Articolo metodologico

SCAnED - Una macro di segmentazione cutanea open-source per il rilevamento semi-automatico di cellule e nuclei nei compartimenti cutanei epidermici e dermici

DOI:

10.3791/68746

⸱

8 agosto 2025

 ,  , 
1Department of Dermatology, Medical University of Vienna

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo semi-automatizzato per l'identificazione e la quantificazione di cellule immunitarie e non immunitarie in sezioni cutanee utilizzando SCAnED, una macro gratuita basata su ImageJ per la segmentazione della pelle.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La distribuzione spaziale delle cellule immunitarie e non immunitarie all'interno dei tessuti e l'espressione di marcatori cellulo-specifici forniscono informazioni essenziali sulla funzione cellulare in situ. La pelle umana è un organo altamente complesso con compartimenti definiti che comprendono diverse cellule con diversi fenotipi. Utilizzando la marcatura multifluorescenza, è possibile determinare e caratterizzare ulteriormente popolazioni di cellule cutanee distinte. Tuttavia, attualmente, la disponibilità di strumenti non commerciali per l'analisi delle immagini di campioni cutanei che consentono la segmentazione in silico di cellule specificamente all'interno dell'epidermide o del derma con una risoluzione di una singola cellula è limitata. Qui forniamo un protocollo passo-passo per la colorazione in immunofluorescenza di sezioni cutanee, la microscopia confocale e l'analisi delle immagini utilizzando il nostro strumento disponibile gratuitamente SCAnED (Skin Compartment Analysis of Epidermis and Dermis). La macro SCAnED consente l'identificazione e la classificazione precisa di cellule e nuclei sia nel compartimento epidermico che in quello dermico della pelle umana. Forniamo linee guida su come determinare i livelli medi di intensità dell'espressione di maker in diverse cellule e compartimenti cellulari, come il citoplasma e il nucleo, e su come quantificare le cellule che esprimono quantità variabili di questi marcatori con una pipeline Python di accompagnamento fornita come notebook Jupyter pronto all'uso eseguito in Google Colab. Questo protocollo consentirà agli utenti inesperti di determinare i profili di espressione specifici delle cellule all'interno del tessuto cutaneo e di fornire informazioni sulla distribuzione spaziale delle cellule all'interno dei compartimenti epidermico e dermico, consentendo una comprensione più profonda dell'intricata struttura dei tessuti e della composizione cellulare della pelle umana.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La comprensione dei tessuti cutanei a livello cellulare e la distinzione dei fenotipi cellulari, della morfologia e della loro localizzazione all'interno dei compartimenti epidermico e dermico sono fondamentali nella ricerca dermatologica e nell'istopatologia 1,2. La composizione cellulare all'interno dell'epidermide, che comprende cheratinociti, melanociti e cellule di Langerhans in condizioni sane, diventa notevolmente squilibrata nelle malattie infiammatorie della pelle e nel cancro. Inoltre, il fenotipo e la localizzazione delle cellule all'interno del derma, situate sotto l'epidermide e che ospitano i fibroblasti e la maggior parte delle cellule immunitarie, possono cambiare significativamente nella malattia. Pertanto, la segmentazione cellulare e dei nuclei è indispensabile per valutare gli attributi cellulari come il numero di cellule, l'espressione proteica, la morfologia e l'organizzazione spaziale e le caratteristiche del nucleo come le dimensioni, la forma e l'espressione del fattore di trascrizione, aiutando così nella comprensione dell'omeostasi cutanea e delle malattie 3,4,5.

Nonostante la disponibilità di piattaforme di analisi delle immagini generiche come QuPath6, CellProfiler7 e ilastik8, questi strumenti richiedono spesso un'ampia personalizzazione e scripting per adattarsi alla complessità strutturale e alla morfologia cellulare eterogenea del tessuto cutaneo. Pochi strumenti sono stati specificamente adattati per la segmentazione automatizzata dei compartimenti epidermici e dermici e molte soluzioni disponibili sono commerciali e non liberamente accessibili. Queste limitazioni rendono difficile per i non esperti implementare pipeline efficienti per l'analisi specifica della pelle.

Qui presentiamo un protocollo completo per l'analisi di cellule e nuclei all'interno del tessuto cutaneo e dei suoi compartimenti, che copre tutte le fasi vitali, dalla colorazione dei tessuti all'analisi delle immagini, utilizzando la nostra pipeline di analisi delle immagini semi-automatizzata. Iniziamo con informazioni dettagliate sulla colorazione in immunofluorescenza del tessuto cutaneo, inclusa la colorazione con E-caderina per la segmentazione dell'epidermide/derma e 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per la rilevazione di cellule/nuclei. Due marcatori di interesse, Vimentina (VIM) e CD90, sono stati inclusi a scopo di convalida. Si consiglia di utilizzare anticorpi a concentrazioni ottimizzate (vedere la Tabella 1) e di acquisire immagini utilizzando la microscopia confocale con impostazioni coerenti per l'intensità del laser, il tempo di esposizione e la risoluzione per garantire la riproducibilità.

Inoltre, presentiamo il nostro macro SCAnED, ImageJ9 progettato su misura, che sta per Skin Compartment Analysis of Epidermis e Dermis, e forniamo tutti i passaggi necessari per la segmentazione in silico e il rilevamento di nuclei e cellule sia all'interno dell'epidermide che del derma. Gli utenti possono scegliere tra due diversi metodi di rilevamento dei nuclei, utilizzando la soglia semplice e veloce o lo strumento di deep learning StarDist10 e il nostro modello di pelle addestrata, prima di procedere con il protocollo SCAnED. A differenza degli strumenti generali, SCAnED è stato sviluppato specificamente per l'istologia cutanea e li supera consentendo la compartimentazione automatica delle regioni epidermiche e dermiche e la quantificazione integrata di più marcatori in entrambe le regioni. Ciò è particolarmente utile per i ricercatori che non hanno esperienza nella programmazione o nell'apprendimento profondo, offrendo uno strumento pronto all'uso su misura per l'analisi delle immagini cutanee.

Mostriamo inoltre come i livelli medi di intensità per cellula vengono estratti da immagini di immunofluorescenza di un massimo di cinque distinti marcatori di interesse. Infine, forniamo un codice Python per l'analisi statistica dei dati ottenuti a singola cella scritti ed eseguiti in Google Colab11 e condivisi come Jupyter notebook. Il nostro protocollo e il macro SCAnED mirano a fornire ai ricercatori della pelle senza competenze avanzate di immunofluorescenza e calcolo uno strumento pratico per marcare e quantificare in modo semi-automatico le cellule e l'espressione dei marcatori nella pelle umana, concentrandosi sui compartimenti epidermico e dermico.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Marcatura in immunofluorescenza di E-caderina, VIM e CD90 e colorazione nucleare con DAPI in sezioni cutanee incluse in paraffina

NOTA: Il protocollo mostra i passaggi per le sezioni incluse in paraffina. Per i campioni di tessuto freschi e congelati, fissare le sezioni di tessuto e continuare con il passaggio 1.3 del protocollo.

  1. Sciogliere la paraffina usando una ventola o un forno.
  2. Reidratare le sezioni passando attraverso alcoli graduati con contenuto di acqua crescente (ad esempio, xilene → etanolo al 100% → etanolo all'85% → etanolo al 70% → acqua).
  3. Eseguire le fasi di recupero dell'antigene in base alle esigenze degli antigeni.
  4. Permeabilizzare le sezioni di tessuto con Triton X allo 0,3% in PBS (3 x 20 min) (vedere Tabella 2).
  5. Lavare i vetrini con PBS (1 x 5 min).
  6. Circondare ogni campione con un pennarello idrofobo per evitare fuoriuscite di liquidi e ridurre al minimo il volume dei reagenti e lasciarlo asciugare.
  7. Applicare anticorpi primari (tampone per Abs: PBS + 2% BSA) (vedere Tabella 1 e Tabella 2). Posizionare i vetrini in una scatola da camera umidificata (wet box) e incubare per una notte.
  8. Lavare i vetrini con Triton X allo 0,3% in PBS (3 x 5 min).
  9. Rimuovere il detersivo in eccesso lavando i vetrini con PBS (1 x 5 min).
  10. Applicare gli anticorpi secondari e il siero di capra (vedere Tabella 1). Incubare i vetrini in un luogo buio per 1 ora.
  11. Lavare i vetrini con Triton X allo 0,3% in PBS (3 x 5 min).
  12. Rimuovere il detersivo in eccesso lavando i vetrini con PBS (1 x 5 min).
  13. Aggiungere DAPI per la colorazione dei nuclei (vedere Tabella 1). Incubare i vetrini in un luogo buio per 30 minuti.
  14. Lavare i vetrini con Triton X allo 0,3% in PBS (3 x 5 min).
  15. Lavare i vetrini con PBS (1 x 5 min).
  16. Applicare 1 goccia (~5-15 μL) di terreno di montaggio della fluorescenza su ciascun campione e posizionare con cura i vetrini coprioggetti (rimuovere le bolle se necessario). Lasciare asciugare i vetrini al buio.
Anticorpi e colorantiConcentrazione lavorativaDiluizione
anticorpo anti-Vimentina0,8 μg/mL1:50
anticorpo anti-E-caderina1 μg/mL1:333
anticorpo anti-CD901:1000
AF488 anti-mouse1:500
AF568 anti-coniglio1:500
AF647 anti-mouse1:500
DAPI1 μg/mL

Tabella 1: Anticorpi e colorante.

1. Tampone di colorazione
ReagenteConcentrazione finaleImporto
BSA2%1 g
PBS1x50 ml
Totalen/a50 ml
2. Tampone di permeabilizzazione
ReagenteConcentrazione finaleImporto
Tritone X0.30%300 μl
PBS1x100 ml
Totalen/a100 ml

Tabella 2: Ricette per le soluzioni.

2. Imaging confocale

NOTA: Per questo protocollo è stato utilizzato un microscopio a scansione laser confocale, dotato di un obiettivo 10x (NA 0,4) e 4 linee laser (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).

  1. Acquisire immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza (vedere l'immagine di esempio nella Figura 1).
  2. Utilizzare il seguente parametro della dimensione di scansione per creare la macro, addestrare il modello StarDist e, idealmente, per l'acquisizione delle immagini: Dimensione dell'immagine = 4.096 x 4.096 pixel (o 1.273 x 1.273 micron), profondità di bit = 16 bit, dimensione minima dei pixel = 0,3 micron, rapporto segnale/rumore (SNR) = minimo di 3.

figure-protocol-1
Figura 1: Colorazione in immunofluorescenza della sezione cutanea. DAPI: etichetta i nuclei, CD90: marcatore di fibroblasti, E-caderina: utilizzato per marcare l'epidermide, VIM: cellule che esprimono VIM, Merge: fusione di DAPI (magenta), CD90 (blu), E-caderina (giallo) e VIM (verde) colorazione. Barre di scala = 100μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Analisi delle immagini utilizzando la macro SCAnED (File supplementare 1, Video supplementare S1 e Video supplementare S2)

  1. Avviare la macro (SCAnED.mp4 filmato).
    1. Apri immagini in immunofluorescenza in Fiji/ImageJ utilizzando i bioformati con le impostazioni predefinite.
      NOTA: Non dividere i canali in questo passaggio.
    2. Scarica ed esegui la macro SCAnED accedendo a Plugin | Macro | Eseguire e selezionare lo script macro SCAnED (file supplementare 1).
    3. Seguire le istruzioni dettagliate sullo schermo fornite dalla macro.
  2. Segmentazione in silico dell'epidermide e del derma utilizzando la macro SCAnED.
    1. Selezionare il canale E-caderina quando richiesto.
    2. Regola manualmente la soglia navigando su Immagine | Regola | Soglia e facendo clic su OK per il canale E-caderina per acquisire completamente la regione epidermica.
    3. Se necessario, confermare il passaggio Riempimento allagamento per chiudere gli spazi vuoti nella maschera E-caderina selezionando l'icona Strumento Riempimento allagamento in ImageJ, facendo clic sulla parte superiore dell'epidermide e facendo clic su OK (Figura supplementare S1A-E e suggerimenti per la risoluzione dei problemi nella sezione di discussione).
    4. Se la maschera è invertita, selezionare Sì e OK quando viene richiesto di invertire la selezione; in caso contrario, selezionare No e OK (vedere la Figura supplementare S1F,G e i suggerimenti per la risoluzione dei problemi nella sezione di discussione).
    5. Selezionare il canale DAPI quando richiesto. Le immagini dei nuclei prima e dopo la segmentazione epidermico-dermica sono mostrate nella Figura 2.
  3. Segmentazione dei nuclei utilizzando la funzione di soglia
    1. Definisci automaticamente i livelli di intensità.
  4. Segmentazione dei nuclei con StarDist
    1. Aprire StarDist in ImageJ (Figura 3).
    2. Caricare il modello di rilevamento dei nuclei (file supplementare 2) nell'interfaccia grafica di StarDist (Figura 4). La coppia di training corrispondente per la creazione del modello StarDist è illustrata nella Figura S2 supplementare.
      NOTA: Tensor Flow versione 1.15 deve essere utilizzato per questo modello se si verifica un errore StarDist (vedere la Figura S3 supplementare).
    3. Fare clic prima sul canale dei nuclei.
    4. Regolare le impostazioni dei riquadri di conseguenza (assicurarsi che il numero di riquadri corrisponda alla dimensione prevista della patch (256 x 256 px) (vedere la Figura 3 e la Figura 4).
      NOTA: La segmentazione StarDist può richiedere del tempo a seconda del numero di nuclei.
  5. Misura dell'intensità e quantificazione delle proteine nucleari
    NOTA: prima di eseguire SCAnED, andare su Analizza | Impostare le misurazioni e configurare i parametri per garantire un output di dati accurato e pertinente (Figura 5).
    1. Quando richiesto, selezionare Sì per misurare l'intensità del marcatore nei nuclei.
    2. Scegliere il canale del marker appropriato (fino a cinque possibili).
    3. Salvare i risultati come file CSV come indicato dalla macro.
    4. Ripetere per ogni canale.
    5. Dopo che tutti i canali sono stati elaborati, salvare i risultati come file CSV come indicato dalla macro.
      NOTA: Per una migliore visualizzazione, abbiamo incluso una vista ingrandita di una specifica regione della pelle per il resto dell'analisi (Figura 6).
  6. Segmentazione cellulare (regione citoplasmatica)
    NOTA: La segmentazione cellulare si basa sull'espansione del ROI nucleare e deve quindi essere avviata dopo la segmentazione dei nuclei.
    1. Quando la funzione di soglia è stata utilizzata per la segmentazione dei nuclei, applicare la dilatazione binaria.
    2. Quando StarDist è stato utilizzato per la segmentazione dei nuclei, utilizzare l'espansione dell'ingrandimento, che ha un tempo di elaborazione più lungo (vedere la Figura S4 supplementare).
  7. Misura dell'intensità e quantificazione delle proteine citoplasmatiche
    1. Selezionare Sì per misurare l'intensità dell'indicatore in celle intere.
    2. Salvare i file CSV dei risultati come indicato dalla macro.
    3. Ripetere l'operazione per ogni canale del marker nell'ordine.
    4. Mantieni lo stesso ordine di canali sia per le misurazioni del nucleo che per quelle delle cellule per mantenere la coerenza dei dati di output.
    5. Scegliere Elimina ogni volta che la macro lo richiede, per evitare di mescolare i dati dei nuclei tra epidermide e derma. La Figura 7 illustra tutti i passaggi della segmentazione basata su soglia.

figure-protocol-2
Figura 2: Analisi e separazione dei nuclei canale-specifici nei nuclei epidermici e dermici. La colorazione in immunofluorescenza di DAPI dimostra la morfologia e la distribuzione spaziale dei nuclei nell'intera pelle (immagine a sinistra). Rappresentazione dei nuclei dei nuclei epidermici colorati con DAPI, fornendo informazioni sulla distribuzione dei nuclei all'interno del compartimento epidermico (immagine centrale). Rappresentazione dei canali dei nuclei dermici colorati con DAPI, che offre la visualizzazione della distribuzione dei nuclei all'interno del compartimento dermico (immagine a destra). Barre di scala = 100μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-protocol-3
Figura 3: Utilizzo dell'opzione "StarDist". Screenshot che evidenzia la posizione dell'opzione "StarDist 2D" all'interno del menu/Plugins/StarDist/StarDist 2D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-protocol-4
Figura 4: Istruzioni per l'uso del modello di rilevamento dei nuclei. Scarica il file "nuclei_detection_model.zip" e fornisci il suo percorso nella sezione Sfoglia . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-protocol-5
Figura 5: Configurazione delle impostazioni di misurazione. (A) Screenshot che evidenzia la posizione dell'opzione Imposta misure all'interno del menu, consentendo la personalizzazione dei parametri di misurazione per l'analisi successiva. (B) Casella Imposta misure che visualizza l'interfaccia per la regolazione delle impostazioni di misurazione, consentendo agli utenti di specificare i parametri per la raccolta e l'analisi dei dati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-protocol-6
Figura 6: Vista ingrandita di una regione specifica. (A) Fusione di colorazione DAPI (magenta) e VIM (verde). (B) Vista ingrandita di una regione specifica da A, fornendo una visualizzazione dettagliata dell'espressione di VIM all'interno del tessuto cutaneo. Si prega di notare la diversa morfologia dei nuclei all'interno dell'epidermide e del derma. Barre di scala = 100 μm (A), 20 μm (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-protocol-7
Figura 7: Segmentazione SCAnED nell'epidermide e nel derma per nuclei e cellule utilizzando la soglia. (A) Immagine intera: unione di colorazione DAPI (magenta) e VIM (verde). Parte superiore: (B) Fusione di nuclei epidermici colorati con DAPI e VIM dopo la separazione. (C) Maschera dei nuclei epidermici utilizzando la soglia. (D) Segmentazione dei nuclei epidermici sovrapposti alla fusione di DAPI e VIM, aiutando nella visualizzazione della distribuzione dei nuclei all'interno del compartimento epidermico. (E) Segmentazione cellulare di nuclei epidermici sovrapposti alla fusione di DAPI e VIM, aiutando nella visualizzazione della distribuzione dei nuclei all'interno del compartimento epidermico utilizzando la soglia e la dilatazione, in quanto mostra che la regione di selezione è più grande dei nuclei. Parte inferiore: (F) Fusione di nuclei dermici colorati con DAPI e VIM dopo la separazione. (G) Maschera dei nuclei dermici utilizzando la soglia. (H) Segmentazione dei nuclei dermici sovrapposti alla fusione di DAPI e VIM, aiutando nella visualizzazione della distribuzione dei nuclei all'interno del compartimento dermico. (I) Segmentazione cellulare di nuclei dermici sovrapposti alla fusione di DAPI e VIM, aiutando nella visualizzazione della distribuzione dei nuclei all'interno del compartimento dermico. Barre di scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Classificazione e visualizzazione dei dati estratti a singola cella (Video Supplementare S3)

NOTA: Ogni marcatore di immunofluorescenza genera due file CSV: uno per il compartimento epidermico e uno per il compartimento dermico.

  1. Stabilire soglie di intensità specifiche per il marcatore utilizzando campioni di controllo dell'isotipo.
    1. Importa i file di output CSV generati dalla macro SCAnED in Google Colab utilizzando il Jupyter Notebook fornito. Per prima cosa, scarica il Jupyter Notebook appropriato (ad esempio, Supplemental File 3 o Supplemental File 4), vai su Google Colab (https://colab.research.google.com/), fai clic su File, apri il notebook, seleziona il file, esegui le celle di codice una per una. Quando viene richiesto Scegli file, fare clic sul pulsante e caricare il file .csv.
    2. Per ogni anticorpo, calcolare l'intensità media della fluorescenza dai controlli isotipici. Per determinare il cut-off per ogni anticorpo, aprire il notebook DotPlot (File supplementare 4), caricare il file di controllo dell'isotipo corrispondente ed eseguire il codice.
    3. In base alla distribuzione dei punti nel controllo isotipografico e ai grafici anticorpali specifici, scegliere una soglia di intensità appropriata per separare il fondo (controllo isotipico) dal segnale (colorazione specifica). Utilizzare questi valori come valori limite per classificare le singole celle come positive o negative per l'espressione del marcatore.
  2. Confrontare le intensità dei marcatori nei campioni sperimentali con le soglie calcolate.
    1. Classificare le celle con intensità ≥ soglia come positive.
    2. Classificare le cellule con intensità < soglia come negative.
    3. Classificare le sottopopolazioni in base a combinazioni di espressioni di marcatori, ad esempio, identificare popolazioni cellulari singole-positive, doppie positive o triple-positive.
  3. Visualizza la distribuzione e le relazioni dell'espressione dei marcatori utilizzando due tipi di grafici:
    1. Crea istogrammi e sovrapponi istogrammi per confrontare la distribuzione dell'intensità tra le condizioni (ad esempio, controllo e pelle malata) eseguendo il codice dell'istogramma (scarica il file supplementare 3, vai su Google Colab (https://colab.research.google.com/), fai clic su File, apri il taccuino, seleziona il file, esegui il codice) (Figura 8).
    2. Crea grafici a punti per simulare grafici a dispersione in stile citometria a flusso per valutare i modelli di co-espressione eseguendo il codice DotPlot (scarica il file supplementare 4, vai su Google Colab (https://colab.research.google.com/), fai clic su File, apri il notebook, seleziona il file, esegui il codice) (Figura 9).
    3. Esportazione dei dati elaborati per ulteriori analisi e valutazione di differenze significative utilizzando test statistici.

figure-protocol-8
Figura 8: Istogramma sovrapposto che confronta l'intensità media delle cellule VIM-positive. Sovrapposizione dell'istogramma che confronta l'intensità media delle cellule VIM in campioni sani (H) in blu e campioni di psoriasi (P) in arancione all'interno del derma. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-protocol-9
Figura 9: Doppi segnali positivi su un dot plot. Una dimostrazione del dot plot a doppia colorazione che può aiutare a migliorare la visualizzazione di popolazioni single-positive, double-positive e double-negative. Questo esempio mostra la doppia colorazione di CD90 e VIM nel derma di (A) pelle sana e (B) psoriasica, e nell'epidermide di (C) campioni di pelle sana e (D) psoriasica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Risultati

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In uno studio precedente, abbiamo utilizzato con successo SCAnED per rilevare e quantificare le cellule e i livelli di espressione della lisil ossidasi (LOX), una proteina citoplasmatica, e del fattore di trascrizione ipossia-inducibile fattore 1 (HIF-1) nelle cellule all'interno del derma della pelle umana12 , evidenziando l'applicabilità di questo strumento per la ricerca sulla pelle.

Per valutare ulteriormente la precisione della nostra macro segmentazione cutanea ne...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo SCAnED è un metodo semi-automatico per l'analisi compartimentale specifica di cellule immunitarie e non immunitarie nel tessuto cutaneo umano. Il flusso di lavoro integra un protocollo di colorazione basato su E-caderina per consentire la segmentazione dell'epidermide e del derma, il rilevamento di nuclei e cellule basati su DAPI, seguito dalla quantificazione dell'espressione dei marcatori nei nuclei e nelle cellule utilizzando la nostra macro basata su ImageJ. Inoltre, gu...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lo sviluppo di questa pipeline di analisi delle immagini è stato finanziato dal Land Niederösterreich nell'ambito del Danube Allergy Research Cluster e dal Fellinger Krebsforschung.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,3% Triton X Sigma-AldrichT9284
BSA (albumina sierica bovina)Sigma Aldrich
CD90Segnalazione cellulareD3V8A
DAPI Roche10236276001
Acqua deionizzata
E-cadherina Abcamab1416
Mezzo di montaggio a fluorescenza  DakoS3023
Anticorpo secondario anti-topo IgG1 adsorbito incrociato per capra, Alexa Fluor 488  (AF 488 anti-topo)Thermo Fisher ScientificA-21121
Anticorpo secondario anti-topo IgG2a adsorbito incrociato per capra, Alexa Fluor 647 (AF 647 anti-mouse)Thermo Fisher ScientificA-21241
Anticorpo secondario anti-coniglio IgG (H+L) adsorbito incrociato per capra, Alexa Fluor 568 (AF 568 anti-coniglio)Thermo Fisher ScientificA-11011
Siero per capra Agilent Technologies & Ouml; sterreich GmbH, DakoX0907
PBS Gibco14190-094
Vimentin DakoM7020
Materiali
Camera box (scatola umida)
Copertine & nbsp;Thermo Fisher
Penna a scorrimento repellente per colorazioni (idrofobica) & nbsp;Daido SangyoZ37782124x50mm
Soluzioni
Buffer di permeabilizzazione (0,3% Triton X in PBS) Consulta la Tabella 2
Tampone di colorazione (2% BSA in PBS) & nbsp;Consulta la Tabella 2
Software e Dataset
Microscopio a scansione laser confocale  OlimpoFV3000 basato su IX83 invertitaequipaggiata con un obiettivo 10x (NA 0,4), 4 linee laser (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm, coerente)
Fiji (ImageJ) V1.54h
Google ColabGoogle
GraphPad Prism GraphPad Software Inc.Prisma 10per ulteriori analisi statistiche
ALONEIndica Labs
Programma PythonPython 3.11.12
QuPathsoftware aperto (Bankhead, P. et al., https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5)v0.5.1
StarDistInstalla la versione CPU di TF1.15.0

Riferimenti

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