Rapida ottimizzazione di un sistema inducibile dalla luce per controllare l'espressione genica nei mammiferi

Gli strumenti di biologia sintetica, come i sistemi di espressione genica inducibile, hanno fornito contributi significativi alla ricerca biologica. La loro capacità di regolare l'espressione genica in modo regolabile, reversibile e preciso può migliorare il controllo della produzione di proteine 1,2,3,4,5,6, la morfologia cellulare 7,8,9,10,11,12, le vie metaboliche 13,14,15^,16,17,18 e altri obiettivi per la bioproduzione e le applicazioni terapeutiche. I sistemi inducibili da sostanze chimiche possono avere^{effetti residui 19,20} o fuori bersaglio. Gli additivi chimici possono anche essere molto costosi e difficili da scalare industrialmente a causa di ulteriori processi di purificazione a valle 21,22,23. I sistemi di espressione genica inducibili dalla luce possono offrire un metodo scalabile e preciso per le pratiche di bioproduzione 24,25,26,27.

Molti sistemi di espressione genica inducibili dalla luce sono stati sviluppati come utili strumenti di biologia sintetica in una varietà di applicazioni 28,29,30,31,32,33,34,35,36 e lunghezze d'onda del blu 35,37,38, rosso/rosso lontano^12,39,⁴⁰ o luce verde⁴¹. Nel caso della regolazione genica optogenetica basata su CRISPR, la modifica della quantità di RNA guida individuali (gRNA) erogati può influenzare l'espressione dell'mRNA dei geni endogeni⁴² e dovrà essere ottimizzata per diverse linee cellulari. Possono essere utilizzate anche proteine di transattivazione come VP64 37,42,43,44^, VP16 39,40,44,45,46, p65⁴⁴ o fusioni di esse 47, aumentando la modularità dei sistemi optogenetici. Al fine di studiare i percorsi biologici complessi e intrecciati 12,40,48,49,50,51,52,53, possono essere testate diverse combinazioni di questi componenti noti. Inoltre, diverse linee cellulari possono mostrare differenze nell'induzione con lo stesso sistema⁵². Diversi livelli di induzione possono portare a un'espressione genica o a una sensibilità insufficiente nel controllo preciso dell'espressione genica, richiedendo test rigorosi per trovare un sistema optogenetico ottimale in linee cellulari nuove o più biologicamente rilevanti. Con un ritmo crescente e l'ampliamento dell'applicabilità della regolazione genica optogenetica, è imperativo caratterizzare rapidamente questi diversi sistemi.

I metodi attuali per la caratterizzazione degli strumenti optogenetici utilizzano l'espressione stabile o transitoria dei geni^12,54. La generazione di linee cellulari che esprimono stabilmente e l'ottimizzazione della dinamica del sistema per la massima espressione possono richiedere molto tempo e quindi denaro. L'espressione transitoria consente di ottenere informazioni rapide e preziose, soprattutto quando si testano sistemi optogenetici multicomponente. Qui, abbiamo utilizzato il sistema effettore CRISPR-dCas9 attivato dalla luce blu (LACE)³⁷, composto da criptocromo 2 (CRY2) e terminale N-terminale basic-helix-loop-helix (CIBN) che interagisce con il criptocromo. È stato utilizzato per controllare l'espressione genica in cellule di mammifero come HEK293T (cellule renali embrionali umane)^37,38, CHO-DG44 (cellule ovariche di criceto cinese)⁵⁵ e C2C12 (cellule mioblastiche di topo)³⁸. La sua natura modulare è ideale per caratterizzare rapidamente le prestazioni del sistema attraverso l'espressione transitoria e metodi ad alto rendimento. Ad esempio, i sistemi multicomponente come il LACE possono richiedere l'ottimizzazione dei rapporti di massa per migliorare l'induzione, un passaggio non tipicamente impiegato nella caratterizzazione dei sistemi optogenetici.

Questo protocollo descrive in dettaglio la rapida ottimizzazione e caratterizzazione di due sistemi plasmidici LACE (2pLACE)³⁸. In questa configurazione, 2pLACE controlla l'espressione di un reporter fluorescente, eGFP (enhanced green fluorescent protein), in HEK293T cellule. L'attivazione viene eseguita in piastre nere a 96 pozzetti con fondo di vetro utilizzando un OptoPlate-96, un array di LED stampato in 3D progettato e costruito da Lukasz Bugaj e colleghi 56,57,58,59. Questo protocollo ottimizza specificamente l'espressione massima con diversi rapporti di massa del sistema a due plasmidi. Include anche un codice di facile utilizzo per controllare diverse intensità luminose per studiare la sintonizzabilità del sistema e la sua gamma dinamica completa. La citometria a flusso viene utilizzata per la raccolta e l'analisi dei dati. I protocolli per la generazione di costrutti plasmidici e materiali di stampa 3D per l'array di LED possono essere trovati in pubblicazioni precedenti^54,56. Questi metodi evidenziano una pipeline rapida e ad alto rendimento per la caratterizzazione di sistemi di espressione genica inducibili dalla luce.

1. Placcatura HEK293T celle in un formato a 96 pozzetti

1. In una cappa di biosicurezza, raccogliere un contenitore per rifiuti di candeggina, pipette sierologiche, pipette-coadiuvanti, soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS), terreno di Eagle modificato con Dulbecco (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e una fiaschetta per colture cellulari T-75 con cellule HEK293T confluenti. Preriscaldare il fluido a 37 °C.
2. In un pallone T-75, verificare che la confluenza sia circa l'80%-100% confluente attraverso un microscopio invertito.
3. Nella cappa di biosicurezza, utilizzare una pipetta sierologica per aspirare il terreno esaurito dal pallone per colture cellulari. Evitare di toccare la superficie o la plastica del pallone. Smaltire il materiale esaurito e l'aspiratore nel contenitore dei rifiuti.
4. Lavare delicatamente le cellule con circa 10 ml di DPBS aspirandolo in un angolo del pallone e facendolo roteare delicatamente sulla superficie. Aspirare il DPBS dal pallone e gettare la biancheria e l'aspiratore nel contenitore dei rifiuti.
5. Aggiungere 1,5 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% per coprire la superficie del pallone e incubare a temperatura ambiente per 1 minuto. Picchiettare delicatamente il pallone per staccare le cellule dalla superficie.
6. Aggiungere 8,5 ml di DMEM fresco nel pallone. Risospendere e mescolare le cellule con una pipetta sierologica fino a quando tutti gli aggregati non sono stati rotti aspirando su e giù.
7. Raccogliere 9 mL di sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL.
   1. Aggiungere 9 mL di DMEM fresco nel pallone e metterlo in un incubatore a 37 °C e 5% di CO₂
8. Utilizzando un emocitometro, mescolare 10 μL di cellule sospese con 10 μL di colorante blu di tripano in un rapporto 1:1 per calcolare la concentrazione di cellule. Utilizzare questo valore per preparare un numero sufficiente di cellule da seminare sulla piastra.
9. Seminare ~35.000 cellule in 100 μL per ogni pozzetto di una piastra di fondo in vetro nero ad alte prestazioni #1,5 a 96 pozzetti e metterle in un incubatore a 37 °C e 5% di CO₂ per 24 ore.

2. Ottimizzazione della trasfezione 2pLACE

1. Per un pozzetto e il 10% in eccesso, aliquotare 11 μL di DMEM (SFM) caldo privo di siero in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
2. Utilizzando un rapporto di massa plasmidico CRY2-eGFP: CIBN-gRNA pari a 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 e 9:1, aliquotare 110 ng per ogni pozzetto di DNA totale alle aliquote di SFM (Tabella 1).
3. Come controllo positivo, aliquotare la stessa massa di plasmide CMV-eGFP con aliquote diverse di SFM.
4. Per ogni pozzetto, aliquotare 11 μL di SFM per la diluizione del reagente di trasfezione.
5. Preparare il reagente di trasfezione con un rapporto di 1:3 tra massa (μg) e volume (μL) di DNA e reagente di trasfezione.
6. Aggiungere il reagente di trasfezione diluito al DNA diluito e incubare per 12 minuti a temperatura ambiente per creare i complessi di trasfezione.
7. Aggiungere ~20 μl del complesso di trasfezione a ciascun pozzetto. Assicurarsi che non tocchi le pareti del pozzo.
8. Avvolgere la piastra in un foglio di alluminio e metterla in un'incubatrice a 37 °C e 5% di CO₂ per 24 ore.

3. Attivazione 2pLACE

1. Modificare il codice di ingresso del microcontrollore per illuminare i pozzetti desiderati utilizzando queste impostazioni (File di codifica supplementare 1, righe 147 - 158).
   1. Intensità LED: 9,27 mW/cm² (File di codifica supplementare 1, righe 200 - 215).
   2. Lunghezza dell'impulso: 1 s (file di codifica supplementare 1, righe 280 - 290).
   3. Frequenza degli impulsi: 0,067 Hz (ogni 15 s) (File di codifica supplementare 1, righe 264 - 278).
      NOTA: Le impostazioni della lunghezza d'onda sono determinate dai tipi di LED installati.
2. Spruzzare il coperchio stampato in 3D dell'OptoPlate con etanolo al 70% e lasciarlo asciugare in una cabina di biosicurezza.
3. Accendi una lampada a luce rossa per camera oscura e posiziona la piastra a 96 pozzetti in una cabina di biosicurezza, quindi sostituisci il coperchio con il coperchio stampato in 3D essiccato.
   NOTA: È possibile visualizzare opzionalmente le cellule CMV-eGFP utilizzando la microscopia a fluorescenza per stimare l'efficienza di trasfezione.
4. Prendi la piastra a 96 pozzetti e posizionala sull'array di LED per costruire l'apparato dell'array di LED. Assicurarsi che la piastra scatti in posizione.
5. Collegare il microcontrollore, il LED e le porte della ventola a una fonte di alimentazione.
6. Spruzzare con cura i fili con etanolo al 70% e asciugare.
7. Posizionare l'apparecchio LED array in un incubatore a 37 °C e 5% di CO₂ per 24 ore. Assicurarsi che i LED si accendano come previsto e che i fili non siano tesi quando l'incubatrice è sigillata.

4. Preparazione della citometria a flusso

1. In un ambiente a luci rosse, estrarre l'OptoPlate e posizionare la piastra in una cabina di biosicurezza
   NOTA: È possibile visualizzare le cellule mediante microscopia a fluorescenza per confermare visivamente l'induzione della luce.
2. Aspirare con cura tutti i terreni da ciascun pozzetto.
3. Staccare le cellule utilizzando 30 μl di tripsina-EDTA allo 0,05% e incubare per 1 minuto a temperatura ambiente.
4. Miscelare ogni pozzetto con 100 μL di tampone FACS freddo (1% FBS in PBS) fino a ottenere una singola cellula.
5. Trasferire ogni campione in una piastra a 96 pozzetti con fondo a V.
6. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti con fondo a V a 164 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
7. Aspirare 80 μl di surnatante senza disturbare il pellet.
8. Aggiungere 200 μl di tampone FACS freddo per risospendere il pellet.
9. Avvolgere la piastra a 96 pozzetti con fondo a V in un foglio di alluminio per un leggero isolamento.
10. Metti il piatto in una scatola di polistirolo con ghiaccio per il trasporto.

5. Citometria a flusso e raccolta dati

1. Accendere il citometro a flusso utilizzando l'interruttore sul retro e aprire il rispettivo software di citometria a flusso sul computer.
2. Eseguire il programma di avvio del sistema e caricare 2 mL di acqua deionizzata nel caricatore di campioni (Figura supplementare 1A).
3. Eseguire il controllo qualità (QC) utilizzando le perline QC fornite (Figura 1B supplementare).
4. Assicurarsi che il citometro a flusso sia in modalità di campionamento su piastra (Figura 1C supplementare).
5. Impostare e specificare i pozzetti del campione (Figura supplementare 1D).
6. Creare i seguenti grafici a dispersione e tabelle (Figura 2A supplementare).
   1. Side Scatter (SSC-A) vs Forward Scatter (FSC-A).
   2. SSC-H contro SSC-A.
   3. SSC-A contro FITC-A.
   4. Tabella statistica FITC-A (Figura supplementare 2B).
7. Inserire la piastra con fondo a V nel caricatore di piastre del citometro.
8. Selezionare un pozzetto non trasfettato e fare clic su Inizializza, quindi fare clic su Esegui.Assicurarsi che la frequenza di campionamento del volume sia di 10 μL/min (Figura 2C supplementare).
9. Regolare le tensioni SSC e FITC per centrare la popolazione di interesse sul grafico SSC-A vs FSC-A (Figura 2C supplementare).
   1. Creare un poligono per controllare la popolazione di cellule sane di interesse (Figura 2D supplementare).
   2. Crea un poligono per il gate per la discriminazione del doppietto sul grafico SSC-H vs SSC-A.
   3. Regolare la tensione FITC per posizionare le celle non trasfettate verso sinistra del grafico SSC-A vs FITC-A (Figura 2D supplementare).
10. Ripetere l'operazione per i restanti pozzetti non trasfettati e registrare i dati FITC-A medi.
11. Selezionare un CMV-eGFP trasfettato bene e fare clic su Esegui.
12. Regolare la tensione FITC per acquisire sia le celle autofluorescenti che quelle fluorescenti nel grafico SSC-A vs FITC-A.
    1. Creare un poligono per bloccare le celle fluorescenti contro le celle non fluorescenti facendo riferimento al gate iniziale nelle celle non trasfettate (Figura 2E supplementare).
13. Registrazione automatica dei campioni a 60 μL/min fino al raggiungimento di 200 s e/o fino a quando gli eventi non hanno raggiunto i 10.000 (Figura 2F supplementare).
14. Esporta Mean FITC come file CSV e analizza i dati.
15. Pulire il citometro a flusso tramite l'opzione Pulizia giornaliera (Figura supplementare 2G).

6. Ottimizzazione dell'intensità dei LED

1. Modificare lo script del microcontrollore per testare le intensità LED desiderate (File di codifica supplementare 1, righe 200-215).
   NOTA: Le intensità dei LED equivalenti rispetto ai valori nello script del microcontrollore sono riportate altrove³⁸. L'autocalibrazione può essere necessaria quando si utilizzano LED diversi.
2. Assicurarsi che lo script contenga i seguenti valori in (File di codifica supplementare 1, righe 200-215) come indicato nella Tabella 2 e caricare il codice nel microcontrollore.
3. Ripetere i passaggi da 1 a 5.

Adottando gli elementi del flusso di lavoro della letteratura precedente 37,38,55, abbiamo aggiunto l'illuminazione simultanea ad alto rendimento dall'OptoPlate-96 e abbiamo dimostrato una pipeline per ottimizzare rapidamente un sistema di espressione genica inducibile dalla luce nelle cellule di mammifero (Figura 1).

Per i sistemi di espressione genica inducibile, gli intervalli dinamici elevati sono un indicatore critico delle prestazioni, oltre all'espressione assoluta on e off (leaky). Con l'imaging a fluorescenza di cellule trasfettate, è possibile osservare qualitativamente la differenza nell'espressione di eGFP tra le cellule attivate dalla luce e le cellule mantenute al buio (Figura 2). Un rapporto di 1:9 si traduce visibilmente in una minore espressione massima di eGFP rispetto a un rapporto di 5:5. Si può anche osservare che c'è una maggiore perdita nel rapporto 5:5. L'imaging a fluorescenza di cellule trasfettate e cellule non trasfettate con eGFP che esprimono costitutivamente (CMV-eGFP) sono preziosi controlli positivi e negativi per contestualizzare rispettivamente l'efficienza della trasfezione e l'espressione indotta e permeabile del sistema. L'utilizzo dell'imaging a fluorescenza consente agli utenti di vedere e convalidare rapidamente la trasfezione e l'attivazione riuscite dell'espressione genica con la luce blu, fornendo un prezioso punto di controllo prima della citometria a flusso. La citometria a flusso può quindi essere utilizzata per quantificare l'intensità media della fluorescenza (MFI) e l'intervallo dinamico.

Dopo l'attivazione della luce, le cellule vengono preparate con tampone FACS e analizzate mediante citometria a flusso. HEK293T cellule sono di circa 11-15 μm, con un guadagno di FSC di 500 e un guadagno di SSC di 125 (Figura 2C supplementare) per centrare le popolazioni cellulari sane. Tensioni più elevate determinano l'analisi dei detriti piuttosto che delle popolazioni cellulari sane. Le nostre corse hanno costantemente oltre ~60% di eventi nel primo gate di popolazione (P1) (Figura 3A-D). Una volta che le popolazioni di cellule sane costituiscono la maggior parte degli eventi nel grafico SSC-A vs FSC-A, la densità degli eventi può anche essere controllata per identificare la maggior parte della popolazione (Figura supplementare 3A). Quindi, la discriminazione del doppietto può essere eseguita attraverso il grafico SSC-H vs SSC-A, che è fondamentale per risultati affidabili e riproducibili60,61. In questo sistema, abbiamo generalmente riscontrato che oltre il 95% degli eventi gated in P1 sono singoletti (Figura 3A-D). Nel grafico SSC-A vs FITC-A, le celle non trasfettate saranno generalmente verso sinistra del centro del grafico e saranno gate per avere una popolazione <0,1% (Figura 3A). Quindi, le cellule eGFP-positive popoleranno il cancello che era vuoto nel campione non trasfettato, con conseguenti misurazioni di analisi a singola cellula di MFI (Figura 3B). Una volta raccolti i controlli negativi e positivi per impostare i gate e le tensioni corretti, i campioni con 2pLACE possono essere analizzati utilizzando gli stessi gate per escludere in modo affidabile le celle a autofluorescenza (Figura 3C, D). Qui, la percentuale di popolazione per le cellule eGFP-positive era ~99% per CMV-eGFP e ~57% per le cellule trasfettate con 2pLACE. Un gate finale può essere utilizzato anche sul canale PE-A per garantire la cattura di celle altamente fluorescenti (Figura supplementare 3B).

Un altro rapporto che si è scelto di testare è stato di 3:7. Come fase di convalida, le immagini della microscopia a fluorescenza sono state scattate prima della citometria a flusso e hanno osservato una trasfezione riuscita per l'induzione dell'espressione di eGFP con 2pLACE, prevedibilmente inferiore a CMV-eGFP (Figura 4A). Dopo aver raccolto i dati della citometria a flusso di 2pLACE, l'espressione genica attivata dalla luce blu può essere confrontata con l'espressione genica permeabile (Figura 4B). Utilizzando le impostazioni elencate nel passaggio 3.1, siamo stati in grado di osservare un aumento di ~3 volte dell'espressione dopo l'attivazione della luce blu, che corrisponde all'aumento del segnale di fluorescenza visto qualitativamente dalla microscopia. Inoltre, le efficienze di trasfezione possono essere osservate indirettamente misurando la percentuale di popolazione positiva per eGFP, o percentuale di genitore, a ~60% di singole cellule sane (Figura 4C).

L'implementazione di questo protocollo nella sua interezza è in grado di identificare i rapporti di massa ottimali (Figura 5A) e le intensità luminose (Figura 5B) per la massima gamma dinamica e l'espressione regolabile. I rapporti di massa inferiori a 6:4 hanno mostrato una gamma dinamica più ampia (3,5-4,5), mentre i rapporti di massa superiori a 6:4 hanno mostrato una diminuzione della gamma dinamica a causa dell'aumento del fondo e della diminuzione dell'espressione massima di eGFP. Sia per l'espressione massima che per l'elevata gamma dinamica, è preferibile un rapporto di 3:7. Rapporti inferiori a 3:7 hanno mostrato induzioni di piegamento simili, ma avevano un'espressione massima complessiva inferiore. Utilizzando i nostri valori di intensità luminosa precedentemente calibrati38 (Tabella 2), è possibile caratterizzare il livello di espressione genica rispetto a diverse intensità luminose. L'intensità della luce ha anche controllato i livelli di espressione di eGFP, dove l'MFI si satura a ~3 mW/cm2. Le intensità della luce superiori a questo possono avere valori MFI variabili, probabilmente a causa del fotobleaching in alcuni campioni, come osservato a ~9 e 11 mW/cm2.

Figura 1: Pipeline generale di esperimenti ad alto rendimento per testare sistemi optogenetici. Le cellule vengono seminate in una piastra nera a 96 pozzetti per 24 ore. Quindi, le cellule vengono trasfettate con un periodo di incubazione di 12 minuti di DNA e reagente di trasfezione. 24 ore dopo la trasfezione, la piastra viene posizionata sull'OptoPlate-96 per l'attivazione della luce blu. Dopo la durata desiderata dell'attivazione della luce blu, le cellule vengono preparate in un ambiente a luce rossa per la citometria a flusso. I dati della citometria a flusso sono rappresentati come grafici dell'intensità media della fluorescenza di cellule eGFP-positive al buio o trattate con luce blu. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini rappresentative al microscopio a fluorescenza di 2pLACE nello stato on e off in cellule HEK293T. Diversi rapporti di massa di CRY2-eGFP: CIBN-gRNA sono stati testati per i livelli di espressione di eGFP. Le cellule sono state esposte alla luce blu (ON) o tenute al buio (OFF) per 24 ore. La barra della scala rappresenta 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Grafici di dispersione rappresentativi della citometria a flusso di cellule HEK293T non trasfettate (UT), CMV-eGFP e 2pLACE. La citometria a flusso è stata eseguita utilizzando la funzione di caricatore a piastre. (A) HEK293T celle sono state gated in base alla diffusione diretta (FSC-A) e alla dispersione laterale (SSC-A). La concentrazione degli eventi sui grafici SSC-A rispetto a FSC-A può essere visualizzata utilizzando un grafico di contorno (Figura 3A supplementare) per aiutare a gating le popolazioni sane. La discriminazione del doppietto è stata eseguita su un grafico SSC-H rispetto a SSC-A utilizzando un gate lineare. Il grafico finale delle cellule fluorescenti gate facendo riferimento al campione non trasfettato. (B) Le cellule sono state gated come in (A), mostrando la popolazione fluorescente e l'intensità della fluorescenza nella tabella statistica (Figura supplementare 2B). Le cellule trasfettate con 2pLACE (C,D) sono state gate separatamente attraverso il gate P3. La popolazione magenta rappresenta tutte le cellule eGFP-positive (Figura supplementare 3B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi qualitativa e quantitativa dell'espressione di eGFP indotta dalla luce in cellule HEK293T. (A) Immagini al microscopio a fluorescenza di cellule HEK293T trasfettate con plasmidi 2pLACE o CMV-eGFP. (B) Quantificazione dell'intensità media di fluorescenza (MFI) di eGFP in cellule mantenute in condizioni di luce blu o buio. (C) Percentuale di cellule eGFP-positive misurata attraverso l'analisi gating con citometria a flusso. Il gating ha comportato che il <0,1% delle cellule non trasfettate rientrasse nella soglia eGFP-positiva. I dati della citometria a flusso rappresentano valori medi e le barre di errore indicano le deviazioni standard da quattro repliche tecniche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Citometria a flusso di rapporti di massa rappresentativi di 2pLACE e intensità di luce blu. (A) Vari rapporti di massa di CRY2-eGFP: CIBN-gRNA è stato trasfettato in cellule HEK293T, che sono state poi esposte alla luce blu o mantenute al buio utilizzando le stesse impostazioni riportate nella fase 3 del protocollo. Ogni condizione è la media di 3 repliche biologiche. (B) Andamento rappresentativo dell'espressione genica in funzione dell'intensità della luce blu. Ogni condizione è la media di 6 repliche tecniche. Le intensità medie di fluorescenza sono quantificate attraverso il gating del citometro a flusso delle cellule che esprimono eGFP. Tutte le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Per i rapporti plasmidici, la significatività statistica dell'MFI è stata calcolata utilizzando un test t unidirezionale che confronta la luce e il buio di un rapporto plasmidico. Per le intensità luminose, la significatività statistica è stata calcolata con l'ANOVA unidirezionale e il test post-hoc T2 di Tamhane rispetto allo stato buio (OFF). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p <0,0001, *****p < 0,00001 e ns non è significativo. Questa figura è stata adattata da Garimella et al.38. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Quantità di plasmidi CRY2-eGFP e CIBN-gRNA per pozzetto utilizzando concentrazioni di esempio. Le quantità di volume sono per pozzetto e possono essere modificate in base al numero di campioni o repliche in un esperimento. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Valori consigliati per l'intensità della luce blu. Il codice si trova nel file di codifica supplementare 1 (righe 215-228). I valori di intensità equivalenti sono calcolati utilizzando i dati di calibrazione precedentemente riportati utilizzando un misuratore di potenza ottica. Ogni livello di intensità ha 6 repliche tecniche. Le righe G e H sono destinate a CMV-eGFP e pozzetti di controllo non trasfettati. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Figura 1 supplementare: Passaggi 5.1-5.5 del protocollo. (A) Esecuzione del programma di avvio del sistema. (B) Standardizzazione del controllo qualità mediante perline in fluoroforo. (C) Passaggio dalla modalità di campionamento dei tubi alla modalità caricatore di piastre. (D) Selezione dei pozzetti da etichettare come pozzetti campione; Per questo esempio sono stati selezionati 35 pozzi. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 2 supplementare: Passaggi 5.6-5.14 del protocollo. (A) Impostazione di grafici di diffusione della luce: FSC-A vs. SSC-A per il gating della popolazione cellulare sana, SSC-A vs. SSC-H per la discriminazione del doppietto e SSC-A vs. FITC-A per il gating di cellule autofluorescenti ed eGFP-positive. (B) Impostazione della tabella statistica per l'acquisizione dei dati FITC-A per misurare l'intensità media della fluorescenza. (C) Evidenziazione delle regole di arresto nella scheda Eventi da visualizzare. Garantire una bassa portata del campione, espellere e caricare la piastra, inizializzare la sonda del citometro a flusso e regolare le tensioni di acquisizione. (D) Creazione di poligoni per il cancello di ogni popolazione come mostrato. (E) Aggiunta del numero appropriato di pozzi. (F) Facendo clic su Registrazione automatica una volta completate le impostazioni e i cancelli. (G) Facendo clic su Pulizia giornaliera dopo che tutti i campioni sono stati raccolti e le statistiche sono state esportate. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 3 supplementare: Validazione di tutte le celle all'interno del gate catturato, visualizzate da eventi verdi in P4 (magenta). (A) Diagramma di contorno della popolazione sana all'interno del gate di popolazione eGFP-positivo (P3). Le cellule sono concentrate principalmente nelle zone rosse, diminuendo verso l'esterno. (B) Grafico SSC-A vs. PE-A per il gating P4, che fornisce un controllo aggiuntivo per garantire che tutti gli eventi di fluorescenza siano presi in considerazione nel grafico FITC-A. Clicca qui per scaricare questo file.

File di codifica supplementare 1: Esempio di codice Arduino che implementa tutte le proprietà descritte nel protocollo di cui sopra. Questo file attiva tutte le posizioni dei LED utilizzando i valori di intensità dei LED consigliati nella Tabella 2. Clicca qui per scaricare questo file.

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.