Articolo metodologico

Rapida ottimizzazione di un sistema inducibile dalla luce per controllare l'espressione genica nei mammiferi

DOI:

10.3791/68779

⸱

4 novembre 2025

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of California, Davis, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Davis

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio descrive un metodo per esperimenti ad alto rendimento che utilizzano un array di LED stampato in 3D per ottimizzare l'espressione genica inducibile dalla luce nelle cellule HEK293T.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli strumenti di espressione genica inducibile possono aprire nuove applicazioni nella salute umana e nella biotecnologia, ma le opzioni attuali sono spesso costose, difficili da invertire e hanno effetti indesiderati fuori bersaglio. I sistemi optogenetici utilizzano proteine sensibili alla luce per controllare l'attività dei regolatori in modo tale che l'espressione sia controllata con la semplice pressione di un interruttore. Questo studio ottimizza un sistema effettore CRISPR (2pLACE) semplificato attivato dalla luce, che fornisce un controllo regolabile, reversibile e preciso dell'espressione genica dei mammiferi. L'OptoPlate-96 consente lo screening ad alto rendimento tramite citometria a flusso per l'analisi di singole cellule e l'ottimizzazione rapida di 2pLACE. Questo studio dimostra come utilizzare il sistema 2pLACE con l'OptoPlate-96 in celle HEK293T per identificare i rapporti ottimali dei componenti per massimizzare la gamma dinamica e per trovare la curva di risposta all'intensità della luce blu. Flussi di lavoro simili possono essere sviluppati per altre cellule di mammifero e per altri sistemi optogenetici e lunghezze d'onda della luce. Questi progressi migliorano la precisione, la scalabilità e l'adattabilità degli strumenti optogenetici per le applicazioni di bioproduzione.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli strumenti di biologia sintetica, come i sistemi di espressione genica inducibile, hanno fornito contributi significativi alla ricerca biologica. La loro capacità di regolare l'espressione genica in modo regolabile, reversibile e preciso può migliorare il controllo della produzione di proteine 1,2,3,4,5,6, la morfologia cellulare 7,8,9,10,11,12, le vie metaboliche 13,14,15,16,17,18 e altri obiettivi per la bioproduzione e le applicazioni terapeutiche. I sistemi inducibili da sostanze chimiche possono avereeffetti residui 19,20 o fuori bersaglio. Gli additivi chimici possono anche essere molto costosi e difficili da scalare industrialmente a causa di ulteriori processi di purificazione a valle 21,22,23. I sistemi di espressione genica inducibili dalla luce possono offrire un metodo scalabile e preciso per le pratiche di bioproduzione 24,25,26,27.

Molti sistemi di espressione genica inducibili dalla luce sono stati sviluppati come utili strumenti di biologia sintetica in una varietà di applicazioni 28,29,30,31,32,33,34,35,36 e lunghezze d'onda del blu 35,37,38, rosso/rosso lontano12,39,40 o luce verde41. Nel caso della regolazione genica optogenetica basata su CRISPR, la modifica della quantità di RNA guida individuali (gRNA) erogati può influenzare l'espressione dell'mRNA dei geni endogeni42 e dovrà essere ottimizzata per diverse linee cellulari. Possono essere utilizzate anche proteine di transattivazione come VP64 37,42,43,44, VP16 39,40,44,45,46, p6544 o fusioni di esse 47, aumentando la modularità dei sistemi optogenetici. Al fine di studiare i percorsi biologici complessi e intrecciati 12,40,48,49,50,51,52,53, possono essere testate diverse combinazioni di questi componenti noti. Inoltre, diverse linee cellulari possono mostrare differenze nell'induzione con lo stesso sistema52. Diversi livelli di induzione possono portare a un'espressione genica o a una sensibilità insufficiente nel controllo preciso dell'espressione genica, richiedendo test rigorosi per trovare un sistema optogenetico ottimale in linee cellulari nuove o più biologicamente rilevanti. Con un ritmo crescente e l'ampliamento dell'applicabilità della regolazione genica optogenetica, è imperativo caratterizzare rapidamente questi diversi sistemi.

I metodi attuali per la caratterizzazione degli strumenti optogenetici utilizzano l'espressione stabile o transitoria dei geni12,54. La generazione di linee cellulari che esprimono stabilmente e l'ottimizzazione della dinamica del sistema per la massima espressione possono richiedere molto tempo e quindi denaro. L'espressione transitoria consente di ottenere informazioni rapide e preziose, soprattutto quando si testano sistemi optogenetici multicomponente. Qui, abbiamo utilizzato il sistema effettore CRISPR-dCas9 attivato dalla luce blu (LACE)37, composto da criptocromo 2 (CRY2) e terminale N-terminale basic-helix-loop-helix (CIBN) che interagisce con il criptocromo. È stato utilizzato per controllare l'espressione genica in cellule di mammifero come HEK293T (cellule renali embrionali umane)37,38, CHO-DG44 (cellule ovariche di criceto cinese)55 e C2C12 (cellule mioblastiche di topo)38. La sua natura modulare è ideale per caratterizzare rapidamente le prestazioni del sistema attraverso l'espressione transitoria e metodi ad alto rendimento. Ad esempio, i sistemi multicomponente come il LACE possono richiedere l'ottimizzazione dei rapporti di massa per migliorare l'induzione, un passaggio non tipicamente impiegato nella caratterizzazione dei sistemi optogenetici.

Questo protocollo descrive in dettaglio la rapida ottimizzazione e caratterizzazione di due sistemi plasmidici LACE (2pLACE)38. In questa configurazione, 2pLACE controlla l'espressione di un reporter fluorescente, eGFP (enhanced green fluorescent protein), in HEK293T cellule. L'attivazione viene eseguita in piastre nere a 96 pozzetti con fondo di vetro utilizzando un OptoPlate-96, un array di LED stampato in 3D progettato e costruito da Lukasz Bugaj e colleghi 56,57,58,59. Questo protocollo ottimizza specificamente l'espressione massima con diversi rapporti di massa del sistema a due plasmidi. Include anche un codice di facile utilizzo per controllare diverse intensità luminose per studiare la sintonizzabilità del sistema e la sua gamma dinamica completa. La citometria a flusso viene utilizzata per la raccolta e l'analisi dei dati. I protocolli per la generazione di costrutti plasmidici e materiali di stampa 3D per l'array di LED possono essere trovati in pubblicazioni precedenti54,56. Questi metodi evidenziano una pipeline rapida e ad alto rendimento per la caratterizzazione di sistemi di espressione genica inducibili dalla luce.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Placcatura HEK293T celle in un formato a 96 pozzetti

  1. In una cappa di biosicurezza, raccogliere un contenitore per rifiuti di candeggina, pipette sierologiche, pipette-coadiuvanti, soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS), terreno di Eagle modificato con Dulbecco (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e una fiaschetta per colture cellulari T-75 con cellule HEK293T confluenti. Preriscaldare il fluido a 37 °C.
  2. In un pallone T-75, verificare che la confluenza sia circa l'80%-100% confluente attraverso un microscopio invertito.
  3. Nella cappa di biosicurezza, utilizzare una pipetta sierologica per aspirare il terreno esaurito dal pallone per colture cellulari. Evitare di toccare la superficie o la plastica del pallone. Smaltire il materiale esaurito e l'aspiratore nel contenitore dei rifiuti.
  4. Lavare delicatamente le cellule con circa 10 ml di DPBS aspirandolo in un angolo del pallone e facendolo roteare delicatamente sulla superficie. Aspirare il DPBS dal pallone e gettare la biancheria e l'aspiratore nel contenitore dei rifiuti.
  5. Aggiungere 1,5 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% per coprire la superficie del pallone e incubare a temperatura ambiente per 1 minuto. Picchiettare delicatamente il pallone per staccare le cellule dalla superficie.
  6. Aggiungere 8,5 ml di DMEM fresco nel pallone. Risospendere e mescolare le cellule con una pipetta sierologica fino a quando tutti gli aggregati non sono stati rotti aspirando su e giù.
  7. Raccogliere 9 mL di sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL.
    1. Aggiungere 9 mL di DMEM fresco nel pallone e metterlo in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2
  8. Utilizzando un emocitometro, mescolare 10 μL di cellule sospese con 10 μL di colorante blu di tripano in un rapporto 1:1 per calcolare la concentrazione di cellule. Utilizzare questo valore per preparare un numero sufficiente di cellule da seminare sulla piastra.
  9. Seminare ~35.000 cellule in 100 μL per ogni pozzetto di una piastra di fondo in vetro nero ad alte prestazioni #1,5 a 96 pozzetti e metterle in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2 per 24 ore.

2. Ottimizzazione della trasfezione 2pLACE

  1. Per un pozzetto e il 10% in eccesso, aliquotare 11 μL di DMEM (SFM) caldo privo di siero in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
  2. Utilizzando un rapporto di massa plasmidico CRY2-eGFP: CIBN-gRNA pari a 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 e 9:1, aliquotare 110 ng per ogni pozzetto di DNA totale alle aliquote di SFM (Tabella 1).
  3. Come controllo positivo, aliquotare la stessa massa di plasmide CMV-eGFP con aliquote diverse di SFM.
  4. Per ogni pozzetto, aliquotare 11 μL di SFM per la diluizione del reagente di trasfezione.
  5. Preparare il reagente di trasfezione con un rapporto di 1:3 tra massa (μg) e volume (μL) di DNA e reagente di trasfezione.
  6. Aggiungere il reagente di trasfezione diluito al DNA diluito e incubare per 12 minuti a temperatura ambiente per creare i complessi di trasfezione.
  7. Aggiungere ~20 μl del complesso di trasfezione a ciascun pozzetto. Assicurarsi che non tocchi le pareti del pozzo.
  8. Avvolgere la piastra in un foglio di alluminio e metterla in un'incubatrice a 37 °C e 5% di CO2 per 24 ore.

3. Attivazione 2pLACE

  1. Modificare il codice di ingresso del microcontrollore per illuminare i pozzetti desiderati utilizzando queste impostazioni (File di codifica supplementare 1, righe 147 - 158).
    1. Intensità LED: 9,27 mW/cm2 (File di codifica supplementare 1, righe 200 - 215).
    2. Lunghezza dell'impulso: 1 s (file di codifica supplementare 1, righe 280 - 290).
    3. Frequenza degli impulsi: 0,067 Hz (ogni 15 s) (File di codifica supplementare 1, righe 264 - 278).
      NOTA: Le impostazioni della lunghezza d'onda sono determinate dai tipi di LED installati.
  2. Spruzzare il coperchio stampato in 3D dell'OptoPlate con etanolo al 70% e lasciarlo asciugare in una cabina di biosicurezza.
  3. Accendi una lampada a luce rossa per camera oscura e posiziona la piastra a 96 pozzetti in una cabina di biosicurezza, quindi sostituisci il coperchio con il coperchio stampato in 3D essiccato.
    NOTA: È possibile visualizzare opzionalmente le cellule CMV-eGFP utilizzando la microscopia a fluorescenza per stimare l'efficienza di trasfezione.
  4. Prendi la piastra a 96 pozzetti e posizionala sull'array di LED per costruire l'apparato dell'array di LED. Assicurarsi che la piastra scatti in posizione.
  5. Collegare il microcontrollore, il LED e le porte della ventola a una fonte di alimentazione.
  6. Spruzzare con cura i fili con etanolo al 70% e asciugare.
  7. Posizionare l'apparecchio LED array in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2 per 24 ore. Assicurarsi che i LED si accendano come previsto e che i fili non siano tesi quando l'incubatrice è sigillata.

4. Preparazione della citometria a flusso

  1. In un ambiente a luci rosse, estrarre l'OptoPlate e posizionare la piastra in una cabina di biosicurezza
    NOTA: È possibile visualizzare le cellule mediante microscopia a fluorescenza per confermare visivamente l'induzione della luce.
  2. Aspirare con cura tutti i terreni da ciascun pozzetto.
  3. Staccare le cellule utilizzando 30 μl di tripsina-EDTA allo 0,05% e incubare per 1 minuto a temperatura ambiente.
  4. Miscelare ogni pozzetto con 100 μL di tampone FACS freddo (1% FBS in PBS) fino a ottenere una singola cellula.
  5. Trasferire ogni campione in una piastra a 96 pozzetti con fondo a V.
  6. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti con fondo a V a 164 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
  7. Aspirare 80 μl di surnatante senza disturbare il pellet.
  8. Aggiungere 200 μl di tampone FACS freddo per risospendere il pellet.
  9. Avvolgere la piastra a 96 pozzetti con fondo a V in un foglio di alluminio per un leggero isolamento.
  10. Metti il piatto in una scatola di polistirolo con ghiaccio per il trasporto.

5. Citometria a flusso e raccolta dati

  1. Accendere il citometro a flusso utilizzando l'interruttore sul retro e aprire il rispettivo software di citometria a flusso sul computer.
  2. Eseguire il programma di avvio del sistema e caricare 2 mL di acqua deionizzata nel caricatore di campioni (Figura supplementare 1A).
  3. Eseguire il controllo qualità (QC) utilizzando le perline QC fornite (Figura 1B supplementare).
  4. Assicurarsi che il citometro a flusso sia in modalità di campionamento su piastra (Figura 1C supplementare).
  5. Impostare e specificare i pozzetti del campione (Figura supplementare 1D).
  6. Creare i seguenti grafici a dispersione e tabelle (Figura 2A supplementare).
    1. Side Scatter (SSC-A) vs Forward Scatter (FSC-A).
    2. SSC-H contro SSC-A.
    3. SSC-A contro FITC-A.
    4. Tabella statistica FITC-A (Figura supplementare 2B).
  7. Inserire la piastra con fondo a V nel caricatore di piastre del citometro.
  8. Selezionare un pozzetto non trasfettato e fare clic su Inizializza, quindi fare clic su Esegui.Assicurarsi che la frequenza di campionamento del volume sia di 10 μL/min (Figura 2C supplementare).
  9. Regolare le tensioni SSC e FITC per centrare la popolazione di interesse sul grafico SSC-A vs FSC-A (Figura 2C supplementare).
    1. Creare un poligono per controllare la popolazione di cellule sane di interesse (Figura 2D supplementare).
    2. Crea un poligono per il gate per la discriminazione del doppietto sul grafico SSC-H vs SSC-A.
    3. Regolare la tensione FITC per posizionare le celle non trasfettate verso sinistra del grafico SSC-A vs FITC-A (Figura 2D supplementare).
  10. Ripetere l'operazione per i restanti pozzetti non trasfettati e registrare i dati FITC-A medi.
  11. Selezionare un CMV-eGFP trasfettato bene e fare clic su Esegui.
  12. Regolare la tensione FITC per acquisire sia le celle autofluorescenti che quelle fluorescenti nel grafico SSC-A vs FITC-A.
    1. Creare un poligono per bloccare le celle fluorescenti contro le celle non fluorescenti facendo riferimento al gate iniziale nelle celle non trasfettate (Figura 2E supplementare).
  13. Registrazione automatica dei campioni a 60 μL/min fino al raggiungimento di 200 s e/o fino a quando gli eventi non hanno raggiunto i 10.000 (Figura 2F supplementare).
  14. Esporta Mean FITC come file CSV e analizza i dati.
  15. Pulire il citometro a flusso tramite l'opzione Pulizia giornaliera (Figura supplementare 2G).

6. Ottimizzazione dell'intensità dei LED

  1. Modificare lo script del microcontrollore per testare le intensità LED desiderate (File di codifica supplementare 1, righe 200-215).
    NOTA: Le intensità dei LED equivalenti rispetto ai valori nello script del microcontrollore sono riportate altrove38. L'autocalibrazione può essere necessaria quando si utilizzano LED diversi.
  2. Assicurarsi che lo script contenga i seguenti valori in (File di codifica supplementare 1, righe 200-215) come indicato nella Tabella 2 e caricare il codice nel microcontrollore.
  3. Ripetere i passaggi da 1 a 5.

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Risultati

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Adottando gli elementi del flusso di lavoro della letteratura precedente 37,38,55, abbiamo aggiunto l'illuminazione simultanea ad alto rendimento dall'OptoPlate-96 e abbiamo dimostrato una pipeline per ottimizzare rapidamente un sistema di espressione genica inducibile dalla luce nelle cellule di mammifero (Figura 1).

Per i sistemi di esp...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo dimostra il controllo optogenetico di un'espressione genica transitoria multicomponente in cellule di mammifero, consentendo ad altri ricercatori di caratterizzare rapidamente e simultaneamente sistemi optogenetici modulari con un reporter fluorescente.

In questo caso, un sistema inducibile dalla luce a due plasmidi è stato ottimizzato per l'espressione di eGFP in HEK293T cellule. Per una co-trasfezione di successo, è essenziale ottimizzare l...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è supportato dal Translational Research Institute attraverso il NASA Cooperative Agreement NNX16AO69A e dal Good Foods Institute. Questo progetto è stato supportato dall'UC Davis Flow Cytometry Shared Resource Laboratory con l'assistenza tecnica di Bridget McLaughlin, Jonathan Van Dyke e Ashley Karajeh, con il finanziamento dell'NCI P30 CA093373 (Comprehensive Cancer Center) e del S10OD018223 (citometro Beckman Coulter "Cytoflex").

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tubi microcentrifughe da 1,5 mLVWR10025-724
Serbatoi di reagenti da 10 mLVWR77395-252
Pipette sierologiche da 10 mLVWR75816-100
1000 & mu; Punte filtro a LVWR76322-154
15 mL  Tubi centrifughe ad alte prestazioni, tappo piattoVWR89039-664
Misuratore di potenza ottica 1931-CNewport1931-C
Pipette sierologiche da 2 mLVWR75816-104
20 & mu; Punte filtro a LVWR76322-134
200 & mu; Punte filtro a LVWR76322-150
Tubi centrifughe ad alte prestazioni da 50 mL, tappo piattoVWR89039-656
Piastre a V a 96 pozziMARCHplate781661
A21, lampadina LED rossaLampadine BluexN/ASorgente di luce rossa
Arduino IDE SoftwareArduinoN/A
Armadio di biosicurezza, Classe IINuAireN/A
Emocitometro a linea luminosaHausser Scientific3110
Slide di conteggio delle celleBioRad1450016
Piastra di coltura cellulare a 96 pozzi, piastra inferiore in vetro #1.5HCellvisP96-1.5H-N
CytExpert SoftwareBeckman CoulterN/A
CytoFLEX Pronti all'Uso Quotidiano delle Fluorosfere QCBeckman CoulterC657194 & deg; C
CytoFLEX-S Flow Cytometro (4 canali viola, 2 blu, 4 gialli verdi, 3 rossi)Beckman CoulterC09766
Polvere salina tamponata con fosfato di Dulbecco, senza calico, senza magnesioFisher Scientific21600069Temperatura Ambiente
Centrifuga Eppendorf 5804Eppendorf  022622501Passo centrifuga a piastra inferiore a V
Centrifuga Eppendorf 5810REppendorf22625501
Eppendorf Research plus, 8-canali, volume variabile, 30 - 300 & mu; LEppendorf3125000052
Eppendorf Research plus, single-channel, volume variabile, 100 - 1000 & mu; LEppendorf3123000063
Eppendorf Research plus, single-channel, volume variabile, 2 - 20 & mu; LEppendorf3123000039
Eppendorf Research plus, single-channel, volume variabile, 20 - 200 μ LEppendorf3123000055
Nastro di etichettatura da laboratorio a uso generaleVWR89097-920
DMEM Gibco, polvere, glucosio altoFisher Scientific121000614 & deg; C
Gibco Trypan Blue Solution, 0,4%Fisher Scientific15-250-061Temperatura Ambiente
FBS Gibco Value Heat InattivatoFisher ScientificA5256901-20 ° C
Gibco, Tripsina-EDTA (0,05%), con EDTA, Origine Animale, 1X, Fenolo Rosso, 500 mLGibco25300062-20 ° C
HEK293T CelleATCCCRL-11268-80 ° C, azoto liquido
Marcatori di laboratorio, MicronovaVWR89205-944
Lampada da scrivania in metalloDesign SempliciN/ALampada per la luce rossa
OptoPlate-96LABmakerN/A
XP per aiuti di pipetteDrummond4-000-101
Plasmide: CIBN-gRNAN/AN/A-20 ° C
Plasmide: CMV-eGFPN/AN/A-20 ° C
Plasmide: CRY2-eGFPN/AN/A-20 ° C
Reagente di trasfezione in vitro del DNA di PolyJetFisher ScientificNC15361174 & deg; C
Fiaschetta di coltura cellulare T-75VWR10062-860
Incubatore CO2 con camicia d'acquaVWR10810-884

Riferimenti

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