Un flusso di lavoro verificato per l'elaborazione dei dati MiRNA-Seq e l'analisi bioinformatica utilizzando R

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per analizzare i dati miRNA-Seq utilizzando R. Il flusso di lavoro consente ai ricercatori di esplorare le reti regolate dai miRNA e il loro significato in diverse questioni biologiche e cliniche. Questo lavoro intende fungere da guida pratica sia per i ricercatori alle prime armi che per quelli esperti nel campo della bioinformatica dei miRNA.

Abstract

I microRNA (miRNA) sono regolatori post-trascrizionali critici che influenzano un'ampia gamma di processi fisiologici e patologici. Con il progresso delle tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento, il miRNA-Seq è emerso come un potente strumento per la profilazione dei modelli di espressione dei miRNA. Tuttavia, un'interpretazione affidabile di tali dati richiede una pipeline di analisi standardizzata e riproducibile. Qui, presentiamo un flusso di lavoro verificato per l'elaborazione dei dati miRNA-Seq e l'analisi bioinformatica utilizzando R. Questo protocollo comprende tutte le fasi essenziali, tra cui la pre-elaborazione dei dati grezzi, il controllo qualità, l'allineamento, la quantificazione, la normalizzazione, l'analisi dell'espressione differenziale, la previsione del target, l'arricchimento funzionale e la costruzione della rete regolatoria. Progettato per garantire flessibilità e trasparenza, il flusso di lavoro integra pacchetti R ampiamente adottati e supporta l'annotazione specifica per specie e la personalizzazione modulare. Inoltre, gli utenti sono guidati a condurre l'interpretazione biologica a valle sfruttando database curati e strumenti di visualizzazione come Cytoscape. Questo protocollo non solo supporta una solida analisi statistica, ma consente anche di ottenere informazioni significative sulle interazioni miRNA-mRNA e sui loro ruoli nei meccanismi della malattia. È particolarmente adatto sia per i ricercatori alle prime armi che per quelli esperti che conducono la scoperta di biomarcatori di miRNA, la modellazione di malattie o studi multi-omici integrativi.

Introduction

I microRNA (miRNA) sono molecole di RNA corte non codificanti che influenzano significativamente l'espressione genica agendo nella fase post-trascrizionale¹. Tipicamente funzionano legandosi a sequenze complementari nelle regioni 3' non tradotte (UTR) degli RNA messaggeri bersaglio (mRNA), portando alla degradazione dell'mRNA o alla repressione traduzionale¹. Negli ultimi due decenni, i miRNA sono stati sempre più riconosciuti come regolatori centrali di vari processi biologici, tra cui la proliferazione cellulare, la differenziazione, l'apoptosi, le risposte immunitarie e lo sviluppo de....

Protocol

NOTA: I materiali con collegamenti software sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparare campioni di RNA e librerie di sequenze

NOTA: Eseguire l'estrazione e il sequenziamento dell'RNA al di fuori di questo flusso di lavoro computazionale. Esiste più di un modo per analizzare i dati di sequenziamento dei miRNA. Questa sezione fornisce il contesto di una pratica.

1. Estrarre l'RNA totale: estrarre l'RNA totale dai campioni biologici utilizzando un kit ottimizzato per l'isolamento di piccoli RNA (ad esempio, kit di isolamento de....

Results

Abbiamo scaricato la matrice di espressione dei microRNA da GSE133530 e condotto direttamente l'analisi dell'espressione differenziale. È stato fornito un esempio di script R analitico per il set di dati nel file supplementare 1. Il set di dati ha eseguito la profilazione globale dei miRNA su 16 cisti renali di diverse dimensioni (cisti minime: meno di 1-5 mL, n = 10; cisti medie: tra 10-25 mL, n = 4; cisti grandi: maggiori di 50 mL, n = 4) e tessuto minimamente cistico (.......

Discussion

L'analisi dei dati miRNA-Seq presenta sfide distinte a causa delle dimensioni ridotte e della ridondanza delle letture, rendendo fondamentale un rigoroso controllo di qualità e la pre-elaborazione. Uno dei passaggi più importanti del flusso di lavoro è la rifilatura dell'adattatore. Poiché i miRNA sono lunghi circa 22 nucleotidi, le sequenze di adattatori possono facilmente dominare le letture se non vengono rimosse correttamente. La mancata esecuzione di un taglio accurato può causare d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent-021827 Microarray di miRNA umano	Agilent	/	Un array commerciale per la profilazione di microRNA di campioni umani
Cravatta a farfalla	Università Johns Hopkins	http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml	Uno strumento software per l'allineamento delle letture di sequenziamento a lunghe sequenze di riferimento
clusterProfiler (pacchetto R)	Bioconduttore	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	Un pacchetto R progettato per l'analisi dell'arricchimento funzionale e la visualizzazione di dati biologici ad alto rendimento.
Cutadapt	Open Source	https://cutadapt.readthedocs.io	Uno strumento da riga di comando che rimuove sequenze di adattatori, primer, code poly-A e altri frammenti indesiderati dalle letture di sequenziamento ad alto rendimento.
Cytoscape	Consorzio Cytoscape	https://cytoscape.org/	Una piattaforma software open-source progettata per la visualizzazione e l'analisi di reti biologiche complesse.
DESeq2 (pacchetto R)	Bioconduttore	https://bioconductor.org/packages/DESeq2/	Un pacchetto R progettato per l'analisi dell'espressione genica differenziale dei dati di conteggio
EnhancedVolcano (pacchetto R)	Bioconduttore	https://bioconductor.org/packages/EnhancedVolcano/	Un pacchetto R progettato per creare grafici vulcanici di qualità da pubblicazione.
Controllo rapido	Babraham Bioinformatica	https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/	Uno strumento di controllo qualità open source per dati di sequenziamento ad alto rendimento.
featureCounts	Lettura secondaria / SourceForge	http://subread.sourceforge.net/	Un programma utilizzato per il conteggio delle letture mappate alle caratteristiche genomiche
HTSeq-count	Pacchetto Python	https://htseq.readthedocs.io	Uno strumento da riga di comando che conta il numero di letture di sequenziamento ad alto rendimento allineate che si sovrappongono a caratteristiche genomiche come geni o esoni. Io
Illumina Human v2 MicroRNA expression beadchip	Illumina	/	Un array commerciale per la profilazione di microRNA di campioni umani
multiMiR (pacchetto R)	Bioconduttore	https://bioconductor.org/packages/multiMiR/	Un pacchetto R che fornisce la più ampia raccolta integrata di microRNA previsti e convalidati sperimentalmente. Interazioni mirate insieme alle loro associazioni a malattie e farmaci.
Org. Hs.eg.db (pacchetto R)	Bioconduttore	https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/	Un pacchetto di annotazioni progettato per la ricerca genomica umana (Homo sapiens).
R Software	Progetto R	https://www.r-project.org/	Un progetto open-source per il calcolo statistico
Rstudio	Poni PBC	/	Un ambiente di sviluppo integrato aiuta a essere più produttivi con R e Python
Strumenti SAM	Open Source	http://www.htslib.org/	Un pacchetto software per la manipolazione dei dati di sequenziamento di nuova generazione (NGS).