Qui, presentiamo un protocollo per una tecnica di raccolta del sangue ottimizzata in soggetti murini attraverso la venipuntura venosa facciale utilizzando una lancetta. Utilizziamo questa tecnica insieme alla valutazione citofluorimetrica per caratterizzare i fenotipi cellulari di ceppi transgenici, congenici e reporter. È adatto anche per l'analisi delle citochine sieriche e gli studi sul diabete.
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Articolo metodologico
Vena facciale Venipuncture per la raccolta del sangue murino
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo articolo presenta un protocollo ottimizzato per la raccolta di sangue murino tramite venipuntura venosa facciale utilizzando una lancetta, offrendo un'alternativa rapida, minimamente invasiva ed economica ad altre tecniche comuni come il campionamento della vena caudale e retro-orbitale. Questa tecnica è particolarmente vantaggiosa per gli studi che richiedono campionamenti ripetuti, come la fenotipizzazione dei topi, l'analisi delle citochine sieriche e la ricerca sul diabete. Il protocollo è efficiente, richiede un'attrezzatura specializzata minima ed è adatto per l'analisi cellulare ad alto rendimento nei topi. La nostra applicazione principale è la fenotipizzazione di topi transgenici, congenici e reporter utilizzando la citometria a flusso, dimostrata qui con la colorazione degli anticorpi e i topi reporter tdTomato. Il documento delinea la procedura completa, dalla preparazione dell'animale all'analisi del campione. Le fasi principali includono la raccolta del sangue con una lancetta da 3 mm, la lisi cellulare, la colorazione e la profilazione citofluorimetrica. La venipuntura venosa facciale migliora l'efficienza della raccolta supportando al contempo le pratiche di ricerca etica. Questo metodo, pratico e adattabile, è adatto a un'ampia gamma di protocolli sperimentali che coinvolgono il prelievo di sangue murino e l'analisi cellulare.
Introduzione
Una raccolta del sangue efficiente, riproducibile e minimamente invasiva è essenziale per molti studi murini, in particolare quelli che richiedono campionamenti ripetuti. Questo protocollo fornisce un metodo semplificato per la raccolta di piccoli volumi di sangue mediante venipuntura venosa facciale, seguita da lisi dei globuli rossi, colorazione degli anticorpi e analisi citofluorimetrica. Questo flusso di lavoro è particolarmente adatto per applicazioni ad alta produttività, riducendo al minimo le complessità tecniche.
Molti metodi di raccolta del sangue, come il sanguinamento retro-orbitale o l'incisione della vena caudale, possono richiedere procedure che coinvolgono calore, anestesia1 e tempi di manipolazione prolungati, che possono causare un notevole disagio all'animale2. Al contrario, la venipuntura venosa facciale con lancetta offre un'alternativa semplice e rapida che supporta un disegno sperimentale etico e riproducibile. Questo metodo è stato convalidato in studi precedenti come alternativa umana per il prelievo di sangue di piccole quantità nei topi3.
Illustriamo questo metodo fenotipizzando le cellule immunitarie di topi transgenici e reporter, inclusi i topi reporter TdTomato e i topi MD4-IgHEL. Quest'ultimo richiede la colorazione con anticorpi contro CD19 e IgMa, un allotipo IgM.
Sebbene questo protocollo sia stato sviluppato per la profilazione cellulare del sangue, può essere facilmente adattato per altri usi, tra cui l'analisi delle citochine sieriche, il rilevamento di anticorpi specifici o la misurazione del glucosio, omettendo la fase di lisi dei globuli rossi. Nel complesso, questa tecnica migliora la qualità dei dati e l'efficienza sperimentale, causando al contempo un disagio minimo agli animali, rendendola ampiamente utile in diverse applicazioni di ricerca.
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Protocollo
I topi sono stati alloggiati in un ambiente specifico privo di agenti patogeni presso il Dartmouth Hitchcock Medical College, un'istituzione accreditata AAALAC, e utilizzati in conformità con un protocollo approvato dall'Institutional Animal Care and Utilization Committee.
1. Raccolta dei materiali
- Preparare provette di coltura da 5 ml, ciascuna contenente 1,5 ml di 1x tampone di lisi dei globuli rossi (RBC) (10x lisi dei globuli rossi diluita con acqua sterile). Usa un tubo per topo.
- Raccogli una scatola di lancette da 3 mm (una lancetta per topo).
- Raccogli una scatola di spugne di garza (una spugna di garza per topo).
- Raccogliere le pipette di trasferimento e una provetta conica da 50 mL contenente 1x HBSS con 0,5 mM EDTA (sufficiente per un massimo di 20 topi).
NOTA: Questo tampone viene utilizzato per arrestare la reazione di lisi. Se il tampone è necessario solo per la fenotipizzazione e non per ulteriori analisi a valle, la maggior parte dei tamponi neutri con pH 7,2-7,4 può essere utilizzata al posto dell'HBSS. - Portare con sé un secchiello per il ghiaccio, 1 tampone di lisi dei globuli rossi, provette da 5 ml e pipette di trasferimento.
2. Etichettatura di mouse e tubi
- Etichettare ogni scheda gabbia e topo con un identificatore del fenotipo che corrisponda alle etichette su ciascun tubo per aiutare a distinguere quali risultati sono correlati a quale topo. Gli identificatori comunemente usati includono diversi colori di pennarelli indelebili (ad esempio, rosso, blu, verde, nero) sulla coda dei topi, che corrispondono ai segni sul tubo.
NOTA: Includere sempre un mouse di controllo per la fenotipizzazione. Per i topi reporter, assicurarsi di avere un controllo reporter negativo. Per i topi transgenici, includere un topo wild-type come controllo. - Disporre le provette etichettate in una rastrelliera con un secchiello per il ghiaccio nelle vicinanze per conservare le provette subito dopo il prelievo del sangue.
- Aprire tutte le lancette necessarie per la procedura.
- Aprire tutte le spugne di garza necessarie per la procedura.
3. Manipolazione del mouse e raccolta dei campioni
- Usa la mano dominante per afferrare il mouse per la coda e posizionarlo su una griglia di alimentazione a filo o su qualsiasi superficie piana.
- Usa l'indice e il pollice non dominanti per collottolare il mouse manovrando dalla coda verso la regione cervicale.
- Usa le dita rimanenti per fissare la coda, riducendo al minimo il movimento del mouse.
- Utilizzare la mano dominante per recuperare una lancetta da 3 mm aperta.
- Individua la piccola macchia glabra appena oltre la bocca e traccia una linea retta verso l'orecchio. Fermati nel punto in cui la linea si interseca con l'angolo esterno dell'occhio (Figura 1).
- Inserire la lancetta in corrispondenza di questa intersezione per garantire un ampio afflusso di sangue.
- Usa il bordo laterale piatto della lancetta per raccogliere una singola goccia di sangue.
- Depositare l'intera lancetta, con il campione di sangue, nella provetta etichettata contenente il tampone di lisi dei globuli rossi.
- Agitare delicatamente la provetta per assicurarsi che l'intero campione sia miscelato nel tampone. Una miscelazione incompleta può causare coagulazione e scarsa qualità dei dati.
- Utilizzare una spugna di garza per applicare una leggera pressione sul sito di puntura per 5-10 s.
- Rimetti il topo nella sua gabbia.
- Mantenere un rapporto tampone sangue/lisi superiore a 1:10.
- Ripetere i passaggi descritti in questa sezione per ogni mouse aggiuntivo.
4. Lisi, preparazione e analisi del campione
- Attendere 7-10 minuti dopo l'inizio della lisi, aggiungere circa 2 mL di 1x HBSS con 0,5 mM EDTA (o altri terreni).
- Provette da centrifuga a 400 g per 5 min. Prepara cocktail di anticorpi durante questo periodo.
- Scartare il surnatante.
- Rimuovere le lancette dai tubi usando una pinza.
- Aggiungere 30 μl di un cocktail di anticorpi progettato per identificare le popolazioni cellulari desiderate.
NOTA: Per fenotipizzare i topi MD4 IgHEL, il nostro cocktail consisteva in 1 mL di HBSS, 25 μL di IgMa PerCP cy-5.5 e 25 μL di CD19 APC. - Risospendere le cellule mediante vortice per 2-3 s e incubare per 25-30 minuti a 4 °C.
- Accendere il citometro a flusso e configurare i diagrammi di flusso in base alle esigenze dell'esperimento.
NOTA: Non è necessario ruotare le cellule dopo la colorazione se l'obiettivo è la fenotipizzazione. - Aggiungere 150-25 μl di HBSS o altri terreni a ciascun campione utilizzando una pipetta di trasferimento. Se necessario, DAPI può essere aggiunto a una concentrazione finale di 1 μg/mL (utilizzare 10 μL di terreno contenente DAPI).
- Agitare ogni campione per 2-3 s appena prima dell'acquisizione.
- Acquisizione di dati 8.000-10.000 eventi/s, puntando a 100.000 cellule se la lisi è stata efficace.
- Analizzare i dati acquisiti, illustrati in Figura 2 e Figura 3.
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Risultati
Utilizzando la citometria a flusso, la Figura 2 mostra il sangue lisato di topi reporter wild-type (WT) e PF4-Cre TdTomato, preparati utilizzando il protocollo sopra descritto. La prima serie di diagrammi di flusso mostra la dispersione laterale (SSC), che riflette la granularità delle celle, rispetto alla dispersione diretta (FSC), che indica la dimensione delle celle. I detriti cellulari e le piastrine si osservano vicino a...
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Discussione
Questo protocollo ottimizzato di raccolta del sangue della vena facciale fornisce un'alternativa efficiente e semplice ad altri metodi di uso comune, come il sanguinamento della vena caudale o retro-orbitale. Sebbene il protocollo sia semplice e diretto, è necessario seguire attentamente alcuni passaggi critici. Il passaggio più importante da eseguire correttamente è il corretto posizionamento del sito di puntura4. Puntare la posizione appropriata sulla guancia ga...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health Grant: R35 HL155458 (C.V.J.)
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anticorpo anti-topo APC CD19 | Biolegend | 152410 | CD19 APC |
| Centrifuga 5810 R, senza rotore, 120 V, 50/60 Hz | Eppendorf | 22625501 | Centrifuga |
| Spugne di garza Dermacea 8 strati 2" x 2" | Covidien | 441211 | Guaze Ponges |
| Pipette di trasferimento graduate usa e getta | Fisherbrand | 13-711-91am | Pipetta di trasferimento |
| ErgoOne Single Channel Pipette (200 & micro; L) | USA Scientific | 7100-2200 | Pipetta |
| Etilediaminamina, Acido Tetraacetico (Soluzione 0,5 M/pH 8,0) | Fisherbrand | BP2482-100 | EDTA 5 M |
| Analizzatore di celle FACSymphony A3 | BD in Biologia | 660937 | Citometro di flusso |
| Fisherbrand Miscelatore a vortice analogico | Fisherbrand | 02-215-414 | Vortice |
| Goldenrod Animal Lancet 3 mm Sterile 5 vassoi da 200 | Verga d'oro | GR 3MM | Lancet 3 mm |
| Pinza Graefe | Strumenti scientifici di qualità | 11051-10 | Pinza |
| Hank' s Soluzione salina bilanciata, 1X senza calcio e magnesio | Corning | 21-021-CVR | HBSS |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse IgMa Anticorpi | Biolegend | 408612 | IgMa PerCP cy-5.5 |
| Buffer di lisi dei globuli rossi (10 volte) | Biolegend | 420301 | Buffer di lisi dei globuli rossi |
| Provette in polistirene a fondo rotondo senza tappo | Fisherbrand | FB1496110 | Tubi di coltura |
| Pennarelli permanenti con pennarello pennarello, punta a scalpello | Pennarello | 38254PP | Pennarelli e pennarelli; |
| Testati per l'acqua sterile USP | Corning | 25-055-CI | Acqua di grado coltura cellulare |
| Ricariche della punta della pipetta TipOne (200 & micro; L Naturale smussato | USA Scientific | 1111-1730 | Punte per pipette |
Riferimenti
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- Jo, E. J., Bae, E., Yoon, J. H., Kim, J. Y., Han, J. S. Comparison of murine retroorbital plexus and facial vein blood collection to mitigate animal ethics issues. Lab Anim Res. 37 (1), 12(2021).
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Ristampe e permessi
