.
4. Piastra 5 mL di sospensione cellulare (contenente 5 × 10⁵ cellule) per piastra da 100 mm e incubare le cellule a 37 °C con CO₂ al 5% per 24 ore.
5. Dopo 24 ore, sostituire il terreno con 10 mL di terreno completo ed espandere le cellule coltivandole a 37 °C con CO₂ al 5% per almeno 7 giorni prima di iniziare gli esperimenti di riprogrammazione.
6. Dopo l'espansione, seguire i passaggi 3.2-3.4 per preparare le sospensioni cellulari per la successiva trasduzione con il volume precedentemente determinato di SFFV-PIB-IRES-eGFP, ottenendo il rapporto 1:1 più vicino tra cellule trasdotte (eGFP⁺) e non trasdotte (eGFP^-) il giorno 3.
7. Aggiungere 8 μg/mL di polibrene alla sospensione cellulare, insieme al volume precedentemente determinato di lentivirus alla sospensione cellulare in provette coniche da 50 mL. Mescolate bene senza creare bolle.
8. Pipettare 2 mL di sospensione cellulare (contenente 10-5 cellule) per pozzetto in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti e incubare per 24 ore a 37 °C con CO₂ al 5%.
   NOTA: In alternativa, piastrate le cellule in 5 mL di terreno di trasduzione in piastre di coltura tissutale da 100 mm. Tuttavia, si noti che l'efficienza di trasduzione può essere ridotta in volumi maggiori e dovrebbe essere determinata empiricamente come descritto nei passaggi 3.1-3.13.
   Si raccomanda di trasdurre almeno il 10% in più di cellule per compensare la potenziale perdita di cellule durante il processo di trasduzione e per garantire un volume sufficiente per il pipettaggio o l'iniezione durante l'insediamento del tumore.
9. Dopo 24 ore, rimuovere il terreno contenente lentivirus, lavare due volte con PBS, aggiungere 500 μL di tripsina in ciascun pozzetto e incubare per 5-10 minuti a 37 °C con CO₂ al 5%.
10. Controllare al microscopio ottico se le cellule si sono dissociate completamente dalle piastre e quindi raccoglierle con il terreno completo in provette coniche da 50 mL.
11. Pellettare le celle centrifugandole per 5 minuti a 350 × g, lavare il pellet con PBS e centrifugare nuovamente per 5 minuti a 350 × g. Prelevare un'aliquota e contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro e la colorazione con blu di tripano.
12. Risospendere il pellet in PBS ghiacciato per raggiungere una concentrazione di 2-4 × 10⁷ cellule per mL, che corrisponde a 1-2 × 10⁶ cellule in 50 μL di volume di iniezione per tumore.
    NOTA: È importante sottolineare che questi numeri sono stati convalidati per i tumori del melanoma YUMM1.7 per isolare in vivo cellule cDC1-like riprogrammate per l'analisi della citometria a flusso. Per altre linee cellulari e per altre letture sperimentali, come la crescita tumorale e gli esperimenti di sopravvivenza, i numeri devono essere testati empiricamente. Per gli esperimenti di crescita e sopravvivenza del tumore, si raccomanda un numero inferiore di cellule, compreso tra 100.000 e 250.000 cellule per tumore.
13. Trasferisciti nell'area di lavoro in cui vengono eseguiti gli esperimenti sugli animali e mantieni le celle sul ghiaccio.
    NOTA: Dopo la preparazione delle cellule, eseguire le iniezioni cellulari il più rapidamente possibile poiché la vitalità delle cellule si riduce nel tempo.
14. Preparare la soluzione per anestesia contenente 3 μL di xilazina (20 mg/mL), 27 μL di ketamina (100 mg/mL) e 30 μL di PBS per topo.
15. Anestetizzare i topi CD45.1 iniettando 60 μL di anestetico per via intraperitoneale. Randomizza i topi e tienili su un tappetino riscaldante per evitare un calo della temperatura corporea. Applicare la crema per gli occhi sugli occhi per prevenire la disidratazione oculare durante l'anestesia.
    NOTA: È fondamentale utilizzare topi CD45.1 per consentire la distinzione tra cellule cDC1-like riprogrammate in vivo che esprimono l'allele CD45.2 wild-type e cellule immunitarie endogene. Se la linea cellulare è CD45.1, i topi C57BL/6 (CD45.2) possono essere utilizzati come riceventi. I topi devono essere abbinati per sesso ed età tra i gruppi sperimentali e randomizzati prima dell'instaurazione del tumore.
16. Attendere 5-10 minuti fino a quando tutti i topi sono completamente anestetizzati.
17. Radere il fianco destro dei topi usando un rasoio; Facoltativamente, contrassegnali con un tagliaorecchie. Disinfettare l'area e rimuovere i peli rimanenti con etanolo al 70%.
18. Risospendere le cellule tumorali pipettando su e giù con una pipetta P1000. Caricare la sospensione cellulare in una siringa da 0,5 mL da 30 G.
19. Sollevare delicatamente la pelle del fianco rasato del mouse con due dita e inserire la punta dell'ago nel punto in cui la pelle forma una piega.
    NOTA: Fai attenzione a non perforarti le dita con l'ago.
20. Rilasciare la pelle, tenere la siringa in posizione con una mano e usare due dita dell'altra mano per allungare la pelle del topo.
21. Iniettare lentamente 50 μl della sospensione di cellule tumorali per creare un rigonfiamento ovale (gonfiore sottocutaneo) nel sito di iniezione.
    NOTA: Se non si forma un rigonfiamento, la sospensione potrebbe essere fuoriuscita nel tessuto sottocutaneo circostante, il che può portare a una formazione di tumore incoerente o fallita.
22. Dopo la procedura, monitorare tutti i topi che si svegliano per garantire la sopravvivenza dopo l'anestesia.
23. Mantenere i topi in un ambiente a temperatura controllata con 23 ± 2 °C e un ciclo fisso/buio di 12 ore e libero accesso a cibo e acqua.
    NOTA: Se si desidera monitorare la crescita del tumore, procedere con i passaggi 4.24-4.26. In caso contrario, salta questi passaggi e procedi direttamente alle sezioni successive.
24. Per monitorare la crescita del tumore, trattenere delicatamente il topo con una mano, consentendo una chiara visualizzazione del tumore.
25. Utilizzando un calibro elettronico, misurare la lunghezza (l), la larghezza (w) e l'altezza (h) del tumore. Calcolare il volume tumorale (V) utilizzando la formula: V = (l x w x h) / 2.
26. Misurare le dimensioni del tumore ogni due o tre giorni. Quando il tumore raggiunge un volume che soddisfa il criterio dell'endpoint umano (ad esempio, 1.500 mm³), sopprimere l'animale in conformità con le linee guida etiche e istituzionali.

5. Isolamento del tumore per l'analisi della citometria a flusso

1. Prepara forbici, pinze, tampone FACS e piastre di coltura non tissutali a 12 pozzetti con terreno completo RPMI ghiacciato per la raccolta di campioni tumorali.
2. Preparare la soluzione per la digestione del tumore mescolando 30 μL di 100 mg/mL di collagenasi D e 3 μL di 10 mg/mL di DNAsi I in 3 mL di terreno completo RPMI per tumore (per raggiungere una concentrazione di lavoro di 1 mg/mL di collagenasi D e di 10 μg/mL di DNAsi I).
   NOTA: Se l'efficienza della digestione non è ottimale, aggiungere 2-5 mM di CaCl₂ per supportare l'attività della collagenasi.
3. Eutanasia dei topi mediante lussazione cervicale o asfissia da CO₂ il giorno dell'isolamento.
4. Asportare i tumori sottocutanei con forbici e pinze e posizionare ciascun tumore in un pozzetto della piastra di coltura non tissutale a 12 pozzetti con RPMI ghiacciato. Cerca di ridurre al minimo l'escissione del tessuto non tumorale.
5. Tagliare i campioni tumorali in³ pezzi da 1-2 mm con le forbici, raccogliere i pezzi in provette coniche da 50 mL contenenti 3 mL di soluzione digestiva e incubare a 37 °C agitando a 200-250 giri/min per 30-45 minuti.
   NOTA: Vortice o pipetta ogni 15 minuti per facilitare il processo di digestione.
6. Dopo la digestione, pipettare energicamente la miscela per 1 minuto utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μm in una nuova provetta conica da 50 mL.
7. Utilizzare lo stantuffo di una siringa da 10 ml per frantumare i pezzi non digeriti contro il filtro cellulare da 70 μm e sciacquare il filtro con 10 ml di terreno completo RPMI.
8. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 × g per 5 minuti a 4 °C, risospendere in 1 mL di tampone FACS e contare le cellule vitali.
9. Trasferire la sospensione cellulare in provette di polistirene da 5 mL, le celle in pellet a 350 × g per 5 minuti e risospendere 10⁶ cellule vitali per 100 μL di tampone FACS.
10. Celle separate per i controlli a colore singolo (SC) e FMO in tubi di polistirene separati.
11. Preparare una master mix di colorazione anticorpale contenente siero di ratto (1:100) per bloccare il legame non specifico; un colorante di vitalità fissabile (1:100) per escludere le cellule morte dall'analisi; e anticorpi marcati in fluorescenza anti-CD45.1, anti-CD45.2 e anti-MHC-II alla loro concentrazione ottimale. Aggiungere 100 μl della miscela master a ciascun campione e incubare per 20 minuti a 4 °C al buio.
12. Lavare i campioni 2 volte con 2 mL di tampone FACS e procedere con l'analisi con citometria a flusso.
13. Quantificare le percentuali di cellule cDC1-like che esprimono CD45.2 e/o MHC-II, mediante gating in cellule tumorali trasdotte (eGFP⁺) (CD45.1-mCherry⁺).
    NOTA: Questo protocollo può essere utilizzato per eseguire l'immunofenotipizzazione dei tumori dopo la riprogrammazione in vivo di cDC1 completando il pannello di colorazione con anticorpi contro popolazioni di cellule immunitarie linfoidi endogene e/o mieloidi.

6. Congelamento e sezionamento del tumore per analisi al microscopio confocale

1. Prepararsi all'isolamento del tumore seguendo i passaggi 5.1 e 5.3. Asportazione dei tumori sottocutanei con forbici e pinze.
2. Fissare i tumori in paraformaldeide (PFA) al 4% preparata al momento in PBS a 4 °C con agitazione delicata. Regolare il tempo di fissazione in base alle dimensioni del tumore, utilizzando 1 ora per mm³ di tessuto come linea guida.
3. Trasferire i tumori in saccarosio al 15% in PBS e incubare a 4 °C agitando delicatamente i tessuti fino a quando non affondano sul fondo della provetta. Quindi, spostali al 20% di saccarosio in PBS nelle stesse condizioni.
4. Una volta che i tumori si sono depositati sul fondo della provetta, incubarli in una miscela 1:1 di saccarosio al 20% in composto PBS e OCT per 30 minuti a 4 °C con agitazione.
5. Rimuovere la miscela, incorporare i tessuti in un criomold con OCT al 100% e congelare a scatto con azoto liquido.
   NOTA: Indossare sempre dispositivi di protezione individuale adeguati (crioguanti, visiera e camice da laboratorio) per evitare ustioni da freddo o lesioni dovute alla rapida espansione del vapore. Lavorare in un'area ben ventilata per evitare il rischio di asfissia.
   1. Conservare i blocchi a -80 °C in contenitori chiusi per evitare la disidratazione.

7. Colorazione in immunofluorescenza di sezioni tumorali

1. Utilizzando un criostato, tagliare i tumori in sezioni spesse circa 8 μm e montarle su vetrini da microscopio. Se necessario, conservare i vetrini a -80 °C.
   NOTA: Per preservare l'integrità dei tessuti, conservare i blocchi e i vetrini con i tagli tumorali montati su ghiaccio secco durante il trasporto da e verso il criostato. Assicurarsi che il criostato sia mantenuto a -20 °C durante il sezionamento.
2. Scongelare i vetrini in PBS per 5 minuti e fissarli in una soluzione di PFA al 4% per 10 minuti a RT.
3. Dopo il fissaggio, lavare i vetrini in PBS per 5 minuti.
   NOTA: Assicurarsi che i tessuti rimangano idratati; Conservarli sempre in un liquido durante tutte le successive fasi di colorazione. Se l'esperimento deve essere messo in pausa, le diapositive possono essere conservate in PBS a RT per un massimo di 3 ore. Evitare di conservare le diapositive in PBS durante la notte.
4. Per il recupero dell'antigene, riempire una vaporiera con acqua e accenderla. Metti un barattolo contenente acqua deionizzata e un barattolo contenente 10 mM di citrato di sodio (pH 6) nella vaporiera e copri l'apertura con un foglio di alluminio. Senza rimuovere il coperchio, inserire un termometro attraverso le prese d'aria del coperchio della vaporiera, forare il foglio di alluminio e monitorare la temperatura, assicurandosi che le soluzioni raggiungano ~99 °C.
5. Quando i tamponi raggiungono ~99 °C, immergere i vetrini in acqua deionizzata per 10 s e poi trasferirli rapidamente nella soluzione di recupero dell'antigene.
6. Incubare i vetrini a ~99 °C per 15 minuti.
7. Lavare i vetrini in 1x PBS per 3 x 5 min.
8. Usa una Pap Pen barriera idrofobica per delineare ogni sezione di tessuto, formando un perimetro idrofobico che impedisce la fuoriuscita di liquidi aggiunti ai tessuti.
   NOTA: I successivi lavaggi PBS possono interrompere il perimetro idrofobico che circonda i tessuti e richiedere il rinnovamento. Disegnalo di nuovo se necessario.
9. Bloccare e permeabilizzare i tessuti con 150 μL di tampone bloccante (5% siero e 0,5% Triton X-100 in 1x PBS) per 60 minuti a RT. Per tutte le fasi di colorazione utilizzare siero della stessa specie dell'ospite dell'anticorpo secondario.
10. Lavare i vetrini in 1x PBS per 3 x 5 min.
11. Incubare i tessuti con 20 μg/mL dell'anticorpo primario anti-CD45 in tampone bloccante (5% siero e 0,5% Triton X-100 in 1X PBS) per una notte a 4 °C.
    NOTA: Per utilizzare altri anticorpi, convalidare empiricamente la concentrazione di anticorpi.
12. Lavare i vetrini in 1x PBS per 3 x 5 min.
13. Incubare le sezioni di tessuto con l'anticorpo secondario anti-ratto di capra coniugato con AlexaFluor-647 a una diluizione di 1:250 in tampone bloccante (siero al 5%) per 2 ore al buio a RT.
    NOTA Dopo aver aggiunto l'anticorpo secondario, eseguire tutti i passaggi successivi al buio per prevenire il fotosbiancamento dei fluorofori.
14. Lavare i vetrini in 1x PBS per 3 x 5 min.
15. Incubare i tessuti con 1 μg/mL di DAPI e 20 μg/mL di anticorpi coniugati AlexaFluor-594 in tampone bloccante (siero al 5%) per 1 ora al buio a RT.
16. Lavare i vetrini in 1x PBS per 3 x 5 min.
17. Aggiungere una goccia di soluzione di montaggio su ciascuna sezione del tumore, quindi applicare alcune gocce di terreno di montaggio sul vetrino coprioggetti. Capovolgere rapidamente il vetrino coprioggetti sul vetrino per montarlo e garantire l'assenza di bolle vicino ai tumori.
18. Lasciare asciugare i vetrini durante la notte e visualizzarli al microscopio confocale.

Risultati

Una panoramica schematica del protocollo di riprogrammazione in vivo trattabile è presentata nella Figura 1. In primo luogo, abbiamo prodotto il vettore lentivirale policistronico SFFV-PIB-IRES-eGFP (PIB-eGFP), che codifica per i fattori di riprogrammazione PU.1, IRF8, BATF3 che istruiscono cDC1, seguito da un sito di ingresso ribosomiale interno (IRES) e da una proteina fluorescente verde potenziata (eGFP) nella linea cellulare di confezionamento HEK 293T. Per controllare l'immunogenicità mediata da lentivirus, abbiamo prodotto un vettore SFFV-MCS-eGFP (eGFP) vuoto, contenente un sito di clonazione multipla (MCS) e IRES-eGFP, ma escludendo i fattori di riprogrammazione. Dopo la produzione virale, abbiamo raccolto il surnatante contenente lentivirus e lo abbiamo concentrato mediante ultracentrifugazione. Abbiamo titolato funzionalmente il virus per determinare la quantità necessaria per ottenere un rapporto 1:1 tra cellule trasdotte (eGFP⁺) e non trasdotte (eGFP^-), che abbiamo valutato il giorno 3 dopo la trasduzione. Quindi, abbiamo utilizzato la quantità di virus risultante per trasdurre la linea cellulare tumorale selezionata il giorno -1. Dopo 24 ore, abbiamo raccolto le cellule e le abbiamo impiantate per via sottocutanea per stabilire i tumori. Questa strategia ha garantito che le cellule trasdotte si riprogrammassero in cellule simili a cDC1 in vivo, all'interno del TME. Nei momenti indicati dopo l'attecchimento, abbiamo asportato e processato i tumori per le analisi a valle, tra cui la citometria a flusso di cellule tumorali dissociate, per quantificare l'efficienza della riprogrammazione in vivo , o la colorazione in immunofluorescenza di sezioni tumorali crioconservate per caratterizzare i cambiamenti nel TME.

In primo luogo, per garantire la produzione di titoli lentivirali elevati, abbiamo monitorato le cellule HEK 293T prima della trasfezione, con l'obiettivo di raggiungere il 70-80% di confluenza e 24 ore dopo, abbiamo valutato l'efficienza della trasfezione attraverso l'espressione di eGFP mediante microscopia a fluorescenza (Figura 2A). Successivamente, abbiamo raccolto il terreno contenente il virus 48 ore e 60 ore dopo la trasfezione, lo abbiamo ultracentrifugato e conservato in aliquote a -80 °C (Figura 2B). Quindi, abbiamo determinato la quantità virale ottimale necessaria per ottenere un rapporto 1:1 tra cellule eGFP⁺ ed eGFP^- nelle cellule di melanoma YUMM1.7. Abbiamo seminato 10^{cellule da 5} YUMM1.7 per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti, abbiamo trasdotto le cellule con volumi crescenti di lentivirus e sostituito il surnatante contenente il virus con un terreno completo DMEM/F12 fresco dopo 24 ore (Figura 2C). Il giorno 3, abbiamo valutato l'espressione di eGFP mediante microscopia a fluorescenza, prima di procedere alla quantificazione delle percentuali precise di cellule eGFP⁺ mediante citometria a flusso (Figura 2C). Per quantificare il rapporto tra cellule eGFP⁺ ed eGFP^- , abbiamo effettuato un gating in singole cellule vive per escludere cellule morte e doppietti (Figura 2D). Il volume ottimale del lotto di lentivirus prodotto è stato determinato sia per PIB-eGFP che per il virus eGFP di controllo come 2 μL per 10^{cellule 5} YUMM1.7, risultando rispettivamente in 50,0 ± 0,3% e 63,0 ± 0,9% di cellule eGFP⁺ (Figura 2E).

Successivamente, per valutare l'efficienza della riprogrammazione in vivo, abbiamo generato una linea cellulare tumorale marcata in fluorescenza (mCherry⁺) (YUMM1.7-mCherry). Ciò ha garantito la possibilità di discriminare tra cellule tumorali e cellule stromali o immunitarie mediante gating in cellule vive di mCherry⁺ nell'analisi di citometria a flusso (Figura 3A, B). Abbiamo quindi trasdotto le cellule YUMM1.7-mCherry con 2 μL di PIB-eGFP o virus eGFP di controllo per 10⁵ cellule per ottenere un rapporto eGFP⁺ / eGFP^- di 1:1. Abbiamo impiantato per via sottocutanea 1,6 × 10^{cellule per} tumore in topi CD45.1 e abbiamo conservato un'aliquota di cellule in coltura in vitro per il confronto. Abbiamo valutato l'efficienza della riprogrammazione mediante citometria a flusso, gating di cellule vive mCherry⁺, eGFP⁺ e CD45.1^- per escludere le cellule immunitarie dell'ospite che hanno inghiottito eGFP o mCherry (Figura 3B). Dal giorno 1 al giorno 9, abbiamo osservato l'acquisizione graduale dell'espressione di CD45.2 e/o MHC-II, marcando cellule cDC1-like parzialmente riprogrammate (CD45.2⁺ MHC-II^- o CD45.2^- MHC-II⁺) e cellule cDC1-like completamente riprogrammate (CD45⁺ MHC-II⁺) (Figura 3C). Abbiamo convalidato che la riprogrammazione delle cellule tumorali di topo in vivo ha portato a percentuali più elevate di cellule cDC1-like al giorno 9 rispetto alle condizioni in vitro (9,54 ± 1,54% CD45⁺ MHC-II⁺ in vivo vs. 4,72 ± 1,1% CD45⁺ MHC-II⁺ in vitro, P = 0,018). Anche la cinetica di riprogrammazione è stata accelerata poiché abbiamo osservato una percentuale più elevata di cellule cDC1-like già al giorno 4 (8,7 ± 3,3% CD45⁺ MHC-II⁺ in vivo vs. 0,3 ± 0,1% CD45⁺ MHC-II⁺ in vitro, P = 0,05), indicando che la presenza di segnali ambientali promuove una riprogrammazione più rapida ed efficiente verso le cellule cDC1-like¹⁹. Mentre le cellule cDC1-like riprogrammate in vitro erano presenti fino al giorno 15, le cellule cDC1-like in vivo persistevano per 9 giorni, ma non venivano rilevate entro il giorno 15, suggerendo la deplezione del TME da parte del sistema immunitario dell'ospite (Figura 3C). 

Infine, abbiamo mirato a caratterizzare le prime variazioni del TME a seguito della riprogrammazione in vivo di cDC1 nei primi 9 giorni. Abbiamo eseguito la colorazione in immunofluorescenza di tessuti tumorali crioconservati e sezionati da tumori eGFP e PIB-eGFP dopo 3 e 9 giorni di riprogrammazione in vivo , concentrandoci sull'infiltrazione di cellule immunitarie marcate dal marcatore pan-ematopoietico CD45. In particolare, le cellule cDC1-like hanno reclutato un numero significativamente maggiore di cellule CD45 nel TME il giorno 3, rispetto ai tumori eGFP (49,6 ± 17,0 vs. 8,0 ± 5,8 eGFP intensità media di fluorescenza della colorazione CD45 per area tumorale; Figura 4A, B). È interessante notare che abbiamo rilevato TLS all'interno del TME dei tumori dopo 9 giorni di riprogrammazione in vivo . Ciò suggerisce che le cellule simili a cDC1 possono rimodellare rapidamente il TME da un ambiente "immuno-freddo" a uno "immuno-caldo" entro 3 giorni, il che porta successivamente alla formazione di TLS il giorno 9.

Figura 1: Panoramica del protocollo per generare cellule simili a cDC1 mediante riprogrammazione in vivo di cellule tumorali. I vettori lentivirali SFFV-PIB-IRES-eGFP che codifica PU.1, IRF8 e BATF3 in una cassetta policistronica sotto il controllo del promotore del virus che forma il fuoco della milza (SFFV) e l'eGFP dopo un sito di ingresso del ribosoma interno (IRES) per tracciare le cellule trasdotte mediante citometria a flusso e microscopia a fluorescenza - sono prodotti nella linea cellulare di confezionamento HEK 293T. Quindi, i vettori lentivirali vengono ultracentrifugati e titolati funzionalmente per determinare la quantità di virus necessaria per la trasduzione delle cellule tumorali in un rapporto di 1:1 tra eGFP⁺ trasdotta e cellule eGFP^- non trasdotte. Per gli esperimenti di riprogrammazione in vivo , le cellule tumorali vengono piastrate con la quantità ottimale di lentivirus il giorno -1. Il giorno successivo, questa miscela 1:1 di cellule GFP⁺ trasdotte e GFP^- non trasdotte viene lavata e raccolta per l'insediamento del tumore sottocutaneo nei topi. Le colture in vitro parallele vengono mantenute per convalidare la trasduzione il giorno 3 mediante citometria a flusso. Gli animali vengono monitorati ogni 2-3 giorni per la crescita e la sopravvivenza del tumore. I tumori vengono raccolti in punti temporali definiti, dissociati e colorati per l'espressione di marcatori di superficie per l'analisi della citometria a flusso. In alternativa, i tessuti interi vengono fissati, crioconservati e sezionati per la colorazione in immunofluorescenza e l'analisi al microscopio confocale. L'efficienza della riprogrammazione in vivo è valutata mediante analisi di citometria a flusso, mentre le variazioni nel microambiente tumorale sono caratterizzate dall'imaging confocale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Produzione e titolazione funzionale del lentivirus per la riprogrammazione in vivo di cDC1. (A) Quando le cellule HEK 293T raggiungono una confluenza del ~70-80%, vengono trasfettate con una miscela contenente 10 μg di plasmide di trasferimento SFFV-PIB-eGFP (PIB-eGFP) o di controllo del vettore lentivirale vuoto SFFV-eGFP (eGFP), insieme a 7,5 μg di psPAX2 e 2,5 μg di mPD2.G e 60 μL di 1 mg/mL di PEI. Immagini al microscopio in campo chiaro e a fluorescenza di cellule HEK 293T che mostrano l'espressione di eGFP 24 ore dopo la trasfezione, indicando il successo della somministrazione del plasmide. Barre di scala = 200 μm. (B) Rappresentazione schematica del flusso di lavoro dell'ultracentrifugazione per concentrare il lentivirus. Il surnatante contenente lentivirus delle cellule HEK 293T viene raccolto 48 ore e 60 ore dopo la trasfezione, filtrato attraverso un filtro PES a basso legame proteico da 0,45 μm e pesato 37 g in provette di polipropilene a parete sottile Open-Top utilizzando una bilancia da banco. Le provette vengono ultracentrifugate in un rotore a secchiello oscillante, il surnatante viene aspirato e il pellet essiccato per 5 minuti. I pellet vengono quindi risospesi in DMEM ghiacciato contenente HEPES e incubati per una notte prima di aliquotare e conservare a -80 °C. (C) Strategia sperimentale della titolazione funzionale per determinare la dose virale ottimale per ottenere un rapporto 1:1 tra cellule GFP+ e GFP-. Immagini al microscopio in campo chiaro e a fluorescenza che mostrano l'espressione di eGFP nelle cellule di melanoma YUMM1.7, 72 ore dopo la trasduzione, indicando il successo della somministrazione dei fattori di riprogrammazione e dell'eGFP. Barre della scala = 100 μm. (D) Grafici rappresentativi della citometria a flusso che mostrano la strategia di gating per quantificare il rapporto tra le cellule eGFP⁺ . Le cellule vive sono state sottoposte a gated per la popolazione negativa al colorante di vitalità (DAPI) seguita dall'esclusione del doppietto. (E) Quantificazione in citometria a flusso dell'efficienza di trasduzione con l'aumento delle dosi virali per determinare il volume ottimale per ottenere cellule GFP⁺/GFP^- 1:1. Sia per PIB-eGFP che per eGFP lentivirus, 2 μL di volume per 10⁵ cellule hanno raggiunto il rapporto desiderato. Abbreviazioni: cDC1s = cellule dendritiche convenzionali di tipo 1; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo; PIB = PU.1, IRF8 e BATF3; PEI = polietilenimmina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Valutazione dell'efficienza di riprogrammazione in vivo di cDC1. (A) Rappresentazione schematica del flusso di lavoro sperimentale per la valutazione dell'efficienza di riprogrammazione in vivo di cDC1. Le cellule tumorali vengono inizialmente trasdotte con un lentivirus che esprime mCherry per generare una linea cellulare marcata in fluorescenza (YUMM1.7-mCherry), seguita dalla trasduzione con la dose ottimizzata di lentivirus PIB-eGFP il giorno -1. Le cellule vengono quindi iniettate per via sottocutanea con un rapporto 1:1 di cellule eGFP⁺/eGFP^- il giorno 0 per stabilire i tumori nei topi CD45.1 e consentire alle cellule trasdotte da PIB di riprogrammarsi in cellule simili a cDC1 all'interno del TME. I tumori vengono quindi isolati nei punti temporali indicati, dissociati e colorati per CD45.1, CD45.2 e MHC-II utilizzando la citometria a flusso. Ciò consente l'esclusione delle cellule immunitarie dell'ospite CD45.1 per quantificare in vivo l'efficienza di riprogrammazione di cDC1 attraverso l'espressione di CD45.2 e MHC-II. Le colture in vitro parallele vengono conservate per tutti i punti temporali come confronto con la riprogrammazione in vivo. (B) Grafici rappresentativi della citometria a flusso che illustrano la strategia di gating il giorno 9. Le cellule sono state gated su mCherry⁺ e GFP⁺ per identificare le cellule tumorali trasdotte con successo. Le cellule immunitarie dell'ospite sono state escluse mediante gating out delle cellule CD45.1⁺. (C) Quantificazione dell'efficienza di riprogrammazione in vivo (a sinistra) di cellule YUMM1.7-mCherry mediante citometria a flusso come percentuale di cellule CD45⁺ MHC-II⁺ (completamente riprogrammate) e CD45.2+ HLA-DR^- o CD45.2-HLA-DR⁺ cDC1-like (parzialmente riprogrammate) gated all'interno di eGFP⁺ mCherry⁺ cellule. Grafici rappresentativi della citometria a flusso (a destra) che mostrano l'acquisizione graduale dell'espressione di CD45.2 e MHC-II nelle cellule YUMM1.7-mCherry trasdotte da PIB-eGFP durante i punti temporali indicati. Le cellule YUMM1.7-mCherry trasdotte con eGFP sono state utilizzate come controllo e le cellule cDC1-like riprogrammate in vitro sono state utilizzate per il confronto. I dati in (C) indicano ± SD medio di 3-5 esperimenti di replicazione biologica. L'analisi statistica in (C) è stata eseguita per le cellule CD45⁺ MHC-II⁺ utilizzando il test di Mann-Whitney. *P < 0,05. Abbreviazioni: cDC1s = cellule dendritiche convenzionali di tipo 1; PIB = PU.1, IRF8 e BATF3; TME = microambiente tumorale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi dell'infiltrazione immunitaria nel microambiente tumorale a seguito della riprogrammazione in vivo di cDC1. (A) Immagini confocali rappresentative che mostrino le cellule CD45⁺ nei tumori YUMM1.7 dopo l'impianto sottocutaneo di cellule trasdotte PIB-eGFP- o di controllo eGFP (rapporto 1:1 tra cellule trasdotte e cellule parentali) nei giorni 3 e 9. Barre della scala = 500 μm. (B) Quantificazione dell'MFI per la colorazione con CD45 in tumori YUMM1.7 trattati con PIB e di controllo trasdotti con eGFP nei giorni 3 e 9. I dati in (B) indicano ± SD medio di 3-6 esperimenti di replicazione biologica. L'analisi statistica in (B) è stata eseguita utilizzando il test di Mann-Whitney. *P < 0,05 e ***P < 0,001. Abbreviazioni: cDC1s = cellule dendritiche convenzionali di tipo 1; PIB = PU.1, IRF8 e BATF3; MFI = intensità media della fluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

In questo protocollo, descriviamo un metodo trattabile per generare cellule simili a cDC1 basato sulla riprogrammazione in vivo di cellule tumorali da tumori solidi. I nostri risultati dimostrano che la sovraespressione di PU.1, IRF8 e BATF3 guida l'acquisizione graduale di un fenotipo cDC1 nel TME fino al giorno 9, dopodiché le cellule cDC1-like vengono esaurite dai tumori. In definitiva, questo porta ad un aumento dell'infiltrazione di cellule CD45 nel TME entro il 3° giorno, causando il rimodellamento di un TME "immuno-freddo" che diventa "immuno-caldo".

Gli attuali protocolli per generare cDC1 includono l'arricchimento di DC autologhe da sangue periferico, la differenziazione da cellule progenitrici ematopoietiche CD34⁺ o la differenziazione da cellule staminali pluripotenti 14,15,16,17,18,19. Tuttavia, questi metodi presentano fattori limitanti: maturazione insufficiente, ridotta presentazione dell'antigene e capacità di produzione di citochine/chemochine in vivo, suscettibilità all'immunosoppressione, elevata eterogeneità delle DC e basso numero di cellule generate⁷. Qui, forniamo un protocollo che consente la generazione scalabile di cellule cDC1-like in vivo per studi funzionali e meccanicistici.

Con questo metodo, abbiamo testato se l'espressione della combinazione di fattori di trascrizione PU.1, IRF8 e BATF3 fosse sufficiente per guidare la riprogrammazione in vivo . Questo protocollo consente un controllo preciso sull'efficienza della somministrazione, poiché la variazione della dose di cellule geneticamente modificate impiantate influenza direttamente l'efficacia del trattamento. Abbiamo precedentemente dimostrato che il 2% di cellule trasdotte, che corrispondono allo 0,15% di cellule CD45⁺ e MHC-II⁺ cDC1-like, sono sufficienti per suscitare l'immunità antitumorale²⁰. Inoltre, la rapida infiltrazione immunitaria osservata il giorno 3 suggerisce che le cellule cDC1-like parzialmente riprogrammate sono funzionalmente attive in vivo, poiché non vi è alcun aumento sostanziale delle cellule cDC1-like completamente riprogrammate in questo momento. In futuro, sarà interessante svelare il ruolo funzionale delle cellule cDC1-like parzialmente rispetto a quelle completamente riprogrammate nell'efficacia antitumorale utilizzando vettori modificati contenenti un gene suicida per indurre la morte cellulare in popolazioni cellulari selezionate in punti temporali definiti²⁴. Questo protocollo può essere ulteriormente utilizzato per esplorare la combinazione con adiuvanti epigenetici, che possono aumentare l'efficienza di riprogrammazione²⁵. Infine, questo metodo potrebbe anche essere adattato per generare altri sottotipi di DC in vivo, lanciando diversi tipi di risposte immunitarie, ad esempio risposte antivirali o tollerogeniche¹⁴. Inoltre, possiamo sfruttare la riprogrammazione in vivo come piattaforma per eseguire screening con codici a barre per combinazioni di fattori di trascrizione per generare diversi tipi di cellule immunitarie. Questa possibilità potrebbe aumentare la flessibilità dei trattamenti sfruttando diverse proprietà funzionali di specifici sottogruppi immunitari.

Nel nostro studio precedente, abbiamo dimostrato che l'ambiente immunosoppressivo in vivo non ostacola la riprogrammazione delle cellule tumorali umane in cDC1s²⁰ immunogeniche. In questo articolo, mostriamo che nei topi, la riprogrammazione è più rapida ed efficiente in vivo che in vitro, suggerendo che la riprogrammazione potenziata osservata in vivo è un fenomeno conservato in entrambe le specie. Tuttavia, uno dei limiti di questo metodo è la mancanza dell'ambiente in vivo durante la consegna iniziale del vettore; Pertanto, non è in grado di discernere se i segnali ambientali influiscano sull'efficienza della somministrazione in vivo. Questo dovrebbe essere determinato in situ confrontando diverse frazioni. I vettori adenovirali, che abbiamo identificato come più efficienti dei vettori lentivirali per la somministrazione in situ ²⁰ , potrebbero essere paragonati a gruppi non virali come RNA lineari, circolari e autoamplificanti o cocktail di piccole molecole^{2 6,27}.

Abbiamo precedentemente dimostrato che la riprogrammazione di cDC1 dota le cellule tumorali di citochine pro-infiammatorie e secrezione di chemochine che reclutano linfociti e di processamento e presentazione professionale dell'antigene su MHC-I e MHC-II in modelli di melanoma^23,28. Ciò si traduce nel rimodellamento del TME da uno stato di "immuno-freddo" a uno "immuno-caldo" inducendo la formazione di TLS, che aumenta l'infiltrazione di cellule T effettrici citotossiche, cellule NK e cellule B e riduce le popolazioni immunosoppressive come le cellule T regolatorie ed esauste²⁰. Nei pazienti, le risposte positive all'immunoterapia sono state collegate alla presenza di TLS all'interno dei tumori, dove il priming sostenuto delle cellule T e B contro gli antigeni tumorali genera risposte anticorpali tumore-specifiche^29,30. In futuro, prevediamo di utilizzare questo protocollo di riprogrammazione cDC1 trattabile in vivo per svelare i meccanismi della neogenesi indotta del TLS, del rimodellamento del TME e dell'immunità antitumorale in diversi tipi di cancro e per determinare se la produzione di anticorpi specifici per il tumore è stimolata.

Abbiamo precedentemente osservato sinergismo tra la riprogrammazione in vivo di cDC1 e l'ICB con anti-PD-1 o anti-CTLA-4²⁰. Ciò suggerisce che il TME "immuno-caldo" creato dalla riprogrammazione di cDC1 potrebbe fornire un ambiente favorevole per possibili combinazioni con altre immunoterapie come l'ACT, comprese le cellule T del recettore delle cellule T (TCR)-T, le cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR)-T o i linfociti infiltranti il tumore (TIL). Un altro vantaggio di questo metodo è la possibilità di eseguire ampi screening combinatoriali o CRISPR imparziali, in cui recettori immunologici, citochine, chemochine o linfotossine potrebbero essere sovraespressi o depleti in cellule cDC1-like in tipi tumorali resistenti, svelando così il ruolo di percorsi distinti nel migliorare l'immunità mediata da cDC1. In conclusione, l'attuale protocollo fornisce una risorsa preziosa per un'ampia comunità scientifica, poiché la riprogrammazione in vivo di cDC1 è una piattaforma flessibile e potente per studi meccanicistici e innovazione terapeutica nell'immunoterapia del cancro.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,45 μ m filtro legante a basso contenuto proteico, filtro sottovuoto per bottiglie da 150 mL	Fisher scientifico	15983297
2-Mercaptoetanolo 50 mM	ThermoFisher Scientifico	31350010
Anticorpo monoclonale CD45 anti-topo (clone: 30-F11), IgG2b di ratto, κ	ThermoFisher Scientifico	14-0451-82
B6. SJL-PtprcaPepcb/BoyCrl (CD45.1)	Il laboratorio Jackson	002014
Siringhe da insulina BD Micro-Fine U-100 (0,5 mL)	Fisher Scientifico	11395751
Topi C57BL/6J	Il laboratorio Jackson	000664
Collagenasi D	Sigma Aldrich	11088882001
Filtro cellulare Corning Falcon per l'uso con tubi conici da 50 ml	Sigma Aldrich	CLS352340
Occhiali di copertura Corning 24 x 50 mm	Sigma Aldrich	CLS2975245
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo, dicloridrato)	ThermoFisher Scientifico	D1306
DNasi I	Sigma Aldrich	10104159001
eBioscience Colorante di vitalità fissabile eFluor 450	Invitrogen	65-0863-14
eBioscience Soluzione per il recupero dell'antigene IHC - pH basso (10x)	ThermoFisher Scientifico	00-4955-58
Siero fetale bovino (FBS)	ThermoFisher Scientifico	A5256701
Mezzo di montaggio Fluoromount-G	ThermoFisher Scientifico	00-4958-02
Anticorpo GFP [Alexa Fluor 594]	Novus Biologicals	NB600-308AF594
Gibco DMEM/Miscela di nutrienti F-12 (DMEM/F-12)	ThermoFisher Scientifico	31331028
Gibco MEM Soluzione di Aminoacidi Non Essenziali (100x)	ThermoFisher Scientifico	11140035
Gibco Opti-MEM I	ThermoFisher Scientifico	11058021
Gibco Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medio	ThermoFisher Scientifico	52400025
Gibco Piruvato di Sodio (100 mM)	ThermoFisher Scientifico	11360070
Gibco Trypan Blue Soluzione, 0,4%	ThermoFisher Scientifico	15250061
Integratore GlutaMAX	ThermoFisher Scientifico	35050061
Anticorpo secondario crossadsorbito IgG (H+L) anti-ratto di capra, policlonale, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientifico	A-11006
Celle HEK 293T	ATTC	Codice CRL-11268
Bromuro di esadimetrina (Polybrene)	Sigma Aldrich	H9268
HyClone Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio	Citiva	SH30243.01
HyClone Penicillina Streptomicina 100x Soluzione (Pen/Strepto)	Citiva	SV30010
Soluzione salina tamponata con fosfato HyClone (PBS)	Citiva	SH30028.02
Ketaminolo veterinario. Soluzione iniettabile 100 mg/mL	MSD Salute animale Svezia	QN01AX03
Lama per microtomo - C35	PFM Medicale	207500005
Topo anti-CD45.2 (104), Superficie, APC, Monoclonale	Bioleggenda	109814
Topo anti-MHCII (M5/114.15.2), Superficie, PE-Cy7, Monoclonale	Bioleggenda	107630
Siero di capra normale	Abcam	ab7481
Siero di ratto normale (sterile)	Abcam	ab7488
Tubi in polipropilene a parete sottile open-top	Beckman Coulter Scienze della vita	326823
Paraformaldeide, 16% p/v aq. soln., senza metanolo	ThermoFisher Scientifico	043368.9M
pFUW-tetO-Batf3, un mouse monocistronico che codifica cassette Batf3	Addgene	139837
pFUW-tetO-Irf8, un mouse monocistronico per la codifica a cassette Irf8	Addgene	139838
pFUW-tetO-Pu.1, un mouse monocistronico per la codifica a cassetta Pu.1	Addgene	139839
Plasmide pMD2.G	Addgene	12259
Plasmide psPAX2	Addgene	12260
Plasmide SFFV-eGFP (eGFP)	Clonazione interna	-
Plasmide SFFV-mCherry (mCherry)	Clonazione interna	-
Plasmide SFFV-PIB-eGFP,  un mouse che codifica per cassette policistroniche PU.1, IRF8 e BATF3 (PIB)	Clonazione interna	-	I costrutti e i vettori utilizzati per la riprogrammazione sono disponibili presso Asgard Therapeutics nell'ambito di un accordo di trasferimento di materiale con l'azienda
Polietilenimmina (PEI), lineare, MW 25000, grado di trasfezione	Poliscienze	23966
ReadyProbes Penna per Pap con barriera idrofobica	ThermoFisher Scientifico	R3777
Butirrato di sodio	Sigma Aldrich	303410
Saccarosio	Sigma-Aldrich	S7903
Vetrini per microscopio ad adesione SuperFrost Plus	Epredia	J1800AMNZ
Composto Tissue-Tek O.C.T.	Sakura Finetek	4583
TrypLE Express Enzima (1x) senza rosso fenolo	ThermoFisher Scientifico	12604021
TT Cryomold Intermedio, quadrato (15 x 15 x 5 mm)	Sakura Finetek	4566
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Invitrogen	15575020
Veterinario di Xysol. Soluzione iniettabile 20 mg/mL	VM Pharma	QN05CM92
Celle YUMM1.7	Antineo