Sviluppo di linee organoidi derivate da topi da cellule epiteliali delle tube di Falloppio per la modellazione del carcinoma ovarico sieroso di alto grado

Sommario

Questo protocollo descrive in dettaglio lo sviluppo di modelli murini di carcinoma ovarico sieroso di alto grado (HGSOC) in vitro e in vivo. Dalla derivazione di organoidi murini delle tube di Falloppio, alla loro modificazione genetica per ricapitolare la genetica umana HGSOC e alla loro introduzione nella borsa ovarica di topi singenici per lo sviluppo in vivo di tumori.

Abstract

Una modellazione efficace delle malattie in ambienti realistici è fondamentale per migliorare la nostra comprensione delle diverse patologie. Sotto questo aspetto, gli organoidi offrono un ambiente più fedele rispetto ai loro classici omologhi bidimensionali in vitro. Allo stesso modo, i modelli murini singenici consentono anche ai ricercatori di studiare interazioni tumore-ospite più complete, ad esempio con il sistema immunitario, in vivo. Qui presentiamo un protocollo completo sull'estrazione di cellule epiteliali delle tube di Falloppio, la cellula di origine dei carcinomi ovarici sierosi di alto grado (HGSOC), da un topo e sulle loro derivazioni come colture di organoidi primari, nonché la loro coltura in vitro e il mantenimento. Quindi, descriviamo come utilizzare tecniche di ingegneria genetica, come la sovraespressione genica lentivirale o retrovirale, nonché la delezione del gene CRISPR-Cas9, per modificare queste linee e trasformarle in tumoroidi precancerosi. Segnaliamo anche come utilizzarli per la validazione in vitro , tramite l'estrazione di materiale genetico e la colorazione in immunofluorescenza. Infine, indichiamo come iniettare efficacemente questi tumoroidi nella borsa ovarica, il sito autoctono dell'HGSOC, per l'inizio del tumore.

Introduzione

Il carcinoma ovarico sieroso di alto grado (HGSOC) rimane una malattia poco conosciuta e altamente letale. Storicamente, la mancanza di modelli fedeli in vitro e in vivo che rappresentino la biologia dell'HGSOC e la risposta alla terapia è stata un importante ostacolo al progresso. Ad esempio, diversi (se non la maggior parte) studi hanno utilizzato linee cellulari che non riescono a condividere le caratteristiche genomiche/genetiche chiave dell'HGSOC, rendendo discutibile la rilevanza dei loro risultati 1,2,3,4. Ad esempio, il modello murino singeneico ID8 comune è derivato dall'epitelio della superficie ovarica (OSE) ed è Trp53-wild di tipo⁵. Al contrario, la maggior parte, se non tutto, dell'HGSOC insorge nell'epitelio delle tube di Falloppio (FTE)⁶, e l'HGSOC è quasi universalmente mutante TP53 o silenziato⁷. Da allora i ricercatori hanno cercato di rettificare questa linea integrando le mutazioni di Trp53 in essa⁵, ma poiché la mutazione di Trp53 è un evento precoce nella patogenesi dell'HGSOC, questa modifica arriva probabilmente troppo tardi nella trasformazione di questa linea cellulare e probabilmente non rappresenta il normale sviluppo dell'HGSOC.

Nell'ultimo decennio, sono stati fatti tentativi per correggere questo stato di cose generando modelli più realistici di HGSOC. Ad esempio, i modelli murini geneticamente modificati (GEMM) che ospitano mutazioni rilevanti sulle cellule del lignaggio del tratto mülleriano, spesso sotto un sistema Cre-ricombinasi per controllare la patogenesi, consentono ai ricercatori di imitare meglio la malattia in vivo ^8,9,10. Sfortunatamente, questi modelli sono spesso complicati da generare e possono avere altri problemi come Cre-leaking, Cre-effect o "field-effects"11,12,13. A questo proposito, i modelli di organoidi singenici sembrano essere un robusto compromesso per i ricercatori che desiderano imitare meglio la malattia sia in vitro che in vivo 14,15,16,17,18,19. Infatti, mentre la maggior parte dei modelli HGSOC disponibili e utilizzati al momento sono modelli bidimensionali, purtroppo non possono simulare correttamente la complessità della matrice extracellulare (ECM), un elemento cruciale che influenza la biologia cellulare. Gli organoidi sono tessuti 3D auto-organizzati, spesso generati da cellule staminali, che possono ricreare la complessità strutturale e funzionale precoce di un organo nella capsula di Petri²⁰. La loro generazione funziona tipicamente sospendendo singole cellule, che sono pluripotenti, in una matrice di membrana basale (BMM), come Matrigel²¹. In vitro, questi modelli sono relativamente più accurati nel ricapitolare le condizioni in vivo rispetto ai modelli 2D. Allo stesso modo, a causa della loro natura singenica, questi modelli sono in grado di essere trapiantati in un topo con un sistema immunitario completamente funzionante, consentendo una ricostruzione più fedele della patogenesi e dello sviluppo^14,15. Questo è un chiaro vantaggio rispetto agli xenotrapianti derivati da pazienti, che, pur avendo la genetica tumorale più realistica, richiedono l'attecchimento in modelli murini immunocompromessi.

In questo protocollo, descriviamo come sviluppare modelli singenici di organoidi HGSOC. Dalla generazione della coltura originale di organoidi FTE wild-type estratti da un topo, alla loro ingegneria genetica per generare genotipi informati sulla malattia, fino al loro trapianto nella borsa ovarica per generare tumori completamente sviluppati. Abbiamo anche incluso alcuni protocolli aggiuntivi per aiutare con esperimenti comuni, come la colorazione in immunofluorescenza (IF) di organoidi in vitro e la conversione 2D di linee cellulari per la produzione su larga scala di cellule, come per le iniezioni. Questo protocollo si rivolge ai ricercatori che vogliono sviluppare modelli singenici di organoidi di HGSOC con controllo sul loro corredo genetico, con l'intenzione particolare di studiare la biologia dell'HGSOC in condizioni più realistiche in vitro e le interazioni presenti nel microambiente tumorale in vivo.

Protocollo

Tutte le procedure e la raccolta di tessuti animali sono state eseguite in modo etico sotto l'approvazione dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso l'Alexandria Center for Life Sciences e del Perlmutter Cancer Center presso la NYU Langone Health, New York, New York.

1. Preparazione dei materiali

1. Preparazione di terreni organoidi murini (MOM)
   1. Preparare il terreno basale combinando gli elementi sulla Tabella 1.
      NOTA: Il supporto è stabile fino a un mese a 4 °C.
2. Preparazione dei supporti 2D
   1. Combinare EGF murino ricombinante 50 ng/mL, insulina-transferrina-selenio (concentrazioni finali 10 mg/L di insulina, 5,5 mg/L di transferina, 6,7 μg/L), siero fetale bovino inattivato termicamente al 3% (FBS) e penicillina-streptomicina (100 U/mL), in DMEM (con piruvato e glucosio alto).
3. Preparazione della miscela per la digestione
   1. Combinare la collagenasi/ialuronidasi (3000 U/mL di collagenasi, 1000 U/mL di ialuronidasi) con DMEM (con piruvato e glucosio alto) in un rapporto 1:10. Preparare aliquote da 1 mL in microprovette da 1,5 mL. Conservare le aliquote a -20 °C e scongelarle con ghiaccio.
   2. Preparare aliquote monouso di DNAsi I (10.000 U/mL) e Dispase (5 U/mL).
   3. Una volta scongelata un'aliquota di collagenasi/ialuronidasi nel DMEM, aggiungere DNAseI (10 μL, 100 unità) e Dispasi (25 μL, 0,1 unità).
      NOTA: Questa soluzione digestiva è utile anche per digerire fino a 0,5 g di tumore.
4. Movimentazione BMM
   1. Conservare il BMM a -80 °C a lungo termine. Per evitare il congelamento-scongelamento del BMM, preparare aliquote da 1 mL in provette da 1,5 mL. Scongelare un'aliquota mettendola in ghiaccio per 2 ore o per una notte a 4 °C.
      NOTA: Il BMM si solidificherà a temperatura ambiente (RT). Pertanto, si consiglia di conservare sempre la provetta di BMM sul ghiaccio o su una griglia per provette fredda. Utilizzare puntali per pipette che sono stati pre-raffreddati in un congelatore a -20 °C per almeno 2 ore.

2. Isolamento di cellule da FTE di topo

1. Scongelare un'aliquota di BMM, l'enzima TrypLE Express pre-riscaldato e una piastra a 24 pozzetti a 37 °C (conservare la piastra nell'incubatore per 24 ore per ottenere i migliori risultati). Quindi, preparare l'area operatoria: strumenti per la dissezione e la pulizia del tessuto sul microscopio da dissezione, piastra con PBS + P/S freddo e miscela di digestione calda.
2. Eutanasia di topi femmina C57BL/6J mediante asfissia da anidride carbonica. Eseguire il metodo di eutanasia secondaria (lussazione cervicale) come richiesto dall'IACUC.
3. Sezionare e rimuovere l'ovaio e le tube di Falloppio e trasferirle in una capsula di Petri sterile contenente DMEM + P-S a 4 °C. Utilizzando un microscopio da dissezione, una sottile serie di pinze e forbici rimuove la quantità residua di grasso dall'ovaio e isola la tuba di Falloppio (infundibolo e parte dell'ampolla distale) dall'ovaio e dall'utero.
   NOTA: Fare attenzione a evitare di toccare la pelle o i peli del mouse con gli strumenti per prevenire la contaminazione microbica.
4. Trasferire il fazzoletto nella provetta contenente la miscela completa per la digestione e utilizzare le forbici sottili per tritare la tuba di Falloppio in piccoli pezzi (<0,5 mm). Incubare per 40-50 minuti a 37 °C.
5. Dopo la dissociazione, centrifugare le cellule a 350 x g per 5 minuti e scartare il surnatante. Aggiungere 500 μl di TrypLE Express preriscaldato. Incubare per 15 minuti a 37 °C.
6. Tripsinizzazione estinta con 500 μL di FBS al 3% in DMEM (terreno 2D). Filtrare la miscela attraverso un filtro cellulare da 70 μm in una nuova microprovetta. Centrifugare per 5 minuti a 350 g ed eliminare il surnatante.
7. Risospendere il pellet cellulare (appena visibile a seconda del numero di FT utilizzati) in 12,5 μL di terreno organoide murino e incubare brevemente su ghiaccio. Miscelare con 37,5 μl di BMM ghiacciato e seminare l'intero volume (50 μl) sul fondo di un pozzetto di una piastra preriscaldata a 24 pozzetti.
8. Posizionare la piastra a 37 °C per almeno 20 minuti, ma non più di 48 ore, per impostare il BMM. Fare attenzione a non disturbare le cupole durante il trasferimento della piastra nell'incubatrice.
9. Aggiungere 500 μl di MOM preriscaldato a ciascun pozzetto pipettando delicatamente il terreno lungo il lato del pozzetto. Non aggiungere mai supporti direttamente alla cupola, poiché possono causare danni o distacchi. Posizionare il coperchio sulla piastra di coltura e incubare a 37 °C e 5% di CO₂.

3. Mantenimento di organoidi murini derivati da FTE

1. Modifica dei media
   1. Utilizzando un puntale sterile da 10 μl non filtrato, aspirare il terreno dal fondo del pozzetto mentre la piastra viene tenuta a un'inclinazione di 45°. Se la cupola si stacca dalla piastra, aspirare con cautela il fluido dalla parte superiore del pozzetto mentre la cupola staccata si trova nella parte inferiore.
   2. Aggiungere lentamente 750 μl di MOM, preriscaldato a 37 °C, con la punta premuta contro la parete laterale del pozzetto.
   3. Cambia il supporto ogni 2 o 3 giorni o fino a quando il supporto non cambia colore da rosa a giallo. Se il terreno diventa giallo meno di 24 ore dopo averlo sostituito, gli organoidi sono pronti per essere fatti passare.
2. Organoidi passanti
   1. Rimuovere il terreno e lavare ogni pozzetto con 500 μL di PBS freddo (4 °C). Aspirare il PBS e aggiungere 500 μL di soluzione fredda (4 °C) di soluzione di recupero cellulare direttamente nella cupola BMM per dissolverla. Continuare il pipettaggio fino a quando il BMM non è completamente sciolto e trasferirlo in una provetta da 1,5 mL.
   2. Mettere la provetta sul ghiaccio per 30 minuti e rimettere la piastra nell'incubatrice in modo che rimanga calda. Se si utilizza una nuova piastra, assicurarsi che sia preriscaldata a 37 °C per 24 ore.
      NOTA: Se si passano più di 2 cupole da 50 μl, ad esempio durante le espansioni descritte di seguito, potrebbe essere necessario prolungare l'incubazione su ghiaccio per più di 30 minuti per ottenere i migliori risultati.
   3. Centrifugare a 350 g per 5 min a 4 °C. Rimuovere il surnatante con cura senza aspirare il pellet e lavare con 500 μL di PBS freddo. Ripeti questo passaggio tre volte.
      NOTA: Se non è disponibile una centrifuga a freddo, lasciare raffreddare la provetta tra un lavaggio e l'altro posizionandola su ghiaccio o su una griglia fredda.
   4. Dopo l'ultimo lavaggio, centrifugare a 350 g per 5 minuti, rimuovere il surnatante e aggiungere 500 μl di enzima TrypLE Express preriscaldato (37 °C). Per evitare di perdere le cellule durante il pipettaggio, trascinare la provetta contro la griglia di sfiato dell'aria nella cappa di coltura tissutale per omogeneizzare le cellule.
   5. Incubare la provetta a 37 °C per 30-60 minuti.
      NOTA: Il tempo può essere adattato a seconda del genotipo dell'organoide e del tempo di passaggio, poiché alcuni possono richiedere una tripsinizzazione più lunga per produrre sospensioni di singole cellule.
   6. Arrestare il processo di dissociazione cellulare aggiungendo 500 μL di DMEM + 3% HI FBS e mescolare pipettando su e giù fino a quando la soluzione non è omogeneizzata.
   7. Centrifugare a 350 × g per 5 minuti e aspirare il surnatante fino a quando non rimangono ~20 μL di volume. Rimuovere manualmente il surnatante rimanente con una pipetta P20 piuttosto che con un aspiratore a vuoto, poiché è comune aspirare il pellet in questa fase.
   8. Risospendere le cellule in 100 μL di MOM freddo (4 °C) e misurare la concentrazione delle cellule. Preparare le diluizioni cellulari a piacere e tenerle in ghiaccio. Quindi, miscelare con BMM ghiacciato utilizzando i puntali per pipette precedentemente conservati a -20 °C.
      NOTA: Si consiglia di preparare due cupole da 50 μl a 2 × 10⁵ cellule/mL, dove il rapporto tra MOM e BMM è 1:4. Pertanto, avresti dovuto; 25 μL di cellule in MOM a 8 × 10⁵ cellule/mL e 75 μL di BMM per un totale di 100 μL, suddivisi in 2 cupole. In questo modo, si semineranno efficacemente 1 × 10⁴ celle per cupola.
   9. Seminare ogni cupola da 50 μl al centro del pozzetto di una piastra preriscaldata a 24 pozzetti. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO₂ per almeno 30 minuti per consentire alla BMM di solidificarsi. Aggiungere 500 μl di MOM a 37 °C come mostrato in precedenza al punto 3.1.2 e rimettere la piastra nell'incubatore.
3. Espansione
   1. Per espandere la coltura cellulare di organoidi in una piastra a 6 pozzetti (preriscaldata), preparare cinque cupole da 50 μl a 8 × 10⁵ cellule/mL. Risospendere le cellule in un totale di 62,5 μL di MOM e mescolare con 187,5 μL di BMM ghiacciato e seminare le 5 cupole nello stesso pozzetto.
   2. Spostare la piastra nell'incubatrice per 30 minuti per consentire al BMM di solidificarsi. Aggiungere 2 mL di MOM a 37 °C come mostrato in precedenza al punto 3.1.2 e rimettere la piastra nell'incubatore. Se necessario, modificare i supporti fino a quando le celle non sono confluenti.
      NOTA: Per raccogliere le cellule per il passaggio, utilizzare 1 mL di soluzione di recupero cellulare invece di 500 μL e incubare su ghiaccio per 45 minuti invece di 30 minuti.
4. Crioconservazione
   1. Per la conservazione a lungo termine degli organoidi, procedere come descritto nelle fasi da 3.2.1 a 3.2.7. Quindi, risospendere in 250 μl di terreno di congelamento per organoidi (80% MOM, 10% FBS e 10% dimetilsolfossido (DMSO)) e trasferire in una crioprovetta Congelare 1 × 10⁵ cellule per crioviale.
   2. Conservare la provetta in un contenitore criogenico per il congelamento di fiale (ad es. Mr. Frosty) e lasciarla raffreddare in un congelatore a -80 °C. Per una conservazione a lungo termine, conservare le celle in un deposito di azoto liquido o in un congelatore a -150 °C.

4. Modificazione genetica di organoidi murini derivati da FTE per lo sviluppo di nuove linee cellulari

1. Trasduzione per spinoculazione (lentivirale o retrovirale)
   1. Preparare una miscela di 25 μl di MOM e 75 μl di BMM e aggiungerla a un pozzetto di una piastra fredda (4 °C, consente al BMM di "bagnare" completamente il pozzetto) a 48 pozzetti. Incubare a 37 °C per 30-60 minuti per consentire alla BMM di solidificarsi prima di seminare le cellule.
   2. Ottenere singole cellule derivate da organoidi (passaggio 3.2.5) e seminare circa 2 × 10⁴ sopra il BMM. Aggiungere 200 μl di MOM caldo (37 °C) e incubare a 37 °C e 5% di CO₂ per 48 ore.
   3. Aggiungere il virus alla concentrazione desiderata. Determinare sperimentalmente il MOI; si suggerisce un MOI approssimativo inferiore al 30%.
      NOTA: Gli organoidi sono particolarmente difficili da infettare rispetto alle linee cellulari 2D e si aspettano bassi MOI anche ad alti titoli virali. Centrifugare le celle a 600 × g per 60 min a 32 °C. Rimettere la piastra nell'incubatrice al termine della spinoculazione.
   4. Dopo 8 ore, rimuovere il terreno e aggiungere una miscela di 25 μL di MOM e 75 μL di BMM sopra le cellule per "inserirle" in BMM , consentendo agli organoidi di crescere naturalmente in 3 dimensioni. Lasciare solidificare il BMM posizionando la piastra nell'incubatrice per 30-60 minuti. Quindi, aggiungere 250 μL di MOM caldo (37 °C).
   5. Una volta che le cellule sono confluenti, procedere al loro passaggio come descritto nel passaggio 3.2, espandendo l'intero volume delle cellule in 2 cupole in una piastra a 24 pozzetti.
      NOTA: Se si utilizza una selezione antibiotica, si consiglia di eseguire la selezione direttamente nel pozzetto a 48 pozzetti, a partire da 48 ore dopo la spinoculazione iniziale. Se si esegue la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS), si consiglia di espandere ulteriormente su una piastra a 6 pozzetti come descritto sopra per acquisire un numero sufficiente di cellule. Si consigliano inoltre tempi di tripsinizzazione più lunghi (1 ora) per garantire singole cellule prima di filtrare i campioni per il flusso.
2. Trasformazione mediante elettroporazione CRISPR-Cas9
   NOTA: Per le concentrazioni e la preparazione del complesso ribonucleoproteico (RNP), fare riferimento alla Guida alla riparazione diretta dall'omologia IDT (pp. 9-11)²². Tuttavia, ometti HDR Enhancer V2 per i knockout, poiché è consigliato solo per l'editing del genoma che richiede una ricombinazione omologa.
   1. Preparare una sospensione unicellulare derivata da organoidi (passaggio 3.2.7). Lavare con PBS e misurare la concentrazione cellulare. Trasferire una sospensione cellulare contenente una quantità compresa tra 10⁴ e 4 dell'ordine di grandezza (1 × 10^{da 4} a 9 × 10⁴ cellule) in una provetta da 1,5 mL.
   2. Centrifugare a 350 × g per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere in 10 μL di tampone per l'editing del genoma. Se per l'elettroporazione sono necessarie >1 ×^{10 4} celle, preparare un volume sufficiente per le elettroporazioni seriali, assicurandosi che ogni 10 μl contenga 1 × 10⁴ a 9 celle × 10⁴ .
   3. Utilizzando un sistema di pipette per elettroporazione, raccogliere 10 μl della sospensione cellulare, assicurandosi che non vengano introdotte bolle. Elettroporazione nelle seguenti condizioni: tensione 1200 V, durata dell'impulso 20 ms, 4 impulsi totali. Mettere le cellule in una provetta con MOM freddo.
   4. Dopo l'elettroporazione delle cellule, centrifugare l'intera sospensione a 350 × g per 5 minuti. Risospendere il pellet in MOM e BMM ghiacciati (rapporto 1:4), preparando abbastanza per seminare una cupola per ciclo di elettroporazione (1 cupola per 1 10⁴ cellule).
   5. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO₂ per almeno 30 minuti per consentire alla BMM di solidificarsi. Aggiungere 500 μl di MOM a 37 °C come mostrato in precedenza al punto 3.1.2 e rimettere la piastra nell'incubatore.
3. Selezione di singoli cloni
   1. Per ottenere un clone proveniente da una singola cellula, far passare le cellule come descritto sopra, ma seminare da 50 a 100 cellule per cupola (4 × 10^{da 3} a 8 × 10³ cellule/mL in sospensione cellulare prima di mescolarle con BMM).
   2. Cambia la MOM ogni 3 giorni. Controlla che gli organoidi crescano in modo appropriato e nota quali sono ben separati dagli altri.
   3. Quando gli organoidi raggiungono una dimensione distinguibile (circa 500 μm), utilizzare un microscopio ottico per identificare 4-5 organoidi di grandi dimensioni che sono abbastanza separati.
      NOTA: Dovrebbero essere visibili ad occhio nudo, ma è utile contrassegnare il fondo della piastra con un pennarello a punta fine disegnando un cerchio attorno all'area della piastra in cui si trova l'organoide.
   4. Utilizzando una pipetta da 20 μl nella cappa sterile, inserire delicatamente il puntale nel BMM e aspirare il singolo organoide (aspirare un volume di circa 12,5 μl). Posizionare l'organoide in una provetta da 1,5 ml con 500 μl di MOM.
   5. Centrifugare a 350 × g per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere in 500 μL di TrypLE Express Enzyme. Incubare a 37 °C per 30 min.
   6. Spegnere la reazione di dissociazione cellulare con 500 μl di FBS al 3% in DMEM (terreno 2D) e centrifugare a 350 × g per 5 minuti. Rimuovere con molta attenzione il surnatante, risospendere in 12,5 μL di MOM freddo, miscelare con 37,5 μL di BMM ghiacciato e seminare l'intera sospensione come una singola cupola da 50 μL in una piastra a 24 pozzetti, come descritto sopra.
   7. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO₂ per almeno 30 minuti per consentire alla BMM di solidificarsi. Aggiungere 500 μl di MOM a 37 °C come mostrato in precedenza al punto 3.1.2 e rimettere la piastra nell'incubatore.
   8. Cambia i media ogni 3-4 giorni e passa quando la cupola è confluente.

5. Derivazione di linee cellulari 2D da organoidi

1. Coltura cellulare di transizione
   1. Iniziare da una sospensione di una singola cellula, come quando si passa gli organoidi.
   2. Procedere come si farebbe per seminare una piastra a 6 pozzetti (passaggio 3.3), ma utilizzando invece una pre-refrigerata (4 °C per 24 ore). Seminare le cupole su una piastra a 6 pozzetti conservata a 4 °C per una notte e lasciare riposare la piastra nella cappa sterile per 5-10 minuti prima di introdurla nell'incubatrice.
      NOTA: Questo passaggio consentirà alle cellule di depositarsi delicatamente sul fondo della piastra per adattarsi a una condizione di crescita 2D pur avendo accesso ai componenti ECM del BMM.
   3. Incubare la piastra a 37 °C e 5% di CO₂ per 30 minuti, quindi aggiungere 2 mL di MOM a 37 °C. Modificare i supporti in base alle esigenze.
   4. Quando gli organoidi raggiungono la confluenza, passare come descritto nei passaggi 3.2.1-3.2.7. Dopo il lavaggio PBS finale del pozzetto per rimuovere il BMM residuo, aggiungere 2 ml di terreno 2D preriscaldato nel pozzetto.
      NOTA: La rimozione del BMM non rimuoverà le cellule attaccate al pozzetto, che ora possono invadere liberamente il resto del pozzetto adattandosi alle condizioni/ai terreni 2D.
   5. Una volta raggiunta una sospensione di una singola cellula con le cellule rimaste nel BMM, seminare metà del volume di cellule, ripetendo il passaggio 5.1.2. Aggiungi l'altra metà del pozzetto originale, permettendo a più cellule di seminare, il che accelererà la confluenza.
   6. Sostituire i supporti 2D dopo 24 ore per rimuovere le celle non collegate.
      NOTA: Dovrebbero esserci molte cellule non attaccate, poiché le cellule coltivate in BMM non sono abituate ai substrati plastici e non si attaccano facilmente.
   7. Ripetere il passaggio 5.1.4. Quindi, risospendere l'intero volume di cellule in 4 mL di terreno 2D e seminare 2 mL in ciascuno dei pozzetti utilizzati in precedenza. Cambia i file multimediali 2D ogni 3-4 giorni.
2. Coltura cellulare 2D per l'espansione
   1. Una volta che le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza, procedere al primo passaggio.
   2. Per il passaggio, aspirare il terreno, lavare una volta con 1 mL di PBS e aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,25%. Incubare le cellule a 37 °C per 5-10 minuti.
      NOTA: Diverse linee cellulari possono avere diverse proprietà aderenti, facendo variare la durata della tripsinizzazione. Controllare al microscopio se le cellule si sono staccate prima di procedere al passaggio successivo. Picchiettare delicatamente la piastra di coltura cellulare con la mano può aiutare a staccare le cellule.
   3. Una volta che tutte le cellule si sono staccate, spegnere la dissociazione con DMEM + 10% FBS e centrifugare a 350 × g per 5 min.
   4. Per la prima espansione (quando l'80-100% è confluente), riseminare con un rapporto di divisione 1:1. Ripetere il passaggio 5.1.6 e cambiare i file multimediali 2D ogni 2-3 giorni.
   5. Alla seconda espansione (confluenza dell'80-100%), seminare tutte le cellule in una piastra da 100 mm risospendendo le cellule in 10 mL di terreno 2D a 37 °C. Ripetere il passaggio 5.1.6 e cambiare il supporto ogni 2-3 giorni.
      NOTA: questo processo richiede molto tempo e può richiedere fino a un mese intero. Se si lavora con linee cellulari che hanno geni viralmente integrati per la sovraespressione proteica, si raccomanda di mantenere gli antibiotici di selezione presenti nei terreni di crescita per tutto il tempo. Se il marcatore è una proteina fluorescente, eseguire lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza il prima possibile (ad esempio, alla fine dell'espansione della piastra di 100 mm).
3. Crioconservazione
   1. Per lo stoccaggio di queste celle, passare come descritto nei passaggi 5.2.1-5.2.3. Quindi, risospendere ~1 × 10⁶ cellule in 1 mL di terreno di congelamento 2D, composto per l'80% da terreno 2D, per il 10% da FBS e per il 10% da DMSO, e trasferirlo in una crioprovetta. Conservare le celle seguendo il passaggio 3.5.2.

6. Validazione delle linee di organoidi

1. Isolamento di materiale genetico da organoidi
   1. Partendo da una sospensione a singola cellula, seminare due cupole al doppio della densità cellulare abituale (1 × 10⁶ cellule/mL). Cambia mamma il giorno 3.
   2. Il giorno 5, rimuovere il terreno, lavare una volta con PBS e aggiungere 350 μl di tampone di lisi preferito direttamente sulle cupole. Dopo 5 minuti di incubazione in RT-o fino a quando il BMM non si è sciolto, trasferire il lisato in una provetta da 1,5 mL.
   3. Per un uso a lungo termine, conservare il lisato a -80 °C. In caso contrario, procedere con il protocollo per l'estrazione del DNA e/o dell'RNA utilizzando la tecnica di estrazione preferita o un kit commerciale.
2. Colorazione in immunofluorescenza (IF)
   1. Per preparare le celle, passare come descritto nei passaggi 3.2.1-3.2.5. Risospendere in una miscela di 37,5 μL di MOM e 112,5 μL di BMM ghiacciato (sufficiente per tre cupole da 50 μL che fungeranno da repliche biologiche). Segui il passaggio 3.2.6 e cambia i media il giorno 3 e il giorno 5.
   2. Il giorno 7, aspirare MOM e lavare le celle con 500 μL di PBS. Fissare ciascuna cupola separatamente aggiungendo 500 μl di soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% preriscaldata (37 °C) in PBS direttamente sulla cupola. Incubare a 37 °C per 60 minuti fino a quando il BMM non si sarà sciolto.
   3. Utilizzando un puntale per pipetta P1000 a foro largo (se non disponibile, è sufficiente tagliare un normale puntale P1000 a circa 0,5 cm dall'estremità fine), raccogliere gli organoidi in PFA al 4% e trasferire il volume in una provetta da 1,5 mL.
      NOTA: L'uso di una punta per pipetta standard causerà la rottura degli organoidi.
   4. Attendere 2 o 3 minuti affinché gli organoidi affondino sul fondo della provetta. Aspirare il 4% di PFA (lasciando una quantità sicura di volume per non aspirare gli organoidi) e aggiungere 500 μL di PBS per lavare gli organoidi. Ripetere questo passaggio altre due volte, per un totale di 3 lavaggi.
      NOTA: Aspettare che gli organoidi affondino sul fondo è preferibile alla centrifugazione per preservare la forma dell'organoide.
   5. Per la conservazione a lungo termine (4-6 settimane), conservare gli organoidi in PBS a 4 °C. Per procedere con la colorazione, permeabilizzare con PBS + 1% Triton-X per 30 min a RT. Lavare una volta con PBS.
   6. Bloccare con PBS + 0,2 % Triton-X + 4% FBS + 1% siero di topo per 60 minuti a RT. Lavare una volta con PBS e lasciare 100 μL di volume nella provetta.
   7. Preparare il tampone di lavoro per la colorazione degli anticorpi: PBS + 0,2% Triton-X, 0,4% FBS, 0,1% siero di ratto. Questo tampone funzionerà sia per gli anticorpi primari che per quelli secondari.
   8. Per preparare la colorazione primaria dell'anticorpo, calcolare che la diluizione deve essere due volte più concentrata della diluizione effettiva necessaria. Preparare una soluzione sufficiente ad aggiungere 100 μL di anticorpo ai 100 μL di PBS rimanenti in ciascuna provetta. Ad esempio, per una diluizione originale di 1:1000, preparare 100 μL di soluzione 1:500.
   9. Incubare per una notte a 4 °C. Successivamente, lavare tre volte con 500 μl di PBS.
   10. Preparare la colorazione dell'anticorpo secondario come spiegato al punto 6.2.8. Incubare per 1 ora a RT.
       NOTA: Da questo passaggio in poi, assicurarsi di coprire l'area di lavoro con un foglio di alluminio/scatola scura preferita per evitare il fotosbiancamento degli anticorpi fluorescenti.
   11. Al termine della colorazione secondaria, lavare tre volte con 500 μl di PBS. Rimuovere quanto più liquido possibile dalla provetta dopo l'ultimo lavaggio per preparare il campione per il montaggio. Utilizzare una pipetta da 20 μl per evitare l'aspirazione degli organoidi.
   12. Utilizzando un puntale per pipetta a foro largo o tagliato, aggiungere 20 μl di terreno di montaggio a scelta e omogeneizzare bene la soluzione, evitando la formazione di bolle.
   13. Posizionare una goccia di organoidi in soluzione di montaggio su un vetrino coprioggetti rettangolare. Usando una pinza, posizionare un vetrino coprioggetti circolare sopra la goccia, evitando bolle, e lasciare asciugare per una notte al buio a RT. Ripetere questo passaggio sullo stesso vetrino se si desidera posizionare più di un campione per vetrino.
   14. Aggiungere altri 20 μl di materiale di montaggio direttamente sopra il vetrino coprioggetto circolare. Ora, crea un "sandwich" di montaggio capovolgendo il vetrino coprioggetto rettangolare di 180° e posizionandolo sopra il vetrino del microscopio. Lasciare asciugare al buio a RT per almeno 8 h.
       NOTA: Il vetrino deve essere nel seguente ordine dal basso verso l'alto: vetrino da microscopio, vetrino coprioggetto circolare, organoidi, vetrino coprivetrino rettangolare. Questo crea condizioni di imaging ottimali.

7. Sviluppo di modelli tumorali nei topi

1. Preparazione delle celle
   1. Scongelare una fiala di cellule 2D a scelta in terreni 2D. Lascia che queste cellule crescano ed espandano fino a una piastra di 150 mm. Se le cellule hanno marcatori di selezione antibiotica, selezionare le cellule prima dell'iniezione per garantire una popolazione pura delle cellule desiderate.
   2. Per 5 iniezioni di topo, espandere le cellule a due piastre da 150 mm. Quando le piastre sono confluenti all'80%, raccogliere le cellule seguendo i passaggi 5.2.2-5.2.3. Risospendere le cellule in 1 mL di terreno di coltura Opti-MEM I Reduced Serum e misurare la concentrazione cellulare.
      NOTA: Ogni iniezione contiene 4 × 10⁶ cellule; Tuttavia, si raccomanda di prepararsi per un'ulteriore iniezione per tenere conto del volume morto delle siringhe. In questo caso, preparare 24 × 10⁶ celle invece di 20 × 10⁶ celle.
   3. Mettere l'intero volume cellulare per tutte le iniezioni in una provetta da 1,5 mL. Preparare un totale di 44 μl per iniezione, composto da 1 parte di cellule in Opti-MEM I non integrato e 1 parte di BMM ghiacciato. Ad esempio, per 24 × 10⁶ cellule (6 iniezioni), risospendere in 132 μL di Opti-MEM I e 132 μL di BMM.
   4. Mescolare accuratamente le cellule e tenerle in ghiaccio fino all'esecuzione dell'iniezione.
2. Preparazione per la procedura
   1. Espellere le bolle d'aria dal volume morto della siringa (U-100 insulina 28 G) con PBS freddo.
   2. Utilizzando le cellule nella provetta da 1,5 ml, preparare cinque iniezioni da 40 μl caricando lentamente la siringa per evitare la lisi delle cellule a causa delle forze di taglio all'interno dell'ago. Tenere in ghiaccio fino a quando i topi non sono sedati.
   3. Una volta che tutto è pronto per le iniezioni, posizionare le siringhe accanto alla lampada riscaldante in modo che il BMM possa riscaldarsi e diventare viscoso, facilitando l'iniezione e l'attecchimento. Non posizionarli direttamente sotto la lampada riscaldante, poiché il BMM troppo solidificato non passerà attraverso la siringa in modo appropriato. In generale, lavora velocemente per evitare che ciò accada.
3. Iniezione intrabursale (IBI) nell'ovaio
   1. Anestetizzare un topo C57BL/6J usando ketamina (100 mg/mL). Somministrare 0,1 ml per 10 g di peso corporeo mediante iniezione intraperitoneale.
      NOTA: I topi femmine giovani spesso richiedono solo iniezioni di 0,2 ml, ma potrebbero averne bisogno di più se più vecchi. Questo fornirà l'anestesia per una durata di 20-40 minuti, ma non fornirà alcuna analgesia.
   2. Posizionare il mouse in una gabbia riscaldata dalla lampada riscaldante.
      NOTA: Non posizionare i topi direttamente sotto la lampada riscaldante, poiché ciò può causare necrosi e ipertermia della coda, che possono essere letali.
   3. Una volta che il primo topo è completamente anestetizzato, utilizzando una tecnica asettica, praticare un'incisione di <1 cm lungo il fianco di un topo C57BL/6J nella regione dell'addome e sopra la coscia. Assicurati di passare attraverso l'epidermide e l'ipoderma prima di raggiungere la regione della borsa.
   4. Estrarre con cautela l'ovaia (facilmente individuabile dal cuscinetto adiposo attaccato ad essa). Prendi una delle siringhe preparate e inietta lentamente le cellule attraverso il cuscinetto adiposo proprio dietro l'ovaio, attraverso l'ovaio stesso, nel sacco dell'ovidotto.
      NOTA: Un'iniezione riuscita vedrà il pallone del sacco dell'ovidotto con BMM. La miscela probabilmente colerà anche su tutto il cuscinetto adiposo, il che è normale.
   5. Rimettere con cura l'ovaio nella borsa e chiudere l'incisione utilizzando graffette chirurgiche o cucendo.
   6. Rimetti il mouse nella gabbia. Usa una lampada riscaldante per mantenere i topi al caldo mentre si riprendono dopo l'operazione fino a quando non sono semi-coscienti (>15 min). Il giorno successivo, controlla il mouse per verificare che non si sia verificata sepsi durante la notte.

Risultati

Nella Figura 1 è mostrato uno schema che riassume il flusso di lavoro per la generazione e la convalida del carcinoma ovarico HGSOC. Questo processo inizia con l'estrazione del tessuto delle tube di Falloppio da una femmina di topo selvatico C57BL/6J (Figura 2A). Si consiglia di iniziare con un generoso pezzo di tessuto per garantire una corretta raccolta. L'uso di un microscopio da dissezione consente l'isolamento preciso delle...

Discussione

Nonostante i significativi progressi nella ricerca oncologica, l'HGSOC rimane il tipo più aggressivo di tumore maligno ginecologico e la principale causa di mortalità tra tutti i tumori ovarici ^23,24. Con l'evoluzione della ricerca in oncologia ginecologica, dovrebbero evolversi anche i modelli utilizzati. In effetti, è stato scoperto che molte linee cellulari modello di cancro ovarico storico non sono ottimali per studiare quest...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,25% tripsina, 0,1% EDTA in HBSS senza calcio, magnesio e bicarbonato di sodio	Corning	25053CI
A83-01	Tocris Bioscienza	2939
DMEM/F12 avanzato	Gibco	12-634-028
Di età C57BL/6J (femmina)	Il Laboratorio Jackson	000664
AllPrep DNA/RNA Mini Kit	QIAGEN	80204	Per l'estrazione di DNA/RNA
Alt-R S.p. Cas9-GFP V3	Tecnologie Integrate del DNA	10008100
Anticorpo anti-Ki67	Abcam	ab15580
Sistema AutoClip	Strumenti scientifici di qualità	12020-00	Per la chiusura della ferita post-IBI
Integratore B-27 (50 volte), senza siero	Gibco	17-504-001
Blasticidina HCl (10 mg/mL) 50 mg	InvivoGen	Ant-BL-05
Albumina Sirica Bovina	Sigma Aldrich	A9647
Buffer RLT Plus	QIAGEN	1053393	Lisare le cellule prima dell'estrazione di DNA/RNA
Soluzione di recupero cellulare	Corning	354253
Collagenasi/Hyaluronidasasi	Tecnologie STEMCELL	07912
CoraLite 594-Faloidina (rosso)	Proteintech	PF00003
Vetro di copertura 15CIR-1	Fisherbrand	12-545-83
Vetro di copertura 24 mm e acuto; 40 mm-1	Fisherbrand	12-544-12
Supplemento N-2 CTS (Cell Therapy Systems)	Gibco	A1370701
DAPI	Roche	10236276001
Ossessribonucleasi I (DNAsi I) dal pancreas bovino	Sigma Aldrich	D5025
Difco Latte Scremato	Becton Dickinson	232100
Dispasi	Tecnologie STEMCELL	07913
DMEM con L-Glutamina, 4,5 g/L di glucosio e piruvato di sodio	Corning	10013CV
DNasi I ricombinante, senza RNasi	Roche	04716728001
La soluzione tamponata fosfato di Dulbecco	Sigma Aldrich	D8537
Dumont #5 - Pinza Rivestita in Ceramica	Strumenti scientifici di qualità	11252-50	Per la dissezione delle tube di Falloppio
Siero bovino fetale	Corning	35-010-CV	Inattivazione termica a 56 °C; C per 60 minuti.
Forbici fini - ToughCut	Strumenti scientifici di qualità	14058-09	Per la prelieva delle tube di Falloppio e l'incisione IBI
Antibiotico selettivo geneticina (G418 solfato) (50 mg/mL)	Gibco	10131027
Integratore GlutaMAX (100 volte)	Gibco	35-050-061
Anticorpo secondario adsorbito incrociato anti-coniglio IgG (H+L) di capra, cianano3	Invitrogen	A10520
Pinza Graefe	Strumenti scientifici di qualità	11053-10	Per la manipolazione dei tessuti
Buffer HEPES	Corning	25060CI
Proteina ricombinante R-Spondin 1 umana	PeproTech	120-38
Siringa per insulina, U-100 0,5 mL 0,36 mm (28 G)x 12,7 mm (1/2")	BD	BD329461
Insulina-Transferrina-Selenio (ITS -G) (100x)	Gibco	41-400-045
L-Glutammina 200 mM (100x)	Gibco	25-030-081
Matrice a membrana basale Matrigel GFR	Corning	356231	BMM
Proteina ricombinante EGF del topo	PeproTech	315-09
Proteina ricombinante FGF-base del topo	PeproTech	450-33
Proteina ricombinante di Noggin del topo	PeproTech	250-38
Proteina ricombinante Wnt-3a del topo	PeproTech	315-20
Supplemento N2	Gibco	17502048
Ammide di N-acetilcisteina	Sigma Aldrich	A0737
Sistema di elettroporazione Neon NxT	Invitrogen	NEON1S	Per l'elettroporazione CRISPR-Cas9
Sistema di elettroporazione Neon NxT 10-μ L Kit con valvole a 1 canale	Invitrogen	N1025	Consumabili per l'elettroporazione, incluso il buffer di editing genomico
Nicotinamide	Sigma Aldrich	N3376
Siero normale per topi	Invitrogen	10410
Siero normale per ratti	Tecnologie STEMCELL	13551
Opti-MEM I Medium Siero Ridotto	Gibco	31985070
Anticorpo policlonale PAX8	Proteintech	10336-1-AP
Penicillina-Sreptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15-140-122
Puromicina	Sigma Aldrich	P8833
Selectfrost 25 mm e acuto; 75 mm e acuto; 1,0 mm	Fisherbrand	12-550-003
Triton X-100	Bioreagenti Fisher	BP151
Enzima TrypLE Express (1x), nessun fenolo rosso	Gibco	12-604-013
Forbici a molla Vannas - filo da taglio da 4 mm	Strumenti scientifici di qualità	15019-10	Per la dissezione delle tube di Falloppio
Y27632	Tecnologie STEMCELL	72304	Inibitore della rho-chinasi (ROCK) & nbsp;