Method Article

Quantificazione tridimensionale del muco intestinale mediante imaging tissutale a montaggio intero

DOI:

10.3791/68789

⸱

September 12th, 2025

 ,  ,  , 
1Laboratory of Host-Microbe Interactions and Cell Dynamics, Department of Medical Biotechnology and Laboratory Science, College of Medicine, Chang Gung University, 2Institute of Microbiology and Immunology, National Yang Ming Chiao Tung University, 3Program in Molecular Medicine, National Yang Ming Chiao Tung University and Academia Sinica, 4Graduate Institute of Biomedical Sciences, College of Medicine, Chang Gung University, 5Center for Molecular and Clinical Immunology, Chang Gung University, 6Division of General Surgery, Department of Surgery, Chang Gung Memorial Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio presenta un metodo di imaging 3D che utilizza tessuti intestinali a montaggio intero e microscopia multi-fotone per quantificare il muco secreto, consentendo un'analisi volumetrica precisa e la visualizzazione della dinamica del muco in risposta a stimoli come il cloruro di carbamilcolina.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il muco svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'omeostasi intestinale facilitando la digestione, formando una barriera contro i microbi e regolando le risposte immunitarie all'interno dell'intestino. La sua secrezione è modulata da vari fattori intrinseci ed estrinseci, tra cui infezioni microbiche e infiammazioni. Mentre i metodi tradizionali per l'analisi del muco si basano sulla quantificazione relativa, come la misurazione dello spessore del muco nelle sezioni istologiche, questi approcci forniscono una visione limitata del volume effettivo e della distribuzione spaziale del muco secreto all'interno del lume intestinale. Qui, presentiamo una metodologia dettagliata per la quantificazione tridimensionale assoluta del muco utilizzando tessuti intestinali a montaggio intero e microscopia multifotonica. Questo protocollo include la preparazione di anse intestinali legate, il trattamento con carbamilcolina cloruro come stimolo per l'attivazione delle cellule caliciformi, la fissazione dei tessuti e la colorazione per l'imaging. Utilizzando la microscopia multifotone, acquisiamo immagini Z-stacked della superficie luminale. Questi vengono elaborati nel software Imaris per quantificare il volume e la distribuzione spaziale del muco secreto. Dimostriamo che il cloruro di carbamilcolina induce in modo robusto la secrezione di muco sia nei tessuti ileali che in quelli del colon entro 30 minuti. Il muco secreto appare in modo sporadico e discontinuo in tutto il lume, sottolineando l'importanza dell'analisi volumetrica rispetto ai tradizionali approcci bidimensionali. Questo protocollo consente ai ricercatori di ottenere dati quantitativi assoluti e visualizzare la distribuzione del muco in situ, offrendo un potente strumento per studiare la dinamica del muco intestinale in condizioni fisiologiche e patologiche.

Introduction

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L'ambiente mucoso del tratto gastrointestinale dei mammiferi è altamente dinamico e supporta la colonizzazione di una comunità microbica diversificata. L'epitelio intestinale è costituito da varie cellule specializzate che collaborano per assorbire i nutrienti, mantenere l'integrità della barriera e comunicare con il sistema immunitario1. Tra queste, le cellule caliciformi immagazzinano granuli di mucina e secernono muco nel lume in condizioni di stato stazionario. Questo muco forma una barriera fisica critica, impedendo il contatto microbico diretto con lo strato epiteliale, modulando l'infiammazione dei tessuti e mantenendo l'omeostasi intestinale 2,3. La disregolazione della secrezione di muco compromette la funzione barriera ed è stata associata a infiammazione e tumorigenesi 4,5,6,7.

La secrezione intestinale di muco può essere innescata da fattori intrinseci, come il neurotrasmettitore acetilcolina, e da componenti microbici dei commensali 8,9. Data la complessità dell'ambiente intestinale, molti fattori che influenzano la secrezione di muco delle cellule caliciformi rimangono inesplorati. Pertanto, un metodo preciso per quantificare il muco luminale è essenziale per studiare come i diversi stimoli influenzano la dinamica della secrezione. Gli approcci tradizionali si basano principalmente sulla quantificazione relativa: ad esempio, la misurazione dello spessore del muco utilizzando particelle fluorescenti o di carbone in sistemi di espianti intestinali ex vivo 10,11, o la valutazione della distanza tra i microbi luminali e l'epitelio in sezioni di tessuto colorato12,13. Sebbene questi metodi siano convenienti per i confronti relativi, potrebbero non catturare l'intera distribuzione o la struttura tridimensionale del muco secreto, in particolare perché il muco secreto non sempre copre uniformemente l'epitelio.

In questo studio, presentiamo un metodo per la visualizzazione tridimensionale e la quantificazione assoluta del muco luminale utilizzando tessuti intestinali a montaggio intero. Questo approccio richiede la fissazione di tessuti freschi con un fissativo appropriato per preservare l'integrità strutturale e la morfologia, seguita da colorazione fluorescente e imaging con un microscopio confocale o multifotone. Somministrando agenti di prova direttamente nelle anse intestinali legate di topi profondamente anestetizzati, seguiti da una fissazione immediata, il metodo preserva l'architettura del muco nativo e consente l'analisi della cinetica delle secrezioni. Rispetto ai tessuti sezionati, dove la profondità di imaging è principalmente limitata dallo spessore del tessuto, la profondità di imaging dei tessuti a montaggio intero (senza delipidazione) raggiunge circa 200-300 μm, limitata dalla diffusione della luce e dall'opacità del tessuto. Utilizzando questa tecnica, dimostriamo che il cloruro di carbamilcolina (CCh), un analogo dell'acetilcolina i cui recettori sono espressi sulle cellule caliciformi14, induce in modo robusto una rapida secrezione di muco. In particolare, il muco secreto forma sia uno strato continuo lungo l'epitelio che strutture discontinue all'interno del lume, caratteristiche difficili da rilevare nelle sezioni di tessuto convenzionali. Questo protocollo fornisce una solida piattaforma per quantificare la distribuzione tridimensionale del muco intestinale e per confrontare il potenziale di induzione del muco di vari stimoli.

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Protocol

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) dell'Università Chang Gung. La struttura per animali dell'Università di Chang Gung è accreditata dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio (AAALAC). In questi studi non sono stati osservati problemi di salute animale.

1. Preparazione della base di fissaggio

  1. Miscelare la polvere di agarosio con ddH2O a una concentrazione del 4% (p/v) in un matraccio per microonde. Microonde per 2-3 minuti fino a raggiungere il bollore senza minuscole bolle.
    NOTA: Il volume dipende dal numero di campioni; circa 10 ml per una piastra di 6 cm.
  2. Lasciare raffreddare la soluzione di agarosio a ~60 °C in ~3 min. Versare con cura l'agarosio in una pirofila da 6 cm fino a quando l'altezza del liquido raggiunge la metà della pirofila (circa 10 ml per una teglia da 6 cm).
  3. Posizionare il piatto con coperchio in una zona chiusa per 20-30 minuti, fino a quando l'agarosio non si sarà completamente solidificato.

2. Preparazione del materiale di fissaggio

  1. Preparare nuovi fili di rame e tagliarli in lunghezze di 5 mm. Ogni pezzo di tessuto richiede 6-8 pezzi di filo.

3. Preparazione della soluzione di CCh

  1. Sciogliere il CCh cristallino in tampone PBS sterile fino a una concentrazione finale di 10 μM (200 μL per un'ansa intestinale).

4. Preparazione di anestetici iniettabili

  1. Per preparare la soluzione madre per l'anestesia, sciogliere il 2,2,2-tribromoetanolo in 2-metil-2-butanolo.
  2. Utilizzare PBS sterile per diluire la soluzione madre, in modo che la soluzione di lavoro finale contenga 30 mg/mL di 2,2,2-tribromoetanolo e il 3% (v/v) di 2-metil-2-butanolo.
  3. Agitare accuratamente per ~1 min fino a quando non rimane più pellet in soluzione (velocità massima: 8).
  4. Conservare la soluzione madre al buio a 4 °C per evitare la degradazione; Smaltire il brodo 1 mese dopo la preparazione.
  5. Prima dell'anestesia, aspirare la soluzione madre in PBS sterile e mescolare bene per garantire una dispersione uniforme, raggiungendo una dose finale di 250 mg/kg per topo.
    ATTENZIONE: Il 2,2,2-tribromoetanolo ha neurotossicità e il 2-metil-2-butanolo è volatile e ha un odore irritante. È necessario utilizzare dispositivi di protezione adeguati. Per lo smaltimento, raccogliere i rifiuti in un contenitore sigillato e seguire le procedure di smaltimento dei rifiuti chimici pericolosi dell'istituto.

5. Inoculazione intestinale tramite iniezione ad ansa

  1. Anestetizzare un topo di 6-8 settimane con iniezione intraperitoneale di 200 μl di 2,2,2-tribromoetanolo (250 mg/kg per topo) e posizionare il mouse su un termoforo per mantenere la sua temperatura corporea.
  2. Dopo aver sterilizzato la superficie della pelle con alcol, praticare un'incisione nell'addome inferiore sinistro del topo utilizzando le forbici operative ed esporre il cieco in anestesia.
  3. Identificare l'ileo o il colon prossimale, posizionare l'ansa intestinale su una garza sterile e utilizzare pinze arteriose per fissare entrambe le estremità, creando un'ansa chiusa lunga 3 cm.
  4. Sciacquare l'organo sulla garza con PBS sterile.
  5. Iniettare il reagente sterile PBS o CCh in un volume non superiore a 200 μL nell'ansa intestinale legata in anestesia.

6. Prelievo, fissazione e colorazione dei tessuti

  1. Dopo 30 minuti di trattamento, sopprimere il topo mediante lussazione cervicale e prelevare l'ansa intestinale.
  2. Usa una pinza per tenere l'ansa intestinale e sciacquala delicatamente con PBS sterile.
  3. Tagliare delicatamente l'ansa intestinale longitudinalmente e sciacquare il tessuto con PBS sterile.
  4. Appiattire il tessuto e utilizzare dei segmenti di filo di rame per ancorarlo all'agarosio in un piatto di 6 cm.
  5. Fissare il tessuto con 10 mL di soluzione di paraformaldeide al 4% per 12-24 ore nella capsula.
  6. Lavare il fazzoletto con PBS almeno 3 volte per rimuovere la paraformaldeide residua.
  7. Immergere il tessuto in 10 mL di tampone bloccante (PBS integrato con Triton X-100 allo 0,4% e albumina sierica bovina al 3% [BSA]) a 4 °C per 12-24 ore nella capsula.
  8. Colorare il tessuto con agglutinina del germe di grano (WGA, 1:200) e falloidina (1:500) in tampone bloccante, agitando a 120 giri/min a 4 °C per 12-24 ore in piastra.
    NOTA: Per ridurre al minimo il consumo di colorante, il tessuto può essere ancorato su agarosio solidificato in un piatto di 3 cm immerso in 2 mL di tampone colorante per la colorazione.
    ATTENZIONE: La paraformaldeide rappresenta un rischio di inalazione. Durante la manipolazione devono essere utilizzati dispositivi di protezione adeguati, ad esempio il funzionamento in una cappa aspirante. Per lo smaltimento, raccogliere i rifiuti in un contenitore sigillato e seguire le procedure di smaltimento dei rifiuti chimici pericolosi dell'istituto.

7. Acquisizione di immagini mediante microscopia multifotone

  1. Lavare via il tampone di colorazione rimanente almeno 3 volte con PBS.
  2. Ancorare il tessuto su agarosio con fili di rame in una piastra di 6 cm in 10 mL di PBS.
  3. Acquisisci 100 sezioni ottiche (che coprono 99 μm di profondità) di tessuto intestinale e muco secreto associato utilizzando un microscopio multifotone dotato di una lente obiettivo ad alta NA per l'imaging dei tessuti profondi. Utilizzare una sorgente di eccitazione per la microscopia multifotone impostata su una lunghezza d'onda di 750 nm. Raccogli i segnali di emissione utilizzando i filtri passa-banda BP500-550 nm e BP565-610 nm. Impostare la velocità di scansione su 8.
    NOTA: Per la microscopia multifotone, la velocità di scansione massima è 9, con valori più alti che indicano un'acquisizione più rapida. L'impostazione della velocità dipende dalla capacità del microscopio. Quando si utilizza la piattaforma di imaging utilizzata per acquisire stack 3D, si consiglia una velocità di scansione di 8 per bilanciare il tempo di acquisizione e la qualità dell'immagine.

8. Analisi delle immagini e quantificazione del muco (Figura 1)

  1. Per misurare il volume di ogni particella di muco (nel canale WGA), apri la pila di immagini in Imaris trascinando e rilasciando il file sulla pagina Arena. Fare clic sull'icona Superficie per avviare il flusso di lavoro di creazione della superficie. Segui i passaggi standard per segmentare e quantificare i volumi delle particelle all'interno dello z-stack. I parametri specifici e le fasi di lavorazione sono descritti in dettaglio nella Figura 1.
  2. Escludere le particelle di muco più piccole di 1.000 μm3, che sono per lo più cellule caliciformi (Figura 2A, B).
  3. Somma il volume di muco secreto per ciascun gruppo.

9. Analisi statistica

  1. Analizza e confronta il volume totale per ogni gruppo. Inserire il valore del volume del muco in Colonna e analizzare utilizzando un test di Mann-Whitney non parametrico.

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Results

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In questo metodo, abbiamo quantificato il volume del muco intestinale da immagini impilate di tessuti interi acquisiti tramite microscopia multifotone. I tessuti intestinali sono stati colorati con falloidina fluorescente e agglutinina del germe di grano (WGA) per visualizzare la F-actina e il muco cellulari, rispettivamente15,16. Sia nei tessuti ileali che in quelli del colon trattati con PBS, il muco WGA+ è stato rilevato principalmente all'interno d...

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Discussion

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Qui presentiamo un metodo per la quantificazione tridimensionale del muco intestinale utilizzando la colorazione dei tessuti a montaggio intero, la microscopia multifotone e l'analisi con il software Imaris. Questa procedura permette di osservare la distribuzione discontinua del muco all'interno del lume intestinale e fornisce una misurazione assoluta del volume del muco.

La distribuzione discontinua del muco dopo la stimolazione è stata osservata anche nei si...

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Disclosures

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgements

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Ringraziamo il Microscopy Core Laboratory, Chang Gung Memorial Hospital, Linkou, per l'assistenza tecnica. Vorremmo anche ringraziare l'assistenza dell'Imaging Core Facility della National Yang Ming Chiao Tung University per il servizio del microscopio multifotone Zeiss LSM da 7 MP, in particolare la signora Pei-jun Chen e Yung-yu Lu per il loro supporto tecnico. Gli autori desiderano riconoscere il supporto di NSTC 110-2320-B-A49A-544-MY3 e 113-2628-B-182-002-MY3 (a YHT).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,2,2-tribromoetanoloSigma-AldrichT48402
2-metil-2-butanoloSigma-Aldrich240486
6 cm di piatto  Alpha Plus16021-1
Agarose HispanagarA02599
BSABioShopALB001
Cloruro di carbamoilcolina ≥ 98% (titolazione), cristallinoSIGMASI-C4382-1G
File di rame (nuovo)TOP TECH WIRE & INDUSTRIA DEL CAVOIW00125Filo di rame senza strato isolante
ForcipeShinetehST-M110
Garza, sterileGMTHMaggio-40
GraphPad Prism 8 GraphPad Software
TermoforoCOMFORTSY-666
IMARIS 10.0.0STRUMENTI OXFORD
ParaformaldeideBIOVOVASBL0415-1000
PBSGENESTARBL0180-1000
Sonde di marcatura con falloidinaInvitrogenA12379
ForbiciShineteh02-1250.18
Triton X-100Merck1.08603.1000
Coniugati dell'agglutinina germinale del grano (WGA)Biotium29027
Zeiss 7MP con obiettivo a immersione in acqua W Plan-Apochromat 20 x/1.0 DIC III (NA 1.0), laser Spectra-Physics Mai Tai HP ti zaffiro femtosecondi (senza modulo DeepSee) con rivelatori BP500 nm-550 nm e BP565 nm-610 nm, e lunghezza d'onda laser da 750 nmpiattaforma di imaging utilizzata per acquisire stack 3D con una lente obiettivo ad alto NA per l'imaging dei tessuti profondi; una sorgente di eccitazione per microscopia multifotonico impostata a una lunghezza d'onda di 750 nm

References

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