Articolo metodologico

Produzione di microbolle stabili monodisperse rivestite di fosfolipidi a temperatura ambiente utilizzando un dispositivo microfluidico per la focalizzazione del flusso

DOI:

10.3791/68796

⸱

10 ottobre 2025

 ,  , 
1Biomedical Engineering, Department of Cardiology, Cardiovascular Institute, Erasmus MC, 2Molecular and Nanoscale Physics Group, School of Physics and Astronomy, University of Leeds

In questo articolo

Sommario

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Questo articolo descrive un metodo per produrre microbolle monodisperse rivestite di fosfolipidi utilizzando un dispositivo microfluidico di focalizzazione del flusso a temperatura ambiente, incluso come preparare la formulazione del rivestimento fosfolipidico.

Abstract

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Le microbolle monodisperse hanno dimostrato un potenziale significativo nel migliorare l'efficacia degli agenti di contrasto a ultrasuoni sia per l'imaging che per le applicazioni terapeutiche. Queste microbolle possono essere prodotte direttamente utilizzando un metodo di focalizzazione del flusso microfluidico, che consente un controllo preciso delle loro dimensioni. Tuttavia, prevenire la coalescenza durante la produzione rimane una sfida critica. Mentre temperature di produzione elevate (ad esempio, 55 °C) possono sopprimere la coalescenza, tali condizioni complicano la progettazione di dispositivi microfluidici e possono essere incompatibili con agenti di targeting e coniugati di farmaci. Questo protocollo delinea un metodo per produrre microbolle monodisperse rivestite di fosfolipidi a temperatura ambiente, mantenendo la stabilità e la monodispersione delle microbolle per almeno 7 giorni. Il protocollo descrive anche la fabbricazione di chip microfluidici PDMS riutilizzabili e la preparazione della formulazione del rivestimento fosfolipidico contenente il tensioattivo Pluronic F68. I nostri risultati mostrano che le microbolle prodotte con questo metodo mantengono le loro dimensioni e stabilità per 7 giorni, supportando la loro futura applicabilità in contesti clinici in cui sono essenziali agenti di contrasto ecografici stabili e controllabili.

Introduzione

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Gli agenti di contrasto ad ultrasuoni (UCA) sono ampiamente utilizzati nell'ecografia clinica e nelle applicazioni terapeutiche 1,2,3. Somministrate per via endovenosa, queste microbolle rimangono confinate nel sistema vascolare, agendo come agenti del pool sanguigno 4,5. Un guscio stabilizzante ricopre le microbolle e riduce la diffusione del gas guidata dalla pressione di Laplace, prolungando così la durata della microbolla 3,6. Se esposte agli ultrasuoni, le microbolle iniziano ad oscillare e producono forti echi a causa della comprimibilità del nucleo del gas 7,8. L'oscillazione è più pronunciata alla frequenza di risonanza della microbolla, che è influenzata dalla dimensione della microbolla e dalle proprietà del guscio 9,10,11. Le UCA clinicamente approvate sono generalmente costituite da microbolle polidisperse con un'ampia distribuzione dimensionale, tipicamente compresa tra circa 0,5-10 μm di diametro 12,13,14. Questa ampia distribuzione dimensionale porta a un'ampia gamma di frequenze alle quali queste microbolle sono risonanti. Dato che le sonde ecografiche cliniche operano tipicamente in una larghezza di banda di frequenza ristretta, solo un sottoinsieme della popolazione UCA risuona efficacemente15. È stato dimostrato che le microbolle monodisperse, che hanno una distribuzione dimensionale stretta (ad esempio, PDI 3~10%16,17), aumentano la diagnosi e la terapia rispetto alle microbolle polidisperse. Per l'imaging ecografico con mezzo di contrasto, l'intensità è aumentata di due o tre ordini di grandezza18, mentre la sensibilità per il rilevamento della pressione non invasiva attraverso segnali subarmonici è stata quasi raddoppiata 19,20,21 e l'efficienza di somministrazione del farmaco è stata aumentata di quasi un ordine di grandezza 22. Di conseguenza, la produzione di microbolle monodisperse con una distribuzione dimensionale ristretta e quindi una risposta acustica è la chiave per massimizzare il loro potenziale per l'imaging a ultrasuoni e le applicazioni terapeutiche, dove le oscillazioni controllate delle microbolle sono fondamentali.

Le microbolle monodisperse possono essere prodotte attraverso vari metodi, come la decantazione23, la filtrazione meccanica24 e la centrifugazione di un agente di microbolle polidisperse25. Tuttavia, ottenere un controllo preciso delle dimensioni e un'elevata monodispersione rimane una sfida con queste tecniche26. Un approccio alternativo e più controllato è la produzione diretta di microbolle monodisperse utilizzando un dispositivo microfluidico di focalizzazione del flusso. In questo processo, un filo di gas viene focalizzato tra due flussi di liposomi acquosi su un chip microfluidico, portando a un pizzicamento riproducibile del filo di gas, che consente la produzione ad alta velocità di microbolle monodisperse alla dimensione desiderata27. Sebbene i metodi di focalizzazione del flusso siano stati ampiamente utilizzati per la produzione di goccioline monodisperse28,29, la loro applicazione nella produzione di microbolle monodisperse è meno comune a causa della difficoltà di prevenire la coalescenza e di mantenere correttamente la stabilità a lungo termine in termini di dimensioni, monodispersione e concentrazione30. La coalescenza, in cui più microbolle si fondono in altre più grandi, influisce sulla monodispersione. È stato dimostrato che temperature di produzione elevate riducono la coalescenza31, ma ciò complica la progettazione del sistema microfluidico e potrebbe non essere adatto per formulazioni che coinvolgono agenti mirati o coniugati di farmaci. Pertanto, la produzione di microbolle monodisperse a temperatura ambiente sarebbe vantaggiosa. Altrettanto importante è il metodo di conservazione di queste microbolle monodisperse, poiché le microbolle rivestite di fosfolipidi tendono a restringersi, collassare e perdere la loro monodispersione nel tempo32. Garantire la stabilità a lungo termine, per diversi giorni, durante lo stoccaggio è fondamentale per tradurre la tecnologia delle microbolle monodisperse in applicazioni cliniche.

In questo protocollo, descriviamo un metodo per la produzione di microbolle monodisperse rivestite di fosfolipidi utilizzando una piattaforma microfluidica focalizzata sul flusso a temperatura ambiente. Questo metodo è compatibile con velocità di flusso lipidico comprese tra 13 e 42 μL/min ed è progettato per l'uso a temperatura ambiente, il che lo rende adatto per i laboratori che non dispongono di controllo della temperatura sul loro sistema microfluidico. Il protocollo utilizza una formulazione fosfolipidica composta da 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[carbonil-metossipolietilenglicole] (DPPE-PEG5000) e Pluronic F68, che garantisce stabilità e riproducibilità. Il protocollo fornisce istruzioni dettagliate sulla fabbricazione di chip microfluidici PDMS riutilizzabili, sulla preparazione delle soluzioni di rivestimento fosfolipidico e sull'incorporazione del tensioattivo Pluronic F68 per prevenire la coalescenza di microbolle durante la produzione a temperatura ambiente. Descrive inoltre le procedure per la pulizia del sistema microfluidico per evitare l'intasamento degli ugelli, la regolazione della pressione del gas e della portata del liquido per controllare le dimensioni delle microbolle e la raccolta e lo stoccaggio delle microbolle prodotte per una stabilità a lungo termine. Questo metodo offre un approccio pratico per generare microbolle monodisperse stabili con un controllo preciso delle dimensioni a temperatura ambiente.

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Protocollo

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1. Realizzazione di film lipidici

NOTA: La miscela lipidica per la produzione di microbolle monodisperse è formulata con una miscela binaria di DSPC e DPPE-PEG5000 con un rapporto molare di 90:10. Il DSPC è stato scelto come lipide principale perché ha dimostrato di fornire una stabilità superiore contro la dissoluzione dei gas sia nelle microbolle polidisperse33,34 che in quelle monodisperse31. Si ipotizza che questa maggiore stabilità derivi dalla sua temperatura di transizione di fase cristallina da gel a liquido relativamente alta di 55 °C35, che è superiore a quella di altri lipidi comunemente usati come il DPPC (~41 °C)35, portando così a un guscio lipidico più rigido e impermeabile a temperatura ambiente36. Qui viene mostrato un esempio di preparazione di una soluzione di rivestimento fosfolipidico da 3 mL. Per raggiungere una concentrazione finale di fosfolipidi di 20 mg/mL, che è una concentrazione tipica per la produzione di microbolle monodisperse16,17, sono necessari 60 mg di fosfolipidi. La quantità desiderata di ciascun componente fosfolipidico è riportata nella Tabella 1.

  1. Togliere la polvere di fosfolipidi dal congelatore a -20 °C e lasciarla scongelare a temperatura ambiente per 1 ora.
  2. Pesare la polvere lipidica necessaria in matracci tarati separati da 2 mL.
  3. Preparare 100 mL di una miscela 90:10 v/v di solvente cloroformio:metanolo in una cappa aspirante misurando 90 mL di cloroformio utilizzando un cilindro graduato in vetro da 100 mL e quindi trasferendoli in un Erlenmeyer in vetro da 250 mL. Quindi misurare 10 mL di metanolo utilizzando il graduato in vetro da 100 mL e versarlo nell'Erlenmeyer da 250 mL che contiene già il cloroformio. Chiudere l'Erlenmeyer di vetro con un tappo di vetro e mescolare i due solventi facendo roteare delicatamente l'Erlenmeyer fino a quando la soluzione non è diventata limpida.
    ATTENZIONE: Il cloroformio e il metanolo sono sostanze chimiche tossiche. Il cloroformio è un potenziale cancerogeno e può causare irritazione respiratoria, cutanea e oculare. Il metanolo è altamente infiammabile, tossico se inalato, ingerito o assorbito attraverso la pelle e può causare cecità se ingerito. Lavorare sempre con miscele di cloroformio/metanolo in una cappa ben ventilata per evitare l'inalazione di fumi. Indossare dispositivi di protezione individuale adeguati, inclusi guanti, occhiali di sicurezza e camice da laboratorio. Assicurarsi che non siano presenti fiamme libere o fonti di accensione quando si maneggia il metanolo. Smaltire i rifiuti solventi secondo i protocolli per i rifiuti pericolosi dell'istituto.
  4. Per sciogliere completamente le polveri lipidiche pesate al punto 1.2, aggiungere mL di miscela di cloroformio/metanolo a ciascun pallone di vetro volumetrico da 2 mL e chiudere rapidamente il coperchio di vetro per evitare l'evaporazione.
    NOTA: Assicurarsi che la polvere lipidica sia completamente sciolta. Se necessario, agitare delicatamente il pallone per facilitarne lo scioglimento.
  5. Mescolare le soluzioni lipidiche disciolte in un flaconcino di vetro da 30 ml versando ciascuna soluzione in sequenza.
  6. Far evaporare il solvente sotto un flusso costante di gas argon, ruotando la fiala per garantire una distribuzione uniforme del film lipidico sulla superficie del vetro.
    NOTA: Le tracce finali di solvente possono essere difficili da evaporare utilizzando solo il gas argon. Lasciare il flacone nella cappa aspirante per 2 ore per consentire un'ulteriore asciugatura. Se l'argon gassoso non è disponibile, l'azoto gassoso37 o un evaporatore rotante sotto vuoto funzionante a 6 °C31,38 (cioè al di sopra della temperatura di transizione di fase del DSPC di 55 °C35) può essere utilizzato per evaporare il solvente cloroformio/metanolo.
  7. Dopo l'evaporazione del solvente, sottoporre la miscela lipidica a vuoto per eliminare eventuali residui di solvente organico residui. Sigillare la fiala di vetro con uno strato di parafilm e praticare diversi fori con un ago per consentire il flusso d'aria durante il vuoto.
    NOTA: Lo scopo dell'uso del parafilm è quello di evitare che il lipide fuoriesca dalla fiala di vetro durante il processo di liofilizzazione.
  8. Mettere le fiale in un liofilizzatore sottovuoto per una notte per rimuovere eventuali residui di solvente organico.
  9. Procedere al passaggio successivo o conservare il film lipidico a -20 °C fino al momento del bisogno.
    NOTA: In questa sezione o in altre parti del protocollo non viene utilizzata alcuna fase di centrifugazione.

2. Fabbricazione di chip microfluidici focalizzatori di flusso

NOTA: Le microbolle monodisperse sono prodotte utilizzando un chip microfluidico focalizzato il flusso, come illustrato nella Figura 1A. Uno schema della geometria del canale microfluidico, comprese le dimensioni dell'ugello e dell'uscita, è fornito nella Figura S1 supplementare. Un protocollo di fabbricazione dettagliato per la fotolitografia basata su SU-8 utilizzata per preparare questi stampi è stato descritto in precedenza37 e può essere trovato come informazioni supplementari a questo protocollo. Il processo di fabbricazione del chip PDMS è descritto nei passaggi seguenti.

  1. Miscelare la base PDMS (23 g) e l'agente indurente (2,3 g) in un rapporto peso di 10:1 per ottenere un totale di 25,5 g di PDMS.
  2. Posizionare lo stampo master in una capsula di Petri e versarvi sopra il composto PDMS.
  3. Degassare la miscela sotto vuoto (2~7 mbar) per 40 minuti per rimuovere le bolle d'aria intrappolate.
    NOTA: Per volumi maggiori, potrebbe essere necessario un tempo di degasaggio più lungo per garantire la completa rimozione delle bolle.
  4. Posizionare lo stampo su una piastra calda a 75 °C per 1 ora.
    NOTA: Per volumi maggiori, potrebbe essere necessario un tempo di polimerizzazione più lungo.
  5. Lasciare raffreddare il PDMS a temperatura ambiente. Usando un bisturi, taglia con cura intorno al PDMS polimerizzato e staccalo per rilasciare il chip.
  6. Tagliare il chip PDMS alla dimensione desiderata e punzonare i fori di ingresso/uscita utilizzando un punzone da 1 mm.
  7. Pulire il chip PDMS con nastro adesivo per rimuovere le particelle di polvere.
  8. Pulire sia il chip PDMS che il vetrino con isopropanolo, quindi con acqua deionizzata.
  9. Incollare il PDMS al vetrino trattandolo in un pulitore al plasma ad aria per 1 minuto al 60% di potenza (60 W).
  10. Posizionare il truciolo incollato su una piastra riscaldante a 95 °C per 3 minuti per migliorare l'incollaggio.
  11. Lasciare raffreddare il chip PDMS a temperatura ambiente. Il chip completamente fabbricato è mostrato nella Figura 1C e un'immagine microscopica in campo chiaro dell'ugello è mostrata nella Figura 1D.
  12. Posizionare il chip incollato nel pulitore al plasma per 5 minuti all'80% della potenza (80 W) per ripristinare l'idrofilia superficiale del canale microfluidico.
  13. Riempire immediatamente il chip con acqua Milli-Q per preservarne l'idrofilia.
  14. Conservare i chip a temperatura ambiente in acqua Milli-Q fino al momento dell'uso.

3. Preparazione della soluzione di rivestimento fosfolipidico

  1. Togliere la pellicola lipidica preparata dal congelatore a -20 °C e scongelare a temperatura ambiente per 1 ora.
  2. Aggiungere 3 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) preriscaldata (55 °C) al film lipidico (60 mg) per raggiungere una concentrazione lipidica finale di 20 mg/mL. Porre i flaconcini in un bagnomaria a 55 °C per 40 minuti, agitando ogni 15 minuti a velocità media (livello 3 di 5 sul miscelatore a vortice).
    NOTA: Questo passaggio serve a pre-sciogliere e disperdere uniformemente i componenti lipidici nel PBS prima della sonicazione nel passaggio 3.5. Questa temperatura è la temperatura di transizione di fase del DSPC39, che favorisce la solubilizzazione parziale e riduce l'aggregazione lipidica. Sebbene la sonicazione nella fase 3.6 sia necessaria per ottenere la piena chiarezza ottica, l'incubazione termica preliminare facilita una sonicazione più efficiente e riproducibile, riducendo al minimo la formazione di grandi aggregati lipidici e migliorando l'omogeneità della dispersione.
  3. Aggiungere 0,43 mL di soluzione di Pluronic F68 alla miscela lipidica per raggiungere una concentrazione molare del 10%, vale a dire, DSPC: DPPE-PEG5000: Pluronic F68 = 81: 9: 10 mol%. Successivamente, il campione dovrebbe assomigliare visivamente alla Figura 2A, che è una soluzione torbida.
    NOTA: Pluronic F68 è un tensioattivo utilizzato per prevenire la coalescenza durante la produzione di microbolle monodisperse 16,40. In assenza di Pluronic F68, le microbolle monodisperse non possono essere formate utilizzando il dispositivo microfluidico Horizon37e la formulazione lipidica descritta in questo protocollo16. Nella formulazione lipidica non è stato utilizzato glicole propilenico, poiché è stato riportato che questo composto compromette sia la monodispersione che la stabilità della sospensione di microbolle monodisperse risultante38.
  4. Per la preparazione di microbolle monodisperse marcate in fluorescenza, incorporare un colorante lipidico, come un colorante lipofilo carbocianina , nella miscela in questa fase.
  5. Sonicare la miscela lipidica a bagnomaria al 100% della potenza per 20 minuti, mantenendo la temperatura dell'acqua a 55 °C. La soluzione lipidica dovrebbe assomigliare alla Figura 2B dopo 20 minuti, che è una soluzione meno torbida rispetto al passaggio 3.4. Continuare la sonicazione a intervalli di 10 minuti fino a quando la soluzione non è limpida, come mostrato nella Figura 2C.
    NOTA: Per la soluzione della Figura 2C, sono stati necessari 30 minuti di sonicazione per ottenere una soluzione limpida. La caratterizzazione della soluzione lipidica può essere eseguita misurando la dimensione del liposoma utilizzando, ad esempio, un diffusore di luce dinamico.
  6. Lasciare raffreddare la soluzione lipidica a temperatura ambiente prima di procedere con l'ulteriore lavorazione.

4. Preparazione del flacone di raccolta microbolle

NOTA: Per garantire la conservazione a lungo termine delle microbolle monodisperse, è necessaria una fiala medicale a tenuta di gas come fiala di raccolta.

  1. Sigillare un flaconcino medico in vetro da 5 ml con un tappo di gomma e riempire il flaconcino con gas C4F10 . Successivamente, crimpare un tappo di alluminio attorno alla fiala per garantire la tenuta del gas. La fiala di raccolta è ora pronta per l'uso.

5. Preparazione della piattaforma microfluidica

NOTA: Come illustrato nella Figura 3A, il sistema comprende la piattaforma microfluidica Horizon37 (di seguito denominata "piattaforma microfluidica"), un computer per il controllo, una telecamera ad alta velocità per il monitoraggio del processo di produzione, una sorgente luminosa esterna a diodi a emissione di luce (LED) per l'illuminazione durante l'imaging ad alta velocità e un generatore di forme d'onda funzionali per l'attivazione di immagini ad alta velocità a intervalli specifici durante la produzione. Prima di iniziare la produzione di microbolle, il dispositivo deve essere pulito per ridurre la probabilità di intasamento dell'ugello. La procedura di pulizia coinvolge sia il tubo che il chip microfluidico.

  1. Procedura di pulizia dei tubi
    1. Accendere l'interruttore di alimentazione della piattaforma microfluidica, che si trova sul lato destro (Figura 3A).
      NOTA: L'"interruttore di alimentazione" si riferisce all'unità di controllo dell'alimentazione principale della piattaforma Horizon, che attiva il microcontrollore, le pompe e i sensori interni del sistema.
    2. Posizionare un flaconcino di vetro da 4 mL riempito con etanolo al 70% sul lato sinistro della camera della pompa P della piattaforma microfluidica (Figura 3). Avviare il flusso del liquido a 100 μL/min in modo che il tubo di ingresso del liquido venga lavato con l'etanolo al 70% dalla fiala. Interrompere il lavaggio interrompendo il flusso del liquido dopo 5 minuti.
      NOTA: La pompa P si riferisce all'unità di erogazione del gas a pressione controllata integrata nel sistema microfluidico. Questo passaggio ha lo scopo di pulire solo il tubo; Il tubo non deve essere collegato al chip microfluidico in questa fase. Questo processo rimuove la polvere solubile in etanolo e i contaminanti dal sistema fluidico.
    3. Sostituire il flaconcino riempito di etanolo con un flaconcino riempito d'acqua Milli-Q.
    4. Sciacquare il tubo con acqua Milli-Q a 100 μL/min per 5 minuti per rimuovere eventuali residui di etanolo dal sistema.
  2. Procedura di pulizia dei trucioli
    1. Accendere l'interruttore della luce LED interna della piattaforma microfluidica.
    2. Inserire il chip PDMS nel supporto.
    3. Posizionare il collettore sopra il truciolo e fissarlo utilizzando la rotella regolabile.
    4. Collegare il gas, il liquido e il tubo di uscita al chip PDMS utilizzando una pinzetta. La configurazione della connessione è illustrata nella Figura 3B. Assicurarsi che il tubo di uscita conduca a una fiala per raccogliere la soluzione di scarto del processo di pulizia.
    5. Regolare la piattaforma per posizionare l'ugello del chip all'interno del campo visivo dell'obiettivo.
    6. Pulire il chip con acqua Milli-Q per 5 minuti utilizzando una pressione del gas di 1000 mbar e una portata del liquido di 100 μL/min. Avviare prima il flusso di gas, quindi seguire il flusso di liquido.
      NOTA: Questo passaggio serve a pulire il chip microfluidico a monte dell'ugello.
    7. Arrestare il flusso di liquido, seguito dal flusso di gas.
    8. Ricollegare il tubo del gas e quello di uscita come mostrato in (Figura 3C).
    9. Ripetere la procedura di lavaggio con acqua Milli-Q per altri 5 minuti, utilizzando una pressione del gas di 1000 mbar e una portata del liquido di 50 μL/min. Avviare prima il flusso di gas, quindi seguire il flusso di liquido.
      NOTA: Questa configurazione pulisce il chip microfluidico a valle dell'ugello.
    10. Arrestare il flusso di liquido, seguito dal flusso di gas. Il chip PDMS è ora pronto per la produzione di microbolle.

6. Configurazione dell'imaging ad alta velocità

NOTA: Per monitorare e controllare la produzione di microbolle monodisperse, si consiglia di integrare una telecamera ad alta velocità con la piattaforma microfluidica, poiché la microbolla verrà prodotta a una velocità di produzione superiore a 105 microbolle/s. La telecamera ad alta velocità consente di misurare le dimensioni e il tasso di produzione delle microbolle sul chip, nonché di monitorare la coalescenza delle microbolle sul chip.

  1. Montare una sorgente luminosa a LED sopra la piattaforma di montaggio (Figura 3A) per illuminare il chip microfluidico durante l'imaging ad alta velocità.
  2. Accoppiare la fotocamera ad alta velocità alla porta di imaging laterale della piattaforma microfluidica.
  3. Utilizza un generatore di forme d'onda a funzione esterna per attivare registrazioni ad alta velocità a intervalli di 10 s per l'intera durata della produzione di microbolle. Collegare l'uscita trigger TTL del generatore di forme d'onda all'ingresso trigger esterno della telecamera ad alta velocità utilizzando un cavo BNC standard per garantire un'acquisizione sincronizzata. Questo monitoraggio è necessario per valutare la forma del filo del gas e la stabilità dimensionale delle microbolle durante la produzione.
    NOTA: Il monitoraggio continuo è importante, poiché durante la produzione possono verificarsi ostruzioni. Inoltre, le sequenze di immagini ad alta velocità vengono utilizzate per estrarre distribuzioni dimensionali delle microbolle su chip risolte nel tempo. Questo intervallo di 10 s può essere regolato in base alle esigenze dell'utente.

7. Produzione e caratterizzazione di microbolle monodisperse

  1. Prima di iniziare la produzione, impostare la fiala di raccolta come mostrato nella Figura 4A. Forare un ago attraverso il tappo di gomma per fungere da ago di raccolta e un altro ago attraverso il tappo come ago di ventilazione, con la punta dell'ago posizionata vicino al fondo della fiala. Tenere la fiala di raccolta capovolta utilizzando una pinza durante la produzione.
    NOTA: L'ago di ventilazione garantisce una pressione costante all'interno del flaconcino durante la raccolta. Poiché C4F10 è più pesante dell'aria, non esce spontaneamente dalla fiala.
  2. Caricare la soluzione fosfolipidica preparata nella pompa P della piattaforma microfluidica.
  3. Spostare la parte dell'ugello del chip nel campo visivo dell'obiettivo.
    NOTA: La piattaforma microfluidica include un modulo ottico interno con zoom e messa a fuoco regolabili e un accoppiatore esterno F-mount per il collegamento di una fotocamera ad alta velocità.
  4. Per avviare la produzione di microbolle, impostare la pressione del gas a 800 mbar e la portata del liquido a 40 μL/min.
    NOTA: La piattaforma microfluidica integra due canali per liquidi a flusso controllato, 1-5 μL/min a sinistra e 1-100 μL/min a destra, e un canale per gas a pressione controllata. In questo protocollo, sono stati utilizzati il canale del liquido da 1-100 μL/min e il canale del gas a pressione controllata.
  5. Una volta che il liquido raggiunge l'ugello, la filettatura del gas si stacca e rilascia microbolle monodisperse attraverso l'uscita (Figura 4A).
  6. Imposta la registrazione ad alta velocità su un frame rate di ≥ 200.000 fps e utilizza le registrazioni ad alta velocità per misurare la dimensione delle microbolle prodotte tramite la funzione imfindcircles in MATLAB.
  7. Regolare la pressione del gas e la portata del liquido per controllare la dimensione delle microbolle.
    NOTA: Dopo aver regolato la portata e/o la pressione del gas, utilizzare lo script MATLAB per tracciare la distribuzione delle dimensioni su chip dalla registrazione ad alta velocità. Adattando la distribuzione dimensionale con una distribuzione gaussiana, è possibile derivare la μ media e la deviazione standard σ . Il μ rappresenta la dimensione su chip delle microbolle monodisperse prodotte. La coalescenza delle microbolle potrebbe verificarsi nella fase iniziale della produzione a causa dell'acqua Milli-Q residua nel tubo, che diluisce la concentrazione lipidica. Questo problema in genere si risolve una volta che la soluzione lipidica non diluita raggiunge l'ugello. La Tabella 2 riassume i diametri delle microbolle risultanti per diverse portate applicate a una pressione del gas costante di 800 mbar; Varie combinazioni di pressione del gas e portata del liquido possono produrre microbolle di dimensioni simili, sebbene anche diverse combinazioni di parametri influenzino la velocità di produzione. A una portata di gas costante, è noto che la velocità di produzione è correlata positivamente con le portate del liquido41. Il tasso di produzione di microbolle in questo protocollo è dell'ordine di ~105 microbolle al secondo, sulla base di un'analisi fotogramma per fotogramma delle registrazioni ad alta velocità, che è coerente con i valori precedentemente riportati per geometrie di focalizzazione del flusso simili37.
  8. Una volta raggiunta la dimensione desiderata delle microbolle, raccogliere le microbolle prodotte collegando il tubo di uscita alla fiala di raccolta.
  9. Durante la raccolta, impostare la registrazione ad alta velocità in modo che si attivi ogni 10 s per monitorare il processo di produzione.
    NOTA: L'intervallo tra le registrazioni può essere regolato in base a requisiti specifici.
  10. Dopo aver raccolto una quantità sufficiente di microbolle, rimuovere sia l'ago di ventilazione che l'ago di raccolta dal flaconcino di raccolta.
  11. Arrestare il flusso di liquido, seguito dal flusso di gas.
  12. Conservare le microbolle raccolte in posizione verticale a temperatura ambiente, assicurandosi che la fiala venga minimamente agitata meccanicamente.
    NOTA: La soluzione di microbolle avrà tre strati come mostrato nella Figura 5A: uno strato di schiuma, uno strato di microbolle monodisperse e un subnatante. È meglio lasciare lo strato di schiuma nella fiala, poiché studi precedenti hanno riportato che le bolle associate alla schiuma possono ridursi gradualmente fino a raggiungere una dimensione monodispersa di16,38. Le microbolle prodotte con questo protocollo non sono state sottoposte a valutazione di sicurezza normativa. Tuttavia, i lipidi costituenti (DSPC, DPPE-PEG5000) e il tensioattivo (Pluronic F68) sono comunemente usati nelle formulazioni iniettabili approvate dalla FDA e sono considerati biocompatibili42,43. È necessaria un'ulteriore valutazione preclinica per stabilire la sicurezza per uso medico.
  13. 2 ore dopo la produzione (cioè 2 ore dopo la produzione delle microbolle monodisperse), caratterizzare la dimensione finale e la concentrazione delle microbolle utilizzando una macchina per la caratterizzazione delle particelle.
    NOTA: Le microbolle monodisperse prodotte con il metodo di focalizzazione del flusso richiedono circa 90 minuti per stabilizzarsi alla loro dimensione finale44. Pertanto, si consiglia di consentire almeno 2 ore di stabilizzazione prima di utilizzare le microbolle.
  14. Collegare un ago da 19 G a una siringa da ml, di seguito denominata "siringa di estrazione".
  15. Inserire un ago separato da 19 G nel flaconcino di microbolle come ago di ventilazione. Assicurarsi che la punta dell'ago rimanga vicino alla parte superiore del flaconcino per consentire l'ingresso dell'aria e mantenere la pressione interna durante l'estrazione delle microbolle.
  16. Agitare delicatamente la fiala per omogeneizzare la sospensione. La sospensione si separerà in tre strati: uno strato superiore di schiuma, uno strato intermedio contenente microbolle monodisperse e uno strato acquoso inferiore.
  17. Inserire rapidamente la siringa di estrazione e posizionare con cura la punta dell'ago al centro dello strato di microbolle monodisperse, evitando la schiuma e lo strato acquoso inferiore di subnatante. Prelevare il volume desiderato di sospensione di microbolle e rimuovere la siringa di estrazione dal flaconcino. Al termine dell'estrazione delle microbolle, rimuovere l'ago di ventilazione.

8. Procedura di pulizia e spegnimento

NOTA: Dopo la produzione di microbolle, la piattaforma microfluidica e il chip devono essere accuratamente puliti per garantire il corretto funzionamento e consentire il riutilizzo del chip. I passaggi seguenti descrivono il processo di pulizia.

  1. Per il chip, procedere come segue:
    1. Sostituire il flaconcino di lipidi con un flaconcino d'acqua Milli-Q.
    2. Lavare il chip microfluidico utilizzando una pressione del gas di 800 mbar e una portata del liquido di 40 μL/min per 5 minuti.
    3. Arrestare prima il flusso di liquido, quindi interrompere il flusso di gas.
    4. Scollegare solo il tubo di ingresso del gas dal chip microfluidico.
    5. Riempire il chip microfluidico con acqua Milli-Q per mantenere l'idrofilia delle superfici interne.
    6. Arrestare il flusso del liquido e scollegare tutti i tubi rimanenti dal chip.
    7. Conservare il chip in acqua Milli-Q fino a quando non sarà necessario per un uso futuro.
  2. Per il sistema microfluidico, procedere come segue:
    1. Sostituire la fiala d'acqua Milli-Q con una fiala di etanolo al 70% nella piattaforma microfluidica.
    2. Lavare il tubo di ingresso del liquido con etanolo al 70% a una portata di 100 μL/min per 5 minuti per rimuovere eventuali residui lipidici.
    3. Sostituire la fiala di etanolo con una fiala d'acqua Milli-Q in P-Pump1.
    4. Sciacquare il tubo con acqua Milli-Q a 100 μL/min per 5 minuti per rimuovere eventuali residui di etanolo dal sistema. Il sistema è ora pulito.
    5. Spegnere la piattaforma microfluidica e il sistema di telecamere ad alta velocità.

9. Passaggi per la risoluzione dei problemi

  1. Blocco dell'ugello
    NOTA: Date le dimensioni ridotte dell'ugello (5 μm), possono verificarsi ostruzioni durante il processo di produzione. Per eliminare il blocco, attenersi alla seguente procedura.
    1. Interrompere immediatamente il flusso di liquido, seguito dal flusso di gas.
    2. Ricollegare il tubo secondo la configurazione mostrata nella Figura 3B.
    3. Sostituire il flaconcino pieno di fosfolipidi con un flaconcino pieno d'acqua Milli-Q in P-Pump1.
    4. Applicare una pressione del gas di 1000 mbar e impostare la portata del liquido a 100 μL/min per 5 minuti per lavare l'ugello.
      NOTA: Nella maggior parte dei casi, le ostruzioni vengono eliminate dopo un risciacquo di 5 minuti. Tuttavia, se il blocco persiste, potrebbe essere necessario sostituire il chip PDMS con uno nuovo.
    5. Una volta eliminato il blocco, ricollegare il tubo come indicato nella Figura 3C.
    6. Lavare nuovamente il chip con acqua Milli-Q per 5 minuti, utilizzando una pressione del gas di 1000 mbar e una portata del liquido di 50 μl/min per garantire la completa liberazione.
    7. Sostituire la fiala riempita d'acqua Milli-Q con la fiala piena di fosfolipidi in P-Pump1 e riprendere la produzione di microbolle.
      NOTA: Se i blocchi persistono durante la produzione, ciò potrebbe indicare una pulizia insufficiente del tubo o del chip microfluidico. In questo caso, scollegare il tubo dal chip e seguire la procedura di pulizia descritta al punto 5. Se i blocchi continuano a verificarsi dopo aver pulito a fondo l'intero sistema, potrebbe suggerire un guasto del filtro interno nella piattaforma microfluidica. La sostituzione del filtro con uno nuovo potrebbe risolvere il problema.
  2. Se lo si desidera, riutilizzare il chip microfluidico.
    NOTA: Se il chip non viene conservato correttamente, potrebbe perdere idrofilia. In tal caso, il pizzicamento della filettatura del gas potrebbe assomigliare allo schema mostrato nella Figura 5E. In questi casi, si consiglia di passare a un nuovo chip idrofilo per garantire una produzione costante e affidabile di microbolle.

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Risultati

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In questo protocollo, presentiamo un metodo per produrre microbolle stabili e monodisperse a temperatura ambiente utilizzando un chip microfluidico focalizzato sul flusso. Il chip PDMS è fabbricato mediante fusione da uno stampo master, come mostrato nella Figura 1. Per legare il chip PDMS a un vetrino, viene impiegato il trattamento al plasma. Il trattamento al plasma è fondamentale in quanto altera la superficie del PDMS da idrofobica a idrofila. Questa idrofilia è essenziale per mantenere...

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Discussione

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Questo protocollo descrive in dettaglio come produrre e conservare microbolle monodisperse stabili a temperatura ambiente utilizzando un chip microfluidico di focalizzazione del flusso. La microbolla monodispersa può essere utilizzata per l'imaging ecografico con mezzo di contrasto18, il rilevamento della pressione non invasivo19 e la somministrazione di farmaci mediata da microbolle22, sia in vitro che ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato finanziato in parte dal Consiglio Europeo della Ricerca (CER) nell'ambito del Programma di Ricerca e Innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea (Grant Agreement 805308) e in parte dal TTW Applied and Engineering Sciences (VIDI-project 17543), parte del NWO, entrambi assegnati a K.K. La piattaforma microfluidica Horizon è stata sviluppata con finanziamenti provenienti da sovvenzioni EPSRC (sovvenzioni n. EP/I000623 e EP/K023845). Gli autori ringraziano il Microbubble Consortium (http://www.microbubbles.leeds.ac.uk/) dell'Università di Leeds per le utili discussioni, così come Stuart Weston e Andrew Price per il loro aiuto nella concettualizzazione dello strumento e della produzione di parti per la Horizon Microfluidic Platform. Lo stampo master per la fabbricazione dei chip PDMS è stato gentilmente fornito dall'Università di Leeds. Gli autori ringraziano Robert Beurskens del Dipartimento di Ingegneria Biomedica del Dipartimento di Cardiologia e Geert Springeling del Dipartimento di Strumentazione Medica Sperimentale, entrambi dell'Erasmus MC, Paesi Bassi, per l'assistenza tecnica durante gli esperimenti.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Punzone per biopsia da 1 mm Kai Medical143831
1,1'-Didottenil-3,3,3',3'-Tetrametilindodicarbocianina (DiD)Thermo Fisher ScienticD307un colorante lipofilo a base di carbocianina
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[glicole carbonil-metossipolietilenglicole] (DPPE-PEG5000)LipoideN. CAS. 384835-61-4
1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC)LipoideN. CAS. 816-94-4
Cilindro graduato in vetro da 100 mLBLAUBRAND
Palloni volumetrici in vetro da 2 mLBLAUBRAND
250 mL di bicchiere ErlenmeyerBLAUBRAND
Flaconcino di vetro da 30 mLDWK Scienze della vitaSCERC40752700D0C2
70% etanolo
75 gradi C piastra riscaldante 
Nastro adesivo
Tappo in alluminio Sigma-aldrich27016
Gas argon  Linde Gas Benelux
C4F10 gasF2 Sostanze chimiche
CloroformioMerck KGaA67-66-3
Clinicamente disponibile  Agente di contrasto ad ultrasuoni (ad es. microbolle)Bracco,
Plan-LesOuates, Svizzera		SonoVueFigura 6A.
Spillo di raccolta e ventilazione 19G100 Sterican4657799
Multisizer da banco per coltri 3Beckman CoulterMacchina per la caratterizzazione di particelle
Mezzo di contrasto ad ultrasuoni su misura (ad es. microbolle monodisperse)NAF1-10PFFigura 6A. Prodotto come descritto da: Wang, Y. et al. Influenza di Pluronic F68 sulla stabilità dimensionale e sul comportamento acustico di microbolle monodisperse rivestite di fosfolipidi prodotte a temperatura ambiente. ACS Appl. Mater. Interfacce 2025, 17, 8976−8986. (2025).
Mezzo di contrasto ad ultrasuoni su misura (ad es. microbolle monodisperse)NAF2-10 PFFigura 6A. Prodotto come descritto da: Wang, Y. et al. Influenza di Pluronic F68 sulla stabilità dimensionale e sul comportamento acustico di microbolle monodisperse rivestite di fosfolipidi prodotte a temperatura ambiente. ACS Appl. Mater. Interfacce 2025, 17, 8976−8986. (2025).
Acqua Demi
Luce LED esternaGSVITECGS02370
LiofilizzatoreMertin Christ GmbHAlfa 1– 2 LD plus
Funzione generatore di forme d'onda Agilent33220A
Fiala di vetro a tenuta di gasSigma-aldrichZ113964-288EA
Scivolo in vetroVWR631-1552
Fotocamera ad alta velocitàFototroneNova S16
Piattaforma microfluidica HorizonUniversità di Leeds, InghilterraLa piattaforma è disponibile in commercio e descritta in dettaglio in: Abou-Saleh, R. H. et al. Horizon: Piattaforma microfluidica per la produzione di microbolle e nanobolle terapeutiche. Rassegna di strumenti scientifici. 92 (7), 074105 (2021).
MatlabIl progetto MathWorksAnno 2023a
MetanoloMerck KGaA67-56-1
Milli-Q acqua
Gel PDMSSYLGARDSYLGARD®   184
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS 1x) Gibco10010023
Pulitore al plasmaHenniker ScientificHPT-100
Pluronic F68Thermo Fisher Scientifico24040032
Tappo in gommaSigmaZ166065-100EA
TubaturaAzienda MasterflexMFLX06407-41PTFE, 1/32" ID x 1/16" OD; 25 piedi
Pinzetta
Vortice Sigma-aldrichZ654779
Sonicatore a bagnomariaEMAGEMMI 30HC

Riferimenti

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  1. Kooiman, K., et al. Ultrasound-responsive cavitation nuclei for therapy and drug delivery. Ultrasound Med Biol. 46 (6), 1296-1325 (2020).
  2. Langeveld, S. A. G., Meijlink, B., Kooiman, K. Phospholipid-coated targeted microbubbles for ultrasound molecular imaging and therapy. Curr Opin Chem Biol. 63, 171-179 (2021).
  3. Frinking, P., et al. Three decades of ultrasound contrast agents: A review of the past, present and future improvements. Ultrasound Med Biol. 46 (4), 892-908 (2020).
  4. Greis, C. Ultrasound contrast agents as markers of vascularity and microcirculation. Clin Hemorheol Microcirc. 43 (1-2), 1-9 (2009).
  5. Correas, J. M., et al. Ultrasound contrast agents. Examples of blood pool agents. Acta Radiol Suppl. 412, 101-112 (1997).
  6. Kooiman, K., et al. Acoustic behavior of microbubbles and implications for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 72C, 28-48 (2014).
  7. de Jong, N., et al. Ultrasonic characterization of ultrasound contrast agents. Med Biol Eng Comput. 47 (8), 861-873 (2009).
  8. Cosgrove, D., Harvey, C. Clinical uses of microbubbles in diagnosis and treatment. Med Biol Eng Comput. 47 (8), 813-826 (2009).
  9. Langeveld, S. A. G., et al. The impact of lipid handling and phase distribution on the acoustic behavior of microbubbles. Pharmaceutics. 13 (1), 119(2021).
  10. Dicker, S., et al. Influence of shell composition on the resonance frequency of microbubble contrast agents. Ultrasound Med Biol. 39 (7), 1292-1302 (2013).
  11. Doinikov, A. A., Haac, J. F., Dayton, P. A. Resonance frequencies of lipid-shelled microbubbles in the regime of nonlinear oscillations. Ultrasonics. 49 (2), 263-268 (2009).
  12. Sennoga, C. A., et al. Evaluation of methods for sizing and counting of ultrasound contrast agents. Ultrasound Med Biol. 38 (5), 834-845 (2012).
  13. Schneider, M., et al. Br1: A new ultrasonographic contrast agent based on sulfur hexafluoride-filled microbubbles. Invest Radiol. 30 (8), 451-457 (1995).
  14. Wang, S., et al. Microbubble type and distribution dependence of focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Ultrasound Med Biol. 40 (1), 130-137 (2014).
  15. Whittingham, T. A. Contrast-specific imaging techniques: Technical perspective. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2005).
  16. Wang, Y., et al. Influence of pluronic f68 on size stability and acoustic behavior of monodisperse phospholipid-coated microbubbles produced at room temperature. ACS Appl. Mater. Interfaces. , (2025).
  17. Segers, T., de Jong, N., Versluis, M. Uniform scattering and attenuation of acoustically sorted ultrasound contrast agents: Modeling and experiments. J Acoust Soc Am. 140 (4), 2506(2016).
  18. Segers, T., et al. Monodisperse versus polydisperse ultrasound contrast agents: Non-linear response, sensitivity, and deep tissue imaging potential. Ultrasound Med Biol. 44 (7), 1482-1492 (2018).
  19. van Hoeve, W., et al. Improved sensitivity of ultrasound-based subharmonic aided pressure estimation using monodisperse microbubbles. J Ultrasound Med. 41 (7), 1781-1789 (2022).
  20. Wang, P., et al. Sensitivity improvement of subharmonic-based pressure measurement using phospholipid-coated monodisperse microbubbles. Ultrason Sonochem. 104, 106830(2024).
  21. Spiekhout, S., et al. Ambient pressure sensitivity of subharmonic vibrating single microbubbles. Ultrasound Med Biol. 51 (6), 931-940 (2025).
  22. van Elburg, B., et al. Dependence of sonoporation efficiency on microbubble size: An in vitro monodisperse microbubble study. J Control Release. 363, 747-755 (2023).
  23. Goertz, D. E., et al. Attenuation and size distribution measurements of definity and manipulated definity populations. Ultrasound Med Biol. 33 (9), 1376-1388 (2007).
  24. Emmer, M., et al. Pressure-dependent attenuation and scattering of phospholipid-coated microbubbles at low acoustic pressures. Ultrasound Med Biol. 35 (1), 102-111 (2009).
  25. Feshitan, J. A., et al. Microbubble size isolation by differential centrifugation. J Colloid Interface Sci. 329 (2), 316-324 (2009).
  26. Pulsipher, K. W., et al. Engineering theranostic microbubbles using microfluidics for ultrasound imaging and therapy: A review. Ultrasound Med Biol. 44 (12), 2441-2460 (2018).
  27. Castro-Hernández, E., et al. Microbubble generation in a co-flow device operated in a new regime. Lab Chip. 11 (12), 2023(2011).
  28. Nisisako, T., Torii, T. Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles. Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).
  29. Xu, S., et al. Generation of monodisperse particles by using microfluidics: Control over size, shape, and composition. Angew Chem Int Ed Engl. 44 (5), 724-728 (2005).
  30. Stride, E., et al. Microbubble agents: New directions. Ultrasound Med Biol. 46 (6), 1326-1343 (2020).
  31. Segers, T., et al. Improved coalescence stability of monodisperse phospholipid-coated microbubbles formed by flow-focusing at elevated temperatures. Lab Chip. 19 (1), 158-167 (2019).
  32. Dixon, A. J., et al. Enhanced intracellular delivery of a model drug using microbubbles produced by a microfluidic device. Ultrasound Med Biol. 39 (7), 1267-1276 (2013).
  33. Borden, M. A., Longo, M. L. Dissolution behavior of lipid monolayer-coated, air-filled microbubbles: Effect of lipid hydrophobic chain length. Langmuir. 18 (24), 9225-9233 (2002).
  34. Daeichin, V., et al. Microbubble composition and preparation for high-frequency contrast-enhanced ultrasound imaging: In vitro and in vivo evaluation. IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control. 64 (3), 555-567 (2017).
  35. Chen, W., et al. Determination of the main phase transition temperature of phospholipids by nanoplasmonic sensing. Sci Rep. 8 (1), 14815(2018).
  36. Kwan, J. J., Borden, M. A. Lipid monolayer collapse and microbubble stability. Adv Colloid Interface Sci. 183-184, 82-99 (2012).
  37. Abou-Saleh, R. H., et al. Horizon: Microfluidic platform for the production of therapeutic microbubbles and nanobubbles. Rev Sci Instrum. 92 (7), 074105(2021).
  38. Segers, T., et al. Universal equations for the coalescence probability and long-term size stability of phospholipid-coated monodisperse microbubbles formed by flow focusing. Langmuir. 33 (39), 10329-10339 (2017).
  39. Kaneshina, S., et al. Barotropic phase transitions of dioleoylphosphatidylcholine and stearoyl-oleoylphosphatidylcholine bilayer membranes. Biochim Biophys Acta. 1374 (1-2), 1-8 (1998).
  40. Shih, R., et al. Flow-focusing regimes for accelerated production of monodisperse drug-loadable microbubbles toward clinical-scale applications. Lab Chip. 13 (24), 4816(2013).
  41. Cleve, S., et al. Microbubble formation by flow focusing: Role of gas and liquid properties, and channel geometry. J Fluid Mech. 972, A27(2023).
  42. Rodeheaver, G. T., et al. Pluronic f-68: A promising new skin wound cleanser. Ann Emerg Med. 9 (11), 572-576 (1980).
  43. Moloughney, G., Weisleder, J. Poloxamer 188 (p188) as a membrane resealing reagent in biomedical applications. Recent Pat Biotechnol. 6 (3), 200-211 (2012).
  44. Segers, T., et al. Stability of monodisperse phospholipid-coated microbubbles formed by flow-focusing at high production rates. Langmuir. 32 (16), 3937-3944 (2016).
  45. Izadiamoli, S., et al. A comprehensive experimental approach to understanding the effects of surface wettability on bubble formation at submerged orifices. Energy Equip Syst. 13 (2), 169-191 (2025).
  46. Dollet, B., et al. Role of the channel geometry on the bubble pinch-off in flow-focusing devices. Phys Rev Lett. 100 (3), 034504(2008).
  47. Shih, R., Lee, A. P. Post-formation shrinkage and stabilization of microfluidic bubbles in lipid solution. Langmuir. 32 (8), 1939-1946 (2016).
  48. Segers, T., et al. Foam-free monodisperse lipid-coated ultrasound contrast agent synthesis by flow-focusing through multi-gas-component microbubble stabilization. Appl Phys Lett. 116 (17), 173701(2020).
  49. Beekers, I., et al. Internalization of targeted microbubbles by endothelial cells and drug delivery by pores and tunnels. J Control Release. 347, 460-475 (2022).
  50. Beekers, I., et al. Opening of endothelial cell-cell contacts due to sonoporation. J Control Release. 322, 426-438 (2020).
  51. Zhang, W. Q., et al. Influence of molecular weight of polydimethylsiloxane precursors and crosslinking content on degree of ethanol swelling of crosslinked networks. React Funct Polym. 86, 264-268 (2015).
  52. Ren, K., et al. Materials for microfluidic chip fabrication. Acc Chem Res. 46 (11), 2396-2406 (2013).
  53. Segers, T., et al. High-precision acoustic measurements of the nonlinear dilatational elasticity of phospholipid coated monodisperse microbubbles. Soft Matter. 14 (47), 9550-9561 (2018).
  54. Jeong, H. H., et al. Liter-scale production of uniform gas bubbles via parallelization of flow-focusing generators. Lab Chip. 17 (15), 2667-2673 (2017).
  55. Jiang, C., et al. Microfluidic-assisted formation of multifunctional monodisperse microbubbles for diagnostics and therapeutics. Micro Nano Lett. 6 (6), 417(2011).
  56. Hashimoto, M., et al. Formation of bubbles and droplets in parallel, coupled flow-focusing geometries. Small. 4 (10), 1795-1805 (2008).
  57. Maskarinec, S. A., et al. Direct observation of poloxamer 188 insertion into lipid monolayers. Biophys J. 82 (3), 1453-1459 (2002).
  58. Frey, S. L., Lee, K. Y. C. Temperature dependence of poloxamer insertion into and squeeze-out from lipid monolayers. Langmuir. 23 (5), 2631-2637 (2007).
  59. Borden, M. A., et al. Lateral phase separation in lipid-coated microbubbles. Langmuir. 22 (9), 4291-4297 (2006).
  60. Borden, M. A., et al. Surface phase behavior and microstructure of lipid/peg-emulsifier monolayer-coated microbubbles. Colloids Surf B Biointerfaces. 35 (3-4), 209-223 (2004).
  61. van den Broek, M. R. P., et al. Functionalized monodisperse microbubble production: Microfluidic method for fast, controlled, and automated removal of excess coating material. Microsyst Nanoeng. 10 (1), 120(2024).

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