Quantificazione tridimensionale del muco intestinale mediante imaging tissutale a montaggio intero

Summary

Questo studio presenta un metodo di imaging 3D che utilizza tessuti intestinali a montaggio intero e microscopia multi-fotone per quantificare il muco secreto, consentendo un'analisi volumetrica precisa e la visualizzazione della dinamica del muco in risposta a stimoli come il cloruro di carbamilcolina.

Abstract

Il muco svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'omeostasi intestinale facilitando la digestione, formando una barriera contro i microbi e regolando le risposte immunitarie all'interno dell'intestino. La sua secrezione è modulata da vari fattori intrinseci ed estrinseci, tra cui infezioni microbiche e infiammazioni. Mentre i metodi tradizionali per l'analisi del muco si basano sulla quantificazione relativa, come la misurazione dello spessore del muco nelle sezioni istologiche, questi approcci forniscono una visione limitata del volume effettivo e della distribuzione spaziale del muco secreto all'interno del lume intestinale. Qui, presentiamo una metodologia dettagliata per la quantificazione tridimensionale assoluta del muco utilizzando tessuti intestinali a montaggio intero e microscopia multifotonica. Questo protocollo include la preparazione di anse intestinali legate, il trattamento con carbamilcolina cloruro come stimolo per l'attivazione delle cellule caliciformi, la fissazione dei tessuti e la colorazione per l'imaging. Utilizzando la microscopia multifotone, acquisiamo immagini Z-stacked della superficie luminale. Questi vengono elaborati nel software Imaris per quantificare il volume e la distribuzione spaziale del muco secreto. Dimostriamo che il cloruro di carbamilcolina induce in modo robusto la secrezione di muco sia nei tessuti ileali che in quelli del colon entro 30 minuti. Il muco secreto appare in modo sporadico e discontinuo in tutto il lume, sottolineando l'importanza dell'analisi volumetrica rispetto ai tradizionali approcci bidimensionali. Questo protocollo consente ai ricercatori di ottenere dati quantitativi assoluti e visualizzare la distribuzione del muco in situ, offrendo un potente strumento per studiare la dinamica del muco intestinale in condizioni fisiologiche e patologiche.

Introduction

L'ambiente mucoso del tratto gastrointestinale dei mammiferi è altamente dinamico e supporta la colonizzazione di una comunità microbica diversificata. L'epitelio intestinale è costituito da varie cellule specializzate che collaborano per assorbire i nutrienti, mantenere l'integrità della barriera e comunicare con il sistema immunitario¹. Tra queste, le cellule caliciformi immagazzinano granuli di mucina e secernono muco nel lume in condizioni di stato stazionario. Questo muco forma una barriera fisica critica, impedendo il contatto microbico diretto con lo strato epiteliale, modulando l'infiammazione dei tessu....

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) dell'Università Chang Gung. La struttura per animali dell'Università di Chang Gung è accreditata dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio (AAALAC). In questi studi non sono stati osservati problemi di salute animale.

1. Preparazione della base di fissaggio

1. Miscelare la polvere di agarosio con ddH₂O a una concentrazione del 4% (p/v) in un matraccio per microonde. Microonde per 2-3 minuti fino a ra....

Results

In questo metodo, abbiamo quantificato il volume del muco intestinale da immagini impilate di tessuti interi acquisiti tramite microscopia multifotone. I tessuti intestinali sono stati colorati con falloidina fluorescente e agglutinina del germe di grano (WGA) per visualizzare la F-actina e il muco cellulari, rispettivamente^15,16. Sia nei tessuti ileali che in quelli del colon trattati con PBS, il muco WGA⁺ è stato rilevato principalmente all'interno d.......

Discussion

Qui presentiamo un metodo per la quantificazione tridimensionale del muco intestinale utilizzando la colorazione dei tessuti a montaggio intero, la microscopia multifotone e l'analisi con il software Imaris. Questa procedura permette di osservare la distribuzione discontinua del muco all'interno del lume intestinale e fornisce una misurazione assoluta del volume del muco.

La distribuzione discontinua del muco dopo la stimolazione è stata osservata anche nei si.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-tribromoetanolo	Sigma-Aldrich	T48402
2-metil-2-butanolo	Sigma-Aldrich	240486
6 cm di piatto	Alpha Plus	16021-1
Agarose	Hispanagar	A02599
BSA	BioShop	ALB001
Cloruro di carbamoilcolina ≥ 98% (titolazione), cristallino	SIGMA	SI-C4382-1G
File di rame (nuovo)	TOP TECH WIRE & INDUSTRIA DEL CAVO	IW00125	Filo di rame senza strato isolante
Forcipe	Shineteh	ST-M110
Garza, sterile	GMTH	Maggio-40
GraphPad Prism 8	GraphPad Software
Termoforo	COMFORT	SY-666
IMARIS 10.0.0	STRUMENTI OXFORD
Paraformaldeide	BIOVOVAS	BL0415-1000
PBS	GENESTAR	BL0180-1000
Sonde di marcatura con falloidina	Invitrogen	A12379
Forbici	Shineteh	02-1250.18
Triton X-100	Merck	1.08603.1000
Coniugati dell'agglutinina germinale del grano (WGA)	Biotium	29027
Zeiss 7MP con obiettivo a immersione in acqua W Plan-Apochromat 20 x/1.0 DIC III (NA 1.0), laser Spectra-Physics Mai Tai HP ti zaffiro femtosecondi (senza modulo DeepSee) con rivelatori BP500 nm-550 nm e BP565 nm-610 nm, e lunghezza d'onda laser da 750 nm			piattaforma di imaging utilizzata per acquisire stack 3D con una lente obiettivo ad alto NA per l'imaging dei tessuti profondi; una sorgente di eccitazione per microscopia multifotonico impostata a una lunghezza d'onda di 750 nm