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Articolo metodologico

Modello murino di recidiva della leucemia alla chemioterapia di induzione per la leucemia linfoblastica acuta

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DOI:

10.3791/68797

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17 ottobre 2025

 ,  ,  ,  , 
1Leukemia Biology Laboratory, Boldrini Children's Center, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, University of Campinas, 3Boldrini Children's Center, 4Department of Translational Medicine, Faculty of Medical Sciences, University of Campinas

In questo articolo

Sommario

Il protocollo ha l'obiettivo di descrivere un modello murino per la generazione di recidive di leucemia linfoblastica acuta, basato sulla dinamica della risposta alla chemioterapia di induzione.

Abstract

La leucemia linfoblastica acuta (ALL) è una neoplasia delle cellule linfoidi precursori immature e una delle neoplasie infantili più comuni. Sebbene i tassi di guarigione nella LLA pediatrica si avvicinino al 90%, la recidiva e la resistenza ai farmaci rimangono sfide. In questo contesto, lo studio della biologia del cancro in vivo è essenziale e gli xenotrapianti derivati da pazienti (PDX) che utilizzano modelli murini sono ampiamente utilizzati a questo scopo. Tuttavia, i PDX provenienti da campioni recidivanti - o confrontati con quelli diagnostici - non valutano completamente i meccanismi alla base dell'inizio e della progressione della recidiva. Questo protocollo si basa sulla generazione di recidive di B-ALL PDX nei topi, consentendo la raccolta di cellule leucemiche durante tutto il processo di acquisizione della resistenza ai farmaci. Gli animali trapiantati con cellule B-ALL PDX sono trattati con una combinazione di quattro farmaci comunemente usati nella terapia con ALL, che rappresentano meccanismi d'azione distinti: desametasone, vincristina, L-asparaginasi e daunorubicina. Dopo una fase di induzione della remissione di 4 settimane, gli animali vengono monitorati per le ricadute durante un periodo di riposo. Il ciclo di trattamento e recidiva viene ripetuto fino a quando il tempo di recidiva non si accorcia, fungendo da surrogato per l'aumento della resistenza ai farmaci in vivo. Per esplorare i meccanismi alla base della recidiva e della resistenza, le cellule leucemiche vengono raccolte prima e dopo ogni ciclo di trattamento per l'analisi fenotipica e genetica. Per convalidare il modello, sono stati testati diversi campioni pediatrici di LLA, inclusi sia quelli con risposta buona che con scarsa risposta, valutati dalla presenza di blasti nel sangue periferico dopo 7 giorni di terapia con corticosteroidi e dalla malattia minima residua (MRD) ai giorni 15, 33 e 78/96. I risultati osservati nei topi erano coerenti con i dati dei pazienti, confermando l'accuratezza del modello nell'imitare la risposta clinica alla chemioterapia. Questo approccio consente lo studio dinamico della recidiva e della resistenza ai farmaci nella B-ALL, supportando le indagini meccanicistiche e lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche.

Introduzione

La leucemia linfoblastica acuta (ALL) è il cancro più diffuso nei bambini. Nonostante gli alti tassi di guarigione raggiunti negli ultimi decenni con una sopravvivenza globale a 5 anni che raggiunge il 90% nei paesi ad alto reddito1 e grandi sforzi nella ricerca di nuove strategie terapeutiche, nei paesi sviluppati, il 15%-20% dei pazienti ha una recidiva della malattia, per i quali il tasso di sopravvivenza varia tra il 30% e il 60% a seconda che la prima recidiva avvenga precocemente (meno di 18 mesi) o più tardi (36 mesi) dopo la diagnosi2, 3. Alla luce di ciò, la refrattaria e la ricaduta rimangono TUTTE sfide da superare. In termini di diagnosi, la LLA refrattaria si distingue dalla recidiva per la scarsa sensibilità alla chemioterapia, mentre la LLA recidivante è caratterizzata dalla recidiva della malattia dopo un periodo di remissione. Come per altri tumori, la LLA è caratterizzata da anomalie genetiche, tra cui aneuploidie, riarrangiamenti cromosomici e varie mutazioni genetiche associate a diverse risposte terapeutiche e al rischio di recidiva4. Poiché le recidive di ALL si verificano più frequentemente nei pazienti ad alto rischio, che hanno già ricevuto la chemioterapia di massima intensità, è improbabile che siano sufficienti ulteriori aggiustamenti delle dosi o delle combinazioni di farmaci. Invece, gli sforzi devono essere diretti verso l'identificazione dei meccanismi alla base della resistenza ai farmaci e della recidiva.

Alla luce di ciò, i ricercatori hanno cercato di capire come la pressione selettiva esercitata dalla chemioterapia contribuisca all'emergere di cellule resistenti. La maggior parte della letteratura esistente attribuisce la recidiva alla propagazione di un subclone maligno resistente che era già presente al momento della diagnosi5. Tuttavia, uno studio recente suggerisce l'esistenza di meccanismi alternativi, come le modificazioni epigenetiche che regolano i programmi trascrizionali, che possono anche contribuire alla recidiva6.

Uno sforzo sostanziale è stato dedicato alla creazione di modelli in vivo accurati per studiare le recidive di LLA. I topi immunodeficienti sono stati utilizzati con successo per l'attecchimento di ALL, preservando le caratteristiche originali della malattia 7,8, portando allo sviluppo di xenotrapianti derivati da pazienti (PDX). Questo modello consente l'attecchimento e la proliferazione di cellule tumorali/leucemiche originali in un microambiente compatibile. Uno dei suoi principali vantaggi è la capacità di valutare la risposta delle cellule LLA trapiantate alla chemioterapia9.

I modelli PDX sono stati utilizzati anche per imitare e studiare le recidive di LLA. Ad esempio, un protocollo sviluppato da Samuels et al.10 ha utilizzato topi diabetici/immunodeficienti combinati gravi (NOD/SCID) non obesi trapiantati con cellule leucemiche del paziente per studiare i meccanismi di resistenza a un regime chemioterapico simile all'induzione. Gli autori hanno descritto il trattamento con vincristina, desametasone, L-asparaginasi e daunorubicina (VXLD) e hanno fornito esempi del numero di cicli di trattamento e dei tempi di recidiva. Tuttavia, il modello si è concentrato sull'analisi delle cellule immediatamente dopo il trattamento - quelle che sono sopravvissute alla terapia iniziale - che probabilmente rappresentano una malattia residua minima (MRD) piuttosto che una recidiva.

Uno studio più recente ha valutato se il trattamento a breve termine del LLA trapiantata di NOD. I topi immunodeficienti Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NOD scid gamma, o NSG) potrebbero prevedere la recidiva nei pazienti corrispondenti11. I campioni di LLA a rischio intermedio - sia da pazienti recidivanti che non recidivanti - sono stati trapiantati nei topi e trattati con un regime simile all'induzione costituito da vincristina, desametasone e L-asparaginasi (VXL). Sono stati misurati e confrontati il tempo all'attecchimento e le recidive post-trattamento. I risultati hanno suggerito che questo modello PDX potrebbe servire come strumento prognostico per prevedere gli esiti dei pazienti. Questa scoperta supporta l'utilità dei modelli murini PDX nello studio della biologia delle recidive di LLA. Ad esempio, le cellule recidivanti potrebbero essere state esaminate in diversi momenti per scoprire i meccanismi alla base della recidiva.

In questo manoscritto, presentiamo miglioramenti al modello di topi PDX per lo studio della recidiva di B-ALL. Il nostro obiettivo è studiare la recidiva di malattia e le caratteristiche delle cellule recidivanti dopo il loro modellamento mediante chemioterapia di induzione. Un regime simile all'induzione di quattro farmaci - vincristina, desametasone, L-asparaginasi e daunorubicina - è stato standardizzato, utilizzando il ceppo di topi NSG. Questo ceppo è noto per avere limitazioni nel resistere a ripetuti cicli di chemioterapia a causa della mutazionescid Prkdc e dell'aumentata sensibilità allo stress genotossico12. Pertanto, il peso corporeo degli animali è stato monitorato come marcatore di tossicità del trattamento. Il modello di recidiva di B-ALL può essere suddiviso in tre fasi principali: (1) trapianto di cellule ALL nei topi, puntando a una soglia di attecchimento dello 0,2-1% di cellule CD45⁺ umane nel sangue periferico; (2) 4 settimane di trattamento chemioterapico, seguite da un periodo di riposo fino alla prima recidiva (R1); e (3) al rilevamento di R1, cicli di trattamento ripetuti di 1 settimana di tipo a induzione. Ricadute successive (R2, R3... RN) e viene registrato l'intervallo tra il trattamento e la recidiva (Δt). Un progressivo accorciamento di Δt è interpretato come un'indicazione di resistenza ai farmaci acquisita. Nell'ambito di indagini più approfondite sui meccanismi di recidiva, le cellule B-ALL possono essere raccolte prima e dopo le diverse fasi del protocollo. È importante sottolineare che, a seconda del tempo che intercorre tra l'insorgenza della recidiva e il recupero cellulare, i meccanismi intrinseci di questo fenomeno potrebbero non essere conservati. Alla luce di ciò, è estremamente importante che le cellule di recidiva vengano raccolte rapidamente dopo la conferma della recidiva. Le cellule raccolte possono essere utilizzate per future analisi fenotipiche e genetiche, tra cui valutazioni della dinamica del ciclo cellulare, della migrazione cellulare, della frequenza cellulare che inizia la leucemia, delle alterazioni cromosomiche e delle modificazioni epigenetiche, tra le altre.

Ai fini di questo articolo, ci concentreremo sulla descrizione del modello murino di recidiva. Verranno fornite informazioni dettagliate per le tre fasi sperimentali: trapianto, trattamento fino alla prima recidiva (R1) e trattamento ciclico fino a recidive multiple (R2, R3...). Speriamo che questo modello consenta ai ricercatori di generare cellule B-ALL resistenti alla chemioterapia da diversi sottotipi, consentendo un'indagine più approfondita sui cambiamenti cellulari e molecolari associati alla recidiva. In definitiva, ciò può contribuire a una migliore comprensione dei meccanismi di resistenza e facilitare lo sviluppo di terapie più efficaci e personalizzate.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le normative e le linee guida etiche della Comissão de Ética no Uso de Animais del Centro Infantil Boldrini (CEUA/Boldrini 0047-2024). I campioni di leucemia utilizzati in questo studio sono stati ottenuti da fiale bio-bancarie di pazienti trattati presso il Centro Infantil Boldrini, che hanno consentito l'uso delle loro cellule attraverso un modulo di consenso informato. Il progetto è stato approvato dal Comitato Etico Istituzionale (CAAE 34601120.7.0000.5376).

1. Trapianto di cellule leucemiche e monitoraggio dell'attecchimento

  1. Preparazione di campioni di leucemia per il trapianto di topo
    1. Scongelare campioni precedentemente crioconservati di cellule ALL prelevate dall'aspirato di midollo osseo del paziente. Utilizzare un bagnomaria impostato a 37°C. Scongelare i campioni muovendo il criotubo con un movimento circolare.
    2. Trasferire il campione scongelato in una provetta da centrifuga da 15 mL. Aggiungere 14 mL di 1x PBS sterile al campione per lavare le cellule e rimuovere la soluzione di crioconservazione. Centrifugare la provetta a 300 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante.
  2. Preparazione della soluzione di trapianto
    1. Risospendere le cellule scongelate in 1x PBS sterile. Utilizzare 5-10 x 106 cellule vitali in un volume di 100 μL di PBS per ogni animale da trapiantare. Tenere la soluzione di trapianto sul ghiaccio fino al trapianto.
      NOTA: Le celle sono state contate seguendo il metodo semiautomatico13.
  3. Trapianto di topi
    1. Seleziona NOD maschio o femmina di 2 mesi. Topi Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) per il trapianto di leucemia.
      NOTA: Per mantenere un disegno sperimentale omogeneo e privo di interferenze sessuali animali, i campioni di ALL sono stati trapiantati in entrambi i sessi di topo, assicurando che tutte le leucemie a risposta buona e scarsa fossero equamente rappresentate in entrambi i sessi. Di conseguenza, abbiamo scoperto che i topi femmina si attecchiscono prima dei topi maschi. Considerando che, per evitare possibili interferenze del sesso del topo nelle analisi future (come la cinetica dell'attecchimento), suggeriamo di utilizzare un solo sesso del topo quando si lavora con lo stesso campione di leucemia. Non sono stati utilizzati altri parametri per scegliere preferenzialmente un sesso rispetto all'altro.
    2. Metti un topo alla volta in una trappola per topi sicura e approvata per garantire un corretto contenimento dell'animale. Assicurarsi che la coda dell'animale sia fuori dalla trappola e facilmente accessibile per il trapianto.
      NOTA: Le cellule leucemiche vengono trapiantate nei topi mediante iniezione endovenosa (i.v.). I protocolli stabiliti utilizzano le vene laterali della coda per questo scopo11.
    3. Utilizzare la luce infrarossa per garantire una corretta espansione delle vene. Iniettare 100 μl di soluzione per trapianto utilizzando un ago per iniezione sterile, affilato e monouso. Conservare i topi trapiantati in una struttura specifica priva di agenti patogeni. Lasciateli riposare per 15 giorni.
      1. Per utilizzare la luce infrarossa, tenere l'animale già trattenuto fuori dalla gabbia e a 30 cm di distanza dalla luce. A seconda della potenziale potenza della luce, regolare il tempo di esposizione. Quando si utilizza una luce di media potenza, un periodo di 5 minuti è sufficiente per garantire l'espansione delle vene. Lasciare la coda esposta per un periodo più lungo può causare ustioni e stress all'animale.
      2. Per l'iniezione, utilizzare una siringa da insulina con ago inserito, con un volume di 1 ml e una dimensione dell'ago di 12,7 mm x 0,33 mm. Le specifiche dell'ago utilizzato sono riportate nella tabella dei materiali. Mantenere i topi in un regime di ciclo luce/buio di 12 ore/12 ore. Inoltre, alloggiare gli animali utilizzati in questo studio in una gabbia autoclavabile in policarbonato ambrato traslucido con arricchimento ambientale per creare nidi.
  4. Prelievo di sangue periferico
    1. Raccogliere un campione di sangue periferico da 50 μl da ciascun topo 2 settimane dopo l'inoculazione e successivamente ogni settimana.
    2. Trattenere manualmente l'animale con la mano sinistra, assicurandosi che la sua testa sia tenuta saldamente. Con la mano destra, utilizzare una lancetta sterile, affilata e monouso per perforare la vena facciale del plesso sottomandibolare dell'animale.
      NOTA: Questa è una procedura potenzialmente dannosa per i topi e deve essere eseguita con attenzione.
      1. Assicurati che l'animale possa respirare facilmente durante la contenzione. Fai attenzione ai cambiamenti nella frequenza respiratoria (mancanza di respiro) e ai cambiamenti nel colore della bocca (non dovrebbe diventare viola o blu scuro). Se il plesso sottomandibolare non viene perforato correttamente, può verificarsi sanguinamento nell'orecchio a causa della puntura del condotto uditivo. Per guidare i futuri sperimentatori, è disponibile la Figura 1 supplementare per garantire la corretta posizione del plesso.
        NOTA: In alternativa, i sanguinamenti della vena caudale possono essere utilizzati anche per raccogliere campioni di sangue.
    3. Dopo il ritiro, non lasciare l'animale incustodito. Deve essere attivo e illeso. Se il topo mostra segni di caduta (testa o corpo) e inattività, dovrebbe essere soppresso. Non superare i 50 μL di volume, poiché quantità maggiori di sangue possono provocare la morte dell'animale.
    4. Conservare il campione di sangue raccolto in una provetta da centrifuga da 1,5 mL contenente 8 μL di EDTA da 50 mM per evitare la coagulazione del campione.
      NOTA: In questo caso, abbiamo utilizzato una soluzione di EDTA precedentemente preparata come anticoagulante. Se si preferisce, in questa fase è possibile utilizzare anche provette EDTA a basso volume disponibili in commercio per la raccolta del sangue. I campioni di sangue devono essere processati lo stesso giorno.
  5. Preparazione di campioni di sangue periferico per l'elaborazione
    1. Omogeneizzare il sangue con EDTA. Trasferire 50 μl della miscela in una provetta per citometria a flusso.
    2. Preparare una miscela di anticorpi da aggiungere a ciascun campione composta da anticorpi anti-topo CD45 (mCD45), anticorpo anti-umano CD45 (hCD45), anticorpo anti-umano CD19 (hCD19) e sterile 1x PBS come diluente.
  6. Elaborazione di campioni di sangue
    1. Aggiungere 10 μl della miscela di anticorpi a ciascun campione di sangue. Omogeneizzare picchiettando delicatamente con il dito indice. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
      NOTA: Selezionare gli anticorpi appropriati descritti sopra, considerando i canali disponibili del citometro. Per determinare la quantità di anticorpi utilizzati per campione, è consigliabile eseguire una curva di titolazione per ciascun anticorpo. Gli anticorpi utilizzati nel nostro studio, i fluorocromi e il volume scelto per i campioni sono elencati nella Tabella supplementare 1. Una descrizione completa dei numeri di catalogo degli anticorpi e dei nomi dei cloni è riportata nella Tabella dei materiali.
    2. Aggiungere 1 mL di soluzione di lisi dei globuli rossi (RBC) a ciascun campione. Omogeneizzare energicamente con il dito indice. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
      NOTA: La soluzione di lisi utilizzata in questa fase è una soluzione di lisi 10x RBC disponibile in commercio. Se si utilizza un reagente diverso, è necessario regolare il volume di lavoro 1x per la lisi.
    3. Aggiungere 2 mL di 1x PBS sterile a ciascun campione per la prima fase di lavaggio. Centrifugare i campioni a 200 x g (in un rotore oscillante) per 5 minuti a temperatura ambiente. Eliminare delicatamente il surnatante capovolgendolo e asciugare il liquido rimanente nella parte superiore del tubo tamponando delicatamente con carta assorbente.
      NOTA: Nelle fasi di lavaggio, le cellule leucemiche verranno pellettate sul fondo del tubo del citometro e il liquido rimanente verrà scartato. È imperativo prestare attenzione quando si maneggiano i campioni, poiché in alcuni casi il pellet potrebbe non essere distinguibile. Per garantire l'integrità del pellet, evitare di scuotere il campione, in quanto ciò può provocarne la perdita.
    4. Ripetere il passaggio 1.6.3. Risospendere le cellule leucemiche con 200 μL di PBS sterile 1x picchiettando delicatamente la provetta per citometria con il dito indice. I campioni sono pronti per essere analizzati mediante citometria a flusso. Il monitoraggio dell'attecchimento deve essere eseguito lo stesso giorno del prelievo del sangue.
  7. Monitoraggio dell'attecchimento mediante citometria a flusso
    1. Utilizzare metodologie standard di citometria a flusso 9,14 per determinare la percentuale di cellule CD45+ umane nel sangue periferico rispetto alle cellule CD45+ di topo (% hCD45+).
    2. Raccogli i dati generati dalla citometria a flusso per la successiva analisi della percentuale di hCD45+ sul totale delle cellule CD45 (hCD45+ più mCD45+) utilizzando il software di analisi della citometria a flusso.
      NOTA: Per garantire un corretto monitoraggio dell'attecchimento, le seguenti fasi di analisi devono essere eseguite lo stesso giorno. Questa sequenza giornaliera è particolarmente importante quando si considera l'inizio del futuro programma di trattamento, che suggeriamo di iniziare il lunedì. Nell'impossibilità di iniziare il lunedì, il trattamento può iniziare in qualsiasi giorno della settimana, a seconda del raggiungimento dell'hCD45+% (0,2%-1%) sul sangue periferico.
  8. Preparazione dell'ambiente per l'analisi dei dati di citometria a flusso
    1. Avvia il software di analisi della citometria a flusso. Importa i dati raccolti e attendi il loro riconoscimento da parte dello strumento.
    2. Apri i dati del campione iniziale per creare il cancello etichettato Linfociti. Verificare le impostazioni dell'asse: selezionare FSC-A per l'asse X e SSC-A per l'asse Y. Nel pannello di creazione del cancello superiore, selezionare lo strumento poly-liner e delineare la popolazione cellulare principale.
      NOTA: I linfociti compaiono tipicamente tra 50.000-100.000 sull'asse X e 0-50.000 sull'asse Y. I valori possono variare a seconda delle caratteristiche di ciascuna leucemia.
    3. Fare doppio clic sulla popolazione recintata per creare un nuovo cancello. Per escludere i doppietti di celle, impostare FSC-A sull'asse X e FSC-H sull'asse Y. Utilizzare lo strumento poly-liner per isolare la popolazione cellulare primaria. Disegna la porta intorno alla popolazione, escludendo gli eventi distanti lungo l'asse X.
      NOTA: questo passaggio distingue i singoli eventi delle celle.
  9. Creazione del pannello citometrico per distinguere le popolazioni cellulari
    1. Fare doppio clic sulla popolazione selezionata per differenziare le cellule CD45 umane da quelle di topo. Impostare l'asse X sul fluoroforo mCD45 e l'asse Y su SSC-A. Utilizzando lo strumento forma, disegna un quadrato attorno alla popolazione mCD45-negativa.
    2. Fare doppio clic sulla popolazione risultante per distinguere le cellule hCD19+ e/o hCD45+. Impostare l'asse X sul fluoroforo hCD19 e l'asse Y su hCD45. Nel pannello di creazione del cancello, selezionare Linee perpendicolari per separare le popolazioni distinte.
      NOTA: In alternativa, lo sperimentatore può utilizzare il gate o la possibilità di discriminare le cellule hCD45 e mCD45. Questa possibilità considera la somma degli eventi come 100%, creando una strategia più precisa per identificare le popolazioni.
  10. Applicazione delle statistiche al pannello creato
    1. Calcola la percentuale di ciascuna popolazione di cellule isolate rispetto a tutti gli eventi acquisiti. Nella finestra principale del software, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'icona Sottografo derivata dal grafico principale di ciascun campione e selezionare Crea statistiche. Nella finestra che si apre, fare clic su Frequenza di e selezionare Celle singole. Eseguire questo passaggio singolarmente per ogni sottografo.
    2. Selezionare tutte le modifiche apportate per applicare la strategia di gating e le statistiche associate a tutti i campioni. Quindi, utilizzando il tasto sinistro del mouse, trascinare le modifiche selezionate nell'opzione Tutti i campioni nella finestra principale del software.
    3. Fare clic su Editor tabella nella finestra principale per generare una tabella con tutte le frequenze calcolate. Nella finestra pop-up, scegli il formato di file .xls, designa la cartella di destinazione e fai clic su Crea tabella.
      NOTA: Tutti i passaggi eseguiti utilizzando il software di analisi della citometria a flusso possono essere visualizzati nella Figura 2 supplementare. La tabella finale generata da questo passaggio contiene la percentuale di hCD45+ necessaria per generare grafici per analizzare la progressione dell'attecchimento nel tempo.
  11. Tracciamento della progressione dell'attecchimento
    1. Avvia un software di tracciatura e analisi dei grafici. Selezionare il formato della tabella XY. Nella finestra principale, scegli Inserisci o Importa dati in una nuova tabella, imposta X su Numeri e Y per Immettere i valori replicati in sottocolonne affiancate.
    2. Nella tabella aperta, organizzare i titoli delle colonne: inserire Giorni di attecchimento per la colonna X e % hCD45+ su PB per il primo gruppo di sottocolonne Y. Completare la colonna X con i giorni post-iniezione corrispondenti ai giorni di prelievo del sangue per il monitoraggio dell'attecchimento. Inserire manualmente la percentuale di dati hCD45+ raccolti settimanalmente per ciascun topo nelle sottocolonne Y.
    3. Nel menu del software, nel sottoinsieme Famiglia, selezionare Dati 1. Nella finestra pop-up, scegli la seconda opzione del grafico denominata Punti e linea di collegamento con barre di errore e abilita il tracciamento della media e delle barre di errore.
    4. Regolare gli assi del grafico in base agli intervalli desiderati. Fai clic su Esporta nell'angolo in alto a destra del menu per scaricare il grafico finale.
      NOTA: Tutti i dati raccolti durante gli esperimenti con ogni singola ALL devono essere tracciati sullo stesso grafico per facilitare le analisi nel tempo dall'inizio dell'esperimento. Un esempio descrittivo di grafici grafici è disponibile nella Figura 3 supplementare.

2. Trattamento dei topi

  1. Preparazione di soluzioni per la lavorazione dei farmaci
    1. Preparare una soluzione di lavoro di vincristina a una concentrazione di 1 mg/mL. Preparare una soluzione di lavoro di desametasone a 4 mg/mL. Preparare la soluzione di lavoro della L-asparaginasi a 2.000 UI/mL. Preparare la soluzione di lavoro di daunorubicina a 2 mg/mL.
      NOTA: I farmaci utilizzati in questo protocollo sono equivalenti a quelli impiegati nel trattamento clinico dei pazienti15. Il veicolo della soluzione di lavoro del desametasone è composto da creatinina, citrato di sodio diidrato, idrossido di sodio, bisolfito di sodio, metilparabene, propilparabene e acqua per preparazioni iniettabili. Il veicolo per la soluzione di lavoro Vincristina è composto da mannitolo, acido solforico, idrossido di sodio e acqua per preparazioni iniettabili. La L-asparaginasi e la daunorubicina sono spesso disponibili in forma liofilizzata. In tali casi, il veicolo raccomandato per la ricostituzione è l'acqua sterile per preparazioni iniettabili, che deve essere utilizzata per raggiungere la concentrazione corretta. Per prevenire la perdita di attività del farmaco dovuta a cicli ripetuti di scongelamento, i farmaci devono essere suddivisi in aliquote di lavoro utilizzate non più di 3 volte.
  2. Animali che pesano quando viene rilevata la leucemia
    1. Iniziare il trattamento nel punto in cui la percentuale di cellule hCD45+ nel sangue periferico dei topi raggiunge un intervallo mediano compreso tra lo 0,2% e l'1%. Una volta raggiunto, dividere i topi trapiantati in due gruppi distinti: uno per ricevere il trattamento e uno per fungere da controllo.
    2. Al raggiungimento della soglia stabilita, persistere nel monitoraggio settimanale della progressione della leucemia. Raccogliere continuamente i dati di hCD45% per monitorare la risposta al trattamento, l'insorgenza di recidive e il rilevamento della resistenza ai farmaci.
    3. Pesare gli animali da trattare. Utilizzare la media aritmetica dei pesi per accertare la dose di ciascun farmaco da somministrare al gruppo. Pesare gli animali del gruppo di controllo per confrontare l'aumento/la perdita di peso tra i gruppi.
      1. Utilizzare le seguenti dosi di farmaco: vincristina, 0,15 mg/kg; desametasone, 5 mg/kg; L-asparaginasi, 1.000 UI/kg; e daunorubicina, 1,2 mg/kg. Pesare tutti gli animali almeno 3 volte a settimana: lunedì, mercoledì e venerdì. Utilizzare i pesi per regolare le dosi di trattamento dei farmaci e per monitorare il livello di tossicità del trattamento.
  3. Preparazione delle soluzioni per la somministrazione del farmaco dalle aliquote di soluzione di lavoro
    NOTA: Le soluzioni per la somministrazione dei farmaci sono costituite da 1x PBS sterile come diluente e dal volume corretto (in base al peso dell'animale) di soluzioni farmacologiche funzionanti (l'acqua sterile viene utilizzata esclusivamente per la ricostituzione e non per l'iniezione) somministrate ogni giorno della settimana. I farmaci che vengono somministrati per via intraperitoneale possono essere uniti nella stessa soluzione; Tuttavia, se un farmaco viene somministrato per via endovenosa, deve essere inserito in una soluzione individuale. Il volume della soluzione di somministrazione del farmaco da somministrare a ciascun animale è di 100 μL.
    NOTA: Nella fase sopra descritta è stata utilizzata una siringa da insulina sterile con ago inserito (1 ml, con dimensioni dell'ago 12,7 mm X 0,33 mm). Una descrizione completa della siringa è disponibile nella Tabella dei materiali.
    1. Lunedì, preparare una soluzione per la somministrazione di farmaci composta da desametasone, vincristina e PBS. Somministrare i farmaci per via intraperitoneale.
    2. Il martedì e il giovedì, preparare una soluzione per la somministrazione di farmaci composta da desametasone, L-asparaginasi e PBS. Somministrare i farmaci per via intraperitoneale.
    3. Mercoledì, preparare una soluzione per la somministrazione di farmaci composta da desametasone e PBS e somministrarla per via intraperitoneale. Preparare una seconda soluzione per la somministrazione del farmaco composta da daunorubicina e PBS. Somministrarlo per via endovenosa.
    4. Venerdì, preparare una soluzione per la somministrazione di farmaci composta da desametasone e PBS. Somministrare il farmaco per via intraperitoneale.
    5. Lasciate riposare gli animali durante i giorni del fine settimana. Ripetere il ciclo di trattamento per 4 settimane.
      NOTA: Un programma di trattamento completo è disponibile nella Tabella supplementare 2. È importante chiarire che sono stati testati altri protocolli già stabiliti per il trattamento dei topi, ma hanno portato ad alti livelli di tossicità per il ceppo NSG. Pertanto, il programma di trattamento proposto è stato prima sottoposto a un processo di standardizzazione per la riduzione della tossicità, che ha portato alle dosi e alla frequenza di somministrazione presentate in questo protocollo. Si prevede che la percentuale di hCD45+ nel gruppo trattato diminuirà rispetto alla percentuale di hCD45+ nel gruppo di controllo a causa della somministrazione del trattamento.
  4. Somministrazione di farmaci e monitoraggio della risposta alla leucemia
    1. Trattenere manualmente l'animale con la mano sinistra per somministrare i farmaci per via intraperitoneale. Tieni l'animale con la parte ventrale rivolta verso l'alto. Sulla parte ventrale, individuare il quadrante in basso a destra.
    2. Con la mano destra, utilizzare un ago per iniezione sterile, affilato e monouso e iniettare 100 μl della soluzione per la somministrazione del farmaco nel quadrante inferiore destro dei topi.
      NOTA: Fare attenzione quando si trattiene l'animale; Non dovrebbe essere una procedura dannosa per i topi. Come per la raccolta del sangue, prestare attenzione a eventuali complicazioni respiratorie. Nel caso di iniezioni intraperitoneali, tenere sempre l'ago perpendicolarmente per evitare la perforazione dell'organo.
    3. Seguire le stesse istruzioni utilizzate per trapiantare le cellule leucemiche per somministrare farmaci per via endovenosa. Lasciare riposare i topi dopo 4 settimane di somministrazione del trattamento fino alla ricomparsa delle cellule LLA, qui chiamata prima recidiva (R1).
      NOTA: Nonostante la differenza nella via di somministrazione, l'iniezione endovenosa utilizza lo stesso volume dell'iniezione intraperitoneale.
  5. Monitoraggio della risposta alla leucemia e rilevamento della prima recidiva (R1)
    1. Non interrompere il monitoraggio settimanale della citometria a flusso della leucemia durante il trattamento o le fasi di riposo.
      NOTA: Considerando il trattamento di 5 giorni alla settimana, si raccomanda vivamente di eseguire il monitoraggio all'inizio della settimana. Nel nostro studio, la raccolta del sangue, l'elaborazione dei campioni e l'analisi sono sempre state eseguite il lunedì.
    2. Eseguire il prelievo di sangue e le successive procedure necessarie per il monitoraggio secondo i passaggi 1.4 - 1.11.
      NOTA: Dopo il periodo di riposo indicato, le cellule R1 saranno rilevate dall'improvviso aumento della percentuale di hCD45+ nel sangue periferico dei topi. Il periodo tra la fine del trattamento e l'insorgenza di recidiva è variabile e può essere distinto per ogni leucemia sottoposta a screening. Al rilevamento di R1, dovrebbe essere eseguita la terza e ultima fase del modello murino di recidiva proposto. Per migliorare il monitoraggio e l'analisi della risposta, suggeriamo di utilizzare misure di risposta obiettive come la malattia progressiva, la malattia stabile, il livello di responsività (parziale, completa o mantenuta), la remissione e la resistenza, seguendo le linee guida descritte da Randall et al. (2024)16.

3. Cicli ripetuti di trattamento fino alla comparsa di cellule resistenti

  1. Rilevamento della prima recidiva
    1. Somministrare un'intera settimana di trattamento di tipo induttivo a qualsiasi topo con recidiva di leucemia (denominata R1), cioè quando viene raggiunta la soglia dello 0,2% di hCD45+ nel sangue periferico. Per 1 settimana, dal lunedì al venerdì, seguire il programma di somministrazione del farmaco utilizzato per il trattamento di induzione di 4 settimane.
      NOTA: La somministrazione di solo 1 settimana di trattamento a questo punto mira a testare in vivo se le cellule leucemiche hanno acquisito resistenza alla chemioterapia guidando eventualmente la progressione della leucemia verso recidive successive nel tempo, sotto pressione chemioterapica. Abbiamo scelto di non somministrare un secondo programma di 4 settimane come mezzo per evitare un'eccessiva tossicità e la perdita di animali.
    2. Lasciare riposare i topi alla fine dell'intera settimana di somministrazione del farmaco. Continuare il monitoraggio settimanale della risposta leucemica mediante citometria a flusso seguendo i passaggi 1.4 - 1.11.
      NOTA: A questo punto, ci si aspetta che le cellule leucemiche rimangano sensibili al trattamento. Di conseguenza, durante il monitoraggio della leucemia, la percentuale di hCD45+ nei topi dovrebbe diminuire e rimanere negativa per un certo periodo.
  2. Monitoraggio dell'aspetto di R2
    1. Attendere la comparsa della recidiva R2 (le cellule hCD45+ ≥ 0,2%). Quando compare, contare il tempo trascorso tra la fine del trattamento e la comparsa di R2. Chiamiamo questo periodo Δt1.
    2. Procedere a una seconda settimana completa di somministrazione del trattamento di tipo induzionistico. Seguire le stesse linee guida della prima somministrazione di questo programma.
    3. Lasciare riposare i topi alla fine del trattamento. Continuare il monitoraggio della leucemia.
  3. Monitoraggio dell'aspetto di R3
    1. Attendi che appaia la ricaduta R3. Contare il tempo nello stesso modo del passaggio 3.2.1. Chiamatelo Δt2.
    2. Confronta Δt1 e Δt2. Ripetere i passaggi precedenti N volte per ottenere recidive multiple di leucemia (R1, R2... RN) se il periodo Δt rimane lo stesso. Interrompere i cicli di trattamento una volta che il periodo Δt si accorcia.
      NOTA: Una diminuzione del Δt alla recidiva è un'indicazione della resistenza ai farmaci acquisita dalle cellule leucemiche. Questo risultato rafforza la capacità del modello murino di recidiva di generare cellule LLA resistenti alla chemioterapia.
    3. Recuperare le cellule leucemiche come descritto nel passaggio 4 di seguito. Conservarli vivi mediante crioconservazione o con qualsiasi conservante compatibile con le successive analisi previste.
      NOTA: L'evento raccomandato per il recupero delle cellule leucemiche è fino al 25% di hCD45+ nel sangue periferico, come descritto dalla letteratura recente16.

4. Recupero delle cellule leucemiche attraverso il prelievo di organi

  1. Eutanasia dei topi con un sovradosaggio di anestetici chimici
    1. Eutanasia dei topi mediante sovradosaggio di anestetici chimici, seguita da lussazione cervicale per la conferma dell'eutanasia come descritto di seguito.
    2. Preparare una miscela contenente tre anestetici diluiti in 1x PBS sterile per l'anestesia profonda. Utilizzare 150 μL di acepromazina maleato commerciale, 50 μL di xilazina commerciale, 80 μL di ketamina commerciale e 220 μL di PBS per ogni animale da sopprimere.
    3. Somministrare 500 μl della miscela preparata mediante iniezione intraperitoneale. Seguire le stesse linee guida per la contenzione e l'iniezione descritte al punto 2.4.
    4. Sotto l'effetto di un'overdose di anestetici chimici, i topi si sdraieranno sul fondo della gabbia. Dopo alcuni minuti, osservare se i topi hanno un arresto respiratorio. In tal caso, attendere che lo sforzo respiratorio cessi. Per verificare che la procedura di eutanasia sia stata efficace, verificare la presenza di un riflesso involontario esercitando pressione su una delle zampe posteriori dell'animale. Per confermare l'eutanasia, procedere alla lussazione cervicale.
  2. Lussazione cervicale
    1. Tenere l'animale con la parte posteriore del corpo contro la griglia di alimentazione della gabbia. Usa l'indice e il pollice della mano sinistra per formare la forma di una pinzetta. Posiziona le dita a forma di pinzetta direttamente sotto la testa dell'animale. Premere con decisione contro la parte cervicale della colonna vertebrale.
    2. Afferra la coda dell'animale con la mano destra. Tiralo indietro con un movimento deciso e costante fino a quando la testa dell'animale non si separa dal resto del suo corpo.
      NOTA: La lussazione cervicale è uno dei metodi accettati per confermare l'eutanasia 17,18,19. In alternativa, possono essere utilizzati altri metodi, come l'esposizione continua alla CO2 per almeno 15 minuti dopo l'arresto respiratorio.
  3. Preparazione degli animali per il prelievo di organi
    1. Igienizza i topi applicando il 70% di alcol su tutto il corpo. Posiziona il corpo dell'animale su una piattaforma chirurgica per roditori con la parte ventrale rivolta verso l'alto. Radere la parte addominale del corpo.
      NOTA: Una descrizione completa della piattaforma operatoria chirurgica per roditori è disponibile nella Tabella dei materiali.
  4. Raccolta della milza
    1. Fai una piccola incisione con forbici chirurgiche sterili e pinzette sulla pelle addominale. Rimuoverlo dalla zona addominale, esponendo il peritoneo.
    2. Fai una piccola incisione nel peritoneo. Tagliarlo fino a ottenere l'accesso completo agli organi situati nell'addome.
    3. Individua la milza, proprio sotto lo stomaco dell'animale. Rimuovere la milza. Posizionarlo in un recipiente contenente 1x PBS sterile per un'ulteriore elaborazione.
  5. Prelievo di femore
    1. Procedere con l'apertura della cavità peritoneale per accedere alle zampe posteriori dell'animale.
    2. Individua il femore. Rimuoverlo tagliando le articolazioni che lo uniscono all'osso pelvico e alla tibia e al perone. Fai questo processo per entrambe le ossa del femore.
    3. Pulisci le ossa rimuovendo eventuali muscoli, pelle o tessuto rimanenti. Metterli in un recipiente contenente 1x PBS sterile per un'ulteriore elaborazione. Disfarsi della carcassa dell'animale secondo le linee guida del Comitato Etico Animale.
      NOTA: A seconda degli obiettivi dello studio, TUTTE le cellule potrebbero anche essere raccolte dal fegato, dal sistema nervoso centrale, dal timo, dai linfonodi, ecc. In questo manoscritto, come esempio, descriviamo la raccolta di TUTTE le cellule dalla milza e dal midollo osseo.
  6. Preparazione per l'elaborazione degli organi
    1. Raccogliere una provetta da centrifuga sterile da 50 ml, due siringhe sterili da 1 ml, un ago ipodermico sterile da 25 mm x 0,6 mm e due filtri cellulari sterili da 70 μm.
  7. Elaborazione della milza
    1. Posizionare un colino cellulare sulla parte superiore di una provetta da centrifuga aperta da 50 mL. Metti la milza sulla superficie del colino cellulare. Macerare l'organo con la parte piatta dello stantuffo della siringa fino a quando non sono visibili grandi porzioni.
    2. Aggiungere 1x PBS sterile alla milza macerata. Eseguire movimenti circolari con la parte piatta dello stantuffo della siringa per garantire la filtrazione cellulare.
      NOTA: La colata PBS può essere effettuata gradualmente; tuttavia, il volume finale utilizzato non può superare i 6 mL. Al termine dell'elaborazione della milza, il filtro cellulare deve essere limpido e privo di qualsiasi tessuto residuo. In caso di saturazione del filtro cellulare, è possibile utilizzare un filtro cellulare alternativo. Il contenuto del filtro iniziale può essere trasferito nel secondo filtro e la lavorazione può essere continuata. Per accedere al carico tumorale all'interno di questo organo, una parte della milza può essere separata per la valutazione istopatologica.
  8. Lavorazione del midollo osseo
    1. Incorporare un nuovo filtro cellulare per la lavorazione del midollo osseo nella provetta da centrifuga già utilizzata. Tagliare i bordi dell'osso del femore fino a quando le aperture del midollo osseo sono accessibili. Inserire l'ago ipodermico in una nuova siringa. Aggiungere 1 mL di PBS sterile 1x alla siringa.
      NOTA: A seconda degli obiettivi dello studio, TUTTE le cellule ottenute dalla milza e dal midollo osseo devono essere raccolte separatamente. In questo caso, è necessario utilizzare una provetta da centrifuga separata per ciascun tessuto. Una parte del femore può essere separata per la valutazione istopatologica per valutare il carico tumorale all'interno di questo organo.
    2. Eseguire il lavaggio del midollo osseo sul colino cellulare. Inserire la punta dell'ago in un lato dell'apertura del midollo osseo. Spingere lo stantuffo della siringa con un movimento deciso e costante. Ripetere la procedura con l'altro osso del femore.
    3. Disaccoppiare l'ago. Utilizzare la parte piatta della siringa per macerare il midollo osseo arrossato. Aggiungere 1x PBS sterile al midollo osseo macerato. Eseguire movimenti circolari con la parte piatta dello stantuffo della siringa per garantire la filtrazione cellulare. Al termine della procedura di lavorazione, la provetta da centrifuga da 50 mL conterrà un volume totale di 10 mL, comprendente una miscela di cellule spleniche e del midollo osseo che sono state diluite in PBS.
      NOTA: Il processo di colata PBS può essere eseguito gradualmente; tuttavia, è imperativo assicurarsi che il volume finale utilizzato non superi i 2 ml.

5. Isolamento di cellule leucemiche mediante centrifugazione in gradiente

  1. Preparazione per l'isolamento delle cellule leucemiche
    1. Raccogliere una provetta da centrifuga da 15 ml, le pipette sterili monouso Pasteur, la provetta da centrifuga da 50 ml contenente gli organi che sono stati processati e il terreno a gradiente di densità per l'isolamento dei linfociti.
      NOTA: Il terreno facilita l'isolamento delle cellule mononucleate creando un gradiente di densità attraverso la centrifugazione. Le cellule mononucleate (linfociti, monociti e cellule ALL) formano uno strato all'interfaccia tra il mezzo e il plasma.
  2. Isolamento di cellule leucemiche
    1. Aggiungere 5 mL del terreno a gradiente di densità per l'isolamento dei linfociti alla provetta da centrifuga da 15 mL utilizzando una pipetta monouso Pasteur. Aggiungere gradualmente i 10 mL della miscela di cellule spleniche e del midollo osseo sullo strato medio. Tenere la provetta a un angolo poco profondo, intorno a 30° o meno, e aggiungere lentamente la miscela di celle lungo la parete della provetta in modo che lo strato di mezzo di densità non venga perturbato.
      NOTA: Prestare attenzione durante questo processo per assicurarsi che le celle non si mescolino con il mezzo di densità. Il disturbo durante questo processo può portare alla mancata formazione del gradiente di densità durante la centrifugazione.
    2. Centrifugare la provetta da 15 mL a 420 x g su un rotore a secchiello oscillante, per 30 minuti, senza accelerazione e senza interruzioni, per evitare di disturbare le fasi formate.
      NOTA: Le cellule leucemiche formeranno uno strato tra il mezzo di densità e le fasi acquose.
    3. Rimuovere ed eliminare la fase acquosa superiore utilizzando una pipetta sterile monouso Pasteur. Raccogliere lo strato di cellule leucemiche formato con una pipetta sterile monouso Pasteur. Trasferirlo in una nuova provetta da centrifuga da 15 mL.
      NOTA: Non preoccupatevi se parte dello strato di terreno a bassa densità viene pipettato insieme alle cellule leucemiche.
  3. Lavaggio delle cellule leucemiche
    1. Aggiungere 1x PBS sterile alla provetta contenente le cellule raccolte fino a raggiungere il limite di 15 mL.
    2. Centrifugare le celle a 300 x gper 5 min. Ripristina la massima accelerazione e frenata. Rimuovere ed eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in un nuovo freddo sterile 1x PBS.5.3.3.Procedere al controllo della vitalità cellulare e cellulare. Seguire le linee guida standard per la procedura di conteggio delle cellule13. Le cellule lavate possono essere colorate con anticorpi CD45 anti-topo (mCD45), anticorpi CD45 anti-umani (hCD45) e anticorpi CD19 anti-umani (hCD19), seguiti da fasi di lavaggio e acquisizione dati.
      NOTA: In caso di elaborazione delle cellule della milza e del midollo osseo in diverse provette da centrifuga, una parte di questi campioni può essere utilizzata per accedere al carico tumorale all'interno di questi organi attraverso la citometria a flusso.
  4. Crioconservazione delle cellule leucemiche
    1. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 300 x g per 5 min. Scartare il surnatante. Mantieni le celle sul ghiaccio.
    2. Preparare un mezzo di congelamento composto per il 90% da siero fetale bovino sterile a freddo (FBS) e per il 10% da dimetilsolfossido (DMSO). Utilizzare 1 mL di questa soluzione per ogni fiala di crioconservazione.
    3. Su ghiaccio, risospendere le cellule nella soluzione preparata a una concentrazione di 2 x 107 cellule/mL. Aliquotare le cellule nelle provette di crioconservazione. Crioconservare le cellule seguendo le linee guida standard per la crioconservazione delle colture cellulari20.
      NOTA: Queste celle possono essere utilizzate per ulteriori analisi. Invece di congelare le cellule vitali, si possono anche aliquotare e conservare le cellule in diversi conservanti per le successive analisi di DNA, RNA, proteine e metaboliti.

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Risultati

Nell'ambito dei nostri studi, sono stati selezionati campioni di LLA a cellule B precursori da due gruppi di pazienti: uno che ha mostrato una risposta favorevole, determinata dall'assenza di cellule leucemiche nel sangue periferico del giorno 8 e dall'assenza di cellule leucemiche residue nel midollo osseo ai giorni 15, 33 e 78/96. L'altro gruppo era formato da LLA che corrispondevano ai sottogruppi molecolari dei precedenti, ottenuti da pazienti che ave...

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Discussione

Comprendere i meccanismi biologici alla base delle malattie neoplastiche è essenziale per lo sviluppo di terapie più efficaci e per migliorare gli esiti dei pazienti. In condizioni come la leucemia linfoblastica acuta pediatrica, questi approcci investigativi non sono solo rilevanti per aumentare i tassi di guarigione, ma hanno anche un valore particolare per i pazienti in cui i trattamenti standard hanno raggiunto i limiti di intensità e tollerabilità terapeutica. Nel contesto della rec...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Centro Infantil Boldrini e tutti i pazienti che hanno donato i loro campioni per lo studio. Manuella M. Hoff ha ricevuto una borsa di studio dal Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) dalla São Paulo Research Foundation (FAPESP, 2024/ 03383-2). José A. Yunes ha ricevuto una borsa di studio per la produttività dal Consiglio nazionale per lo sviluppo tecnologico e scientifico (CNPq, 308399/2021-8). Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti per la ricerca del Ministero della Salute brasiliano dal programma PRONON (Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica, NUP 25000.211174/2019-45).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1 mL  siringaBD #309628Prelievo di organi
10 mL di acqua sterile per iniezioneHalex Istar Indú stria Farmaceutica LTDAhttps://www.medstoremaringa.com.br/produtos/agua-destilada-10ml-pack-c-5un-isofarma/Ricostituzione della droga
Soluzione di lisi 10X per globuli rossiBioLegend#420302Elaborazione dei campioni di sangue dei topi
Analizzatore di celle a 5 canaliBD in Biologia658226R1Citometro di flusso 
Filtro a celle da 70 uMFalcom#352350Prelievo di organi
Maleato acepromazino Inj Vetnil LTDAhttps://vetnil.com.br/produto/acepran-r-1Anestesia dei topi
APC anti-umano CD45 - isotipo di topo IgG1 - clone HI30BioLegend#304037Colorazione linfocitaria
Asparaginasi 10000 UAginasi/medac#88660100Trattamento con topi
Brilliant-Violet 605 anti-mouse CD45 - isotipo mouse IgG2 - clone 30-F11BioLegend#103139Colorazione linfocitaria
DaunorubicinFarmarin#116880025Trattamento con topi
DesametasoneAqu&acuto;#00000066Trattamento con topi
DimetilsolfossidoSigma-Aldrich#589569Crioconservazione dei linfociti
Ago usa e getta - 0,60 x 25 mm (23G x 1' ’)BD#300388Prelievo di organi
Lancetto esterile usa e getta Yancheng Huida Medical Instruments  https://www.cralplast.com.br/produto/lanceta-manual/Raccolta del sangue dei topi
Acido etilendiatitraticicoTecnologie vitali#15576-O28Soluzione EDTA
Siero bovino fetaleCultilab#F083Crioconservazione dei linfociti
Analisi del software per citometria a flusso - Versione 10.10.0BD in Biologiahttps://www.flowjo.com/Analisi della citometria a flusso
Analisi del software per grafici e grafici - Versione 9.5.1Dotmaticshttps://www.graphpad.com/featuresGrafico e analisi
Siringa per insulina con ago attaccato 1mL FX 12,7 mm X 0,33 mmDescarpacke0342101Trapianto di topi e somministrazione dei farmaci
Ketamine InjSespo Indú stria e Comé rcio LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/dopalen-pecuaria/Anestesia dei topi
Piattaforma chirurgica multifunzionale per roditoriKent Scientific Corporationhttps://www.kentscientific.com/products/surgisuite/Interventi chirurgici sui topi
PE anti-umano CD19 - isotipo di topo IgG1 - clone di HIB19BioLegend#302208Colorazione linfocitaria
Cloruro di potassioSigma-AldrichP3911-1KGSoluzione PBS
Dibase fosfato di potassioSigma-AldrichP0662-1KGSoluzione PBS
Reagente per l'isolamento dei linfocitiCytiva#17-1440-02, pacchetto da 6 e volte; 100  MlIsolamento dei linfociti dagli organi prelevati
Cloruro di sodioSigma-AldrichS9888-1kgSoluzione PBS
Fosfato di sodio dibasico  Sigma-AldrichS9763-1KGSoluzione PBS
Pinzette per dissezione anatomica sterile - 12 cm ABC 0170Lab Lí Der120Procedure chirurgiche sui topi
Forbici sterili 12 cm - ABC 0321Lab Lí Der136Procedure chirurgiche sui topi
VincristineLibbs#7896094208483Trattamento con topi
Xylazine InjSespo Indú stria e Comé rcio LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/anasedan-10-ml-bovinos-e-equinos/Anestesia dei topi

Riferimenti

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