Method Article

Rilevamento basato su sonda fluorescente PCR di Aspergillus Spp., Cryptococcus neoformans e Pneumocystis jirovecii

DOI:

10.3791/68819

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May 8th, 2026

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1Clinical Laboratory, Foshan Sanshui District People's Hospital, 2Organization and Personnel Department and Neurology Department, Foshan Sanshui District People's Hospital

In This Article

Summary

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Qui presentiamo un protocollo di test clinico basato sul metodo della sonda fluorescente PCR per la rilevazione simultanea di Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans e Pneumocystis jirovecii.

Abstract

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Questo protocollo descrive una procedura standardizzata per la rilevazione qualitativa di Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans e Pneumocystis jirovecii in campioni clinici di expectorato utilizzando un kit di rilevamento degli acidi nucleici fluorescenti basato su sonda PCR. La procedura prevede la raccolta di campioni clinici, il pretrattamento della liquefazione alcalina, l'estrazione automatica degli acidi nucleici e la rilevazione in tempo reale per PCR multiplex. Aspergillus spp., C. neoformans e P. jirovecii vengono rilevati utilizzando sonde fluorescenti specifiche per bersaglio (canali FAM, VIC e CY5, rispettivamente), con un controllo interno (canale ROX) integrato per la qualità assicurativa. La validità del saggio e l'interpretazione dei risultati del campione si basano su valori definiti della soglia di ciclo (Ct). Un controllo positivo deve presentare curve di amplificazione a forma di S con Ct ≤ 33,7 in tutti i canali, mentre il controllo negativo non deve mostrare amplificazione. Per i campioni clinici, un valore di Ct ≤ 33,7 nel canale FAM indica positività per Aspergillus spp., e un valore di Ct ≤ 36 nei canali VIC o CY5 indica positività rispettivamente per C. neoformans o P. jirovecii.

Introduction

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Le infezioni fungine invasive, come quelle causate da Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans e Pneumocystis jirovecii, rappresentano una minaccia significativa per i pazienti immunocompromissi, portando a un'elevata morbilità e mortalità. Una diagnosi tempestiva e accurata è fondamentale per avviare una terapia antifungica adeguata e migliorare gli esiticlinici 1. I metodi diagnostici convenzionali, inclusi coltura, microscopia e rilevamento di antigeni, presentano limitazioni notevoli. La coltura richiede tempo e presenta una bassa sensibilità, la microscopia manca di identificazi....

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Protocol

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L'uso dei campioni clinici è stato approvato dal comitato etico competente (Approvazione n.: ZYS-GCP-2025006). Tutti i partecipanti hanno fornito un ampio consenso informato all'uso dei propri dati e campioni nella ricerca. Tutti i reagenti e i consumabili utilizzati in questo protocollo sono elencati nelT dei Materiali.

1. Raccolta di campioni

  1. Raccogliere 3–5 mL di liquido di lavaggio dell'espettoro o broncoalveolare in contenitori sterili e inviarli tempestivamente per l'analisi.

2. Preparazione del reagente

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Results

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Le curve di amplificazione rappresentative ottenute utilizzando questo saggio PCR a sonda fluorescente multiplex sono mostrate nella Figura 1 e nella Figura 2. La validità del saggio è stata determinata in base a criteri di controllo predefiniti. In una run valida, il controllo positivo ha prodotto curve di amplificazione caratteristiche a forma di S nei canali FAM, VIC, CY5 e ROX, con valori di soglia di ciclo (Ct) ≤ 33,7 in tu.......

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Discussion

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Il protocollo multiplex in tempo reale per PCR stabilito in questo studio fornisce una procedura standardizzata per la rilevazione simultanea e rapida di tre principali patogeni fungini invasivi (Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans e Pneumocystis jirovecii) in campioni clinici di espriveto. Questo metodo consente la rilevazione diretta del DNA patogeno da campioni clinici. A differenza degli approcci diagnostici tradizionali come la coltura, la microscopia o il test sierologico deg.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgements

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Vorremmo ringraziare il Dipartimento di Laboratorio Clinico dell'Ospedale Popolare del Distretto di Shanshui a Foshan per aver fornito le attrezzature e il supporto tecnico.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 & mu; Punte a pipetta estese sterili a punta a L (Racked)Xiaorui BiotecnologiaS20221126
1000 & mu; Punte per pipette sterili a LJiangsu Xinkang Medical Instrument Co., Ltd241101
200 & mu; Punte di pipetta sterili a filtro esteso LXiaorui Biotecnologia241001
Tubi di lisiZona Civile di Pechino ZC Bio-Science & Scienze Technology CoF1040
Kit di rilevamento degli acidi nucleici per Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans e Pneumocystis jiroveciiZona Civile di Pechino ZC Bio-Science & Scienze Technology Co.CT8143-48T
Reagente di estrazione degli acidi nucleiciZona Civile di Pechino ZC Bio-Science & Scienze Technology CoCN8053-B40T
Buffer di diluizione del campioneZona Civile di Pechino ZC Bio-Science & Scienze Technology CoSP7065

References

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  1. Morrissey, C. O., et al. Aspergillus fumigatus—a systematic review to inform the World Health Organization priority list of fungal pathogens. Med Mycol. 62 (6), 6(2024).
  2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., Watson, R.

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PCR DetectionFluorescent ProbeAspergillus SppCryptococcus NeoformansPneumocystis JiroveciiMultiplex Real Time PCRNucleic Acid ExtractionClinical Sputum SamplesCycle ThresholdInternal Control

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