Flusso di lavoro per la caratterizzazione dei neuropeptidi dal campionamento all'acquisizione indipendente dai dati Spettrometria di massa

Summary

Questo protocollo delinea un flusso di lavoro completo di neuropeptidomica nel tessuto cerebrale di ratto che combina la spettrometria di massa DDA-PASEF (Data-Dependent Acquisition-Parallel Accumulation-Serial Fragmentation) e la spettrometria di massa Data-Independent Acquisition (DIA).

Abstract

I neuropeptidi endogeni sono modulatori chiave della funzione cerebrale, svolgendo un ruolo critico nel comportamento, nello stress, nel dolore e nella regolazione omeostatica, ma la loro analisi rimane difficile. Biologicamente, sono a bassa abbondanza, rapidamente degradate e trasformate in modo variabile da proteine precursori, con un'espressione limitata a piccole popolazioni cellulari localizzate. Tecnicamente, la loro rilevazione è complicata da un'ampia gamma dinamica, diverse modifiche post-traduzionali e segnali sparsi nei set di dati di spettrometria di massa. Questo protocollo delinea un flusso di lavoro completo per l'analisi dei neuropeptidi nel tessuto cerebrale di Rattus norvegicus utilizzando sia la spettrometria di massa (MS) con acquisizione dipendente dai dati (DDA) che l'acquisizione indipendente dai dati (DIA) su una piattaforma timsTOF. Dopo la preparazione ottimizzata del campione cerebrale, compresa la dissezione, l'estrazione e la purificazione dei peptidi, la cromatografia nanoliquida (LC)-MS viene eseguita con il frazionamento in fase gassosa a mobilità ionica per migliorare la sensibilità e l'accuratezza del rilevamento. La libreria spettrale generata da DDA supporta la quantificazione basata su DIA in Skyline, consentendo misure ad alta affidabilità a livello MS2. Questo flusso di lavoro integrato aumenta la copertura dei neuropeptidi e migliora la riproducibilità quantitativa, fornendo una solida piattaforma per lo studio dei neuropeptidi in tessuti cerebrali complessi.

Introduction

I neuropeptidi sono una classe funzionalmente diversificata di molecole di segnalazione endogene che fungono da modulatori critici della comunicazione neuronale, delle funzioni del sistema nervoso e neuroendocrino. Agendo come neuromodulatori, ormoni o co-trasmettitori, influenzano un'ampia gamma di processi fisiologici, tra cui la modulazione del dolore, la risposta allo stress, la regolazione circadiana e il controllo dell'appetito. A differenza dei neurotrasmettitori classici, che sono sintetizzati come piccole molecole, i neuropeptidi sono codificati all'interno di grandi proteine precursori che vengono sintetizzate attraverso la traduzione dell'mRNA. Le proteine precursori, o proormoni, subiscono quindi un processo proteolitico per rilasciare i peptidi attivi, che sono confezionati in vescicole a nucleo denso (DCV). Dopo la stimolazione, i neuropeptidi vengono rilasciati per esercitare effetti modulatori, in genere più lenti e prolungati attraverso interazioni con recettori accoppiati a proteine G. La loro importanza nel mantenimento della funzione del sistema nervoso centrale e periferico li ha resi un'area di intenso interesse biologico e clinico 1,2,3,4,5.

Nonostante la loro rilevanza, i neuropeptidi rimangono analiticamente difficili da caratterizzare. Le loro strutture altamente eterogenee, che vanno da sequenze corte a sequenze estese, spesso portanti diverse modifiche post-traduzionali (PTM) come l'amidazione, l'acetilazione, la fosforilazione, l'isomerizzazione degli amminoacidi o il troncamento, portano a variabilità nei comportamenti di ionizzazione e frammentazione nella spettrometria di massa (MS)1,6,7,8 . Inoltre, sono tipicamente presenti a basse concentrazioni rispetto ai componenti della matrice biologica, facilmente degradabili e sono localizzati in modo spazialmente ristretto all'interno del complesso tessuto del sistema nervoso. Queste caratteristiche complicano sia l'identificazione che la quantificazione, in particolare quando si utilizzano approcci proteomici tradizionali che si basano su una digestione enzimatica prevedibile e proprietà peptidiche uniformi ^9,10,11.

Qui, presentiamo una strategia completa per l'identificazione e la quantificazione di peptidi endogeni nel cervello di Rattus norvegicus, con un'enfasi specifica sui neuropeptidi. Il flusso di lavoro inizia con procedure di campionamento cerebrale ottimizzate, seguite da ampie separazioni di cromatografia liquida (LC) e si conclude con l'analisi MS ad alta risoluzione utilizzando l'accumulo parallelo-frammentazione seriale (PASEF) su una piattaforma di spettrometria di mobilità ionica intrappolata (TIMS) 12,13,14,15,16. Incorporando il frazionamento in fase gassosa a mobilità ionica (IM-GPF) prima della selezione del precursore, l'approccio Data-Dependent Acquisition-PASEF (DDA-PASEF) consente una migliore separazione dei precursori e una migliore rilevazione di neuropeptidi a bassa abbondanza, molti dei quali altrimenti non sarebbero presenti nei flussi di lavoro DDA unidimensionali¹⁷.

Sebbene la DDA rimanga la strategia più comunemente utilizzata nell'identificazione dei peptidi grazie ai suoi spettri MS/MS di alta qualità, è intrinsecamente limitata dalla sua dipendenza dalla selezione degli ioni precursori per intensità, che sbilancia le specie a bassa abbondanza 18,19,20. Inoltre, il suo campionamento semi-stocastico porta a valori mancanti tra le repliche, ostacolando la quantificazione riproducibile. Per superare queste limitazioni, abbiamo costruito una robusta libreria spettrale utilizzando i nostri dati DDA-PASEF, che può essere successivamente impiegata per l'analisi di acquisizione indipendente dai dati (DIA). A differenza del DDA, il DIA campiona tutti gli ioni precursori all'interno di finestre m/z definite, garantendo un campionamento coerente di peptidi sia abbondanti che rari e, se combinato con la libreria spettrale e l'analisi mirata in Skyline, consente una quantificazione sensibile e riproducibile a livello MS2 21,22,23,24.

Questo approccio integrativo - che comprende l'estrazione di peptidi cerebrali, la separazione cromatografica, l'acquisizione di MS potenziata dalla mobilità ionica e la quantificazione ibrida basata su DDA/DIA - è stato sviluppato tenendo conto della complessità dei neuropeptidi. Massimizza la copertura peptidica riducendo al minimo la perdita di dati, affrontando i limiti chiave di una peptidomica più semplice basata su DDA. Pertanto, presentiamo una piattaforma flessibile e potente per esplorare il panorama dei neuropeptidi nel cervello dei mammiferi, che può essere facilmente adattata a un'ampia gamma di domande sperimentali e campioni di tessuto.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali in questo studio sono stati condotti in conformità con il protocollo di utilizzo degli animali approvato dall'Illinois Institutional Animal Care and Use Committee (23228) con il rigoroso rispetto degli standard nazionali e ARRIVE per il trattamento e la cura etica degli animali.

1. Dissezione animale e isolamento cerebrale

1. Eseguire la perfusione salina a freddo immediatamente seguita dal congelamento a scatto dei tessuti per preservare l'integrità dei neuropeptidi, ridurre al minimo gli artefatti di degradazione e migliorare la qualità dei dati per l'analisi peptidomica a valle.
2. Eutanasia del ratto utilizzando il metodo CO₂ seguendo le linee guida istituzionali per la cura degli animali. Confermare la morte per assenza di battito cardiaco e mancanza di riflessi.
3. Posizionare il ratto supino; Fai un'incisione per esporre la cavità toracica.
4. Fai una piccola incisione nel ventricolo sinistro del cuore.
5. Praticare una piccola incisione nell'atrio destro per consentire il deflusso del sangue e della soluzione di perfusione.
6. Inserire nel ventricolo sinistro un puntale per pipetta di plastica tagliato su misura collegato a una siringa da 60 ml riempita con 50 ml di soluzione fisiologica ghiacciata (ad es. soluzione fisiologica allo 0,9% o mGBSS).
7. Perfondere il corpo dell'animale con la soluzione. Decapita il topo usando forbici affilate o una ghigliottina.
8. Rimuovere la pelle e il cranio sovrastanti il cervello con rongeurs o forbici sottili.
9. Sollevare con cautela il cervello dalla cavità cranica, tagliando i nervi cranici secondo necessità.
10. Congelare immediatamente il cervello su ghiaccio secco o congelare a scatto in isopentano raffreddato su ghiaccio secco.
11. Trasferire in crioviali o fogli etichettati, quindi conservare a -80 °C.

2. Estrazione di peptidi dal tessuto cerebrale di ratto

1. Per i campioni di cervello intero, pesare rapidamente ogni tessuto congelato utilizzando una bilancia analitica. Omogeneizzare il tessuto utilizzando una soluzione di grado LC-MS contenente il 10% di acido acetico glaciale e l'1% di acqua in metanolo, utilizzando un rapporto solvente/tessuto di 10:1 (v/p).
2. Incubare i campioni omogeneizzati su ghiaccio per 20 minuti.
3. Centrifugare i campioni a 16.000 × g per 20 minuti a 4 °C. Raccogliere con cura il surnatante senza disturbare il pellet.
4. Risospendere il pellet in acqua di grado LC-MS, utilizzando un rapporto solvente/tessuto di 10:1 (v/p), e ripetere l'incubazione su ghiaccio per 20 minuti.
5. Centrifugare nuovamente nelle stesse condizioni (16.000 × g, 20 min, 4 °C) e raccogliere il secondo surnatante.
6. Combinare entrambi i surnatanti e trasferire 1/10 del volume totale in una nuova provetta per la lavorazione a valle. Asciugare questa aliquota utilizzando un concentratore sottovuoto fino a completa asciugatura. Conservare l'estratto rimanente a -80 °C per un uso futuro.

3. Estrazione in fase solida (SPE) mediante colonne di spin C18

NOTA: Tutti i solventi devono essere di grado LC-MS. Se non diversamente specificato, le fasi di centrifugazione vengono eseguite a 1.500 × g a temperatura ambiente utilizzando una centrifuga da banco.

1. Preparazione del reagente
   1. Preparare la soluzione di attivazione (A): 50% acetonitrile/50% 0,1% acido formico in acqua.
   2. Preparare la soluzione di equilibrio e lavaggio (B): acido formico 0,1% in acqua.
   3. Preparare la soluzione di eluizione (C): 50% acetonitrile/50% 0,1% acido formico in acqua.
2. Preparazione del campione
   1. Ricostituire l'estratto peptidico essiccato in 200 μL di soluzione (B).
   2. Centrifugare il campione a 16.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
   3. Raccogliere con cura il surnatante per SPE.
3. Condizionamento ed equilibratura della colonna
   1. Aggiungere 150 μl di soluzione (A) alla colonna di spin C18.
   2. Centrifugare per 1 min a 1.500 × g.
   3. Ripetere i passaggi 3.3.1 e 3.3.2 due volte per garantire l'attivazione completa.
   4. Aggiungere 150 μl di soluzione (B).
   5. Centrifugare per 1 min.
   6. Ripetere i passaggi 3.3.4 e 3.3.5 due volte.
4. Caricamento e lavaggio dei campioni
   1. Caricare 200 μl della soluzione campione preparata sulla colonna.
   2. Centrifugare per 1 min.
   3. Ricaricare il flusso sulla colonna tre volte per massimizzare la ritenzione dei peptidi.
   4. Aggiungere 150 μl di soluzione (B).
   5. Centrifugare per 1 min.
   6. Ripetere i passaggi 3.4.4 e 3.4.5 tre volte per rimuovere i contaminanti non trattenuti.
5. Eluizione di peptidi
   1. Aggiungere 150 μl di soluzione di eluizione (C) alla colonna.
   2. Centrifugare per 1 min.
   3. Ripetere ancora una volta i passaggi di eluizione 3.5.1-3.5.2.
   4. Unire entrambi gli eluati e conservare con ghiaccio o procedere all'essiccazione sottovuoto.

4. Analisi LC-MS/MS

1. Preparare la soluzione (A): 0,1% di acido formico in acqua, soluzione; (B): acido formico allo 0,1% in soluzione di acetonitrile; (C): 25 fmol/μL di tempo di ritenzione standard (iRT) 0,1% di acido formico in acqua.
2. Risospendere i campioni in una soluzione da 20 μl (C) prima dell'iniezione di LC-MS.
   NOTA: Sono stati analizzati due campioni biologici e ciascuno è stato iniettato cinque volte sia per le esecuzioni DDA che DIA, ottenendo cinque repliche tecniche per metodo per campione.
3. Eseguire la separazione dei peptidi utilizzando un sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), con la fase mobile A costituita dalla soluzione (A) e la fase mobile B costituita dalla soluzione (B).
4. Caricare 1 μL di campioni su una colonna analitica C18 da venticinque μm (150 μm × 250 mm, particelle da 1,9 μm, dimensione dei pori 120 Å) e mantenerla a 40 °C per tutta la durata della seduta.
5. Effettuare la separazione LC ad una portata di 600 nL/min utilizzando il seguente profilo di gradiente: 0-5 min: 2-10% B; 5-85 min: 10-45% B; 85-87 min: 45-50% B; seguito da un elevato lavaggio organico e riequilibrio.
   NOTA: Il LC è stato accoppiato direttamente a un timsTOF MS tramite una sorgente ionica.
6. Per l'analisi DDA, utilizzare il metodo di applicazione predefinito DDA PASEF-standard_1.1sec_cycletime su timsTOF MS.
   1. In breve, azionare lo spettrometro di massa in modalità PASEF con l'esclusione dinamica abilitata. Impostare ogni ciclo in modo che consista in 10 scansioni PASEF MS/MS su un ciclo di lavoro di 1,1 s.
   2. Impostare l'intervallo di massa su m/z 100-1700 e l'intervallo di mobilità ionica da 0,60 a 1,60 V·s/cm², utilizzando un tempo di rampa di 100,0 ms. Aumentare l'energia di collisione da 20,0 a 59,0 eV in funzione della mobilità ionica.
7. Frazionamento in fase gassosa a mobilità ionica (IM-GPF)
   1. Segmentare l'intervallo di mobilità ionica di 0,6-1,6 V·s/cm² in tre finestre sovrapposte: 0,6-1,0, 0,9-1,3 e 1,2-1,6 V·s/cm².
   2. A tale scopo, modificare i valori di inizio e fine della mobilità nel tocco delle impostazioni TIMS di timsControl o dell'editor timsControl sui valori della finestra corrispondenti.
   3. Acquisisci i dati per ogni finestra. Per tutte le finestre di acquisizione della mobilità ionica, utilizzare un tempo di accumulo e rampa costante di 100 ms.
   4. Acquisire i dati in modalità DDA-PASEF utilizzando gli stessi parametri descritti al punto 4.6.
8. Per l'analisi DIA, utilizzare una finestra di isolamento di larghezza di 25 m/z nell'intervallo di massa di 400-1200 m/z. Utilizzare le stesse impostazioni sperimentali di mobilità ionica (IMEX) utilizzate nel metodo DDA.
   1. Ulteriori impostazioni DIA includono una rampa MS1 seguita da 16 rampe MS/MS per ciclo, per un tempo di ciclo totale di 1,8 s.
   2. Utilizzare il metodo DIA-PASEF di proteomica predefinito come modello per lo sviluppo del metodo DIA. Dopo aver creato il metodo DIA, caricarlo nella scheda del metodo di Hystar. Non è richiesta l'attivazione della modalità DIA.
      NOTA: Il metodo DIA verrà registrato automaticamente una volta caricato correttamente.

5. Trattamento dei dati

NOTA: Dopo l'acquisizione dei dati, l'identificazione dei peptidi deve essere eseguita utilizzando strumenti bioinformatici come PEAKS Online, PEAKS Studio, MSFragger, Maxquant o piattaforme simili. Questo studio ha utilizzato Peaks Online, in grado di lavorare con dati grezzi in formato .d.

1. Ricerca nel database
   1. Utilizzare un database di riferimento appropriato per le ricerche di peptidi, come un database curato di peptidi di segnalazione di ratto, un proteoma di ratto o il proteoma umano, o un database curato di peptidi di segnalazione basato sulla fonte del campione.
      NOTA: Questi database possono essere ottenuti da fonti affidabili come NCBI o UniProt (https://www.uniprot.org/). Si noti che verranno identificate solo le proteine o i peptidi presenti nel database. I dati del segnale di ratto sono stati curati filtrando il proteoma di ratto mediante l'annotazione "Signal peptide" in UniProt. Nei termini Uniprot, filtrare per "peptide segnale" significa restringere il proteoma alle proteine coinvolte nella secrezione, nella localizzazione della membrana o nel traffico compartimentale. Questo database personalizzato contiene 5630 proteine. Limitare le dimensioni del database delle proteine da 50.000 a 5.000 offre diversi vantaggi. In primo luogo, migliora la sicurezza dell'identificazione riducendo la probabilità di corrispondenze casuali dello spettro peptidico, aumentando così l'accuratezza delle assegnazioni peptidiche. In secondo luogo, un database più piccolo migliora l'efficienza computazionale, consentendo tempi di elaborazione più rapidi e una minore domanda di risorse computazionali. In terzo luogo, un database più conciso può portare a un migliore controllo del tasso di false scoperte (FDR), con conseguenti identificazioni proteiche più affidabili e statisticamente robuste. Tuttavia, il database deve essere relativamente grande per evitare l'inflazione artificiale dei punteggi di confidenza e una stima imprecisa di FDR.
   2. Configurare la ricerca nel database nella GUI del programma con i seguenti parametri consigliati: Tolleranza all'errore di massa del precursore: 10-25 ppm; tolleranza all'errore di massa del frammento: 0,01-0,05 Da; specificità enzimatica: nessuna (digestione aspecifica); Intervallo di lunghezza dei peptidi: 4-45 aminoacidi.
   3. Definire l'insieme di PTM da includere nella ricerca.
   4. Dopo aver completato la ricerca nel database, esportare i file pepxml e mzXML (o MGF) corrispondenti a ciascuna finestra di mobilità ionica, incluso l'intervallo di mobilità completo standard (0,6-1,6 V·s/cm²).
2. Costruzione della biblioteca Skyline
   1. Apri Skyline e crea un nuovo documento, assicurati che l'interfaccia Proteomics sia selezionata e utilizza le impostazioni predefinite se non diversamente specificato.
   2. Passare a File > Importa > Ricerca peptidi.
   3. Nell'Importazione guidata di ricerca peptidica , selezionare Crea e aggiungere i file pepxml pertinenti (assicurarsi che i file mzXML o MGF corrispondenti si trovino nella stessa directory).
   4. Impostare i peptidi standard iRT su Automatico, scegliere DIA come flusso di lavoro, quindi fare clic su Avanti.
   5. Dopo la costruzione della libreria, scegliere circa 10-15 peptidi come standard iRT per l'allineamento tra le repliche. Se viene richiesto di ricalibrare iRT, fare clic su OK per procedere.
   6. Nella pagina Estrai cromatogrammi , fare clic su Sfoglia per selezionare e importare tutti i file raw DIA, quindi fare clic su Continua.
   7. Nella finestra Impostazioni di transizione , impostare l'intervallo di carica del precursore su 1-5, l'intervallo di carica del prodotto su 1-3, i tipi di ioni su ,p,y,b e definire la selezione degli ioni del prodotto Dallo ione 2 all'ultimo ione. Altre impostazioni consigliate: tolleranza di corrispondenza ionica: 0,05 Da, Picchi da selezionare: 5.
   8. Nella finestra Impostazioni peptidi , impostare le modifiche che corrispondono all'impostazione di ricerca Picchi descritta in 4.1.3.
   9. Nella pagina Schema di isolamento , immettere un nome per l'isolamento e lo schema e selezionare Finestre di isolamento prespecificate. Fare clic su importa e caricare uno dei file DIA per importare automaticamente la configurazione della finestra di isolamento dell'esperimento.
   10. Impostare le impostazioni di acquisizione della scansione completa con i seguenti parametri. Metodo di acquisizione: DIA; Prodotto analizzatore di massa: Centroidale; Schema di isolamento: Utilizzare quello definito sopra; Precisione di massa: 10-20 ppm; Potere risolutivo della mobilità: 30-50; Abilita Usa solo scansioni entro 5 minuti dalla RT prevista; Facoltativamente, modificare il filtro MS1 se è necessaria l'importazione di cromatogrammi MS1. Selezionare un analizzatore di massa e una risoluzione appropriati per un'estrazione ottimale del cromatogramma MS1.
   11. Importa FASTA e genera esche. Imposta il metodo di generazione dell'esca: Sequenza casuale.
   12. Seleziona l'enzima: la digestione non è specifica nell'analisi dei peptidi endogeni. Modifica l'enzima selezionando aggiungi dal menu a discesa dell'enzima. Impostare il nome dell'enzima, digitare su entrambi, scindere il terminale c su KR e scindere il terminale N su KR, consentire la semi-scissione e fare clic su OK. Imposta le scissioni mancate a 3.
   13. Importare il file FASTA di destinazione, quindi fare clic su Fine. Confermare la pagina delle proteine associate , se richiesto.
   14. Assicurarsi che la libreria spettrale sia stata creata correttamente e che i dati DIA siano stati importati. Ispezionare manualmente l'elenco dei peptidi identificati e procedere con l'analisi quantitativa e qualitativa a valle.
3. Misurazioni qualitative e quantitative
   NOTA: Le analisi qualitative e quantitative vengono effettuate in Skyline. Per i dettagli sull'analisi dei dati DIA in Skyline, visitare il https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorial_dia_swath.
   1. Se i dati DDA sono caricati, selezionare Impostazioni > Impostazioni di transizione dal menu, scegliere DDA in Metodo di acquisizione; in Impostazioni > Impostazione peptide, scegli il livello MS 1 per la quantificazione.
   2. Se i dati DIA sono caricati, Impostazioni > Impostazione transizione, scegliere DIA in Metodo di acquisizione; in Impostazioni > Impostazione peptide, scegli il livello MS 2 per la quantificazione.
   3. In Visualizza > griglia del documento, seleziona Quantificazione peptidica, quindi Esporta il foglio di calcolo. Combina i fogli di calcolo dei risultati DDA e dei risultati DIA.
      NOTA: Il foglio di calcolo riepiloga le aree di picco di tutti i peptidi nella libreria in tutti i campioni. In questo esperimento, le aree di picco del peptide sono state normalizzate al peptide standard del tempo di ritenzione GISNEGQNASIK, che fa parte della miscela del tempo di ritenzione Pierce. La normalizzazione è stata eseguita calcolando il rapporto tra l'area di picco di ciascun peptide e quella dello standard.

Results

Uno schema sperimentale rappresentativo è mostrato nella Figura 1. L'analisi dei dati DDA-PASEF (Figura 2) acquisiti utilizzando sia l'intervallo di mobilità ionica standard che IM-GPF ha rivelato una copertura peptidica sostanzialmente più elevata per l'approccio IM-GPF (Figura 2B). In particolare, la maggior parte dei peptidi identificati utilizzando il metodo DDA-PASEF standard si sovrapponeva a quelli trovati nel set di dati IM-GPF. Per massimizzare la copertura dell'identificazione dei peptidi, è stata generata una libreria spettrale completa integrando le identificazioni di entrambi gli approcci.

Un'ulteriore analisi del database di set di dati replicati acquisiti tramite DDA e DIA-PASEF (Figura 3), utilizzando un database curato di peptidi di segnalazione del ratto, ha rivelato 217 proteine comuni a entrambi i metodi. Inoltre, 115 proteine sono state identificate in modo univoco da DIA-PASEF, mentre 69 erano esclusive di DDA-PASEF. Le analisi esplorative che utilizzano librerie spettrali derivate dai dati DDA e IM-GPF hanno dimostrato che DIA-PASEF ha permesso la rilevazione sicura di neuropeptidi come NPAFLFQPQRF (neuropeptide SF) e YGGFMRRVGRPEWWMDYQ (derivato dalla proencefalina). Questi neuropeptidi non sono stati rilevati in modo affidabile nei corrispondenti set di dati DDA-PASEF a causa della scarsa assegnazione dei picchi (Figura 3B, C).

Da un punto di vista quantitativo, il grafico a dispersione nella Figura 4A rivela una moderata correlazione positiva tra l'intensità del precursore DDA e l'intensità degli ioni frammento DIA, come previsto dato che entrambi gli approcci quantificano gli stessi peptidi ma catturano tipi di ioni diversi. I box plot per peptidi selezionati mostrati nella Figura 4B illustrano ulteriormente la riproducibilità delle misurazioni quantitative ottenute da entrambi gli approcci. I box plot mostrano le aree di picco relative per ciascun peptide misurate da DIA e DDA, con barre di errore che rappresentano la variabilità della misurazione tra le repliche tecniche. I peptidi selezionati derivano da proormoni oppioidi, tra cui la proencefalina (PENK) e la prodinorfina (PDYN), che svolgono entrambi un ruolo centrale nella modulazione del dolore e dell'analgesia.

Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro della peptidomica per l'identificazione e la quantificazione di peptidi endogeni da tessuto cerebrale di ratto. Il flusso di lavoro include la dissezione dei tessuti, l'estrazione e la purificazione dei peptidi, l'acquisizione di dati LC-ion mobility-MS (LC-IM-MS) mediante frazionamento in fase gassosa (IM-GPF) e l'elaborazione dei dati per generare librerie spettrali ed eseguire analisi quantitative. Parti della Figura sono state create in BioRender. Tan, Y. (2025) https://BioRender.com/vrejrsk. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Identificazione di peptidi e proteine nel database. (A) Grafico a barre che confronta il numero totale di precursori, le corrispondenze peptidico-spettro (PSM) e i peptidi unici identificati in diverse finestre di mobilità ionica. (B) Grafico a torta che illustra la proporzione di peptidi comunemente identificati in tutte le finestre di mobilità e quelli rilevati in modo univoco all'interno delle singole finestre. (C, D) Mappe di calore che illustrano la distribuzione dei segnali ionici attraverso le dimensioni m/z e di mobilità ionica per l'intero intervallo di mobilità (0,6-1,6 V·s/cm²) (C) e la finestra di mobilità limitata (0,6-1,0 V·s/cm²) (D). (E) Grafico sconvolto che mostra il numero di proteine identificate in set di dati acquisiti utilizzando metodi DDA e DIA, evidenziando identificazioni proteiche condivise e uniche. (F) Heatmap che rappresenta i peptidi derivati dal precursore della proencefalina identificato nelle repliche acquisite con DIA (pannello superiore) e nelle repliche acquisite con DDA (pannello inferiore). La leu-encefalina non è stata rilevata in due delle quattro repliche di DDA, indicando potenziali valori mancanti nell'acquisizione basata su DDA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Analisi comparativa ed esplorativa dei dati DDA-PASEF e DIA-PASEF utilizzando librerie spettrali. (A) Allineamento del tempo di ritenzione del neuropeptide SF attraverso repliche DIA e DDA-PASEF. (B) EIC di PENK (212-229) frammenta ioni da set di dati DIA (in alto) e DDA (in basso). (C) Cromatogrammi ionici in frammenti di neuropeptide SF da repliche DIA che dimostrano un'elevata co-eluizione e qualità spettrale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Confronto delle misure quantitative tra DIA-PASEF (livello MS2) e DDA-PASEF (livello MS1). (A) Questo grafico a dispersione confronta le intensità del segnale peptidico ottenute utilizzando le modalità DIA e DDA. In particolare, l'asse x rappresenta l'area del picco del precursore trasformato log₁₀ da DDA, mentre l'asse y mostra l'area del picco del frammento trasformato log₁₀ da DIA per ciascun peptide. (B) I box plot rappresentano le aree di picco relative di quattro peptidi rappresentativi, PENK 107-133, PENK 188-195, PDYN 221-233 e PDYN 235-248. Le barre di errore rappresentano la variabilità tra le repliche tecniche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

In peptidomica, in particolare quando si analizzano i peptidi endogeni, preservare il profilo peptidico nativo è essenziale per l'integrità dei dati e l'interpretazione biologica. La perfusione salina fredda non solo rimuove il sangue, ma raffredda anche il cervello, riducendo significativamente la degradazione proteolitica post-mortem che si verifica rapidamente a causa dell'attività delle proteasi endogene. Abbassando la temperatura cerebrale, l'attività enzimatica viene rallentata e le proteasi circolanti vengono espulse dal sistema vascolare, riducendo anche i cambiamenti metabolici post mortem^25,26. La perfusione con soluzione salina ghiacciata elimina anche il sangue dalla vascolarizzazione del cervello. Questo passaggio è particolarmente importante, poiché il sangue contiene proteine ad alta abbondanza (come albumina e globuline) e proteasi circolanti che possono interferire con il rilevamento dei neuropeptidi. La degradazione post mortem di abbondanti proteine del sangue può aumentare la complessità degli estratti di neuropeptidi e mascherare i segnali di bassa abbondanza, compromettendo in ultima analisi sia l'identificazione che la quantificazione 25,26,27. Il congelamento immediato del tessuto cerebrale, sia su ghiaccio secco che tramite congelamento rapido in isopentano refrigerato, arresta i processi enzimatici quasi istantaneamente. Questa conservazione è particolarmente importante per rilevare neuropeptidi maturi a bassa abbondanza e a lunghezza intera e garantire una quantificazione affidabile. Senza questi passaggi, la degradazione dei peptidi può portare a un aumento della variabilità e ad artefatti che compromettono sia l'identificazione che la quantificazione. Pertanto, la rimozione del sangue, la perfusione fredda e il rapido raffreddamento del cervello sono tecniche fondamentali che influiscono direttamente sulla qualità, la sensibilità e la riproducibilità dei dati peptidomici prima delle misurazioni.

L'analisi dei peptidi estratti dal cervello di ratto ha rivelato la presenza di due distinti pennacchi di mobilità ionica (Figura 2C, D). Questo fenomeno può essere attribuito sia a diverse classi molecolari che a diversi stati di carica dei peptidi. Se i pennacchi corrispondono a classi molecolari distinte, le specie non peptidiche coeluite possono competere con i peptidi per la selezione e la frammentazione. Inoltre, se la separazione deriva da differenze negli stati di carica, ci si aspetterebbe che il pennacchio contenente peptidi altamente carichi produca spettri MS/MS di qualità superiore, facilitando un'identificazione più sicura dei peptidi.

Per indagare su questo, abbiamo implementato una strategia di frazionamento della mobilità ionica, acquisendo dati attraverso tre finestre di mobilità discrete: 0,6-1,0, 0,9-1,3 e 1,2-1,6 V·s/cm². Queste finestre coprono collettivamente l'intero intervallo di mobilità ionica tipicamente analizzato negli esperimenti DDA-PASEF standard per i peptidi. Come illustrato nella Figura 2, sebbene il numero totale di precursori rilevati fosse più alto nell'intervallo di scansione completo (0,6-1,6 V·s/cm²), è stato osservato un numero significativamente maggiore di corrispondenze dello spettro peptidico (PSM) all'interno della finestra di 0,6-1,0 V·s/cm² . Questa scoperta suggerisce che la presenza di due pennacchi potrebbe effettivamente essere dovuta all'interferenza di altre molecole.

Il frazionamento dei precursori basato sulla mobilità ionica ha comportato un aumento del 30% della copertura peptidica rispetto al metodo convenzionale a scansione completa. Circa l'82% dei peptidi identificati nel set di dati a scansione completa si sovrapponeva ai peptidi identificati utilizzando il frazionamento (Figura 2B), evidenziando la coerenza e la robustezza della strategia di frazionamento. Sulla base di queste osservazioni, abbiamo impiegato il frazionamento della mobilità ionica e i dati full-scan per costruire librerie spettrali per l'analisi quantitativa dei peptidi neuroendocrini utilizzando DIA-PASEF.

L'analisi del database dei set di dati replicati acquisiti tramite DDA e DIA ha rivelato un numero maggiore di identificazioni di peptidi e proteine nei dati DIA, tra cui 115 proteine identificate in modo univoco da DIA (Figura 2E). Questi includevano neuropeptidi come i peptidi correlati a Pro-FMRFamide FF e FV. Al contrario, 69 proteine sono state identificate esclusivamente dalla DDA, molte delle quali sono associate all'adesione cellulare e allo sviluppo neuronale. Questi risultati suggeriscono che le metodologie DDA e DIA possono essere applicate in modo complementare per ottenere una copertura peptidica più ampia.

Ulteriori analisi hanno dimostrato che l'acquisizione di DIA risolve efficacemente alcuni dei problemi di valore mancante frequentemente riscontrati nell'analisi dei peptidi endogeni utilizzando DDA. Ad esempio, la leu-encefalina è stata rilevata solo in due delle quattro repliche di DDA (Figura 2F, pannello inferiore), mentre è stata identificata in modo coerente in tutte e quattro le repliche di DIA (Figura 3F, pannello superiore).

Skyline, una piattaforma ampiamente utilizzata per la proteomica quantitativa, è stata utilizzata per analizzare i set di dati DDA e DIA-PASEF²⁸. Il software facilita l'identificazione dei peptidi attraverso la corrispondenza della libreria spettrale, la co-eluizione di ioni frammento e l'allineamento del tempo di ritenzione. Per valutare la capacità di DIA-PASEF di ridurre l'identificazione mancante, abbiamo eseguito una valutazione qualitativa dei peptidi rilevati esclusivamente nel set di dati DIA.

Come mostrato nella Figura 3D, il neuropeptide SF è stato costantemente rilevato in tutte le repliche DIA entro la stessa finestra temporale di ritenzione. Il rilevamento nelle repliche DDA ha mostrato una notevole variabilità, con tempi di ritenzione compresi tra 25 minuti e 45 minuti (Figura 3A). Le incongruenze osservate, tra cui le assegnazioni errate dei picchi con bassi punteggi di confidenza, erano probabilmente dovute a una copertura ionica limitata o di bassa qualità, come mostrato nella Figura 3B. Al contrario, la Figura 3C mostra che gli ioni frammento corrispondenti al neuropeptide SF erano ben allineati in tutte le repliche DIA, supportando un'identificazione automatizzata sicura.

Un confronto tra la qualità spettrale MS/MS per il peptide PENK (212-229), derivato dalla proencefalina, ha ulteriormente dimostrato i vantaggi di DIA-PASEF. Gli spettri ottenuti dalla DIA hanno mostrato una maggiore intensità e una migliore qualità degli ioni frammento rispetto alla DDA (Figura 3), il che è particolarmente utile per rilevare peptidi endogeni a bassa abbondanza.

L'analisi quantitativa ha confermato che DIA-PASEF ha prodotto misurazioni coerenti e riproducibili tra le repliche biologiche, con prestazioni paragonabili a DDA (Figura 4). Inoltre, la DIA ha consentito la quantificazione a livello di MS2, offrendo una specificità a livello di ioni frammento e una maggiore fiducia nell'identificazione dei peptidi rispetto alla DDA basata su MS1. Questi risultati supportano l'uso di DIA-PASEF come approccio affidabile ed efficiente per la quantificazione mirata dei neuropeptidi in matrici biologiche complesse, in particolare quando la completezza e la riproducibilità dei dati sono fondamentali.

Questo protocollo delinea una strategia completa per l'analisi e la quantificazione dei neuropeptidi. L'approccio IM-GPF facilita la costruzione di librerie spettrali di alta qualità. Sebbene DIA-PASEF offra una migliore riproducibilità e una maggiore copertura peptidica rispetto a DDA-PASEF, migliora anche la quantificazione basata su MS2. La combinazione di entrambe le strategie di acquisizione aumenta la copertura peptidica complessiva, poiché ogni metodo contribuisce in modo univoco all'identificazione di peptidi distinti (Figura 2E). Il limite di questo protocollo è la necessità di un ampio materiale campione per supportare sia la generazione di librerie spettrali che l'acquisizione di dati tramite metodi DDA e DIA-PASEF.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1% Acido Formico Acqua	Fisher Scientific	LS118-500	di grado LC / MS
	Fisher Scientific	A11350	Acetonitrile di grado LC/MS
	Fisher Scientific	AA47138K7	di grado LC/MS
	Fisher Scientific	PI28905	di grado LC/MS
	Fisher Scientific	AA47192K7	LC/MS
nanoELute2	Bruker	N/A
Pierce C18	Fisher Scientific
Pierce Peptide Retention Time Calibration Mixture	Thermo Fisher	A11351	Concentratore
a vuoto SpeedVac	Genevac	https://scientificproducts.com/product_cat/benchtop-solvent-evaporators/	Il modello specifico utilizzato in questo studio non è più disponibile presso il produttore. Un link all'attuale modello equivalente è fornito come riferimento
timsTOF Pro2	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-pro-2.html
Water	Fisher Scientific	AA47146M6	Grado LC/MS