Sviluppo di linee organoidi derivate da topi da cellule epiteliali delle tube di Falloppio per la modellazione del carcinoma ovarico sieroso di alto grado

Sommario

Questo protocollo descrive in dettaglio lo sviluppo di modelli murini di carcinoma ovarico sieroso di alto grado (HGSOC) in vitro e in vivo. Dalla derivazione di organoidi murini delle tube di Falloppio, alla loro modificazione genetica per ricapitolare la genetica umana HGSOC e alla loro introduzione nella borsa ovarica di topi singenici per lo sviluppo in vivo di tumori.

Abstract

Una modellazione efficace delle malattie in ambienti realistici è fondamentale per migliorare la nostra comprensione delle diverse patologie. Sotto questo aspetto, gli organoidi offrono un ambiente più fedele rispetto ai loro classici omologhi bidimensionali in vitro. Allo stesso modo, i modelli murini singenici consentono anche ai ricercatori di studiare interazioni tumore-ospite più complete, ad esempio con il sistema immunitario, in vivo. Qui presentiamo un protocollo completo sull'estrazione di cellule epiteliali delle tube di Falloppio, la cellula di origine dei carcinomi ovarici sierosi di alto grado (HGSOC), da un topo e sulle loro derivazioni come colture di organoidi primari, nonché la loro coltura in vitro e il mantenimento. Quindi, descriviamo come utilizzare tecniche di ingegneria genetica, come la sovraespressione genica lentivirale o retrovirale, nonché la delezione del gene CRISPR-Cas9, per modificare queste linee e trasformarle in tumoroidi precancerosi. Segnaliamo anche come utilizzarli per la validazione in vitro , tramite l'estrazione di materiale genetico e la colorazione in immunofluorescenza. Infine, indichiamo come iniettare efficacemente questi tumoroidi nella borsa ovarica, il sito autoctono dell'HGSOC, per l'inizio del tumore.

Introduzione

Il carcinoma ovarico sieroso di alto grado (HGSOC) rimane una malattia poco conosciuta e altamente letale. Storicamente, la mancanza di modelli fedeli in vitro e in vivo che rappresentino la biologia dell'HGSOC e la risposta alla terapia è stata un importante ostacolo al progresso. Ad esempio, diversi (se non la maggior parte) studi hanno utilizzato linee cellulari che non riescono a condividere le caratteristiche genomiche/genetiche chiave dell'HGSOC, rendendo discutibile la rilevanza dei loro risultati 1,2,3,4.<....

Protocollo

Tutte le procedure e la raccolta di tessuti animali sono state eseguite in modo etico sotto l'approvazione dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso l'Alexandria Center for Life Sciences e del Perlmutter Cancer Center presso la NYU Langone Health, New York, New York.

1. Preparazione dei materiali

1. Preparazione di terreni organoidi murini (MOM)
   1. Preparare il terreno basale combinando gli elementi sulla Tabella 1.
      NOTA: Il supporto è stabile fino a un mese a 4 °C.
2. Preparazione dei supporti 2D
   1. Combi....

Risultati

Nella Figura 1 è mostrato uno schema che riassume il flusso di lavoro per la generazione e la convalida del carcinoma ovarico HGSOC. Questo processo inizia con l'estrazione del tessuto delle tube di Falloppio da una femmina di topo selvatico C57BL/6J (Figura 2A). Si consiglia di iniziare con un generoso pezzo di tessuto per garantire una corretta raccolta. L'uso di un microscopio da dissezione consente l'isolamento preciso delle.......

Discussione

Nonostante i significativi progressi nella ricerca oncologica, l'HGSOC rimane il tipo più aggressivo di tumore maligno ginecologico e la principale causa di mortalità tra tutti i tumori ovarici ^23,24. Con l'evoluzione della ricerca in oncologia ginecologica, dovrebbero evolversi anche i modelli utilizzati. In effetti, è stato scoperto che molte linee cellulari modello di cancro ovarico storico non sono ottimali per studiare quest.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,25% tripsina, 0,1% EDTA in HBSS senza calcio, magnesio e bicarbonato di sodio	Corning	25053CI
A83-01	Tocris Bioscienza	2939
DMEM/F12 avanzato	Gibco	12-634-028
Di età C57BL/6J (femmina)	Il Laboratorio Jackson	000664
AllPrep DNA/RNA Mini Kit	QIAGEN	80204	Per l'estrazione di DNA/RNA
Alt-R S.p. Cas9-GFP V3	Tecnologie Integrate del DNA	10008100
Anticorpo anti-Ki67	Abcam	ab15580
Sistema AutoClip	Strumenti scientifici di qualità	12020-00	Per la chiusura della ferita post-IBI
Integratore B-27 (50 volte), senza siero	Gibco	17-504-001
Blasticidina HCl (10 mg/mL) 50 mg	InvivoGen	Ant-BL-05
Albumina Sirica Bovina	Sigma Aldrich	A9647
Buffer RLT Plus	QIAGEN	1053393	Lisare le cellule prima dell'estrazione di DNA/RNA
Soluzione di recupero cellulare	Corning	354253
Collagenasi/Hyaluronidasasi	Tecnologie STEMCELL	07912
CoraLite 594-Faloidina (rosso)	Proteintech	PF00003
Vetro di copertura 15CIR-1	Fisherbrand	12-545-83
Vetro di copertura 24 mm e acuto; 40 mm-1	Fisherbrand	12-544-12
Supplemento N-2 CTS (Cell Therapy Systems)	Gibco	A1370701
DAPI	Roche	10236276001
Ossessribonucleasi I (DNAsi I) dal pancreas bovino	Sigma Aldrich	D5025
Difco Latte Scremato	Becton Dickinson	232100
Dispasi	Tecnologie STEMCELL	07913
DMEM con L-Glutamina, 4,5 g/L di glucosio e piruvato di sodio	Corning	10013CV
DNasi I ricombinante, senza RNasi	Roche	04716728001
La soluzione tamponata fosfato di Dulbecco	Sigma Aldrich	D8537
Dumont #5 - Pinza Rivestita in Ceramica	Strumenti scientifici di qualità	11252-50	Per la dissezione delle tube di Falloppio
Siero bovino fetale	Corning	35-010-CV	Inattivazione termica a 56 °C; C per 60 minuti.
Forbici fini - ToughCut	Strumenti scientifici di qualità	14058-09	Per la prelieva delle tube di Falloppio e l'incisione IBI
Antibiotico selettivo geneticina (G418 solfato) (50 mg/mL)	Gibco	10131027
Integratore GlutaMAX (100 volte)	Gibco	35-050-061
Anticorpo secondario adsorbito incrociato anti-coniglio IgG (H+L) di capra, cianano3	Invitrogen	A10520
Pinza Graefe	Strumenti scientifici di qualità	11053-10	Per la manipolazione dei tessuti
Buffer HEPES	Corning	25060CI
Proteina ricombinante R-Spondin 1 umana	PeproTech	120-38
Siringa per insulina, U-100 0,5 mL 0,36 mm (28 G)x 12,7 mm (1/2")	BD	BD329461
Insulina-Transferrina-Selenio (ITS -G) (100x)	Gibco	41-400-045
L-Glutammina 200 mM (100x)	Gibco	25-030-081
Matrice a membrana basale Matrigel GFR	Corning	356231	BMM
Proteina ricombinante EGF del topo	PeproTech	315-09
Proteina ricombinante FGF-base del topo	PeproTech	450-33
Proteina ricombinante di Noggin del topo	PeproTech	250-38
Proteina ricombinante Wnt-3a del topo	PeproTech	315-20
Supplemento N2	Gibco	17502048
Ammide di N-acetilcisteina	Sigma Aldrich	A0737
Sistema di elettroporazione Neon NxT	Invitrogen	NEON1S	Per l'elettroporazione CRISPR-Cas9
Sistema di elettroporazione Neon NxT 10-μ L Kit con valvole a 1 canale	Invitrogen	N1025	Consumabili per l'elettroporazione, incluso il buffer di editing genomico
Nicotinamide	Sigma Aldrich	N3376
Siero normale per topi	Invitrogen	10410
Siero normale per ratti	Tecnologie STEMCELL	13551
Opti-MEM I Medium Siero Ridotto	Gibco	31985070
Anticorpo policlonale PAX8	Proteintech	10336-1-AP
Penicillina-Sreptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15-140-122
Puromicina	Sigma Aldrich	P8833
Selectfrost 25 mm e acuto; 75 mm e acuto; 1,0 mm	Fisherbrand	12-550-003
Triton X-100	Bioreagenti Fisher	BP151
Enzima TrypLE Express (1x), nessun fenolo rosso	Gibco	12-604-013
Forbici a molla Vannas - filo da taglio da 4 mm	Strumenti scientifici di qualità	15019-10	Per la dissezione delle tube di Falloppio
Y27632	Tecnologie STEMCELL	72304	Inibitore della rho-chinasi (ROCK) & nbsp;