Un metodo di imaging ottico compatibile con microscopia elettronica a scansione per la mappatura mesoscopica del cervello di tutte le cellule

Summary

Abbiamo introdotto una tecnica di imaging innovativa chiamata Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), che consente l'imaging imparziale di tutte le cellule nei campioni cerebrali alla mesoscala e può essere integrata senza soluzione di continuità nel flusso di lavoro di imaging della microscopia elettronica a scansione seriale su nastro sullo stesso campione.

Abstract

Comprendere le relazioni strutturali e funzionali all'interno delle complesse reti neurali nel cervello richiede la costruzione di atlanti cerebrali che possiedano sia un ampio campo visivo sia una risoluzione subcellulare. Tuttavia, i metodi attuali di imaging ottico e microscopico elettronico presentano entrambe limitazioni, rendendo difficile l'imaging di tutte le cellule all'interno di un singolo campione. Questo protocollo introduce una tecnica di imaging chiamata Tomografia di Interferenza Multilayer Ottica (OMLIT), che consente l'imaging ottico indiscriminato di tutte le cellule in campioni cerebrali realizzati dopo la preparazione del campione tramite microscopia elettronica, ricostruendo così un atlante cerebrale completo di tutte le cellule neurali. Inoltre, l'imaging OMLIT può essere integrato senza soluzione di continuità con il flusso di lavoro di imaging della microscopia elettronica a scansione automatica per la raccolta di nastro (ATUM-SEM). Ciò consente ai ricercatori di ottenere informazioni strutturali mesosscale delle cellule prima dell'imaging elettronico, facilitando la selezione precisa delle regioni di interesse e riducendo significativamente l'area e il volume di dati necessari per l'imaging elettronico ad alta risoluzione (EM). Abbiamo validato l'accuratezza e la compatibilità di questo metodo in campioni reali della corteccia cerebrale del topo adulto, dimostrandone le ampie prospettive di applicazione nella costruzione di atlanti cerebrali multi-scala.

Introduction

Una mappatura completa dei circuiti neurali a risoluzione cellulare e subcellulare è essenziale per rivelare la struttura e la funzione del cervello. I metodi tradizionali di imaging ottico, come la microscopia a due^{fotoni 1}, la tomografia micro-ottica a fluorescenza (fMOST^)2,3,4 e il sistema VISoR⁵, hanno permesso l'imaging neuronale mesoscala e l'imaging funzionale in vivo. Tuttavia, a causa della loro dipendenza da un'etichettatura scarsa, non riescono a catturare l'intera popolazion....

Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali dell'Università di Scienza e Tecnologia della Cina e con le normative nazionali pertinenti. La preparazione del campione per l'imaging OMLIT segue lo stesso protocollo utilizzato nell'elettromagnetismo convenzionale, e la procedura specifica che abbiamo impiegato è stata descritta^{altrove 21}. In breve, dopo l'anestesia, i topi venivano perfusi transcardicalmente in modo sequenziale con tampone cacodilato di sodio, liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) e infine un fissativo contenente glutaraldeide e paraformal....

Results

Il flusso di lavoro complessivo del protocollo (Figura 1) inizia con la preparazione di diversi nastri di raccolta. La Figura 1 mostra i tre tipi di nastri menzionati nel protocollo (da sinistra a destra: Kapton, D-50 e PET rivestito con CNT), che mostrano proprietà ottiche distinte quando posizionate sullo stesso substrato di fondo. Dopo la preparazione del campione e il taglio dei blocchi, alcune sezioni dovrebbero essere prim.......

Discussion

Qui abbiamo sviluppato un approccio di imaging ottico, chiamato OMLIT, che consente l'imaging mesoscopico ed è compatibile con i flussi di lavoro di microscopia elettronica a scansione seriale basati su nastro. Utilizzando il metodo OMLIT, la microscopia ottica può essere impiegata per catturare caratteristiche strutturali mesoscopiche da campioni cerebrali, inclusi vasi sanguigni, corpi cellulari, nuclei, rami dendritici principali e alcuni grandi assoni mielinizzati. Inoltre, OMLIT può.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nastro adesivo	3M	B5005094008	Adesivo a doppia faccia
Microscopio a Forza Atomica	Bruker	Icona Dimensionale
Sistema automatico di raccolta di sezione ultrasottile	Lehua	AutoCUTS II
Nastro adesivo conduttivo	Ted Pella	FP16084-8
Dektak Stylus Profilers	Bruker	DektakXT
Coltello diamantato per sezionare	Diatomee	DUJ3530	Coltello Jumbo a diatome
Coltello diamantato per la rifinitura	Diatomee	DTB90	Coltello di vetro
Microscopio elettronico	Zeiss	MultiSEM505	Alternativa: GeminiSEM 300, Zeiss
FIJI (v1.54p, 64-bit)	Open source	https://fiji.sc
Coltello da rifilatura in vetro	Selfmade
Citrato di piombo	Leica	T534/2
Microscopio ottico	Olympus	VS200	Alternativa: Axio Imager. A2 Vario, Zeiss
Microscopio luminoso	Zeiss	Axio Imager.A2 Vario
Detergente al plasma	Yidon Technologies	Hydro-S4	Alternative: Ted Pella Pelco o altri detergenti al plasma da banco
Nastro polimerico	Melton	Kapton	Il sito web dell'azienda non è più accessibile. Raccomandiamo ai ricercatori di provare nastri KAPTON disponibili localmente.
Nastro polimerico	Teijin	PET	https://www.teijin.com/
Nastro polimerico	Teijin	D-50	https://www.teijin.com/
Cialetta al silicio	Saichi	912303	Il wafer è lucidato su un lato.
Rivestimento a sputo	Leica	ACE600	Alternativa: Sputter a doppia testa, Yujie
Ultramicrotomo	Leica	UC7	Alternativa: RMC PT-PC
Uranilacetato	EMS	22400
VAST (v1.5.0, 64-bit)	Istituto Medico Howard Hughes	https://software.dvid.io/vast/	VAST A1:D32Lite è uno strumento gratuito per l'annotazione manuale e la segmentazione di grandi set di dati di microscopia 3D.
Software ZEN (v3.2, 64 bit)	Zeiss	https://www.zeiss.com/microscopy/zh/products/software/zeiss-zen.html