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Articolo metodologico

Un metodo di imaging ottico compatibile con microscopia elettronica a scansione per la mappatura mesoscopica del cervello di tutte le cellule

703 visualizzazioni

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DOI:

10.3791/68814

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20 febbraio 2026

 ,  , 
1School of Biomedical Engineering (Suzhou), Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, 2Anhui Province Key Laboratory of Biomedical Imaging and Intelligent Processing, Institute of Artificial Intelligence, Hefei Comprehensive National Science Center, 3Department of Biomedical Engineering, City University of Hong Kong, 4Institute for Brain and Intelligence, Fudan University

In questo articolo

Sommario

Abbiamo introdotto una tecnica di imaging innovativa chiamata Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), che consente l'imaging imparziale di tutte le cellule nei campioni cerebrali alla mesoscala e può essere integrata senza soluzione di continuità nel flusso di lavoro di imaging della microscopia elettronica a scansione seriale su nastro sullo stesso campione.

Abstract

Comprendere le relazioni strutturali e funzionali all'interno delle complesse reti neurali nel cervello richiede la costruzione di atlanti cerebrali che possiedano sia un ampio campo visivo sia una risoluzione subcellulare. Tuttavia, i metodi attuali di imaging ottico e microscopico elettronico presentano entrambe limitazioni, rendendo difficile l'imaging di tutte le cellule all'interno di un singolo campione. Questo protocollo introduce una tecnica di imaging chiamata Tomografia di Interferenza Multilayer Ottica (OMLIT), che consente l'imaging ottico indiscriminato di tutte le cellule in campioni cerebrali realizzati dopo la preparazione del campione tramite microscopia elettronica, ricostruendo così un atlante cerebrale completo di tutte le cellule neurali. Inoltre, l'imaging OMLIT può essere integrato senza soluzione di continuità con il flusso di lavoro di imaging della microscopia elettronica a scansione automatica per la raccolta di nastro (ATUM-SEM). Ciò consente ai ricercatori di ottenere informazioni strutturali mesosscale delle cellule prima dell'imaging elettronico, facilitando la selezione precisa delle regioni di interesse e riducendo significativamente l'area e il volume di dati necessari per l'imaging elettronico ad alta risoluzione (EM). Abbiamo validato l'accuratezza e la compatibilità di questo metodo in campioni reali della corteccia cerebrale del topo adulto, dimostrandone le ampie prospettive di applicazione nella costruzione di atlanti cerebrali multi-scala.

Introduzione

Una mappatura completa dei circuiti neurali a risoluzione cellulare e subcellulare è essenziale per rivelare la struttura e la funzione del cervello. I metodi tradizionali di imaging ottico, come la microscopia a duefotoni 1, la tomografia micro-ottica a fluorescenza (fMOST)2,3,4 e il sistema VISoR5, hanno permesso l'imaging neuronale mesoscala e l'imaging funzionale in vivo. Tuttavia, a causa della loro dipendenza da un'etichettatura scarsa, non riescono a catturare l'intera popolazione cellulare. D'altra parte, le tecniche di imaging ottico senza marcatore, come la microscopia fotoacustica funzionale (fPAM)6,7, la tomografia di coerenza ottica (OCT)8 e la microscopia di fasequantitativa 9, hanno il potenziale di visualizzare simultaneamente tutti i neuroni all'interno del campo visivo. Tuttavia, questi metodi sono tipicamente limitati da bassa risoluzione assiale e profondità di imaging ridotta, e la loro complessità hardware ostacola l'applicazione diffusa nella costruzione di atlanti cerebrali. Al contrario, le tecniche di microscopia elettronica a sezione seriale (ssEM), tra cui SEB a faccia bloccata seriale (SBF-SEM)10,11, SEM A FASCIO IONICO FOCALIZZATO (FIB-SEM)12,13,14 e ultramicrotomia automatica per raccolta del nastro SEM (ATUM-SEM)15,16,17 , può rivelare dense reti di connettività sinaptica a risoluzione nanometrica, fornendo strumenti essenziali per la connettomica ad alta risoluzione. Tuttavia, queste tecniche soffrono di basso throughput, lunghi tempi di acquisizione, campi visivi limitati e elevati costi di elaborazione e hardwaredei dati 18.

Per superare le limitazioni sopra menzionate, abbiamo sviluppato un metodo di imaging chiamato Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), che offre una soluzione a basso costo e ad alta produttività per immagini indiscriminate, ad alto contrasto e a campo ampio di tutte le cellule su sezioni ultrasottili, raggiungendo una risoluzione submicronica su vaste aree tissulari. Allo stesso tempo, OMLIT è intrinsecamente compatibile con i flussi di lavoro SEM a sezione seriale: prima della microscopia elettronica ad alta risoluzione, OMLIT fornisce informazioni strutturali sulle stesse sezioni, permettendo una navigazione precisa sul ROI e riducendo significativamente l'area e il volume di dati necessari per l'imaging elettromagnetico successivo. OMLIT offre vantaggi unici a livello di imaging mesoscala e funge da ponte critico che collega le mappe strutturali neurali su diverse scale spaziali. La sua natura non distruttiva preserva il potenziale per future integrazioni con strategie specifiche di marcatura, come l'uso di proteine fluorescenti resistentiall'osmio 19 per la preparazione e l'imaging del campione. Questo metodo consente l'imaging mesoscala di regioni cerebrali selezionate, consentendo l'acquisizione rapida della morfologia, quantità, distribuzione e densità neuronale nelle regioni. Facilita inoltre la caratterizzazione quantitativa delle proiezioni assonali e della distribuzione dei dendriti tra neuroni in diverse aree cerebrali. Per regioni specifiche di interesse nei risultati di imaging, i dettagli ultrastrutturali in situ possono essere ulteriormente indagati tramite microscopia elettronica.

Il principio di imaging di OMLIT è stato descritto nel lavoro di HaoFan 20. Per un breve periodo, durante l'imaging, la sezione ultrasottile, lo strato rivestito, il nastro di raccolta, il nastro conduttivo e la wafer formano una struttura a film sottile multistrato. Quando un'onda piana interagisce con questa struttura, le onde riflesse vengono generate a varie interfacce e si sovrappongono nello spazio di rilevamento, causando interferenze ottiche dovute a differenze di riflettanza, indice di rifrazione e assorbimento tra i materiali. Un programma di simulazione basato su MATLAB sviluppato secondo questo principio dimostrò un ragionevole accordo con i risultati sperimentali.

Lo schema di imaging OMLIT può essere suddiviso in due tipi in base alla strategia di elaborazione del nastro. La prima è la strategia ad alta riflettività, in cui metalli come Cr, Cu, Al o Ag vengono utilizzati per rivestire la superficie del nastro, risultando in intensità ottiche più elevate nelle regioni citoplasmatiche e lumen vascolari riempiti di resina rispetto alle aree circostanti. La seconda è la strategia a bassa riflettività, che utilizza nastro Kapton non rivestito, nastro D-50 o nastro PET rivestito in CNT. In questo caso, l'esito dell'imaging ottico è l'opposto del primo: regioni ricche di resina prive di membrana (ad esempio, citoplasma e lumen vascolari) compaiono con intensità inferiore.

Riassumiamo e stabiliamo sistematicamente protocolli standardizzati adattati a due strategie di imaging distinte. I protocolli qui presentati offrono procedure sperimentali complete e dettagliate. Inoltre, vengono riassunti i problemi comuni incontrati durante gli esperimenti, insieme alle soluzioni proposte. Ci concentriamo sulla presentazione di un dataset della corteccia del topo acquisita utilizzando la strategia a bassa riflettività (805 × 857,5 × 11,66 μm³), illustrando le caratteristiche distintive e i vantaggi dell'approccio di imaging OMLIT.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali dell'Università di Scienza e Tecnologia della Cina e con le normative nazionali pertinenti. La preparazione del campione per l'imaging OMLIT segue lo stesso protocollo utilizzato nell'elettromagnetismo convenzionale, e la procedura specifica che abbiamo impiegato è stata descrittaaltrove 21. In breve, dopo l'anestesia, i topi venivano perfusi transcardicalmente in modo sequenziale con tampone cacodilato di sodio, liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) e infine un fissativo contenente glutaraldeide e paraformaldeide. Il cervello è stato accuratamente rimosso e circa 1 × 1 × blocchi di tessuto cerebrale sono stati sezionati. I campioni venivano poi fissati chimicamente, sottoposti a macchie seriali di metalli pesanti, disidratati e incorporati nella resina. Il flusso di lavoro generale del protocollo è presentato nella Figura 1.

figure-protocol-1
Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro. (A) Nastri di raccolta menzionati nel protocollo (da sinistra a destra: poliimide, D-50 e PET rivestito con CNT). (B) Sezionamento seriale e raccolta dei campioni rifilati. (C) Montaggio di nastri contenenti sezioni raccolte su una wafer circolare di silicio. (D) Microscopia lucida, barra in scala 100 μm. (E) Rivestimento al carbonio. (F) L'imaging elettronico corrisponde alla regione descritta nella Figura 1D, barra di scala: 10 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Preparazione del nastro

NOTA: Le seguenti procedure devono essere eseguite in una stanza bianca per prevenire la contaminazione del nastro da parte della polvere.

  1. Strategia ad alta riflettività
    1. Seleziona Kapton (d'ora in poi chiamato nastro poliimide, spessore 50 μm) o pellicola Panlite (d'ora in poi D-50, spessore 50 μm) e montalo sul sistema di avvolgimento motorizzato. Qui, come esempio, viene usato il nastro in poliimide.
      NOTA: In questo studio è stato utilizzato un dispositivo di avvolgimento motorizzato, progettato per essere azionato da un motore passo passo controllato tramite una scheda Arduino, per far passare il nastro da un mulinello all'altro attraverso il cono di plasma a sputter. Per compensare l'aumento della velocità di linea della traslazione del nastro causato dall'accumulo di nastro sulla bobina di guida, aumentando il diametro della bobina di ritiro, veniva scritto un programma per accordare serialmente la velocità angolare della bobina di ritiro dopo ogni rotazione di 360°.
    2. Depositare un film sottile uniforme di Cr (o altri metalli come Al, Ag o Cu) sulla superficie del nastro utilizzando un sistema di sputtering a magnetron (sput a doppia testa). Posizionare il nastro a una distanza di 80 mm dal bersaglio di sputtering per una deposizione ottimale. Eseguire il processo con alimentazione DC e a una pressione di 1,0 Pa regolata dal 99,99% di gas argon.
    3. Imposta la velocità di avvolgimento del nastro a 0,6 mm/s per ottenere uno spessore del rivestimento metallico di 50 nm. Dopo la deposizione, raffreddare lentamente la camera fino alla temperatura ambiente (RT) sotto alto vuoto per minimizzare lo stress del rivestimento.
      NOTA: Lo spessore ottimale del rivestimento per lo stesso nastro può variare a seconda del tipo di metallo utilizzato. Regolare la velocità di traslazione del nastro per ottenere una varietà di spessori di rivestimento, come 50, 70, 100, 150 e 200 nm.
    4. Valuta lo spessore e l'uniformità del rivestimento utilizzando un profilatore a stilo, microscopia a forza atomica o microscopia elettronica a scansione.
    5. Pulire e rendere il nastro idrofilo usando un detergente al plasma a 80 W di potenza, con una velocità di movimento del nastro di 7 mm/s. Dopo il trattamento, le gocce d'acqua poste sulla superficie del nastro dovrebbero diffondersi rapidamente in un film sottile (Figura 2A).
  2. Strategia a bassa riflettività
    NOTA: Questo protocollo consente l'uso sia di nastro D-50 sia di un nastro commerciale di nanotubi di carbonio (CNT) rivestito di polietilene tereftalato (PET). Poiché quest'ultima può introdurre un certo rumore di fondo durante l'imaging microscopico elettronico — anche se non forte — potrebbe potenzialmente influenzare la segmentazione delle immagini elettromagnetiche. Pertanto, la seguente descrizione utilizzerà comunque il nastro D-50 come esempio.
    1. Prepara i film D-50 e taglia il foglio intero in nastri larghi circa 7 mm. Usa un lato esposto del nastro per raccogliere le sezioni, proteggendo l'altro lato con uno strato di pellicola opaca per prevenire graffi e contaminazioni. Rimuovi la pellicola opaca durante il successivo passaggio di montaggio del wafer di silicio.
    2. Per un numero maggiore di sezioni, unire tra loro diverse sezioni di nastro D-50. Fissa le giunzioni tra i segmenti del nastro usando nastro adesivo a doppia faccia.
      NOTA: Quando si attaccano i segmenti di nastro, assicurarsi che il nastro anteriore si sovrapponi a quello posteriore dall'alto verso il basso tramite il nastro a doppia faccia. Minimizza l'area adesiva e lascia un margine lungo i bordi del nastro per evitare che la colla venga spremuta durante l'avvolgimento del nastro, che potrebbe contaminare il nastro (Figura 2B).
    3. Pulire e rendere il nastro idrofilo usando un detergente al plasma, seguendo la stessa procedura e ottenendo lo stesso effetto descritto in precedenza.
      NOTA: A parte i passaggi di rivestimento metallico e sputtering al carbonio, gli altri passaggi di entrambe le strategie sono gli stessi.

2. Sezioni ultrasottili seriali e raccolta basata su nastro

  1. Con una piccola smerigliatrice o uno strumento da taglio simile, taglia la resina sul lato con il campione, rimuovendo la resina circostante per esporre l'area del campione.
  2. Posiziona il blocco in resina nel portacampioni e stringi la manopola del supporto per fissare saldamente il blocco.
  3. Monta il portacampioni sul braccio mobile del microtomo. Installa un coltello da vetro o un coltello da taglio diamantato (con un angolo di 45°) sul portacoltelli. Al microscopio, ritaglia la superficie del campione a forma piramidale e liscia la superficie.
    NOTA: I bordi anteriore e posteriore del blocco di campione tagliato devono essere il più paralleli possibile ( vedi Figura 2C).
  4. Rifilare e levicare i quattro lati del blocco campione per rimuovere eventuali residui di resina intorno ai bordi, prevenendo potenziali collisioni con il coltello diamantato. Ruota la manopola per assicurarti che i bordi anteriori e posteriori del blocco tagliato siano allineati in posizione orizzontale.
  5. Rimuovi il coltello da taglio e sostituiscilo con un coltello diamantato disposto a un angolo di 45°. Imposta l'angolo di inclinazione della base del microtomo a 6°. Muovi lentamente il portacoltello usando la manopola finché il bordo anteriore del coltello diamantato non è a 1-2 mm dalla superficie del campione.
  6. Osserva la banda luminosa tra la superficie del campione e il bordo del coltello, e regola l'angolo di inclinazione in modo che la banda sia uniforme dall'alto verso il basso e lateralmente. Questo aiuta a garantire che la prima sezione includa l'intera superficie del campione, non solo un angolo.
  7. Inietta acqua distillata nella scanalatura del coltello diamantato, permettendo al livello del liquido di salire e assicurando che la lama sia bagnata. Poi, usa una siringa per rimuovere un po' dell'acqua finché il livello del liquido non scende e il riflesso appare argentato.
  8. Imposta lo spessore della sezione (alimentazione), la velocità di taglio e la finestra di taglio nell'unità di controllo. Regola la velocità di sezionamento a 0,6 mm/s e imposta lo spessore della sezione a 60 nm (la velocità e lo spessore specifici dipendono dalla qualità del campione).
  9. Inizia a sezionare. Una volta che il microtomo è svolto stabile e sono state prodotte sezioni uniformi, si interrompe il processo di sezionamento. Usa un pennello fine per rimuovere le sezioni tagliate e eventuali detriti.
  10. Installa sia la bobina di nastro rivestita che una bobina vuota di raccolta sul sistema automatico di raccolta della sezione ultrasottile. Fissare il meccanismo di bloccaggio ed eseguire una prova per garantire che il nastro si muova regolarmente a velocità costante e venga correttamente raccolto sulla bobina vuota.
  11. Immergi la testa di raccolta del dispositivo di raccolta nastro nel bagno d'acqua del coltello diamantato. Regola la posizione della testina di raccolta in modo che sia parallela al bordo del coltello, a una distanza di 1,5 volte la lunghezza della fetta del campione, assicurandoti che le sezioni tagliate vengano raccolte in modo fluido sul nastro. Mettere in sicurezza il dispositivo di raccolta e riprendere la sezionazione mentre contemporaneamente si utilizza il dispositivo di raccolta nastro.
  12. Dopo aver raccolto un numero sufficiente di sezioni continue, si interrompe il processo di sezionamento. Taglia il nastro nell'area della sezione dove non sono state raccolte sezioni e continua a far funzionare il dispositivo di raccolta del nastro finché tutto il nastro rimanente non sarà raccolto sulla bobina.
  13. Rimuovi la bobina contenente le sezioni raccolte e mettila in un forno elettronico per asciugare. Pulisci il dispositivo di raccolta nastro e il microtomo, e rimetti tutti gli accessori al loro posto corretto.

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Figura 2: Preparativi prima della sezionamento. (A) Gocce d'acqua sulla superficie del nastro D-50 prima (in alto) e dopo il trattamento idrofilo (in basso). (B) Schemi superiori e laterali dell'area di giunzione del nastro D-50. Blu: nastro D-50; arancione: adesivo a doppia faccia; Freccia verde: direzione del movimento del nastro. (C) Vista frontale del campione dopo il rifinitura, mostrando bordi paralleli superiore e inferiore. (D) Dispositivo automatico di raccolta dei nastro. a: Bobina del nastro per l'alimentazione del nastro D-50; b: Bobina del nastro per il recupero del nastro; Freccia Rossa: direzione del movimento del nastro. (E) Posizione della testa di raccolta sul dispositivo automatico di raccolta del nastro. La scatola gialla in basso a destra indica una sezione appena tagliata che sta per essere raccolta dal dispositivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Montaggio su un wafer di silicio

NOTA: Assicurati che lo spazio di lavoro sia pulito per evitare la contaminazione del nastro con la polvere durante i passaggi seguenti.

  1. Usa una wafer di silicio rotonda da 4 pollici pre-pulita e idrofilizzata in un sistema di trattamento al plasma (a 80 W di potenza, 3 minuti).
  2. Indossa guanti puliti, posiziona la wafer di silicone su una superficie piana e taglia un pezzo di nastro di carbonio conduttivo a doppia faccia alla lunghezza appropriata (con una sporgenza di 2-3 cm su entrambe le estremità). Togli lo strato protettivo bianco da un lato del nastro conduttivo a doppia faccia e applicalo dall'alto verso il basso sulla wafer di silicio.
    NOTA: I due lati del nastro conduttivo devono essere distanziati di circa 2 mm e i bordi del nastro dovrebbero essere visibili sul wafer di silicio. Per un nastro conduttivo a doppia faccia largo 25 mm, tre segmenti di nastro possono essere applicati a un wafer di silicio da 4 pollici.
  3. Disegna un contorno della wafer di silicio da 4 pollici sul banco da lavoro e segna la lunghezza approssimativa di ogni segmento di nastro che verrà applicato al wafer. Taglia il nastro che ha raccolto le sezioni secondo le lunghezze precedentemente segnate.
    NOTA: Il nastro tagliato non deve superare il bordo del wafer di silicio e non tagliare le sezioni.
  4. Togliere la pellicola protettiva trasparente dal nastro conduttivo a doppia faccia e, per il nastro D-50, rimuovere la pellicola protettiva sul retro del nastro in questo punto. Applica il nastro parallelo al nastro conduttivo a doppia faccia. Applicare fino a tre segmenti di nastro su ciascun pezzo di nastro conduttivo a doppia faccia.
    NOTA: Per ridurre il rischio che il nastro D-50 venga disallineato o contaminato dalla polvere, copri parte del nastro conduttivo con la pellicola trasparente precedentemente staccata, lasciando esposta solo una piccola porzione del nastro conduttivo per fissare l'estremità del nastro D-50. Questo permette una regolazione più semplice della direzione del nastro. Successivamente, stacca lentamente la pellicola trasparente rimanente, lasciando cadere delicatamente il resto del nastro D-50 e aderire al nastro conduttivo.
  5. Dopo il montaggio del nastro, possono formarsi bolle d'aria tra il nastro e il nastro conduttivo, che possono interferire con il successivo processo di immaginazione. Posiziona la wafer di silicio in una camera a vuoto (o altro apparecchio a vuoto) e applica un vuoto. Dopo il processo di vuoto, assicurati che le bolle d'aria siano scomparse.

4. Post-colorazione

  1. Prepara al 4% di acetato di uranyle e al 3% di citrato di piombo, e preriscaldali a 50°C usando una pentola da bagno maria.
    ATTENZIONE: L'acetato di uranyle è radioattivo e ha una tossicità significativa per fegato e reni. Il citrato di piombo può causare avvelenamento da piombo, influenzando il sistema nervoso, i reni e l'ematopoietico. Il lavoro con questi reagenti deve essere effettuato in una cappa e devono essere indossati dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati, inclusi camice da laboratorio, guanti in nitrilo, maschera e occhiali di sicurezza. In caso di contatto con la pelle o lo sguardo, lava immediatamente con abbondanti quantità d'acqua, segnala il personale di sicurezza del laboratorio e cerca assistenza medica.
  2. Inserire la wafer di silicio, che è stata aspirata ed è priva di bolle, in un sistema di idrofilizzazione al plasma per idrofilizzazione e pulizia.
  3. Utilizzando una siringa da 10 mL con l'ago rimosso, applica un filtro a siringa da 0,22 μm e filtra l'acetato di uranile al 4%. Lascia cadere la soluzione sulla sezione finché non si copre tutta la superficie della sezione sulla wafer di silicio, poi aspetta 3 minuti.
  4. Lava con acqua distillata per 3 minuti, ripetendo 3 volte, poi asciuga con il phon la superficie del campione con azoto.
  5. Utilizzando una siringa da 10 mL con l'ago rimosso, applica un filtro per siringa da 0,22 μm e filtra il citrato di piombo al 3%. Lascia cadere la soluzione sulla sezione finché non si copre tutta la superficie della sezione sul wafer di silicio, poi aspetta 5 minuti.
  6. Lava con acqua distillata per 3 minuti, ripetendo 3 volte, poi asciuga con il phon la superficie del campione con azoto.

5. Acquisizione dati

  1. Microscopia ottica
    NOTA: In questa sezione, uno scanner per vetri di ricerca (VS200, Olympus) è utilizzato come esempio per la microscopia ottica. Altri microscopi, come l'Axio Imager.A2 Vario (Zeiss, Germania), sono anch'essi adatti per l'imaging ottico descritto qui. I passaggi per altri microscopi ottici sono generalmente gli stessi.
    1. Posizionare la wafer di silicio sul palco del microscopio ottico e fissarla con un nastro adesivo non residuo.
    2. Usa una lente obiettivo 5x per ottenere un'immagine panoramica della wafer di silicio, del nastro e del campione.
    3. Nell'immagine panoramica, delinea ogni sezione e ordinale, poi aggiungi punti di messa a fuoco e punti di esposizione per eseguire immagini automatiche a ingrandimento 20x o 50x su tutta la wafer di silicio con tutte le sezioni.
    4. Dopo aver completato l'imaging, salva le immagini e poi controlla la qualità dell'immagine. Se ci sono immagini fuori fuoco o di scarsa qualità, rifocalizza e riimmagine.
  2. Microscopia elettronica
    NOTA: Più tipi di microscopi elettronici possono eseguire immagini continue di sezioni ultrasottili poste su wafer di silicio. Qui viene usato il Multibeam 505 (Zeiss) come esempio.
    1. Eseguire un rivestimento al carbonio sulla superficie del campione utilizzando un rivestimento a spruzzo ad alto vuoto, con uno spessore di carbonio di 5,7 nm.
      NOTA: Questo passaggio può essere saltato per nastri rivestiti di metallo con una strategia ad alta riflettività o rivestiti con nanotubi di carbonio (CNT) in una strategia a bassa riflettività.
    2. Utilizzare un microscopio ottico (Axio Imager.A2 Vario, Zeiss) per catturare la mappa di navigazione ottica del wafer di silicio.
    3. Inserire la wafer di silicio nella camera campionaria del SEM. Associare la mappa di navigazione ottica all'immagine del microscopio elettronico identificando sequenzialmente i due marcatori a forma di L annidati sul palco campione.
    4. Utilizzare il modulo SAT nel software di microscopia (v3.2, 64 bit) per identificare in modo semi-automatico le posizioni delle sezioni e le aree di imaging dalla mappa ottica di navigazione.
    5. Imposta la dimensione dei pixel dell'immagine a 4 nm, il tempo di permanenza a 0,8 μs, i punti di messa a fuoco e le posizioni di archiviazione.
    6. Inizia l'imaging continuo.

6. Elaborazione dei dati

NOTA: La cucitura 2D delle immagini OMLIT viene eseguita automaticamente dal software. Per la registrazione e segmentazione 3D su larga scala delle immagini OMLIT, sono disponibili altri algoritmi di IA più potenti. Qui, per comodità della maggior parte dei laboratori di verificare il processo, vengono dimostrate la cucitura, la registrazione e la segmentazione utilizzando Fiji (v1.54p, 64 bit) e VAST (v1.5.0, 64 bit).

  1. Apri il dataset di immagini a Fiji trascinando la cartella contenente tutti i file immagine nell'interfaccia Fiji e seleziona Virtual Stack quando richiesto.
  2. Usa lo strumento Rettangolo per selezionare la regione di interesse (ROI), poi ritaglia il dataset tramite Image > Crop.
  3. Allinea lo stack di immagini usando il plugin Register Virtual Stack Slices (Plugins > Registration > Register Virtual Stack Slices).
  4. Salva il dataset allineato in formato TIFF (File > Salva come > Tiff).
  5. Importa lo stack di immagini TIFF in VAST22 usando Importa > Importa volume immagine dalle immagini a . File VSV.
    NOTA: Per un tutorial più dettagliato, si prega di consultare il sito web: https://lichtman.rc.fas.harvard.edu/vast/
  6. Collegando un tablet esterno, usa lo strumento pennello in modalità Disegna segmenti per iniziare la segmentazione manuale e il tracciamento (usa i tasti scorciatoie A e Z per navigare rapidamente tra le fette di immagine).
  7. Visualizza la struttura segmentata in 3D usando Window > 3D Viewer > Visualizza > Aggiorna.
  8. Salva i risultati della segmentazione tramite File > Salva Segmentazione.

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Risultati

Il flusso di lavoro complessivo del protocollo (Figura 1) inizia con la preparazione di diversi nastri di raccolta. La Figura 1 mostra i tre tipi di nastri menzionati nel protocollo (da sinistra a destra: Kapton, D-50 e PET rivestito con CNT), che mostrano proprietà ottiche distinte quando posizionate sullo stesso substrato di fondo. Dopo la preparazione del campione e il taglio dei blocchi, alcune sezioni dovrebbero essere prim...

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Discussione

Qui abbiamo sviluppato un approccio di imaging ottico, chiamato OMLIT, che consente l'imaging mesoscopico ed è compatibile con i flussi di lavoro di microscopia elettronica a scansione seriale basati su nastro. Utilizzando il metodo OMLIT, la microscopia ottica può essere impiegata per catturare caratteristiche strutturali mesoscopiche da campioni cerebrali, inclusi vasi sanguigni, corpi cellulari, nuclei, rami dendritici principali e alcuni grandi assoni mielinizzati. Inoltre, OMLIT può...

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interesse dichiarato.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation of China (32271430, 62361166631) e dal Ministero della Scienza e della Tecnologia cinese (2023YFF0715904). Ringraziamo il Centro Tecnico Pubblico dell'Istituto di Ingegneria e Tecnologia Biomedica di Suzhou, e la Struttura di Imaging Cerebrale dell'Istituto di Intelligenza Artificiale, Centro Nazionale Scientifico Completo di Hefei, per il loro supporto nell'OMLIT e nell'imaging elettromagnetico seriale.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nastro adesivo3MB5005094008Adesivo a doppia faccia
Microscopio a Forza AtomicaBrukerIcona Dimensionale
Sistema automatico di raccolta di sezione ultrasottile  LehuaAutoCUTS II
Nastro adesivo conduttivoTed PellaFP16084-8
Dektak Stylus ProfilersBrukerDektakXT
Coltello diamantato per sezionareDiatomeeDUJ3530Coltello Jumbo a diatome
Coltello diamantato per la rifinituraDiatomeeDTB90Coltello di vetro
Microscopio elettronicoZeissMultiSEM505Alternativa: GeminiSEM 300, Zeiss
FIJI (v1.54p, 64-bit) Open sourcehttps://fiji.sc
Coltello da rifilatura in vetroSelfmade
Citrato di piomboLeicaT534/2
Microscopio otticoOlympus VS200Alternativa: Axio Imager. A2 Vario, Zeiss
Microscopio luminoso Zeiss  Axio Imager.A2 Vario
Detergente al plasmaYidon TechnologiesHydro-S4Alternative: Ted Pella Pelco o altri detergenti al plasma da banco
Nastro polimericoMeltonKaptonIl sito web dell'azienda non è più accessibile. Raccomandiamo ai ricercatori di provare nastri KAPTON disponibili localmente.
Nastro polimericoTeijinPEThttps://www.teijin.com/
Nastro polimericoTeijinD-50https://www.teijin.com/
Cialetta al silicioSaichi912303Il wafer è lucidato su un lato.
Rivestimento a sputo LeicaACE600Alternativa: Sputter a doppia testa, Yujie
UltramicrotomoLeicaUC7Alternativa: RMC PT-PC
UranilacetatoEMS22400
VAST (v1.5.0, 64-bit)Istituto Medico Howard Hugheshttps://software.dvid.io/vast/VAST A1:D32Lite è uno strumento gratuito per l'annotazione manuale e la segmentazione di grandi set di dati di microscopia 3D.
Software ZEN (v3.2, 64 bit)Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/zh/products/software/zeiss-zen.html

Riferimenti

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  2. Gong, H., et al. Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution. Neuroimage. 74, 87-98 (2013).
  3. Zheng, T., et al. Visualization of brain circuits using two-photon fluorescence micro-optical sectioning tomography. Opt Express. 21 (8), 9839(2013).
  4. Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nat Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
  5. Wang, H., et al. Scalable volumetric imaging for ultrahigh-speed brain mapping at synaptic resolution. Natl Sci Rev. 6 (5), 982-992 (2019).
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