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Articolo metodologico

Preparazione di diffusioni cromosomiche meiotiche da ovociti di topo per la valutazione della sinapsi e della ricombinazione

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DOI:

10.3791/68749

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18 luglio 2025

1Department of Biomedical Sciences, Cornell University, 2Cornell Reproductive Sciences Center, Cornell University

In questo articolo

Sommario

Gli errori meiotici nelle sinapsi e nella ricombinazione sono comuni agli ovociti dei mammiferi. Un'analisi rigorosa delle proteine coinvolte in questi processi è essenziale per capire come e perché l'oogenesi spesso va male. Le tecniche qui presentate consentono un monitoraggio completo della ricombinazione e delle sinapsi per valutare la qualità degli ovociti nei topi.

Abstract

Tre processi critici e interdipendenti definiscono la profase I meiotica: i cromosomi omologhi devono accoppiarsi insieme, una struttura proteica chiamata complesso sinaptonemale forma per legare insieme gli omologhi (sinapsi) e gli omologhi subiscono ricombinazione, scambiando reciprocamente materiale genetico per formare crossover (CO). Errori in questi processi possono portare a insufficienza ovarica prematura, aneuploidia e, infine, perdita della gravidanza e infertilità. La ricombinazione meiotica è particolarmente soggetta a errori negli ovociti, con oltre il 7% degli ovociti umani che contengono almeno una coppia di cromosomi senza crossover e tra il 20% e l'80% degli ovuli contro il 2,5%-7% degli spermatozoi sono aneuploidi. Tuttavia, non è chiaro il motivo per cui gli errori cromosomici mostrino disparità di sesso così evidenti. Il presente protocollo descrive i metodi per la preparazione e l'analisi delle profasi I e dei cromosomi della metafase I degli ovociti rispettivamente da topi fetali e giovani. Per tracciare la dinamica cromosomica critica durante la profase I meiotica, questo protocollo impiega la colorazione in immunofluorescenza di marcatori comuni per la ricombinazione meiotica (RAD51 per le rotture a doppio filamento, MSH4 per gli intermedi CO e MLH1/MLH3 per identificare la maggior parte dei CO) e la sinapsi (SYCP3 per gli assi cromosomici, SYCP1 per le regioni sinapsi e HORMAD1 per le regioni asinapsiche). Inoltre, questo protocollo utilizza la maturazione in vitro degli ovociti raccolti per valutare il numero di cromosomi accoppiati (bivalenti) e il numero totale di crossover (chiasmi) nella metafase I. Insieme, queste tecniche forniscono un quadro completo e quantitativo per esaminare i meccanismi che regolano le dinamiche cromosomiche precoci nella meiosi femminile.

Introduzione

La meiosi è una divisione cellulare specializzata essenziale per la produzione di gameti aploidi. Durante la profase I, i cromosomi omologhi (ciascuno costituito da cromatidi fratelli tenuti insieme dalla coesina) devono svolgere tre compiti critici: 1) riconoscersi e accoppiarsi tra loro, 2) comprimersi formando il complesso sinaptonemale (SC) tra i loro assi laterali e 3) scambiare DNA tramite ricombinazione omologa, con conseguente crossover (CO) tra cromatidi non fratelli 1,2. La connessione fisica risultante dalla formazione di crossover, mantenuta dalla coesina, garantisce il corretto biorientamento e segregazione cromosomica durante la metafase I 3,4,5.

La profase meiotica I comprende cinque stadi, ciascuno definito dallo stato della sinapsi6. Nel leptonema (in greco "filo sottile"), i cromosomi si condensano quando l'elemento assiale (contrassegnato da SYCP3) si forma lungo gli assi dei cromosomi. Durante lo zigonoma (fili uniti), gli omologhi iniziano a sinapsi quando l'elemento trasversale del SC (SYCP1) si forma tra gli assi7. Nel pachinema (filo spesso), i cromosomi sono sinapsi per tutta la loro lunghezza. La SC si disassembla quindi durante il diplonema (due fili), lasciando gli omologhi collegati solo nei siti di crossover (chiasmata). I chiasmi sono il prodotto della ricombinazione omologa, un processo avviato con l'induzione programmata di rotture del doppio filamento di DNA (DSB). Da centinaia di DSB, solo ~10% diventa CO. Nei topi, la maggior parte (90%-95%) si forma attraverso la via CO di classe I facilitata da MutLγ (MLH1-MLH3), mentre i restanti CO prodotti da MUS81-EME1 attraverso la via CO di classe II 8,9,10,11.

L'appaiamento, la sinapsi e la ricombinazione sono processi altamente regolati e interdipendenti. Gli errori in genere innescano meccanismi di checkpoint, portando alla morte cellulare. Nelle femmine, la perdita di cellule germinali da errori precoci della profase I può causare insufficienza ovarica prematura12,13, mentre errori tardivi (ad esempio, omologhi che non riescono a formare CO, posizionamento errato di CO o perdita prematura di coesina) possono portare a mancata segregazione cromosomica e aneuploidia. Nell'uomo, gli errori meiotici sono una delle principali cause di aborto e infertilità. La meiosi femminile è particolarmente soggetta a errori. Circa il 20%-80% degli ovuli umani (contro il 2,5%-7% degli spermatozoi) ha un numero di cromosomi anormale, la maggior parte derivante da errori nella prima divisione meiotica 14,15,16,17. Sebbene l'età sia stata identificata come la principale causa di aneuploidia materna, il motivo per cui gli ovociti sono così suscettibili agli errori rimane poco chiaro.

Nonostante l'importanza di comprendere i fattori alla base degli alti tassi di errore negli ovociti, la maggior parte delle nostre conoscenze sulla regolazione degli eventi di profase I proviene da studi sulla meiosi maschile. Poiché un piccolo frammento di materiale testicolare adulto fornisce materiale sufficiente per valutare tutti gli stadi delle cellule germinali meiotiche e post-meiotiche, la meiosi maschile è stata a lungo più facilmente accessibile ai ricercatori. Al contrario, la meiosi femminile si verifica in modo discontinuo. Nei topi, la profase I progredisce in modo semi-sincrono nell'ovaio fetale, a partire da circa 14 giorni dopo il coito (dpc; Figura 1A), poco dopo la determinazione del sesso gonadico 18,19,20. Intorno al momento della nascita, gli ovociti entrano in arresto dittato fino a mesi di ovulazione (nei topi) o decenni (nell'uomo) dopo 21,22,23. Di conseguenza, gli stadi specifici della profase I sono accessibili solo durante finestre di sviluppo limitate (Figura 1A), con eventi post-profase I che si verificano solo in pochi ovociti alla volta nel giovane e nell'adulto. Sebbene i progressi tecnici abbiano migliorato gli studi sulla meiosi degli ovociti dei mammiferi, questi metodi rimangono impegnativi e richiedono molto tempo rispetto alle tecniche comparabili utilizzate negli studi maschili.

L'analisi meiotica femminile è ulteriormente complicata dalla limitazione della sottostadiazione degli ovociti pachitenici, fondamentale per lo studio della designazione e della maturazione del crossover. Gli studi maschili beneficiano di dinamiche di appaiamento dei cromosomi sessuali ben caratterizzate e della presenza della variante istonica, H1t, che funge da marcatori per il pachinema precoce, medio e tardivo 24,25,26. Tuttavia, non è stato formalizzato alcun metodo affidabile per la sub-stadiazione degli ovociti di pachitene.

I protocolli qui presentati facilitano un'analisi completa della sinapsi e della ricombinazione negli ovociti di topo dalla profase I iniziale fino alla metafase I. Questo lavoro si basa sulle tecniche classiche di diffusione cromosomica sviluppate da Peters et al.27 e Tarkowski28 e su precedenti perfezionamenti di tali metodi da parte di Hunt29 e Sun e Cohen30. Questo protocollo è stato sviluppato per enfatizzare: 1) l'arricchimento e l'identificazione di specifici sottostadi della profase I, 2) la massimizzazione del numero di applicazioni eseguite per coppia di ovaie fetali e 3) metriche approfondite e accessibili per la valutazione dei difetti di sinapsi e la ricombinazione da focolai a chiasmi.

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Protocollo

Tutte le procedure e le procedure di gestione degli animali sono state eseguite dopo l'approvazione del Cornell Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ai sensi del protocollo 2004-0063.

1. Preparazione del vetrino di diffusione del cromosoma Profase I dell'ovocita

  1. Nel tardo pomeriggio, sono stati organizzati accoppiamenti a tempo di topi femmine C57BL/6J (2-6 mesi) con maschi (2-12 mesi). A partire dal giorno successivo, controlla le femmine ogni mattina (prima delle 9) per un tappo copulatorio. Il mezzogiorno del giorno della presa è definito come 0,5 dpc.
  2. Prepara quanto segue prima di sacrificare i topi gravidi.
    1. Allestire una camera umidificata a temperatura ambiente H2O.
    2. Preparare 10 mL di tampone di estrazione ipotonico (HEB; vedere Tabella 1) composto da 30 mM di Tris-HCl, 50 mM di saccarosio, 17 mM di citrato di sodio, 5 mM di EDTA, 2,5 mM di DTT e 0,5 mM di PMSF in acqua Milli-Q. Prima di aggiungere DTT e PMSF, regolare il pH a 8,2 - 8,4 utilizzando 50 mM di acido borico. Prepara HEB fresco e usalo entro 2 ore dall'aggiunta di DTT.
    3. Preparare 100 mM di saccarosio aggiungendo 342 mg di saccarosio a 10 mL di H2O ultrapuro. Conservare a 4 °C quando non in uso.
    4. Preriscaldare l'H2O ultrapuro in un forno a microonde standard per 1 minuto (fino a 90 - 95 °C). Sotto una cappa aspirante, aggiungere l'H2O ultrapuro riscaldato a 0,5 g di Paraformaldeide (PFA). Aggiungere due gocce di NaOH 1 N, vortice per mescolare e lasciare raffreddare a temperatura ambiente. Regolare il pH a 9,2 - 9,3 utilizzando 50 mM di acido borico e aggiungere Triton X-100 allo 0,15% (v/v). Aggiungere H2O ultrapuro a un volume finale di 50 mL (soluzione fissativa PFA all'1%) e versare il fissativo in un barattolo di colorazione Coplin in vetro da 50 mL.
      NOTA: Questo protocollo è stato ottimizzato utilizzando acqua quasi bollente per preparare il PFA; tuttavia, il riscaldamento del PFA in soluzione a temperatura superiore a 65 °C può causare la degradazione e il rilascio di fumi tossici. In alternativa, preriscaldare l'H2Ø ultrapuro a 60 °C a bagnomaria.
    5. Pulire i vetrini del microscopio con etanolo al 70%. Utilizzare una penna PAP a barriera idrofobica per disegnare fino a tre quadrati (circa 20 x 20 mm; vedere la Figura 1E). Un singolo paio di ovaie fornirà materiale sufficiente per sei quadrati (o due vetrini da 3 quadrati, ciascuno).
  3. Sacrificare topi gravidi 14,5 - 18,5 dpc mediante asfissia da CO2 e lussazione cervicale secondo le linee guida IACUC.
    1. I punti temporali per l'arricchimento di specifici stadi della profase I nei topi C57BL/6J sono delineati nella Figura 1A. Per i punti temporali di sviluppo dati, la percentuale approssimativa di ovociti in ogni stadio della profase I è stata fornita utilizzando i dati di Evans et al. (1982)31. Per gli ovociti zigotenici, raccogliere su 16,5 dpc; pachitene precoce su 17,5 dpc; e medio pachitene - diplotene a 18,5 dpc.
  4. Usa le forbici da dissezione per aprire la cavità addominale e rimuovere le corna uterine.
  5. Sezionare i topi fetali dal corno uterino, dal tessuto deciduale e dal sacco vitellino. Mettere i topi fetali in una piastra di Petri da 100 mm con 1x tampone fosfato salino (PBS).
  6. Seziona le ovaie di un feto femmina alla volta mantenendo il resto in 1x PBS. Sacrificare i topi fetali mediante decapitazione secondo le linee guida IACUC. Utilizzando perni per campioni in acciaio inossidabile, fissare la superficie ventrale del busto fino a un cuscinetto di silicone in un piatto di dissezione.
  7. Usa le forbici da microdissezione per praticare un'incisione addominale appena sotto l'ombelico, facendo attenzione a non intaccare le arterie. Usa una pinza sottile per spostare l'intestino fino a quando le corna uterine fetali sono visibili.
  8. Per localizzare le ovaie, seguire ogni corno uterino verso l'esterno dalla vescica verso il rene. L'ovaio e l'ovidotto appariranno come piccole strutture globulari ai terminali delle corna uterine, situate appena sotto il rene e vicino alla parte posteriore della cavità peritoneale (Figura 1B).
  9. Usa una pinza fine per pizzicare le ovaie e raccoglierle in un piccolo vetro da orologio riempito con 750 μL di 1x PBS.
  10. Sezionare l'ovaio dai tessuti circostanti e mettere entrambe le ovaie in un vetro dell'orologio contenente 750 μl di HEB, facendo attenzione a garantire che le ovaie siano completamente sommerse (vedere la Figura 1C e 1D). Incubare le ovaie per 15 minuti a temperatura ambiente.
  11. Pipettare 35 μl di saccarosio da 100 mM su un vetrino concavità. Usa una pinza fine per trasferire entrambe le ovaie dall'HEB al saccarosio.
  12. Utilizzare un ago da 25 G per fissare un'ovaia al vetrino mentre si utilizza un secondo ago, smussato verso il basso, per espellere gli ovociti dall'ovaio.
    1. Quando l'ovaio diventa trasparente e gelatinoso, rimuovere l'ovaio dall'HEB e ripetere il processo con la seconda ovaia. Pipettare delicatamente la soluzione per disperdere le cellule.
  13. Immergere il vetrino nel barattolo di colorazione Coplin di PFA e tamponare brevemente il bordo del vetrino contro un tovagliolo di carta. Una volta che il PFA è stato raccolto in piccole gocce lungo il bordo idrofobico di ciascun quadrato (Figura 1E), pipettare 5 μL della soluzione di ovocita-saccarosio in ciascuna goccia di PFA.
  14. Distribuire gli ovociti sulle sezioni quadrate inclinando delicatamente i vetrini avanti e indietro. Fai attenzione a non permettere che la soluzione di un quadrato si riversi nei quadrati adiacenti.
  15. Posizionare il vetrino in una camera umida e continuare a fare i vetrini fino all'esaurimento della soluzione di ovociti e saccarosio.
  16. Ripetere i passaggi 1.6 - 1.15 fino a quando tutti i feti femminili sono stati utilizzati. Incubare i vetrini in una camera umida a temperatura ambiente per 2 ore.
  17. Dopo l'incubazione, aprire la camera umida. Poiché la maggior parte (se non tutto) del liquido/fissativo dovrebbe essere ancora presente sulla superficie del vetrino (circa 10 μl in ogni sezione quadrata), trasferire delicatamente i vetrini su un tovagliolo di carta e lasciare che i vetrini si asciughino completamente all'aria a temperatura ambiente su un banco da laboratorio (questo processo richiede in genere 30-60 minuti, a seconda dell'umidità locale).
    NOTA: I vetrini possono anche essere asciugati all'aria sotto una cappa aspirante per mitigare la potenziale esposizione ai fumi residui di PFA. Questo ridurrà anche l'asciugatura a circa 20 - 30 minuti.
  18. Lavare i vetrini in umettante allo 0,4% in ultrapuro H2O per 2 min. Lasciare asciugare completamente i vetrini.
    NOTA: A questo punto, i vetrini possono essere conservati a -80 °C; tuttavia, alcuni epitopi sono instabili (ad esempio, nella nostra esperienza, MLH1 colora male e la colorazione SYCP3 ha artefatti significativi dopo il congelamento). Si consiglia vivamente di immunocolorare immediatamente i vetrini.

2. Colorazione in immunofluorescenza delle diffuse del cromosoma della profase I

  1. Preparare 10 tamponi di diluizione anticorpale (ADB; vedere Tabella 2) contenenti il 10% (v/v) di siero di capra normale, il 3% (p/v) di albumina sierica bovina (BSA) e lo 0,05% di Triton X-100 in 1x PBS. Filtro: sterilizzare con un filtro da 0,45 μm e conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
  2. Lavare i vetrini in un barattolo di colorazione Coplin con 0,4% di agente umettante in 1x PBS per 10 minuti. Lavare i vetrini in un barattolo di colorazione Coplin di Triton X-100 allo 0,1% in 1x PBS per 10 minuti. Bloccare i vetrini in un barattolo di colorazione Coplin da 1x ADB per 10 minuti.
  3. Diluire gli anticorpi primari selezionati in 10x ADB (vedere la tabella dei materiali per l'elenco degli anticorpi e le rispettive diluizioni).
    1. Preparare quattro combinazioni di anticorpi per l'immunocolorazione multiplex: (1) SYCP332,33, SYCP133 HORMAD133; (2) SYCP332,33, RAD5132,33, MLH332; (3) SYCP332,33, MSH432, MLH332; e (4) SYCP334, MLH1 32,33,34, CREST 35.
  4. Rimuovere i vetrini dall'ADB, picchiettare il liquido in eccesso e posizionare i vetrini in una camera umidificata con acqua a temperatura ambiente. Applicare 30 μl di anticorpi diluiti per sezione quadrata di ciascun vetrino, facendo attenzione che gli anticorpi di un quadrato non si riversino nei quadrati adiacenti.
  5. Chiudere la camera umidificata e lasciare incubare i vetrini per una notte a temperatura ambiente.
  6. La mattina successiva, aprire la camera umida e prelevare gli anticorpi diluiti dai vetrini. Ripetere il passaggio 2.2.
  7. Diluire gli anticorpi secondari selezionati in 10x ADB (vedere la Tabella dei materiali).
    NOTA: Da questo momento in poi, i vetrini e gli anticorpi sono fotosensibili. Completa tutte le successive incubazioni al buio.
  8. Rimuovere i vetrini dall'ADB, picchiettare il liquido in eccesso e posizionare i vetrini in una camera umidificata di acqua a temperatura ambiente. Applicare 30 μl di anticorpi diluiti selezionati per sezione quadrata di ciascun vetrino, facendo attenzione che gli anticorpi di un quadrato non si riversino nei quadrati adiacenti.
  9. Chiudere la camera umidificata e lasciare incubare i vetrini per 2 ore a temperatura ambiente.
  10. Lavare i vetrini 3 volte per 5 minuti ciascuno in barattoli di colorazione Coplin di agente umettante allo 0,4% in 1x PBS. Lavare i vetrini per 5 minuti in un barattolo colorante Coplin di agente umettante allo 0,4% in H2O ultrapuro.
  11. Applicare una piccola goccia (circa 10 μL) di terreno di montaggio antisbiadimento con 4', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) o colorante di acido nucleico equivalente. Posizionare un vetrino coprioggetti in vetro n. 1,5 da 60 mm x 24 mm su ciascun vetrino e tamponare accuratamente il liquido in eccesso.
    NOTA: I vetrini possono essere sigillati con smalto trasparente o cemento di gomma. Se si utilizza un montante polimerizzante, non è necessario sigillare i vetrini. I vetrini devono essere conservati in una scatola o in una cartella a 4 °C. Sebbene sia buona norma visualizzare i vetrini poco dopo la colorazione, secondo la nostra esperienza i vetrini conservati al buio a 4 °C possono mantenere la loro intensità del segnale per diversi mesi o un anno. Per una conservazione a lungo termine, i vetrini possono essere conservati a -20 °C per diversi anni senza una perdita significativa della qualità del segnale.
  12. Immagine di celle a 63x utilizzando la microscopia a epifluorescenza (vedi Tabella dei materiali). Utilizzare il software di analisi delle immagini (ad esempio, Zen di ImageJ, vedere la tabella dei materiali) per misurare la lunghezza SC e l'intensità della fluorescenza di tutti i canali lungo l'asse. Tracciare la lunghezza di ciascun asse cromosomico (SYCP3), a partire dal centromero (regione densa CREST o DAPI).
    1. Per l'analisi di HORMAD1 e SYCP1, registrare le lunghezze dei picchi del segnale di fluorescenza. Calcola le lunghezze totali dei picchi di HORMAD1 o SYCP1 e dividile per la lunghezza dell'asse cromosomico.
    2. Per l'analisi di MSH4, quantificare il numero di picchi del segnale di fluorescenza per ciascuna misurazione di SYCP3. Registra sia il numero totale di picchi di MSH4 per nucleo che il numero di picchi di MSH4 che si sovrappongono ai picchi di MLH3. Confermare i conteggi di MSH4 confrontando i picchi con il conteggio dei focolai corrispondenti.

3. Preparazioni di diacinesi/prometafase per l'osservazione dei chiasmi

  1. Per massimizzare la resa di ovociti meioticamente competenti, utilizzare topi femmina giovani (25 - 28 giorni di età).
    NOTA: Per aumentare la resa, può essere eseguita la stimolazione mediante iniezione intraperitoneale di topi femmina con 5 UI di gonadotropina sierica di cavalla gravida (PMSG) 48 ore prima della raccolta degli ovociti. Tuttavia, ai fini delle analisi dei chiasmi, è possibile raccogliere un numero sufficiente di ovociti della vescicola germinale (GV) da femmine non stimolate.
  2. Prima di sacrificare i topi, prepara i seguenti reagenti e soluzioni.
    1. Lasciare equilibrare M2 (3 mL per topo) e KSOM (1 mL per topo) in un incubatore per colture cellulari (37 °C, 5 % CO2) per almeno 1 ora.
      NOTA: Le provette di aliquote di terreno congelate possono essere messe nell'incubatrice con i coperchi allentati la sera prima del prelievo degli ovociti, consentendo circa 14 ore di equilibrio.
    2. Preparare il terreno M2 con 2,5 μM di milrinone (un inibitore dell'isoenzima fosfodiesterasi che impedisce la ripresa meiotica)36. Pipettare cinque gocce da 20 μl di M2 + milrinone in una piastra di Petri da 35 mm e sovrapporle con olio minerale leggero (Figura 2C).
    3. Pipettare cinque gocce di KSOM da 20 μl in una piastra di Petri da 35 mm e sovrapporle con olio minerale leggero (Figura 2C).
      ATTENZIONE: Il controllo della temperatura e del pH è fondamentale per la maturazione degli ovociti in vitro. La raccolta degli ovociti deve essere effettuata su un banco riscaldato (37 °C). Tutti i terreni devono essere conservati nell'incubatrice fino a quando non vengono utilizzati e i piatti di terreno devono essere rimossi uno alla volta per limitare le interruzioni causate dall'esposizione all'aria ambiente.
    4. Pulire i vetrini del microscopio con etanolo al 70% e lasciarli asciugare all'aria. Sul retro dei vetrini da microscopio, incidere leggermente (con una penna a punta di diamante) o disegnare (con un inchiostro resistente all'acqua) una griglia 5 x 5 di quadrati di ~ 4 mm x 4 mm (un esempio è mostrato nella Figura 2B e può essere utilizzato per tracciare la griglia).
  3. Raccogli gli ovociti da un topo alla volta. Sacrificare una femmina di topo mediante asfissia da CO2 e lussazione cervicale secondo le linee guida IACUC.
  4. Usa le forbici da dissezione per aprire la cavità addominale. Usa una pinza fine per spostare l'intestino.
  5. Segui ogni corno uterino dalla vescica verso il rene. Le ovaie e gli ovidotti saranno associati a un piccolo cuscinetto adiposo vicino al rene.
  6. Utilizzare le forbici da microdissezione per rimuovere le ovaie e posizionarle in un terreno M2 gassato con milrinone.
  7. Usa le forbici da microdissezione per rimuovere tutto il grasso e altri tessuti (compresa la borsa) dalle ovaie. Usa aghi da 25G per rompere i follicoli antrali.
  8. Utilizzare una pipetta di trasferimento per distribuire gli ovociti in M2 + milrinone in uno strato sottile in una piastra di Petri da 100 mm, facendo attenzione a non lasciare che il terreno tocchi le pareti della piastra (Figura 2C).
  9. Utilizzare un microscopio da dissezione (ingrandimento 25x - 50x) per visualizzare gli ovociti GV (Figura 2F). Gli ovociti GV possono essere associati alle cellule del cumulo in un complesso cumulo-ovocita (COC). Rimuovere le cellule del cumulo con pipettaggio ripetuto.
  10. Raccogliere gli ovociti GV utilizzando una pipetta di vetro azionata a bocca (diametro 100 - 150 μm; Figura 2A). Trasferire gli ovociti di GV in una goccia da 20 μl di M2 + milrinone sovrapposta a olio minerale leggero (Figura 2C). Non mettere più di 30 ovociti in una singola goccia.
  11. Quando tutti gli ovociti di GV sono stati raccolti, passarli attraverso due o tre gocce da 20 μL di M2 + milrinone sovrapposte a olio minerale leggero per rimuovere eventuali cellule somatiche.
  12. Trasferire gli ovociti di GV (con il minor numero possibile di terreni) in una goccia da 30 μl di KSOM. Lavare via il milrinone facendo passare gli ovociti attraverso cinque gocce di KSOM (Figura 2C).
  13. Trasferire tutti gli ovociti di GV in gocce da 20 μl di KSOM sovrapposte a olio minerale leggero, per un massimo di 30 ovociti per goccia di KSOM (Figura 2C). Porre gli ovociti in un incubatore per colture cellulari (37 °C, 5 % CO2).
  14. Incubare gli ovociti per circa 5 ore.
    NOTA: Rottura GV (che segna la scomparsa dell'involucro nucleare e la ripresa meiotica; Figura 2G) In genere si verifica dopo 2 ore di coltura, ma il tasso di maturazione degli ovociti può variare a seconda del ceppo del topo o della stimolazione ormonale. Nella nostra esperienza, un totale di 5 ore di coltura ottimizza al meglio la diffusione dei chiasmi nella maggior parte dei ceppi di topi. Se lasciato maturare troppo a lungo, può verificarsi la prima divisione meiotica e l'estrusione del corpo polare (Figura 2H).
  15. Trasferire 5 - 10 ovociti (con la minor quantità possibile di KSOM) in una goccia da 30 μl di soluzione ipotonica (citrato di sodio allo 0,9% in H2O ultrapuro). Incubare gli ovociti nella soluzione ipotonica per 5 - 10 minuti.
  16. Pipettare una piccola goccia (~ 1 μL) di acqua acidificata (8 gocce di acido acetico glaciale in 50 mL di H2O ultrapuro) su uno dei quadrati dei vetrini preparati (Figura 2B).
  17. Utilizzare una pipetta di vetro a bocca aperta di 100 - 150 μm di diametro per trasferire rapidamente un ovocita dalla goccia d'acqua acidificata. Trasferire la minor quantità possibile di soluzione ipotonica con l'ovocita. Utilizzare la stessa pipetta per rimuovere parte del liquido fino a quando l'ovocita non si attacca al vetrino.
    NOTA: Il volume di liquido intorno all'ovocita è fondamentale. Dovrebbe esserci abbastanza liquido da non far asciugare l'ovocita prima della fissazione, ma non così tanto da non far aderire l'ovocita al vetrino.
  18. Passa rapidamente a un puntale per pipetta in vetro da 150 μm di diametro. Aggiungere una goccia di fissativo di Carnoy fresco (tre parti di metanolo assoluto e una parte di acido acetico glaciale) all'ovocita. Lasciare che il fissativo si disperda sul vetrino. L'ovocita dovrebbe sembrare meno distinto e sciogliersi quando l'acido del fissativo dissolve la zona pellucida e le cellule scoppiano.
  19. Quando la parte anteriore del fissativo inizia a contrarsi, aggiungere rapidamente altre 2 - 3 gocce di fissativo. Soffiare delicatamente sul vetrino per accelerare l'asciugatura.
  20. Ripetere i passaggi 3.16 - 3.19 con altri ovociti dalla soluzione ipotonica.
  21. Ripetere i passaggi 3.15 - 3.20 fino a quando tutti gli ovociti sono stati fissati. Controllare la diffusione dei cromosomi utilizzando un microscopio a contrasto di fase.
  22. Quando il vetrino si è completamente asciugato all'aria, metterlo in un barattolo di colorazione Coplin con 50 ml di Giemsa al 4% (v/v) in ddH2O. Vetrini colorati in Giemsa per 6 minuti a temperatura ambiente.
  23. Lavare i vetrini 3 volte per 3 minuti ciascuno in ddH2O a temperatura ambiente. Lasciare asciugare completamente i vetrini.
  24. Applicare uno strato sottile (~60 μL) di Permount su un vetrino in vetro n. 1,5 da 60 mm x 24 mm. Montare i vetrini capovolgendoli sui vetrini coprioggetti e tamponando accuratamente il liquido in eccesso. Lasciare asciugare i vetrini durante la notte prima di acquisire immagini a 63x in campo chiaro.

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Risultati

Valutazione dei difetti sinaptici, in cellule pachitene-simili
Questo esperimento valuta i difetti delle sinapsi negli ovociti di pachitene e monitora la progressione della profase I (Figura 3A). L'immunocolorazione per SYCP3 (elementi SC assiali/laterali), SYCP1 (elemento SC centrale) e HORMAD1 (assi cromosomici non sinapsed/desinapsiati) consente la stadiazione e la valutazione delle sinapsi. HORMAD1 col...

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Discussione

Gli ovociti dei mammiferi sono particolarmente soggetti a errori rispetto agli spermatociti. Mentre il checkpoint di assemblaggio del fuso (SAC) meno efficiente dell'ovocita contribuisce a questa vulnerabilità 14,52,53, Hassold e Hunt propongono che i colpi multipli portino ad aneuploidia, con la ricombinazione difettosa che è un fattore primario 54. Gli studi sull'uomo c...

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Dichiarazioni

L'autore non ha conflitti da rivelare.

Ringraziamenti

Il finanziamento per questo progetto è stato fornito da un premio K99 dell'Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Development (HD112986 to TH).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,45 μ Filtro a siringa mMillipore SigmaSLHAR33SBper la produzione di pipette a bocca
0,5 M EDTA, pH 8,0Corning46-034-CI per HEB
Siringa sterile da 1 mL con ago calibro 25, 16 mmFisher Scientific14-817-125 per la rottura delle ovaie
Piastra di Petri 100 x 15 mmVWR25384-302 
Pipete Pasteur in vetro borosilicato usa e getta da 14,6 cmFisher Scientific13-678-20B per la produzione di pipette a bocca
Piastra di Petri da 35 x 10 mmCorning351008
Perni in acciaio inox #3 da 40 mm x 0,45 mm per entomologiaAmazonB0CSSPW5S7per bloccare topi fetali per la dissezione
Acido acetico, glacialeFisher ScientificA38-212per il fissativo di Carnoy
Assemblaggi di tubi aspiratori per pipette microcapillari calibrateMillipore SigmaA5177-5EAper la produzione di pipette a bocca
B.P.I. Watch GlassNDS Technologies 1580-00In alternativa, si può utilizzare un piatto embrionale di 30 mm di diametro x 12 mm di profondità (Electron Microscopy Sciences SKU: 70543-30)
Acido boricoFisher ScientificBP168-1per regolare il pH di HEB, PFA
Albumina Sirica BovinaMillipore SigmaA7906-100Gper ADB
Serbatoio di CO2per incubatore
Vetri del microscopio di CorningMillipore SigmaCLS294875X25L x L 75 mm x 25 mm, scrampiata su un lato
Vetrate del microscopio Corning, scracciate su un lato, un'estremitàVWR294875X25
Copri il vetro rettangolare. 60 x 24 mm, #1.5VWR48393-251
Piatto dissezionaleScienze della microscopia elettronica70540
Microscopio disseczionaleQualsiasi modello standard
Forbici per dissecazione, punta affilata, 4,5"VWR82027-578
Pinze extra fine e con punta affilataVWR76548-836
Giemsa StainMillipore SigmaGS500-500Per colorare le sparse di chiasmata
Penna Barriera Idrofobica ImmEdgeLaboratori VectorH-4000
IncubatoreQualsiasi modello standard con tecnologia CO2 e water jacket
Postazione di lavoro IVFK-SistemiQualsiasi modello con piano riscaldato
Soluzione Kodak Photo-Flo 200BH Foto & Video1464510per lavaggi a slitta
MetanoloFisher ScientificA412-4per il fissativo di Carnoy
Barattolo di colorazione Coplin per la MP BiomedicalsFisher ScientificICN17006201
Siero normale per capreGibco16210-072per ADB
Paraformaldeide, grado EM, prill purificatoScienze della microscopia elettronica19200
PermountFisher ScientificSP15-100for  Carrelli di montaggio per le sparse di chiasmata
Attacco antifade in vetro ProLong con tinta NucBlueThermo ScientificP36985per il montaggio di vetrine immunocolorate
Tubo in silicone, diametro interno: 0,125", diametro esterno: 0,25"VWR89068-474per la produzione di pipette a bocca
Diidrato di citrato di sodioFisher ScientificS279-500per HEB, soluzione ipotonica
Sistema di colorazione per vetrine StaintrayScienze della microscopia elettronica71396-BDa usare come camera umidificata. Bisogna usare il coperchio nero per la colorazione tramite immunofluorescenza. In alternativa, si può rivestire il fondo di una scatola oppugnata o di un tupper ware con carta assorbente umida per usarli come camera umidificata...
Consigli per spogliarelliste - 100Cooper SurgicalMXL3-100per pipetta a bocca
Consigli per spogliarelliste - 150Cooper SurgicalMXL3-150per pipetta a bocca
SucrosioMillipore SigmaS-8501per HEB, soluzione ipotonica di saccarosio
Tris BaseFisher ScientificBP152-5per HEB
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100 per PFA, ADB e Triton-PBS
Barattolo di colorazione United Scientific CoplinFisher ScientificS17495APlastica bianca opaca per lavaggi e vetrini bloccanti dopo l'aggiunta di anticorpi secondari fotosensibili
Vettoni della concavità del vetro United ScientificFisher ScientificS139533Spessore 1,3 mm, 2 pozzi
Forbici a microdissezione Vannas 5mm dritteVWR76457-358
Zeiss Axio Imager.Z2, Colibri 7Carl Zeiss000000-2624-307
Zen Blue 3.11 SoftwareCarl ZeissSoftware per acquisizione e analisi di immagini
Anticorpi
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')? Frammento Capra Anti-Mouse IgG, Fc specifico per frammentiJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-546-071diluizione 1:1.000 usata
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')? Frammento Goat Anti-Rabbit IgG, Fc specifico frammentoJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.111-546-046diluizione 1:1.000 usata
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')? IgG Anti-Umano di Capra Frammentata, Fcγ Specifico per frammentiJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.109-606-170diluizione 1:1.000 usata
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Guinea Pig IgG, Fc frammento specificoJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.106-605-008diluizione 1:1.000 usata
Cavia Pig anti-MLH3 pAbRealizzato su misura con Thermo-Fisher, con diluizione 1:500
Cavia anti-SYCP1 pAbda Christer Hö ö g (Kouznetsova et al. 2005), usata diluizione 1:200
Proteina anti-centromera umana pAbAnticorpi Inc.15-234diluizione 1:1.000 usata
Mouse anti-MLH1 mAbBD in Biologia550838Diluizione 1:100 usata
Anti-SYCP3 mAb per topiAbcamab97672diluizione 1:1.000 usata
Rabbit anti-HORMAD1 pAbProteintech13917-1-APDiluizione 1:500 usata
Rabbit anti-MSH4 pAbAbclonaleA8556Diluizione 1:100 usata
Rabbit anti-RAD51 pAbMilliporePC130Diluizione 1:500 usata
Rabbit anti-SYCP3 pAbAbcamAB15093diluizione 1:1.000 usata
Rhodamine Red-X (RRX) AffiniPure F(ab')? Frammento Capra Anti-Mouse IgG, Fc specifico per frammentiJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-296-071diluizione 1:1.000 usata
Rhodamine Red-X (RRX) AffiniPure F(ab')? Frammento Goat Anti-Rabbit IgG, Fc specifico frammentoJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.111-296-046diluizione 1:1.000 usata

Riferimenti

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