Method Article

Rilevamento basato su sonda fluorescente PCR di Aspergillus Spp., Cryptococcus neoformans e Pneumocystis jirovecii

DOI:

10.3791/68819

⸱

May 8th, 2026

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1Clinical Laboratory, Foshan Sanshui District People's Hospital, 2Organization and Personnel Department and Neurology Department, Foshan Sanshui District People's Hospital

In This Article

Summary

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Qui presentiamo un protocollo di test clinico basato sul metodo della sonda fluorescente PCR per la rilevazione simultanea di Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans e Pneumocystis jirovecii.

Abstract

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Questo protocollo descrive una procedura standardizzata per la rilevazione qualitativa di Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans e Pneumocystis jirovecii in campioni clinici di expectorato utilizzando un kit di rilevamento degli acidi nucleici fluorescenti basato su sonda PCR. La procedura prevede la raccolta di campioni clinici, il pretrattamento della liquefazione alcalina, l'estrazione automatica degli acidi nucleici e la rilevazione in tempo reale per PCR multiplex. Aspergillus spp., C. neoformans e P. jirovecii vengono rilevati utilizzando sonde fluorescenti specifiche per bersaglio (canali FAM, VIC e CY5, rispettivamente), con un controllo interno (canale ROX) integrato per la qualità assicurativa. La validità del saggio e l'interpretazione dei risultati del campione si basano su valori definiti della soglia di ciclo (Ct). Un controllo positivo deve presentare curve di amplificazione a forma di S con Ct ≤ 33,7 in tutti i canali, mentre il controllo negativo non deve mostrare amplificazione. Per i campioni clinici, un valore di Ct ≤ 33,7 nel canale FAM indica positività per Aspergillus spp., e un valore di Ct ≤ 36 nei canali VIC o CY5 indica positività rispettivamente per C. neoformans o P. jirovecii.

Introduction

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Le infezioni fungine invasive, come quelle causate da Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans e Pneumocystis jirovecii, rappresentano una minaccia significativa per i pazienti immunocompromissi, portando a un'elevata morbilità e mortalità. Una diagnosi tempestiva e accurata è fondamentale per avviare una terapia antifungica adeguata e migliorare gli esiticlinici 1. I metodi diagnostici convenzionali, inclusi coltura, microscopia e rilevamento di antigeni, presentano limitazioni notevoli. La coltura richiede tempo e presenta una bassa sensibilità, la microscopia manca di identificazione a livello di specie ed è dipendente dall'operatore, mentre i saghi antigenici (ad esempio, galattomanano, β-D-glucano) possono mostrare reattività incrociata e prestazioni incoerenti. La diagnostica molecolare, in particolare la PCR in tempo reale, può colmare alcune di queste lacune offrendo tempi di risposta più rapidi e il potenziale di alta sensibilità e specificità. I progressi nella PCR multiplex permettono ulteriormente la rilevazione simultanea di più patogeni da un singolo campione, migliorando l'efficienza diagnostica.

Questo protocollo descrive un test PCR multiplex con sonda fluorescente per rilevare qualitativamente il DNA di Aspergillus spp., C. neoformans e P. jirovecii in campioni di expectorato umano, colpendo regioni conservate del gene rRNA 18S (Aspergillus spp.), del gene ITS (C. neoformans) e del gene rRNA mtLSU (P. jirovecii). Le caratteristiche chiave di questo metodo includono una sensibilità analitica definita: il limite di rilevamento per Aspergillus spp., C. neoformans e P. jirovecii è di 1.500 copie/mL; Specificità di primer/sonda: Primer e sonde specifici per il bersaglio minimizzano la reattività incrociata con il DNA umano o altra flora comune; Controllo robusto della contaminazione: l'incorporazione di sistemi dUTP-UDG (uracil-DNA glicosilasi) previene efficacemente la contaminazione residua da amplificatori PCR precedenti, una caratteristica fondamentale per mantenere l'affidabilità dei sami in un contesto di laboratorioclinico 2; Controllo integrato del processo: un controllo interno endogeno che prende di mira il gene RP (Proteina Ribosomiale) umano, marcato con fluoroforo ROX, viene co-amplificato per monitorare l'integrità dell'estrazione degli acidi nucleici e identificare una potenziale inibizione PCR, riducendo così i falsinegativi 3. Questo approccio è supportato da linee guida consolidate per la garanzia della qualità nella diagnosticamolecolare 4,5. Il protocollo è principalmente applicabile a campioni respiratori (espetto/BALF) provenienti da popolazioni ad alto rischio, come pazienti ematologici-oncologici o riceventi di trapianto. Vengono inoltre discusse le possibili limitazioni, inclusi falsi positivi dovuti a contaminazione ambientale o una riduzione della sensibilità dovuta a un'eccessiva diluizione del campione, insieme a strategie di mitigazione.

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Protocol

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L'uso dei campioni clinici è stato approvato dal comitato etico competente (Approvazione n.: ZYS-GCP-2025006). Tutti i partecipanti hanno fornito un ampio consenso informato all'uso dei propri dati e campioni nella ricerca. Tutti i reagenti e i consumabili utilizzati in questo protocollo sono elencati nelT dei Materiali.

1. Raccolta di campioni

  1. Raccogliere 3–5 mL di liquido di lavaggio dell'espettoro o broncoalveolare in contenitori sterili e inviarli tempestivamente per l'analisi.

2. Preparazione del reagente

NOTA: Questi passaggi sono stati eseguiti nella sala di preparazione dei reagenti.

  1. Rimuovi il kit di rilevamento dal congelatore a -28 °C e scongela completamente a temperatura ambiente (25–30 °C) per 30 minuti.
  2. Calcola il numero totale di reazioni (N): N = numero di campioni di prova (n) + controlli positivi/negativi (2) + 1
  3. Prepara la miscela di reazione in un tubo sterile per microcentrifuga. Per una singola reazione: 35 μL di miscela di amplificazione degli acidi nucleici + 5 μL di miscela Primer-sonda, vortice accuratamente e centrifuga brevemente.
  4. Aliquota 40 μL della miscela di reazione in ciascun tubo PCR (secondo il protocollo del produttore del kit) e trasferita alla finestra di passaggio della sala di lavorazione del campione.

3. Elaborazione dei campioni

NOTA: Questi passaggi sono stati eseguiti nella Sample Processing Room. Smaltimento dei rifiuti: Scartare il surnazionante del passaggio 3.2.2 e altri rifiuti liquidi contenenti NaOH in un contenitore designato per rifiuti chimici.

  1. Liquefazione
    1. Aggiungi liquido di lavaggio dell'espetto/broncoalveolare (BALF) a un tubo a vite da 50 mL.
    2. Aggiungere 1–2 volumi di soluzione digestionale al 4% di NaOH (rispetto alla viscosità dell'espettoro).
      ATTENZIONE: NaOH è corrosivo. Evita il contatto con pelle e occhi.
    3. Stringi il tappo, fai il vortice per 1 minuto e incuba in un armadietto di biosicurezza a temperatura ambiente per 15–20 minuti.
  2. Arricchimento
    1. Centrifuga i campioni liquefatti a 3.000 giri/min per 5 minuti.
    2. Scartare il soprandanante usando una pipetta, trattenendo 1.000 μL di sedimento.
    3. Vortice accuratamente il sedimento.
  3. Lisi
    1. Trasferire 500 μL di sedimento in un tubo di lisi. Vortice per 10 minuti e brevemente centrifuga.
  4. Estrazione
    NOTA: Smaltimento dei rifiuti: Piastre di estrazione usate, punte e tubi che hanno contattato campioni biologici devono essere scartati in un contenitore di rifiuti biopericolosi approvato.
    1. Trasferire tutto il sovrandante lisato e 100 μL di controlli negativi/positivi alla Colonna 2 della piastra di estrazione.
    2. Eseguire l'estrazione degli acidi nucleici utilizzando un sistema automatico di estrazione degli acidi nucleici con il programmadesignato 6.
  5. Caricamento del campione
    1. Trasferire 10 μL di acido nucleico estratto (Colonna 6) e i controlli su tubi PCR. Centrifugare brevemente e trasferire alla finestra di passaggio della sala amplificazione.

4. Amplificazione degli acidi nucleici

NOTA: Questi passaggi sono stati eseguiti nella Sala Amplificazione.

  1. Carica le valvole PCR nello strumento di amplificazione nucleica automatizzato e seleziona il modello di amplificazione appropriato.
  2. Assegnare canali di rilevamento: Aspergillus spp.: canale FAM; C. neoformans: canale VIC; P. jirovecii: canale CY5; Controllo interno: canale ROX 7,8,9.
  3. Imposta i nomi degli esempi e esegui il programma.

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Results

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Le curve di amplificazione rappresentative ottenute utilizzando questo saggio PCR a sonda fluorescente multiplex sono mostrate nella Figura 1 e nella Figura 2. La validità del saggio è stata determinata in base a criteri di controllo predefiniti. In una run valida, il controllo positivo ha prodotto curve di amplificazione caratteristiche a forma di S nei canali FAM, VIC, CY5 e ROX, con valori di soglia di ciclo (Ct) ≤ 33,7 in tu...

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Discussion

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Il protocollo multiplex in tempo reale per PCR stabilito in questo studio fornisce una procedura standardizzata per la rilevazione simultanea e rapida di tre principali patogeni fungini invasivi (Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans e Pneumocystis jirovecii) in campioni clinici di espriveto. Questo metodo consente la rilevazione diretta del DNA patogeno da campioni clinici. A differenza degli approcci diagnostici tradizionali come la coltura, la microscopia o il test sierologico deg...

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Disclosures

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgements

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Vorremmo ringraziare il Dipartimento di Laboratorio Clinico dell'Ospedale Popolare del Distretto di Shanshui a Foshan per aver fornito le attrezzature e il supporto tecnico.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 & mu; Punte a pipetta estese sterili a punta a L (Racked)Xiaorui BiotecnologiaS20221126
1000 & mu; Punte per pipette sterili a LJiangsu Xinkang Medical Instrument Co., Ltd241101
200 & mu; Punte di pipetta sterili a filtro esteso LXiaorui Biotecnologia241001
Tubi di lisiZona Civile di Pechino ZC Bio-Science & Scienze Technology CoF1040
Kit di rilevamento degli acidi nucleici per Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans e Pneumocystis jiroveciiZona Civile di Pechino ZC Bio-Science & Scienze Technology Co.CT8143-48T
Reagente di estrazione degli acidi nucleiciZona Civile di Pechino ZC Bio-Science & Scienze Technology CoCN8053-B40T
Buffer di diluizione del campioneZona Civile di Pechino ZC Bio-Science & Scienze Technology CoSP7065

References

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  1. Morrissey, C. O., et al. Aspergillus fumigatus—a systematic review to inform the World Health Organization priority list of fungal pathogens. Med Mycol. 62 (6), 6(2024).
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PCR DetectionFluorescent ProbeAspergillus SppCryptococcus NeoformansPneumocystis JiroveciiMultiplex Real Time PCRNucleic Acid ExtractionClinical Sputum SamplesCycle ThresholdInternal Control

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