Articolo metodologico

Iniezione guidata da ecocardiografia per la somministrazione mirata e affidabile di cellule staminali intramiocardiche in un modello di infarto miocardico di ratto

DOI:

10.3791/68775

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25 luglio 2025

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1Cardio & Organ Systems (COST), Biomedical Research Institute, UHasselt

In questo articolo

Sommario

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Questo articolo descrive in dettaglio un protocollo ottimizzato per le iniezioni intramiocardiche guidate dall'ecocardiografia in modelli di ratto di infarto miocardico utilizzando un ago da 29 G x 88 mm. Questa tecnica garantisce una somministrazione robusta, precisa e riproducibile di agenti terapeutici direttamente nella zona peri-infartuale.

Abstract

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L'iniezione intramiocardica guidata da ecocardiografia (EGI) è una tecnica minimamente invasiva per la somministrazione di terapie con cellule staminali in modelli preclinici di infarto del miocardio (IM). Rispetto ai tradizionali approcci a torace aperto, l'EGI offre una migliore traducibilità clinica, una ridotta invasività e un impatto fisiologico minimizzato sull'animale. Sebbene l'EGI sia ben consolidato nei modelli murini, la sua applicazione nei ratti rimane limitata a causa di sfide anatomiche e tecniche. In particolare, l'assottigliamento della parete anteriore del ventricolo sinistro (LVAW) nelle regioni infartuate e peri-infartuali complica la somministrazione miocardica sicura e accurata, poiché lo spessore della parete può scendere al di sotto della dimensione dello smusso dell'ago degli aghi da 27 G o 28 G comunemente usati, aumentando il rischio di perforazione ventricolare o mancata consegna. Per risolvere questa limitazione, abbiamo ottimizzato un protocollo per EGI nei modelli di MI di ratto utilizzando aghi Spinocan da 29 G. L'ago di diametro più piccolo e più lungo consente di indirizzare con precisione il tessuto miocardico sottile, riducendo al minimo i danni e migliorando l'accuratezza dell'iniezione, indipendentemente dallo spessore LVAW. Questa tecnica è compatibile con le piattaforme standard di ecocardiografia transtoracica ed elimina la necessità di toracotomia, consentendo studi longitudinali nello stesso animale. Il nostro metodo raffinato consente una somministrazione robusta e riproducibile di agenti terapeutici nel miocardio vitale adiacente alla zona dell'infarto, dove le terapie rigenerative sono più efficaci. Migliorando la sicurezza e la precisione del targeting, questo approccio aumenta la rilevanza traslazionale della ricerca cardiaca preclinica e supporta lo sviluppo di protocolli standardizzati tra i laboratori.

Introduzione

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Le malattie cardiovascolari rimangono la principale causa di morbilità e mortalità in tutto il mondo, con l'infarto del miocardio che contribuisce in modo significativo alle condizioni cardiache acute e croniche1. Nonostante i progressi nella gestione farmacologica e interventistica, la capacità rigenerativa del cuore umano adulto è limitata, spesso con conseguente rimodellamento avverso e progressione verso l'insufficienza cardiaca 2,3. Di conseguenza, le terapie basate sulle cellule staminali hanno guadagnato attenzione come potenziali strategie per riparare il miocardio danneggiato, preservare la funzione cardiaca e migliorare i risultati clinici4.

Solidi modelli preclinici sono essenziali per valutare la sicurezza, l'efficacia e le strategie di somministrazione di queste terapie. Tra i modelli di piccoli animali, i ratti offrono diversi vantaggi, tra cui dimensioni cardiache gestibili, tecniche di infarto ben caratterizzate e risposte di rimodellamento cardiaco rilevanti dal punto di vista traslazionale5. Convenzionalmente, la somministrazione intramiocardica di cellule staminali in modelli di infarto miocardico di ratto avviene tramite toracotomia, consentendo la visualizzazione diretta del sito di iniezione6. Tuttavia, questo approccio è invasivo, introduce rischi procedurali significativi e impedisce interventi ripetuti negli studi longitudinali. Inoltre, manca di allineamento con le modalità di somministrazione clinica, come l'iniezione percutanea o catetere7.

L'iniezione intramiocardica guidata dall'ecocardiografia (EGI) è un'alternativa minimamente invasiva che consente la somministrazione mirata di agenti terapeutici sotto la guida dell'imaging in tempo reale. Sebbene ben consolidato nei modelli murini, l'uso di EGI nei modelli di ratto è stato limitato. L'EGI è più ampiamente sviluppato nei topi che nei ratti, principalmente perché la maggior parte della ricerca cardiovascolare si è storicamente concentrata sui topicome modello preclinico dominante. Inoltre, le dimensioni ridotte e l'anatomia del cuore dei topi hanno consentito l'ottimizzazione delle procedure guidate da ultrasuoni9. Al contrario, i ratti hanno una parete toracica più spessa e un maggiore movimento respiratorio, complicando l'imaging stabile e ad alta risoluzione durante le procedure10.

I progressi nella tecnologia degli ultrasuoni ad alta frequenza hanno reso fattibile l'EGI nei ratti, migliorando la rilevanza clinica del loro utilizzo. Tuttavia, l'assottigliamento della parete anteriore ventricolare sinistra (LVAW) nelle regioni infartuate rimane una sfida importante per l'EGI nei roditori. Nei ratti, lo spessore della parete spesso diminuisce a meno di 1 mm, mentre gli aghi standard da 27 G o 28 G hanno lunghezze di smusso di 1,25-1,5 mm, aumentando il rischio di perforazione ventricolare o di consegna di cellule mal dirette. Per ovviare a questa limitazione, abbiamo perfezionato la tecnica EGI nei ratti utilizzando aghi Spinocan da 29 G x 88 mm. Questi aghi sono caratterizzati da una lunghezza smussata di 1 mm, che consente una consegna precisa e atraumatica delle cellule nel miocardio assottigliato delle regioni dell'infarto e del peri-infarto. La procedura viene eseguita utilizzando l'ecocardiografia transtoracica ad alta risoluzione, che consente la visualizzazione in tempo reale sia dei punti di riferimento anatomici che della traiettoria dell'ago.

Questo raffinato protocollo EGI fornisce un metodo minimamente invasivo e riproducibile per la somministrazione mirata di agenti terapeutici nel miocardio peri-infartuale in modelli di ratto di infarto miocardico acuto e cronico, indipendentemente dallo spessore LVAW. Facilita l'iniezione in zone di confine vitali, siti critici per ottenere benefici terapeutici, riducendo significativamente il carico chirurgico e i tempi di recupero rispetto agli approcci a torace aperto. Inoltre, supporta studi longitudinali che prevedono iniezioni ripetute e imaging di follow-up, riducendo così il numero di animali in conformità con il principio 3R (Replacement, Reduction, Refinement)11. Il protocollo è adattabile per la somministrazione di agenti farmacologici, terapie geniche, biomateriali e vari tipi di cellule staminali. Standardizzando l'EGI nei modelli di ratto e allineandosi con le modalità di somministrazione clinica, questo approccio migliora la riproducibilità tra i laboratori e rafforza la rilevanza traslazionale della ricerca cardiaca preclinica.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico Locale di UHasselt (Commissione Etica per la Sperimentazione Animale, UHasselt, Diepenbeek, Belgio, ID202308 e ID202497) e condotti in conformità con la Direttiva UE 2010/63/UE.

1. Configurazione dell'attrezzatura

  1. Accendi la piattaforma di imaging a ultrasuoni, la piattaforma riscaldata integrata, l'unità di monitoraggio fisiologico e lo scaldagel.
    NOTA: Per consentire una visualizzazione chiara e sufficientemente dettagliata della parete anteriore del ventricolo sinistro durante la procedura EGI, si consiglia un sistema a ultrasuoni ad alta frequenza dotato di un trasduttore lineare ≥ 15 MHz che fornisce una risoluzione assiale di circa 75 μm.
  2. Accendi il termoforo per mantenere la temperatura corporea del ratto durante la depilazione del torace.
  3. Selezionare il trasduttore appropriato e inizializzare il motore 3D per garantire la gamma completa di movimento del trasduttore.
    NOTA: Oltre all'utilizzo del micromanipolatore del sistema di ringhiere della piattaforma dell'animale, il motore 3D consente regolazioni del trasduttore altamente precise, che possono facilitare l'allineamento con l'ago di iniezione quando necessario. Se necessario, la procedura può essere eseguita anche senza il motore 3D.
  4. Assicurarsi che il sistema sia allineato correttamente prima dell'imaging. Impostare il micromanipolatore di viti che controllano la piattaforma animale in una posizione neutra (cioè centrata all'interno dell'intera gamma di movimento). Centrare la piattaforma per animali stessa al centro del sistema di ringhiere. Posizionare il sistema di montaggio del trasduttore in modo che il trasduttore sia allineato direttamente sopra il centro della piattaforma per animali.

2. Preparazione animale e anestesia

  1. Pesare il ratto e calcolare il volume richiesto di buprenorfina (0,04 mg/kg) da somministrare per alleviare il dolore.
  2. Posizionare il ratto in una camera di induzione collegata a una macchina per anestesia. Indurre l'anestesia con isoflurano al 2,5% integrato con ossigeno a una velocità di flusso di 2 L/min.
  3. Una volta indotta l'anestesia, trasferire il ratto su un termoforo per mantenere la temperatura corporea a 37 0,5 °C. Mantenere un'anestesia adeguata posizionando il muso del ratto in un cono nasale collegato al sistema di anestesia, erogando un flusso costante di isoflurano all'1-3% integrato con 1-1,5 L/min di ossigeno, regolato secondo necessità per garantire un'adeguata sedazione.
  4. Radere il torace del ratto e rimuovere i peli residui con una crema depilatoria. Dopo la depilazione, disinfettare il sito di iniezione alternando un agente di scrub chirurgico appropriato (ad es. iodio povidone) con etanolo al 70%, ripetuto 3 volte. Applicare il gel oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza.
  5. Somministrare la dose precalcolata di buprenorfina per via intramuscolare nella zampa posteriore per ridurre al minimo il disagio correlato all'EGI.
  6. Trasferisci il ratto dal termoforo alla piattaforma animale del sistema di imaging a ultrasuoni. Garantire un'erogazione costante dell'anestesia attraverso il cono nasale integrato nella piattaforma, mantenendo un flusso costante di isoflurano all'1-3% in 1-1,5 L/min di ossigeno. Fissare le zampe del ratto sugli elettrodi della piattaforma, applicando una piccola quantità di gel per elettrodi per garantire una qualità ottimale del segnale. Inserire la sonda di temperatura rettale per il monitoraggio continuo della temperatura corporea.
    NOTA: Il monitoraggio continuo dei parametri fisiologici è essenziale durante le procedure di imaging e iniezione. La frequenza cardiaca (HR), la frequenza respiratoria (RR) e la temperatura corporea del ratto devono rimanere entro intervalli accettabili per evitare complicazioni correlate all'anestesia. Come guida generale, la FC dovrebbe essere compresa tra 250 e 400 bpm, mentre la RR dovrebbe essere di almeno 30 respiri al minuto. Se HR o RR scendono al di sotto di queste soglie, diminuire immediatamente la concentrazione di isoflurano (ad esempio, dal 2-3% all'1-2%) e verificare che l'animale rimanga posizionato correttamente e non diventi ipotermico. Gli aggiustamenti dovrebbero essere effettuati gradualmente, con un attento monitoraggio fino a quando i parametri non torneranno ai livelli target.
  7. In questa fase, acquisire le immagini di base o pre-iniezione desiderate. In generale, le immagini dell'asse lungo parasternale (PSLAX) e dell'asse corto (SAX) sia in modalità B che in modalità M, insieme alle immagini a quattro camere, sono raccomandate per la valutazione funzionale e anatomica di base.
    NOTA: L'imaging generale può essere eseguito con il sistema configurato come mostrato nella Figura 1A. Per la procedura di iniezione, la piattaforma dell'animale dovrà essere riposizionata e il trasduttore regolato di conseguenza. Sebbene l'imaging PSLAX B-mode venga utilizzato come guida durante l'iniezione, queste immagini potrebbero non essere ottimali per le analisi funzionali post-hoc a causa della necessità di un allineamento preciso dell'ago.

3. Procedura di iniezione intramiocardica guidata da ecocardiografia

NOTA: Da questo punto in poi, sono necessari due operatori per eseguire con successo l'iniezione. L'operatore A è responsabile della manipolazione della piattaforma animale e del monitoraggio dell'immagine ecocardiografica in tempo reale, mentre l'operatore B deve posizionarsi dietro il supporto per iniezione per allineare accuratamente l'ago e il trasduttore.

  1. Preparare il sistema di iniezione inserendo un ago guida da 22 G a una siringa da 1 mL. Posizionare la siringa con l'ago guida sul supporto per iniezione e fissare il morsetto per iniezione.
    NOTA: L'ago da 29 G x 88 mm è troppo flessibile per perforare direttamente la pelle e gli strati muscolari; L'ago guida è necessario per facilitare l'iniezione.
  2. Allineare il trasduttore con il supporto di iniezione per assicurarsi che l'ago possa essere visualizzato. Regolare la posizione del trasduttore utilizzando il supporto del trasduttore e il morsetto di supporto e, se necessario, ruotare il supporto di iniezione lungo la guida per ottenere l'allineamento appropriato.
  3. Senza muovere il ratto, ruotare la piattaforma dell'animale in modo che la tacca del trasduttore punti verso la spalla destra del ratto (Figura 1B-D). Questa configurazione consente l'acquisizione di una chiara immagine PSLAX B-mode del ventricolo sinistro. Verificare che l'ago guida rimanga all'interno del campo di movimento del trasduttore. Se disallineato, regolare la posizione del trasduttore tramite il sistema motore 3D piuttosto che modificare il supporto di iniezione.
  4. Una volta ottenuto il corretto allineamento ago-trasduttore, mettere a punto l'imaging utilizzando le viti del micromanipolatore della guida della piattaforma animale. Mantenere la posizione del trasduttore per preservare l'allineamento con l'ago. Potrebbe essere necessaria un'ulteriore rotazione o traslazione della piattaforma animale per ottimizzare la qualità dell'immagine.
  5. Visualizza l'area infartuata. Valutare l'estensione dell'infarto, il movimento regionale della parete e l'assottigliamento della parete, utilizzando sia l'imaging PSLAX in modalità B che in modalità M per valutare la fattibilità del sito di iniezione. Applicare un approccio di punteggio del movimento della parete a 16 segmenti per identificare le regioni acinetiche o gravemente ipocinetiche, che rappresentano il nucleo dell'infarto.
  6. Identificare la zona peri-infartuale e selezionare il sito di iniezione target. Scegliere un'area ipocinetica adiacente al nucleo dell'infarto con uno spessore della parete telediastolica maggiore di 1 mm, che consenta l'inserimento completo dello smusso dell'ago da 29 G con un angolo ridotto.
  7. Utilizzando il sistema di binari, far avanzare il supporto di iniezione verso la piattaforma per animali. Allineare con precisione l'ago con il centro esatto del trasduttore utilizzando le viti del micromanipolatore sul supporto di iniezione.
    NOTA: L'allineamento preciso è fondamentale. Se l'ago non è centrato sul trasduttore, non sarà visibile durante l'iniezione.
  8. Far avanzare l'ago guida utilizzando la vite di micromanipolatore per iniezione sul supporto di iniezione fino a perforare la pelle. Verificare che la punta dell'ago sia visibile nell'immagine ecografica. Se l'ago non è visibile, ritrarlo con cautela utilizzando la vite del micromanipolatore "inject" e ripetere il passaggio 3.7 per riallinearlo.
  9. Attiva la funzione di guida dell'ago nel software a ultrasuoni per confermare la traiettoria dell'ago. Far avanzare l'ago guida verso la regione target predeterminata, posizionando lo smusso dell'ago a circa 1-2 mm dalla parete anteriore del ventricolo sinistro (LVAW) (Figura 2A).
    NOTA: Evitare di perforare il miocardio con l'ago guida per evitare sanguinamenti eccessivi o lesioni cardiache.
  10. Una volta posizionato l'ago, chiedere all'operatore A di stabilizzare saldamente l'ago guida alla sua base garantendo una visualizzazione costante dell'ago sullo schermo ecografico. Contemporaneamente, chiedere all'operatore B di allentare il morsetto che fissa la siringa, rimuovere la siringa e preparare la siringa iniettata. Istruire l'operatore A a mantenere fermo l'ago guida.
  11. Inserire l'ago da 29 G x 88 mm sulla siringa contenente l'iniettato (Operatore B) e fissare la siringa sul supporto per iniezione. Guidare manualmente l'ago da 29 G x 88 mm attraverso l'ago di guida fisso, effettuando piccole regolazioni con le viti del micromanipolatore sul piano dell'asse x (a sinistra o a destra della sonda), se necessario. Avanzare manualmente fino a quando lo smusso dell'ago diventa visibile nella cavità toracica all'ecografia.
    NOTA: A causa della flessibilità dell'ago da 29 G, potrebbe piegarsi durante l'inserimento nella cavità toracica. Per ridurre al minimo questo problema, l'operatore A può stabilizzare la parte esterna dello stelo dell'ago mentre l'operatore B fa avanzare l'ago nella cavità toracica.
  12. Una volta che l'ago da 29 G x 88 mm passa attraverso l'ago guida e diventa visibile all'ecografia, fatelo avanzare nel miocardio del LVAW utilizzando le viti del micromanipolatore per una maggiore precisione e sicurezza. Verificare che lo smusso dell'ago si trovi interamente all'interno del miocardio (Figura 2B).
    NOTA: A causa dello smusso relativamente lungo dell'ago da 29 G rispetto allo spessore della parete miocardica, è fondamentale assicurarsi che l'intero smusso sia incorporato all'interno del miocardio. Utilizzare la funzione "Blocca immagine" per verificare il posizionamento, se necessario. Sebbene la calibrazione della profondità degli ultrasuoni possa aiutare la precisione, in questo protocollo abbiamo verificato la profondità selezionando i siti di iniezione con uno spessore della parete telediastolica >1 mm e confermando visivamente che la punta dell'ago si avvicinava, ma non violava, il bordo endocardico (Figura 2B).
  13. Iniettare lentamente l'iniettato nel miocardio (Operatore B). Il successo dell'iniezione intramiocardica è confermato visivamente da un punto ecogeno luminoso/denso nel sito di iniezione, che dovrebbe muoversi in modo sincrono con il LVAW (Figura 2C). Per ridurre al minimo il riflusso dell'iniettato, attendere circa 10 s dopo aver completato l'iniezione prima di ritrarre l'ago.
  14. Innanzitutto, rimuovere la siringa con gli aghi dal supporto per iniezione per ridurre al minimo il rischio di lesioni da puntura d'ago. Quindi, rimuovi con cura il ratto dalla piattaforma dell'animale e lascialo riprendersi su un termoforo. Monitorare continuamente i parametri vitali fino al completo recupero dall'anestesia.

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Risultati

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Convalida dell'accuratezza dell'iniezione mediante imaging a bioluminescenza in vivo ed ex vivo (BLI)
Per valutare il successo e l'efficienza dell'EGI, le cellule staminali sono state prima trasdotte per esprimere la luciferasi della lucciola (Fluc) tramite un vettore lentivirale, consentendo il monitoraggio in vivo mediante imaging a bioluminescenza (BLI). BLI ha confermato...

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Discussione

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Con l'avanzare della ricerca preclinica incentrata sulle terapie rigenerative per ripristinare il cuore dopo gli infarti del miocardio, gli ostacoli relativi alla somministrazione ottimale dell'agente terapeutico rimangono12. Le tecniche di EGI minimamente invasive sono sempre più favorite rispetto agli approcci a torace aperto perché imitano meglio la somministrazione percutanea clinica, migliorano il benessere degli animali e consentono somministrazioni ripetute...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Kim Nijsten per l'assistenza con l'imaging a fluorescenza. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da un mandato Baekeland per l'innovazione e l'imprenditorialità delle Fiandre (VLAIO) (HBC.2021.0811).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
21? Trasduttore MHz MX250FUJIFILM VisualSonics, Inc./Trasduttore ecografico ad alta frequenza compatibile con il sistema Vevo 3100
Nastro chirurgico 3M Transpore3M1527Per assicurare le zampe dell'animale alla piattaforma per animali
Aquasonic  100 Gel per la trasmissione degli ultrasuoniLaboratori Parker BV01-08Assicura un corretto accoppiamento acustico tra il trasduttore e la pelle dell'animale per una qualità dell'immagine ottimale
Bupaq 0,3 mg/mL Soluzione iniettabile per cani e gattiRichter Pharma AG57446/4008Analgesico oppioide (buprenorfina) somministrato per la gestione del dolore
ISOFLUTEK  1000Alivira/Anestetico per inalazione a base di isoflurano
Scaldagel multiflacone 230 VLaboratori Parker BV83-03-20 CE (LCD)Riscalda il gel per ultrasuoni alla temperatura corporea per prevenire l'ipotermia del disagio animale
Gel per elettrodi SignagelLaboratori Parker BV15-25Applicato agli elettrodi ECG per migliorare la conduzione del segnale per il monitoraggio fisiologico
SPINOCAN 29 G X 88 MMBbraun4501900Ago di calibro fine per un'iniezione intramiocardica precisa
Terumo siringa in 3 parti con ago ipodermico precollegatoTerumo Europe N.V.MDSS01S2516EUtilizzato per montare e fissare l'ago guida da 22 G e l'ago per iniezione da 29 G per un'erogazione controllata nel miocardio.
Unità di monitoraggio fisiologico THM150FUJIFILM VisualSonics, Inc./Monitora i segni vitali come la frequenza cardiaca, la frequenza respiratoria e la temperatura corporea dell'animale durante la procedura
Veet Minima PuroReckitt Benckiser/Crema depilatoria
Vevo 3100FUJIFILM VisualSonics, Inc./Ecografo ad alta risoluzione 
Vidisic carbomerum 980 2mg/g gel oftalmicoBausch + Lomb/Applicato agli occhi di animali anestetizzati per prevenire l'essiccazione corneale

Riferimenti

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