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Articolo metodologico

In vitro Infusione intraluminale di gel: un approccio avanzato per l'analisi microscopica delle arterie di resistenza umana

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DOI:

10.3791/68773

⸱

19 agosto 2025

 ,  ,  ,  , 
1Physiology Unit, Laboratory of Malaria and Vector Research, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, 2Surgical Oncology Program, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 3Infectious Disease Pathogenesis Section, National Institute of Allergy and Infectious Diseases

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per preservare l'architettura arteriosa umana infondendo gel stabilizzante dei tessuti nel lume del vaso prima del sezionamento per analisi molecolari o istopatologiche.

Abstract

Le arterie di resistenza, che comprendono piccole arterie e arteriole, svolgono un ruolo essenziale nella regolazione della pressione sanguigna e della perfusione tissutale. La disfunzione di queste arterie può portare a varie condizioni cardiovascolari come ipertensione, aterosclerosi e insufficienza cardiaca, nonché condizioni neurovascolari. L'esame delle arterie di resistenza umane è fondamentale per comprendere i meccanismi delle malattie cardiovascolari e sviluppare strategie terapeutiche mirate. Questo studio presenta un metodo innovativo per preparare le arterie di resistenza umana isolate infondendo un gel stabilizzante dei tessuti nel lume, preservandone l'architettura nativa e l'integrità cellulare. I tessuti omentali umani sono stati ottenuti da pazienti sottoposti a chirurgia addominale e piccole arterie di resistenza (100-300 μm di diametro) sono state isolate mediante attenta micro-dissezione. Le arterie sono state quindi incannulate, pressurizzate in una camera miografica di coltura e fissate con formalina tamponata neutra al 10%. Un gel stabilizzante dei tessuti è stato infuso nel lume dell'arteria cannulata, che è stato lasciato solidificare per preservare la struttura tridimensionale. Sono state eseguite analisi istologiche, immunoistochimiche e di espressione genica per valutare la conservazione delle arterie. Le sezioni istologiche hanno rivelato l'integrità strutturale ben conservata e l'architettura naturale delle arterie, mantenendo gli strati endoteliali e muscolari lisci ben definiti. La colorazione immunoistochimica ha mostrato una localizzazione distinta di marcatori come CD31 e actina muscolare liscia α. L'ibridazione in situ ha rivelato specifici modelli di espressione genica, fornendo informazioni sui meccanismi molecolari. Questo metodo avanzato di infusione di gel intraluminale offre vantaggi significativi, consentendo l'imaging avanzato e l'analisi completa della struttura arteriosa, del rimodellamento e delle interazioni cellulari sia in stati sani che malati. Questo metodo ha il potenziale per migliorare la diagnostica clinica e le strategie terapeutiche per le malattie vascolari, fornendo così uno strumento prezioso per far progredire la ricerca in biologia vascolare.

Introduzione

Le arterie di resistenza regolano il flusso sanguigno e la pressione e subiscono cambiamenti significativi in condizioni come l'ipertensione, il diabete e l'aterosclerosi 1,2,3,4,5. L'esame delle arterie di resistenza umane è essenziale per comprendere le patologie cardiovascolari e sviluppare terapie mirate 6,7,8,9,10. I metodi tradizionali per l'indagine dei vasi sanguigni hanno spesso portato ad artefatti e alla perdita di integrità tridimensionale 10,11,12,13,14,15. Per affrontare queste limitazioni, presentiamo un metodo innovativo per preparare le arterie isolate di resistenza umana infondendo un gel nel lume, preservando così la loro struttura approssimativa ex vivo e/o in vivo.

Questa tecnica di infusione intraluminale di gel mantiene l'architettura naturale delle arterie, consentendo una rappresentazione più accurata del loro stato fisiologico. Stabilizzando la struttura dei vasi, questo metodo facilita l'esame dettagliato del rimodellamento arterioso, della struttura cellulare, dei microdomini, delle giunzioni eterocellulari e dell'espressione genica/proteica attraverso diversi strati cellulari. Questa tecnica è particolarmente vantaggiosa per lo studio dei componenti specifici del tipo di cellula sia in stato sano che malato.

Questa tecnica è stata applicata con successo nel nostro recente studio16, dimostrando la sua efficacia nel preservare l'integrità strutturale e molecolare delle arterie di resistenza umana, facilitando l'imaging avanzato e l'analisi completa. Il successo di questa applicazione ci ha ispirato a documentare questo protocollo dettagliato affinché altri possano utilizzarlo.

In questo documento metodologico, descriviamo il protocollo per la preparazione di arterie isolate di resistenza umana e l'infusione di un gel biocompatibile stabilizzante dei tessuti (Tissue Guard Gel). Qui, descriviamo il metodo sperimentale e illustriamo le sue applicazioni per la valutazione della struttura arteriosa e lo studio dei modelli di espressione genica e proteica in diversi strati cellulari. Fornendo una tecnica completa e riproducibile per la preparazione delle arterie di resistenza umana, miriamo a far progredire la ricerca sulla biologia cardiovascolare, migliorare la riproducibilità dei risultati e contribuire a nuovi approcci diagnostici e terapeutici per le malattie cardiovascolari.

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Protocollo

Prima di condurre i seguenti esperimenti, assicurarsi che l'uso di tessuti umani e le seguenti procedure siano approvate dall'Institutional Review Board (IRB). La raccolta di tessuto omentale da pazienti sottoposti a operazioni addominali clinicamente indicate presso il National Institutes of Health (NIH) Clinical Center è stata condotta con l'approvazione del NIH Institutional Review Board (NCT01915225). Tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato scritto.

1. Materiali e attrezzature

  1. Fare riferimento alla Tabella dei materiali per le informazioni su tutti i reagenti e i materiali necessari per questo protocollo. Per ulteriori dettagli, è possibile consultare i manuali e i siti Web associati ai rispettivi fornitori, se necessario.

2. Raccolta di tessuti omentali umani

  1. Raccogliere tessuti omentali umani dall'équipe chirurgica.
  2. Collocare immediatamente i fazzoletti in un contenitore pre-refrigerato contenente tampone freddo Krebs Henseleit (KH) (composizione: 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 2,0 mM CaCl2 e 11,1 mM glucosio) su ghiaccio.
  3. Assicurarsi che i fazzoletti siano completamente immersi nel tampone e quindi chiudere saldamente il coperchio.
  4. Trasportare i tessuti nel contenitore chiuso su ghiaccio al laboratorio entro 30 minuti dalla raccolta per garantire la vitalità dei tessuti.
    NOTA: Assicurarsi di regolare il pH a 7,4 utilizzando NaOH durante la preparazione del tampone.

3. Microdissezione delle piccole arterie di resistenza umane

  1. All'arrivo in laboratorio, sciacquare i tessuti omentali con un tampone KH freddo per rimuovere il sangue in eccesso.
  2. Selezionare un pezzo della regione più vascolarizzata del tessuto per la dissezione in tampone freddo in una capsula di Petri su ghiaccio.
  3. Con un microscopio da dissezione, identificare le piccole arterie di resistenza (100-300 μm di diametro) in base alla loro posizione e al modello di ramificazione.
  4. Isolare accuratamente le arterie identificate dai tessuti adiposi e connettivi circostanti. Usando una pinza fine e microforbici, taglia e rimuovi i tessuti circostanti senza danneggiare l'arteria.
  5. Mantenere le arterie isolate in un tampone freddo durante la procedura di dissezione per mantenere la vitalità e prevenire qualsiasi degradazione enzimatica.
    NOTA: Prima della dissezione, assicurarsi che l'area di dissezione sia pulita. Verificare che la bilancia dell'obiettivo del microscopio e/o il software della fotocamera siano calibrati correttamente per misurare con precisione il diametro a diversi ingrandimenti. Di solito, le vene sono chiaramente visibili e le arterie si trovano proprio accanto o intorno alle vene. Le pareti delle arterie sono più spesse di quelle delle vene. Quando isolate dal tessuto circostante, le arterie mantengono la loro struttura come tubi vascolari intatti. Al contrario, le vene hanno pareti più sottili, spesso appaiono più luminose a causa del sangue nel loro lume e tendono ad essere più fragili una volta separate dal tessuto.

4. Preparazione della camera miografa di coltura

  1. Preparare una camera miografica di coltura con due cannule di vetro per l'incannulamento e la pressurizzazione delle arterie sezionate.
  2. Preparare una siringa da 5 ml con tubo capillare pulito e riempire con tampone KH fresco. Collegare il tubo a un'estremità della cannula e riempire con il KH, senza lasciare bolle d'aria.
  3. Riempire la camera con tampone freddo e metterla sul ghiaccio per mantenere una temperatura bassa.
    NOTA: È possibile utilizzare un piattino su misura con due cannule, progettato per imitare la camera del miografo.

5. Incannulamento e pressurizzazione delle arterie

  1. Trasferire con cautela l'arteria sezionata nella camera del miografo utilizzando una pinza fine o una pipetta di trasferimento con un diametro maggiore di quello dell'arteria.
  2. Preparare quattro nodi aperti con la sutura di nylon (sutura 11/0, 7 strati) e metterne due su ciascuna cannula prima di incannulare l'arteria.
  3. Cannulare l'estremità prossimale dell'arteria facendola scorrere su una cannula di vetro utilizzando una pinza sottile e fissarla con le due suture di nylon.
  4. Utilizzare il tampone KH nella siringa per sciacquare delicatamente l'arteria cannulata per rimuovere il sangue residuo.
  5. Incannulare l'estremità distale dell'arteria e fissarla in modo simile.
  6. Posizionare la camera sull'unità miografo collegata al regolatore di pressione e temperatura.
  7. Impostare la temperatura a 37 °C.
  8. Impostare la pressione intraluminale iniziale a 10 mmHg.
  9. Aumentare la pressione intraluminale con incrementi di 10 mmHg ogni 10 minuti fino a raggiungere i 60 mmHg. Assicurarsi che la pressione sia mantenuta in modo costante utilizzando il regolatore di pressione collegato al sistema miografo di coltura.
  10. Utilizzare il microposizionatore per raddrizzare longitudinalmente l'arteria pressurizzata secondo necessità per portare la lunghezza approssimativamente al suo livello fisiologico.
  11. Esegui MyoVIEW o un altro software adatto sul monitor del computer per tracciare i diametri arteriosi interni ed esterni con calibri digitali.
  12. Lasciare che l'arteria si equilibri per 45 minuti per ottenere un diametro stabile, assicurandosi che mantenga le sue dimensioni fisiologiche e il suo tono.
  13. Testare la vitalità dell'arteria utilizzando un vasocostrittore (ad esempio, 60 mM KCl o fenilefrina) o vasodilatatore (ad esempio, acetilcolina) e registrare le variazioni del diametro arterioso.
    NOTA: L'applicazione di una pressione eccessiva con una siringa può danneggiare l'arteria, quindi è importante prestare attenzione durante il lavaggio. Utilizzare una quantità minima di tampone e procedere delicatamente. In alternativa, il sangue arterioso può essere espulso utilizzando il tampone di perfusione mentre si pressurizza l'arteria. Le arterie possono essere pressurizzate a 80 mmHg e il tempo di equilibrio può arrivare fino a 1 ora.

6. Fissazione dell'arteria

  1. Dopo l'equilibratura, fissare le arterie luminalmente e abluminalmente durante la notte con formalina tamponata neutra al 10%. Mantenere una pressione costante di 60 mmHg per garantire che il processo di fissazione preservi l'integrità strutturale della parete arteriosa e dei componenti cellulari.
  2. Dopo il fissaggio, sciacquare le arterie luminalmente e abluminalmente con PBS per rimuovere eventuali residui di fissativo dall'arteria e dalla camera.
    NOTA: A seconda dell'obiettivo dello studio e della regione di interesse per l'analisi, il recipiente montato può essere fissato in presenza di agenti farmacologici come un vasodilatatore o un vasocostrittore. In questa fase, l'arteria può essere conservata in PBS a 4 °C per un massimo di 48 ore. La paraformaldeide al 4% può essere utilizzata anche per fissare le arterie.

7. Preparazione del gel stabilizzante dei tessuti

  1. Liquefare il gel stabilizzante dei tessuti nel suo tubo riscaldandolo a 60 ± 5 °C prima dell'uso.
  2. Posizionare il tubo a temperatura ambiente (RT) per 3-5 minuti affinché il gel liquido abbassi la temperatura, quindi posizionarlo su un blocco riscaldante a 40 °C per mantenere il gel liquido per 10-15 minuti.
  3. Utilizzare una siringa sterile da 3 ml collegata a un tubo capillare lungo 10-15 pollici per prelevare il gel liquido. Procedere immediatamente con le fasi di infusione riportate di seguito.
    NOTA: Il gel può essere liquefatto con diversi metodi. È essenziale seguire le istruzioni del produttore.

8. Infusione e inclusione di gel intraluminale

  1. Mantenere le arterie fisse incannulate nella camera con PBS a 37 °C.
  2. Collegare l'estremità distale del tubo capillare riempito di gel liquido alla cannula prossimale.
  3. Per evitare che le bolle d'aria attraversino il lume durante l'infusione del gel, rimuovere l'estremità prossimale dell'arteria dalla prima cannula per far uscire eventuali bolle d'aria e lasciare che il gel riempia la cannula.
  4. Rimontare l'arteria sulla cannula e infondere delicatamente il gel nel lume dell'arteria fino a quando non esce dalla cannula distale.
  5. Sostituire immediatamente il PBS nella camera con un volume uguale di gel liquido per riempire la camera fino al livello superiore.
  6. Lasciare riposare la camera con le arterie a RT scollegando l'unità dal termoregolatore per circa 10 minuti per consentire al gel di solidificarsi all'interno del lume e all'esterno del lume nella camera. Ciò garantisce che l'arteria sia completamente incorporata nel gel, preservando la sua struttura tridimensionale.
  7. Usando una pinza sottile, allenta le suture di nylon ed estrai delicatamente le cannule dalla camera.
  8. Trasferire l'intero gel solidificato contenente l'arteria dalla camera in un contenitore riempito con etanolo al 70%. L'etanolo funge da soluzione di mantenimento per conservare il campione fino a un'ulteriore elaborazione.
    NOTA: Una valvola a tre vie può facilitare la rimozione delle bolle d'aria prima di infondere il gel. La solidificazione del gel può essere confermata toccando delicatamente il gel nella camera utilizzando un puntale per pipetta pulito.

9. Istopatologia

  1. Tagliare l'arteria trasversalmente mentre è ancora nel gel e posizionare questi campioni nella macchina per la lavorazione dei tessuti secondo le istruzioni del produttore.
  2. Successivamente, incorporare il tessuto per creare un blocco di paraffina. Assicurarsi che i campioni siano incorporati "all'estremità" in modo che le sezioni trasversali siano rivolte verso il basso sul blocco.
  3. Tagliare sezioni assiali a 5 μm di spessore utilizzando un microtomo. Trasferire le sezioni tagliate su vetrini adesivi.
  4. Cuocere le sezioni a 60 °C per 1 ora, quindi decerare con xilene, quindi reidratare con lavaggi con alcol graduale.
  5. Colorare le sezioni con ematossilina ed eosina (HE) per l'istopatologia di routine e differenziare in alcol acido all'1%. Esaminare le sezioni al microscopio ottico utilizzando un microscopio appropriato e acquisire fotografie utilizzando una fotocamera compatibile.

10. Immunoistochimica

  1. Ottenete la colorazione utilizzando un sistema automatizzato con il sistema di rilevamento della raffinazione del polimero secondo il protocollo del produttore.
  2. Decerare le sezioni di tessuto a 72 °C per 30 s con una soluzione decerante, quindi reidratare le sezioni con lavaggi a base di alcol graduato e soluzione di lavaggio.
  3. Eseguire il recupero dell'epitopo indotto dal calore riscaldando le sezioni a 100 °C per 20 minuti nella soluzione di recupero dell'epitopo 1 e applicare un blocco di perossido per 5 minuti per estinguere l'attività della perossidasi endogena.
  4. Applicare anticorpi primari (ad es. anti-CD31 o anti-actina muscolare liscia) a concentrazioni appropriate diluite nel diluente anticorpale riducente di fondo. Incubare le sezioni con un polimero di perossidasi di rafano per 8 minuti e colorare le sezioni con una soluzione cromogena per 10 minuti. Controcolorare i vetrini con ematossilina per 5 minuti.

11. Ibridazione cromogenica in situ RNAScope

  1. Eseguire la colorazione utilizzando un sistema automatizzato con un kit appropriato e il kit di rilevamento del rosso di affinamento del polimero secondo il protocollo del produttore.
  2. Cuocere le sezioni per 30 minuti a 60 °C, quindi decerare le sezioni per 30 s in una soluzione di decera riscaldata a 72 °C.
  3. Reidratare i tessuti con lavaggi a base di etanolo assoluto e soluzione di lavaggio.
  4. Trattare le sezioni con la soluzione di recupero dell'epitopo 2 per 15 minuti a 95 °C e incubare le sezioni con una soluzione enzimatica per 15 minuti a 40 °C.
  5. Ibridare i campioni con le sonde RNAScope appropriate per i geni bersaglio.
  6. Utilizzare una sonda genica per la pulizia a media espressione (ad es. peptidilprolil isomerasi B) per confermare l'abbondanza e l'integrità dell'RNA adeguate.

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Risultati

I tessuti omentali umani sono stati ottenuti da pazienti sottoposti a interventi chirurgici addominali clinicamente indicati. Piccole arterie di resistenza (100-300 μm di diametro) sono state meticolosamente isolate dai tessuti adiposi e connettivi circostanti al microscopio da dissezione (Figura 1A-C). Le arterie isolate sono state pulite, cannulate con successo e montate sulle cannule di vetro nella camera del miografo di coltura per la pressurizzazione (<...

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Discussione

I progressi nell'imaging medico, nelle tecniche chirurgiche e nelle metodologie di ricerca hanno migliorato la nostra comprensione dell'architettura vascolare 3D, rivoluzionando la diagnostica, la pianificazione chirurgica e la ricerca 17,18,19,20. Nonostante queste innovazioni, la conservazione della struttura 3D delle arterie di resistenza umana isolate riman...

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Dichiarazioni

NIAID GenAI è stato utilizzato per generare uno schema iniziale e una bozza del manoscritto, che è stato accuratamente scritto, rivisto e modificato dagli autori umani per garantire accuratezza e coerenza.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata finanziata dalla Divisione di Ricerca Intramurale dell'Istituto Nazionale di Allergie e Malattie Infettive, progetto numero AI001150 all'HCA. Ringraziamo il nostro ex membro del laboratorio, il dottor Steven Brooks, e i nostri attuali membri del laboratorio, Mohamed Ibrahim, Mary Jackson e Jian Wu della sezione di genomica funzionale della malaria, per la loro assistenza nell'acquisizione di immagini durante il processo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Alcol Acido al 1%StatLab  SL89-1
10% NBSLeica Biosystems3800598
Fotocamera HDMI per microscopia 4KHitech Instruments, Inc.HT-XP4K8MA
Diluente di anticorpi - Riduzione di fondoDakoS3022
Processore Automatico di Tessuti & nbsp;Leica BiosystemsHistoCore PEGASUS/Cat# 14048858005
Soluzione di Dewax BondLeica BiosystemsAR9222
Soluzione per il recupero degli epitopi in legame 1Leica BiosystemsAR9961
Soluzione di Recupero Epitopo Bond 2Leica BiosystemsAR9640
Rilevamento della raffinazione dei polimeri legatiLeica BiosystemsDS9800
Rilevamento del rosso raffinato del polimero di legameLeica BiosystemsDS9390
Soluzione di lavaggio per legame (10 volte)Leica BiosystemsAR9590
Pacchetto Cannula (vetro), 80 e linea; 100 & mu; mDMTCodice prodotto: 300407
CD31Abcamab28364
Piatti per la dissezione, grandi (vetro pyrex), 93 mmStrumentazione dei Sistemi ViventiSKU: DD-90
Piatti per la dissezione, piccoliStrumentazione dei Sistemi ViventiSKU: DD-50
Microscopio disseczionaleHitech Instruments, Inc.ZEISS SteREO Discovery.V8 
Pinza Dumont #5Strumenti scientifici di qualitàPunto n. 11295-10
Pinza Dumont #5SFStrumenti scientifici di qualitàPunto n. 11252-00
EcoMountBioCare MedicalEM897L
EosinaIHC WorldIW-3100B
EmatossilinaBioCare MedicalCathe-MM
Fotocamera IamgingOlyumpusDP28
Microscopio per immaginiOlyumpusBX51
Tampone Krebs Henseleit (con 2 mM di cloruro di calcio)Boston BioProducts, Inc.SKU: C-10625N-200mL
Buffer Krebs-Henseleit (senza calcio)Boston BioProducts, Inc.SKU: C-9906W-200mL
Media di montaggioThermoFisher Scientific4111
Camera e unità miograficaDMT202/204CM
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)Thermofisher Scientific10010023
PPIB  ACDBio313908
Kit di reagenti RNAscope 2.5 LS-REDACDBio322150
TintoreLeicaSistema automatizzato Leica Bond RX
Perni di sezione in acciaio inoxStrumentazione dei Sistemi ViventiSKU: PIN-0,1MM | PIN-0,2MM | PIN-#3 | PIN-VP-1
Paraplasto ChirurgicoLeica Biosystems39601006
Tissue Guard GelStatLab  TissueGuard/SKU: TG12
Forbici a molla Vannas - filo da taglio da 2 mmStrumenti scientifici di qualitàPunto n. 15000-03
Forbici a molla Vannas - filo da taglio da 2,5 mmStrumenti scientifici di qualitàPunto n. 15000-08
Forbici a molla Vannas - filo da taglio da 3 mmStrumenti scientifici di qualitàPunto n. 15000-00
α-SMAAbcamab5694

Riferimenti

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