Articolo metodologico

Stampi personalizzati stampati in 3D per l'imaging di pesci zebra e lo sviluppo cardiaco

DOI:

10.3791/68768

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15 agosto 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Mississippi

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui descriviamo un metodo che utilizza una stampante 3D stereolitografica economica per creare stampi per facilitare il montaggio riproducibile di embrioni di zebrafish per studi di imaging. Utilizzando questo metodo, abbiamo creato stampi per l'imaging della morfogenesi cardiaca in embrioni di zebrafish.

Abstract

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Il montaggio degli embrioni è una delle sfide tecniche che i ricercatori incontrano quando intraprendono un progetto di imaging. Gli embrioni devono essere orientati in modo riproducibile in modo tale che il tessuto di interesse sia accessibile a un obiettivo del microscopio per l'intero periodo di imaging. Per superare questa sfida, i ricercatori possono incorporare gli embrioni in mezzi viscosi o creare piatti e calchi specializzati per mantenere gli embrioni nell'orientamento desiderato durante l'imaging. Qui, descriviamo un metodo per l'utilizzo di una stampante 3D stereolitografica (SLA) economica per produrre stampi riutilizzabili che creano pozzetti di agarosio in cui gli embrioni possono essere montati per l'imaging. Questi pozzetti di agarosio forniscono un mezzo affidabile per orientare più embrioni per l'imaging. Questo metodo include un framework di progettazione che può essere facilmente personalizzato per una varietà di tessuti, organismi e sfide di imaging. Utilizzando questo metodo, abbiamo creato stampi per l'imaging dello sviluppo cardiaco nel pesce zebra sia per microscopi verticali che invertiti. Utilizzando materiali e attrezzature accessibili, questo metodo consente ai ricercatori di creare facilmente stampi specifici per le loro esigenze di montaggio.

Introduzione

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Visualizzare le dinamiche cellulari all'interno di un animale integro è essenziale per comprendere le patologie delle malattie congenite e i processi fondamentali dello sviluppo e dell'omeostasi. Questa visualizzazione comprende l'imaging su più scale spaziali per identificare le dinamiche fisiologiche in un intero organismo, nonché a livello tissutale, cellulare e subcellulare. Le modalità di imaging utilizzate per visualizzare le dinamiche cellulari vanno dagli studi di immunofluorescenza di campioni fissati all'imaging time-lapse di campioni vivi. Queste modalità di imaging richiedono di mantenere i campioni intatti in orientamenti specifici, in modo tale che una regione di interesse sia accessibile all'obiettivo del microscopio.

Gli embrioni di pesce zebra sono un organismo modello ideale per gli studi di imaging grazie alla loro trasparenza ottica, trattabilità genetica, fecondazione esterna e origine vertebrata. Tuttavia, montare embrioni di pesce zebra con un orientamento specifico in modo coerente e riproducibile ha rappresentato una sfida continua. Il montaggio è particolarmente impegnativo per la visualizzazione dello sviluppo cardiaco negli embrioni di zebrafish perché la morfogenesi cardiaca si verifica su piani diversi1.

Sono stati sviluppati diversi approcci per affrontare le sfide del montaggio degli embrioni per l'imaging. Uno dei metodi più semplici consiste nel montare embrioni di pesce zebra tra due vetrini coprioggetti con strati di nastro adesivo tra i vetrini coprioggetti per evitare lo schiacciamento. Questo metodo consente l'imaging sia su microscopi invertiti che verticali2. Gli embrioni di zebrafish possono anche essere montati in un mezzo o in un gel altamente viscoso, come la metilcellulosa o l'agarosio a bassa temperatura del punto di fusione allo 0,1-0,8%, per mantenere gli embrioni in orientamenti specifici 2,3,4. Questi approcci a basso rendimento funzionano bene per molti progetti di imaging; Tuttavia, garantire l'integrità dell'embrione e ottenere in modo riproducibile orientamenti specifici può essere problematico. Per aumentare la produttività dell'imaging e facilitare il montaggio, è possibile creare pozzetti regolarmente distanziati dall'agarosio solidificato in una piastra di imaging 5,6,7,8. Per facilitare la creazione di questi pozzetti di agarosio, sono stati creati degli stampi in plastica 9,10,11. Sebbene questi stampi possano essere applicati all'imaging lungo gli assi dorsale-ventrale-laterale standard10,12, sono spesso realizzati per sfide di imaging specifiche, ad esempio per l'uso in piastre a 96 pozzetti13 o per il rilevamento del primo battito cardiaco14. In casi specializzati, sono state create intere piastre di imaging 5,15,16. Ad esempio, una camera microfluidica (denominata ZEBRA) realizzata in PDMS facilita sia l'imaging che l'esposizione degli embrioni a sostanze chimiche17. Questi stampi sono spesso realizzati in silicone o lavorati in lucite 10,18,19. Tuttavia, l'avvento di stampanti tridimensionali (3D) relativamente economiche ha democratizzato la creazione di stampi personalizzati che vengono utilizzati per creare pozzetti di imaging all'agarosio.

La stampa 3D, chiamata anche produzione additiva o stratificata, comporta la produzione di un oggetto 3D da un progetto digitale mediante l'aggiunta e la fusione sequenziale di singoli strati20,21. La stereolitografia (SLA) utilizza la luce ultravioletta (UV) per polimerizzare una resina liquida sensibile alla luce in strati sequenziali22. Le stampanti SLA sono convenienti, veloci e altamente accurate e possono essere utilizzate con una varietà di resine, comprese quelle che offrono una superficie liscia16. Il processo inizia con un software di progettazione assistita da computer (CAD), in cui i modelli digitali dell'oggetto possono essere progettati de novo o modificati da progetti preesistenti. Il modello digitale viene quindi virtualmente tagliato in strati stampabili. Utilizzando questi strati digitali, una stampante 3D costruisce l'oggetto, strato per strato. Qui, presentiamo un metodo e un framework per la progettazione e la creazione personalizzata di stampi di imaging utilizzando una stampante 3D SLA a basso costo disponibile in commercio. Inoltre, utilizziamo questo framework per creare stampi per l'imaging di diverse fasi dello sviluppo cardiaco del pesce zebra su microscopi invertiti o verticali e per l'imaging di embrioni di pesce zebra lungo i loro assi laterale, dorsale o ventrale.

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Protocollo

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I protocolli, gli esperimenti e i risultati qui descritti sono stati condotti in conformità con le normative e le linee guida sul benessere degli animali e con il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Mississippi (protocollo #24-008).

Per creare pozzetti di agarosio di diverse forme in cui gli embrioni possono essere orientati per l'imaging, abbiamo sviluppato un design che utilizza una base attaccata a pioli (Figura 1A). La forma di questi pioli (vedi freccia che indica i pioli in viola nella Figura 1A) può essere personalizzata per orientare embrioni di diversi stadi di sviluppo e per concentrarsi su diversi tessuti. Di seguito, descriviamo un protocollo per la personalizzazione di questi pioli e per l'utilizzo di questo sistema per creare pozzetti di agarosio.

1. Creazione di uno stampo per immagini progettato su misura

  1. Creare uno schizzo preliminare del campione o dell'embrione posizionato nell'orientamento desiderato. Considerare l'orientamento dell'embrione desiderato e se il microscopio da utilizzare contiene obiettivi verticali o invertiti. Considera anche le dimensioni della capsula, il numero di embrioni da montare e la distanza tra di loro.
  2. Misura le dimensioni dell'embrione (ad esempio, lunghezza, larghezza e altezza) utilizzando un microscopio combinato con uno strumento software come FIJI23. Usa queste dimensioni per assicurarti che gli embrioni si adattino ai pozzetti creati dai pioli.
  3. Identificare una forma che corrisponda alla geometria dell'embrione. Utilizzando le misurazioni del passaggio 1.2 in combinazione con un software di progettazione assistita da computer (CAD), creare un piolo che approssima la forma e le dimensioni del campione.
    NOTA: Questa forma può essere creata in un programma software CAD di base combinando e sovrapponendo diverse forme preprogettate, oppure la forma può essere creata de novo utilizzando un programma software CAD avanzato. Inoltre, è possibile modificare uno dei nostri pioli predefiniti (vedi File supplementare 1). La rastremazione del piolo, come nella Figura 1A, può aiutare a orientare gli embrioni per garantire che il tessuto di interesse sia il più vicino all'obiettivo.
  4. Combina il design del piolo con il design della base:
    1. In un programma software CAD, aggiungere un piolo progettato su misura a una delle basi predefinite (File supplementare 1). Quindi, duplica e posiziona uniformemente i pioli su tutta la base per l'imaging ad alta produttività utilizzando gli strumenti di un programma CAD avanzato. Ricontrolla per assicurarti che tutti i pioli raggiungano la stessa altezza lontano dalla base.
  5. Prepara il progetto per la stampa 3D:
    1. Trasferisci il progetto dello stampo personalizzato o uno degli stampi pre-progettati (file supplementare 2) a un software slicer, che converte il progetto in comandi per la stampante 3D.
    2. All'interno del software dello slicer, assicurati di ruotare il design in modo che i componenti critici come i pioli siano posizionati lontano dal tavolino della stampante. Per il supporto del vetrino coprioggetti, che viene stampato su una stampante FDM (Fused Deposition Modeling), posizionare la stampa orizzontalmente.
      NOTA: La rotazione del disegno eviterà la deformazione, che può verificarsi quando le parti delicate sono posizionate vicino alla fase di stampa.
    3. Aggiungi supporti all'interno del software dell'affettatrice per garantire che gli aspetti delicati dello stampo non si rompano durante la stampa. La funzione di posizionamento automatico dei supporti medio nel software, insieme alla cura manuale, garantisce una buona diffusione dei supporti senza grandi spazi vuoti. Per creare uno stampo solido viene utilizzata una strategia di riempimento al 100%.
    4. Stampa più pezzi contemporaneamente utilizzando un singolo file STL contenente tutti gli stampi o organizzando insieme i singoli file STL utilizzando il software affettatrice.
  6. Stampa
    NOTA: Le stampanti SLA sono il nostro tipo di stampante 3D preferito per gli stampi di imaging grazie alla loro fattibilità, precisione e alla creazione di superfici lisce. Una stampante FDM viene utilizzata per realizzare il supporto del vetrino perché crea stampe leggere e più rigide rispetto alle stampanti SLA.
    1. Inizia con le seguenti impostazioni di stampa e ottimizza da lì: altezza dello strato di 0,05 mm; 5 strati inferiori; Tempo di esposizione di 2,5 s; Tempo di esposizione inferiore di 35 s; 5 mm di sollevamento inferiore e distanza di sollevamento; Velocità di sollevamento inferiore 60 mm/min; Velocità di sollevamento 80 mm/min; e velocità di ritrazione di 210 mm/min.
      NOTA: È probabile che le impostazioni di stampa debbano essere ottimizzate dall'utente in quanto dipendono dal tipo di resina, dalla temperatura ambiente e dal modello di stampante.
  7. Dopo la stampa, lavare gli stampi in acqua, rimuovere i supporti e posizionare gli stampi sotto la luce UV in una cappa di coltura tissutale per garantire la solidificazione della resina.
    NOTA: Lavare e polimerizzare accuratamente gli stampi è importante per evitare che la resina si sfaldi, e per evitare che lo stampo si deformi.
    È necessario indossare guanti e camice da laboratorio quando si maneggia la resina non polimerizzata e si puliscono gli stampi, poiché la resina non polimerizzata può essere irritante per la pelle. Le stampanti SLA utilizzano la luce UV per polimerizzare la resina, che può essere dannosa per gli occhi e la pelle. Assicurarsi che la camera di stampa sia chiusa in modo sicuro ed evitare di guardare direttamente la sorgente di luce UV.

2. Una procedura per l'utilizzo di stampi stampati in 3D per creare pozzetti di agarosio

  1. Realizzazione di pozzetti di agarosio
    1. Realizzare pozzetti di agarosio sciogliendo il 2% (g/mL) di agarosio in terreno E3 (1,578 mM NaCl, 0,169 mM KCl, 0,249 mM CaCl2*2H2O, 0,161 mM MgSO4*7H2O). Posizionare uno stampo al centro di un piatto sul fondo di un vetrino coprioggetti con la freccia rivolta verso il basso verso il pozzetto (vedi Figura 2A, B). Pipettare 750 μl di agarosio fuso/E3 al 2% lungo metà del perimetro dello stampo di imaging (vedere la Figura 2C).
      NOTA: L'agarosio fuso deve essere non viscoso ma abbastanza freddo da poter essere pipettato senza creare bolle. Utilizziamo piastre da 60 mm con pozzetto inferiore vetrino da 30 mm, mentre per gli stampi progettati per microscopi verticali può essere utilizzato un piatto standard da 60 mm. Per lo stampo di vagliatura viene utilizzato un protocollo leggermente diverso (vedi sotto).
    2. Pipettare altri 750 μl di agarosio fuso/E3 al 2% lungo l'altra metà del perimetro dello stampo di imaging (vedere Figura 2D).
    3. Attendere 5-7 minuti affinché l'agarosio si solidifichi, osservando il passaggio da un liquido limpido a un gel blu opaco (vedi Figura 2E).
    4. Aggiungere un sottile strato di agarosio fuso attorno al perimetro dell'agarosio centrale solidificato.
      NOTA: Sebbene non sia strettamente necessario, questo passaggio aiuta ad ancorare l'agarosio solidificato alla piastra e a prevenire il distacco indotto dai fluidi.
    5. Posizionare l'anello esterno (Figura supplementare S1B) sul gruppo dello stampo di agarosio con la freccia rivolta verso l'agarosio (vedere la Figura 2F).
    6. Tenendo delicatamente premuto l'anello esterno, tirare con cautela verso l'alto lo stampo interno per staccarlo dall'agarosio (vedi Figura 2G).
      NOTA: Per evitare di rompere o danneggiare i pozzetti dell'agarosio, non spingere troppo forte verso il basso l'anello esterno e non torcere o spostare lo stampo interno quando si tira verso l'alto.
    7. Rimuovere l'anello esterno, rivelando i pozzetti di agarosio nel piatto inferiore del vetrino coprioggetti (Figura 2H).
    8. Ispezionare i pozzetti di agarosio al microscopio per confermare il corretto dimensionamento e la produzione.
      NOTA: Per l'imaging su un microscopio invertito, spesso è necessario sollevare una sottile pellicola di agarosio dal fondo del pozzetto. Questo può essere fatto con il forcipe.
  2. Protocollo modificato per l'utilizzo dello stampo di vagliatura
    1. Versare il 2% di agarosio/E3 fuso nella capsula di Petri fino a riempirla circa a metà.
    2. Tenere lo stampo con i pioli rivolti verso l'alto e pipettare il 2% di agarosio fuso/E3 sui pioli, fino a coprirli (~3 mL).
      NOTA: Assicurarsi che non vengano introdotte bolle rilasciando solo il 90% dell'agarosio fuso che è stato aspirato nella pipetta.
    3. Usando un movimento inclinato, posizionare un'estremità e poi l'intero stampo con i pioli rivolto verso il basso nella capsula di Petri contenente agarosio fuso (Figura supplementare S2).
    4. Lasciare solidificare l'agarosio per 5-7 minuti.
    5. Rimuovere con cautela lo stampo utilizzando la maniglia per sollevare un'estremità e poi l'altra estremità.

3. Montaggio di embrioni in pozzetti di agarosio con e senza agarosio a bassa temperatura di fusione

  1. Decorionare e anestetizzare gli embrioni in una soluzione di tricaina da 200 μg/mL prima del montaggio.
    NOTA: È necessaria una soluzione di tricaina da ~400 μg/mL per fermare il battito cardiaco.
    1. Senza utilizzare agarosio a bassa temperatura di fusione: riempire la piastra di imaging con 1x E3 e tricaina (200 μg/mL), aggiungere embrioni anestetizzati dechorionati alla piastra di imaging, utilizzare una pinza per posizionare e orientare gli embrioni nei pozzetti di agarosio e quindi creare l'immagine (vedere Figura 2I, J).
      NOTA: Poiché le pinze possono facilmente danneggiare un embrione, è possibile utilizzare un attizzatoio per embrioni in cui una lenza di 0,41 mm di diametro viene inserita in un tubo capillare o in una punta di pipetta e fissata con supercolla24.
    2. Utilizzando l'agarosio a bassa temperatura di fusione:
      NOTA: Sebbene gli stampi siano progettati per posizionare gli embrioni in orientamenti specifici, l'utilizzo di agarosio a bassa temperatura di fusione per mantenere gli embrioni in posizione può garantire che gli embrioni non vadano alla deriva durante l'imaging o durante il trasporto al microscopio della capsula di imaging con gli embrioni montati. I passaggi seguenti derivano dal nostro precedente protocollo6.
      1. Creare provette di agarosio a bassa temperatura di fusione sciogliendo lo 0,1-0,8% di agarosio a bassa temperatura di fusione in 5 mL di terreno E3 e riscaldando a 65-70 °C in un bagno d'acqua. Di tanto in tanto, capovolgere la provetta fino a quando l'agarosio a bassa temperatura di fusione non si è sciolto. Aliquotare la soluzione di agarosio a bassa temperatura di fusione in provette per microfusibili e posizionarle su un blocco termico impostato a 42 °C. Lasciare equilibrare la soluzione a 42 °C per almeno 1 ora.
        NOTA: In genere si consiglia di utilizzare una soluzione di agarosio a bassa temperatura di fusione appena preparata.
      2. Utilizzando una pipetta Pasteur in vetro a foro largo, trasferire un singolo embrione in una provetta contenente la soluzione di agarosio a bassa temperatura di fusione. Per evitare di aggiungere liquido in eccesso alla soluzione di agarosio a bassa temperatura di fusione, trasferire solo l'embrione e il liquido immediatamente circostante. Trasferire immediatamente l'embrione, che ora si trova in agarosio a basso punto di fusione, in uno dei pozzetti di agarosio. Rimettere la soluzione di agarosio a bassa temperatura di fusione nel blocco termico per il riutilizzo.
      3. Utilizzando una pinza o un attizzatoio per embrioni (vedere il passaggio 3.1.1), posizionare l'embrione nel pozzetto per l'imaging.
      4. Ripetere i passaggi 3.1.2.2-3.1.2.3 per gli altri pozzetti. Se i pozzetti precedenti iniziano ad asciugarsi, utilizzare una pipetta p200 per aggiungere una piccola quantità di E3 (~50-100 μL) sulla parte superiore del pozzetto.
  2. Una volta che gli embrioni sono stati montati in tutti i pozzetti e l'agarosio a bassa temperatura di fusione si è solidificato, utilizzando una pipetta aggiungere lentamente la soluzione di tricaina/E3 alla piastra di imaging.
  3. Dopo l'imaging, estrarre con cura gli embrioni dai pozzetti usando una pinza e lasciarli sviluppare ulteriormente per garantire che l'imaging non abbia causato difetti di sviluppo.
    NOTA: I pozzetti di agarosio possono essere rimossi dalla piastra di imaging, che può essere risciacquata e riutilizzata. Il risciacquo con un detergente per vetri disponibile in commercio e poi più volte con ddH2O aiuta a rimuovere i depositi di sale sui vetrini. Sebbene non abbiamo riscontrato tossicità a causa di tracce residue di detergente per vetri, si consiglia al ricercatore di confermare questi risultati utilizzando le proprie condizioni di laboratorio.

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Risultati

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Il protocollo di cui sopra è stato utilizzato per progettare stampi per l'imaging di diverse fasi dello sviluppo cardiaco in zebrafish, tra cui la fusione cardiaca, la formazione del tubo cardiaco, il looping cardiaco e la formazione della camera. Poiché lo sviluppo cardiaco non avviene lungo i principali assi anatomici dell'embrione, la forma dei pioli è stata personalizzata per le diverse fasi di sviluppo al fine di posizionare correttamente gli embrioni. Ad esempio, il posizionamento interno anteriore del cuore del pe...

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Discussione

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In questo protocollo, delineiamo un metodo per la progettazione di stampi stampati in 3D che creano pozzetti di agarosio che possono facilitare il montaggio di embrioni o tessuti per studi di imaging. Questi stampi possono essere realizzati per l'imaging con microscopi verticali o invertiti e i pozzetti di agarosio realizzati utilizzando questi stampi personalizzati possono essere utilizzati per applicazioni di imaging che vanno dagli studi di immunofluorescenza di embrioni fissati all'i...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

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Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Bloomekatz, in particolare Sasmitha Singh e Allison Holmes, così come il nucleo di imaging GlyCORE (supportato da P20GM130460), il laboratorio IDEA dell'Università del Mississippi, il Dr. Yiwei Han e il laboratorio Han, e i membri delle comunità di Glycoscience e Developmental Biology dell'Università del Mississippi. Questo lavoro è sostenuto da finanziamenti del NIH (R15HD108782, P20GM130460).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Stampante 3D SLAElegooMARS 2 PRO
Agarose Apex Bioresearch; Genesee Scientific 20-102QDQualsiasi marca può essere sostituita:
Autodesk Fusion 360Autodesk Inc.https://www.autodesk.com/products/fusion-360/ Software CAD (Computer Aid Design) - più avanzato
Microscopio verticale Axio-ZoomZeissAxio Zoom.V16
ChituboxCBD-Techhttps://www.chitubox.com/Software per affettare
Coperchio coperchio inferiore (piatto da 60 mm con pozzetto inferiore da 30 mm)CellvisD60-30-1.5N
F59 Catena pesante della miosina (tutte le isoforme veloci)DHSBF59diluizione 1:50
filamenti FDMBambuPLA filamenti
stampante FDMBambu BambuX1 Carbon FDM0,4 mm ugello estrusore
PinzeFisher16-100-121Altre marche sono probabilmente adatte
Capra anti-topo Alexa 488ThermoFisher#A28175diluizione 1:300
ImarisAndor10.2Software
Microscopio confocale invertitoLeicaLeica SP8 X
Agarosio a bassa temperatura di fusioneOro BiotecnologiaCodice prodotto: A-204-25Altre marche sono probabilmente adatte
Pompa per pipetteBel-ArtF37898
Resina per stampante SLAElegooElegoo P05BB028Fotopolimero lavabile con acqua Resina V2.0
Ricinus communis agglutinina (RCA-120)Vector labs#RLK-2200 (kit lectina)Diluizione 1:300
TinkerCADAutodesk Inc.https://www.tinkercad.com/Software CAD (Computer Aid Design) - Tricaina di base
Chimica occidentale, Inc.ANADA #200-226
Agglutinina del germe di grano (WGA)Vector labs#RLK-2200 (kit di lectina)Diluizione 1:300
Pipetta Pasteur in vetro a foro largo Duran Wheaton Kimble (DWK)63A53WT
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Riferimenti

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