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Articolo metodologico

Preparazione degli occhi suini per la microscopia a riflettanza confocale per visualizzare la rete di fibre di collagene vitreo

648 visualizzazioni

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DOI:

10.3791/68823

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17 ottobre 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Utah, 2Department of Biomedical Engineering, University of Utah, 3Department of Chemistry, University of Utah, 4Department of Mechanical Engineering, University of Utah

In questo articolo

Sommario

Questo metodo visualizza la struttura nativa delle fibre di collagene nel corpo vitreo utilizzando la microscopia a riflettanza confocale.

Abstract

Il vitreo è un gel trasparente che riempie lo spazio tra il cristallino e la retina. La sua struttura è supportata da una rete di fibre di collagene, che probabilmente influenza le proprietà viscoelastiche e contribuisce alla malattia della retina. Tuttavia, l'organizzazione di questa rete di collagene rimane scarsamente caratterizzata perché l'imaging del vitreo nel suo stato nativo è impegnativo. Molte tecniche di imaging applicate al vitreo causano disidratazione e distorsione e i metodi basati sui coloranti possono introdurre artefatti o marcature non specifiche, rendendo difficile lo studio della rete di collagene. In questo protocollo, delineiamo: 1) un metodo per sezionare gli occhi suini per l'imaging; 2) una strategia per il montaggio degli occhi su un microscopio invertito; 3) linee guida per l'imaging della rete di collagene vitreo nel suo stato nativo mediante microscopia a riflettanza confocale; e 4) istruzioni per l'analisi quantitativa delle immagini delle caratteristiche della rete. Evidenziamo le insidie comuni e sottolineiamo i punti tecnici chiave. Riportiamo l'applicazione della microscopia a riflettanza confocale al vitreo. Rispetto alle precedenti strategie di imaging del vitreo, questo approccio preserva la struttura, l'orientamento e la distribuzione nativi delle fibre di collagene vitreo senza coloranti esogeni o artefatti di disidratazione. La microscopia a riflettanza confocale può sondare le basi strutturali della rigidità del gel vitreo in salute e malattia.

Introduzione

Il vitreo è la matrice extracellulare tra il cristallino e la retina nell'occhio. La trazione dal vitreo sulla retina svolge un ruolo importante nella perdita della vista in malattie come il distacco della retina, il foro maculare e la trazione vitreomaculare 1,2,3,4. La capacità del vitreo di trasmettere forze di trazione alla retina è determinata dalla rigidità del suo gel, che a sua volta dipende dalle proprietà dei suoi componenti principali, il collagene e l'acido ialuronico5. La rigidità del gel del vitreo è probabilmente influenzata dalle caratteristiche della rete di fibre di collagene, poiché la rigidità dei gel di collagene artificiale è guidata da caratteristiche della rete come la densità, l'allineamento e la larghezza delle fibre6.

La rete di fibre di collagene vitreo è difficile da visualizzare a causa dell'elevato contenuto di acqua e della bassa concentrazione di collagene7, che porta a una distorsione artefattuale durante l'elaborazione per la microscopia o la microscopia elettronica a trasmissione. L'istologia tradizionale e la microscopia elettronica a trasmissione richiedono l'elaborazione per indurire il vitreo per il sezionamento sottile. La disidratazione richiesta per l'inclusione istologica provoca l'aggregazione delle fibre vetrose in una configurazione a nido d'ape8 e la formazione di cristalli di ghiaccio durante il congelamento aumenta la dimensione dei pori nella matrice extracellulare9. L'inclusione in plastica8 e il congelamento rapido10 sono stati applicati al vitreo per ridurre al minimo gli artefatti, anche se probabilmente rimangono alcuni artefatti residui. La microscopia a contrasto di fase è una metodica che non richiede il sezionamento ed è stata applicata al vitreo, ma richiede la rimozione di un piccolo pezzo di vitreo dall'occhio, perdendo così la posizione e l'orientamento originali della rete11. Più recentemente, la microscopia quantitativa a luce polarizzata è stata utilizzata per mappare l'orientamento medio delle fibre attraverso un occhio suino grossolanamente sezionato, ma non è stato possibile risolvere le singole fibre12. Inoltre, gli approcci di marcatura basati su coloranti (ad esempio, blu di tripano, rosso picrosirio, 5-(4,6-diclorotriazinil) amminofluoresceina) possono introdurre artefatti o marcature non specifiche e sono stati quindi evitati per preservare la rete di collagene nativa.

Abbiamo adottato il metodo di preparazione del campione utilizzato da Filas et al. per lo studio della microscopia a luce polarizzata, cioè la dissezione macroscopica in un blocco di agarosio12, e abbiamo ripreso il campione utilizzando la microscopia a riflettanza confocale, che non è stata precedentemente applicata al vitreo. Utilizzando questo metodo, abbiamo acquisito immagini della rete di fibre di collagene vitreo in uno stato idratato e quasi fisiologico. Ciò offre numerosi vantaggi rispetto ai metodi precedenti, tra cui la riduzione degli artefatti rispetto agli approcci basati sulla crio-frattura o sulla disidratazione10,13. Questo protocollo richiede un microscopio confocale invertito con un obiettivo a immersione di almeno 30x di ingrandimento, un'apertura numerica maggiore di 0,9 e una distanza di lavoro superiore a 200 μm. Includiamo una guida chiave per la preparazione del campione e l'acquisizione delle immagini per facilitare la chiara risoluzione delle fibre. Mantenendo uno stato quasi nativo della matrice di collagene vitreo, questo approccio consente ai ricercatori di analizzare quantitativamente l'orientamento delle fibre, la densità e i parametri di distribuzione spaziale che sono probabilmente cruciali per comprendere la rigidità vitreale e i suoi cambiamenti patologici. Questa tecnica è particolarmente indicata per i ricercatori interessati alla rete di collagene vitreo, alla sua struttura e alla patogenesi delle malattie vitreoretiniche.

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Protocollo

1. Preparazione e dissezione dei tessuti

NOTA: Questa ricerca è stata condotta in conformità con le linee guida istituzionali. Presso il nostro istituto, non era richiesta l'approvazione del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali per eseguire esperimenti su occhi suini ex vivo .

  1. Ottenere occhi suini ex vivo da un impianto di lavorazione della carne. Utilizzare gli occhi entro 48 ore dalla morte.
    NOTA: Sebbene l'aspetto vitreo non cambi con un tempo post-mortem più lungo, la retina e la coroide si degradano, portando alla dispersione di detriti cellulari e pigmentati durante la dissezione. Questi detriti possono interferire con l'imaging e l'analisi delle fibre.
  2. Rimuovere i muscoli e il tessuto connettivo in eccesso dal globo.
  3. Posizionare il piedistallo a tre punte sulla base di uno stampo a cubetti, come uno stampo per cubetti di ghiaccio in silicone extra-large (Figura 1A e Figura 2).
  4. Posiziona il globo sul piedistallo a tre punte, posizionandolo in modo che il limbus poggi sui rebbi.
  5. Prepara un gel di agarosio al 3% aggiungendo 3 g di agarosio per uso generico a 100 ml di acqua distillata e poi riscaldando la soluzione fino a quando non si è sciolta. Una volta che la soluzione si è raffreddata a circa 37 °C, versarla nello stampo fino a quando l'occhio non è immerso nell'agarosio.
    NOTA: Questo incorporerà l'occhio in gel di agarosio per stabilizzare l'occhio per la dissezione.
  6. Raffreddare il cubetto di agarosio per almeno 4 ore.
    NOTA: Questo aumenta l'adesione del gel all'occhio e garantisce che l'occhio rimanga immobile durante la dissezione
  7. Dopo l'abbattimento, togliere il cubetto di agarosio dallo stampo. Quindi, rimuovere il piedistallo dal cubo (Figura 1B).
  8. Costruisci una cornice a tre lati delle stesse dimensioni del cubo di agarosio usando una combinazione di mattoncini, piastre e tessere Lego 1 x 8 (Figura 3).
    NOTA: Questo fisserà il cubo in posizione e fornirà una guida per la lama durante la dissezione. L'altezza della cornice Lego determinerà la posizione in cui verrà tagliato l'occhio. Questo può essere visualizzato attraverso il gel di agarosio semitrasparente.
  9. Posiziona il cubo di agarosio raffreddato nella cornice Lego. Tieni una lama per microtomo ad alto profilo per i bordi smussati e allinea la lama con la parte superiore del telaio Lego. Applicare una leggera pressione verso il basso sulla parte superiore del cubo e trascinare delicatamente la lama del microtomo avanti e indietro attraverso l'intero cubo e l'occhio incorporato (Figura 1C).
    NOTA: Questo creerà una sezione di tessuto oculare che è incorporata nell'agarosio, che sarà indicata come "calotta oculare".

2. Campione di montaggio per l'imaging

  1. Utilizzando la lama del microtomo, tagliare circa 1 mm di agarosio dall'intera superficie di taglio del cubo (Figura 4A).
    NOTA: Questo lascerà una piccola sezione di calotta oculare che si estende sopra la superficie tagliata del cubo di agarosio
  2. Usa una salvietta di fazzoletti o una piccola spugna di cellulosa triangolare per asciugare la superficie tagliata del cubo di agarosio, specialmente vicino al bordo della calotta oculare.
  3. Aggiungi circa un cucchiaino di mastice siliconico multiuso a un piccolo sacchetto di plastica per sandwich e taglia un foro di 3 mm in uno degli angoli inferiori del sacchetto per creare una sac à poche per il mastice.
  4. Utilizzando la sac à poche, applicare un sottile cordone di mastice sulla superficie tagliata del cubo di agarosio, proprio lungo il bordo della calotta oculare, creando un bordo impermeabile attorno al campione (Figura 4B). Ciò impedirà al gel vitreo di fuoriuscire dal cappuccio oculare.
  5. Posizionare un grande vetrino coprioggetti sopra la calotta oculare e premere verso il basso in modo che la superficie tagliata della calotta oculare sia a contatto con il vetrino coprioggetti senza intrappolare aria o liquidi (Figura 4C). Verificare che il cordone di silicone effettui una tenuta continua con il vetrino coprioggetti.
    NOTA: Se il mastice siliconico non forma una tenuta continua, il fluido vetroso potrebbe fuoriuscire e consentire all'aria di entrare nel campione. L'esposizione all'aria causerà il restringimento del vitreo, risultando in fibre più luminose e dense, nonché in un'area liquida senza fibre. Se il vitreo non è a contatto con il vetrino coprioggetti, sarà difficile da visualizzare.
  6. Tenendo in mano il cubo di agarosio, capovolgere il campione e posizionarlo sul grande adattatore del vetrino coprioggetti per l'imaging su un microscopio invertito (Figura 4D e Figura 5).

3. Acquisizione delle immagini

  1. Utilizzare un microscopio confocale invertito che non sia del tipo a disco rotante. Utilizzare un obiettivo ad acqua (con acqua o gel lubrificante oculare come accoppiatore) o un obiettivo a olio con un'apertura numerica di almeno 0,90, un ingrandimento compreso tra 30x e 60x e una distanza di lavoro di almeno 200 μm.
  2. Regolare le impostazioni del percorso della luce per il microscopio confocale per ottenere immagini di riflettanza. Al posto dello specchio dicroico utilizzato per reindirizzare la luce eccitante e trasmettere la luce emessa per l'imaging a fluorescenza, assicurarsi che ci sia uno specchio a divisione del fascio che reindirizza una parte del laser illuminante e trasmette una parte della luce riflessa.
    NOTA: Il segnale di riflettanza delle fibre di collagene vitreo è piuttosto debole, quindi il rumore di fondo può influire sulla capacità di visualizzare le fibre. È stato osservato un miglioramento del rapporto segnale/rumore con una lunghezza d'onda di 473 nm, ma siamo stati in grado di visualizzare le fibre di collagene vitreo con lunghezze d'onda comprese tra 405 nm e 635 nm.
  3. Impostare le lunghezze d'onda di rilevamento in modo che includano la lunghezza d'onda del laser illuminante.
  4. Per orientare la posizione Z all'interno del campione, ridurre la potenza del laser al livello più basso possibile e identificare il lampo di luce riflessa dal vetrino coprioggetti. Ciò accadrà nella parte inferiore e superiore del vetrino coprioggetti (Figura 6).
    NOTA: Vicino al vetrino coprioggetti, c'è un notevole segnale riflettente sullo sfondo. Lontano dal vetrino coprioggetti, il segnale della luce riflessa dalle fibre di collagene diminuisce.
  5. Regolare la posizione z in modo che si trovi sopra la parte superiore del vetrino coprioggetti e all'interno del campione.
  6. Aumentare la potenza del laser a un livello superiore a quello normalmente utilizzato per un'applicazione di fluorescenza.
    NOTA: C'è un artefatto ad anello riflettente che si troverà al centro del campo di imaging. Una combinazione di ingrandimento e decentramento del campo di imaging può aiutare a escludere questo artefatto (Figura 7).
  7. Utilizzare la media delle linee e aumentare il tempo di permanenza dei pixel nelle impostazioni di acquisizione delle immagini, che sono metodi standard per aumentare il rapporto segnale/rumore nei microscopi confocali.

4. Analisi delle immagini della larghezza delle fibre con CT-FIRE 14

  1. Installa CT Fire seguendo le istruzioni su questo sito web: https://github.com/uw-loci/curvelets/wiki/Downloads-and-Installation-(CTF).
    NOTA: Le versioni utilizzate qui erano "CT-FIRE V3.0 BetaWindows64-2018b" e il runtime MATLAB, "MCR-2018b-win64". Entrambi devono essere scaricati affinché il software funzioni.
  2. Converti le immagini in tif a 8 bit e apri le immagini tif a 8 bit in CT-FIRE.
  3. Assicurati che il software sia impostato su CT-Fire nell'angolo in alto a destra, quindi seleziona Esegui.
  4. CT-FIRE caricherà automaticamente i risultati dell'analisi in una cartella denominata "ctfireout" situata nella stessa cartella dell'immagine originale. Esamina la qualità dell'estrazione confrontando il file che inizia con il nome "OL_ctFIRE" con l'immagine originale. Per seguire questo protocollo, utilizzare le seguenti impostazioni predefinite per la segmentazione dell'immagine (ad esempio, l'identificazione delle fibre): thresh_im2: 5; s_xlinkbox: 8; thresh_ext: 70; thresh_dang_L: 15; thresh_short_L: 15; s_fiberdir: 4; thresh_linkd: 15; thresh_linka: -150; thresh_flen: 15
    1. Se le fibre non sono identificate con precisione, regolare i parametri facendo clic sul pulsante Aggiorna nella sezione dei parametri nell'angolo in alto a destra.
      NOTA: Le indicazioni su come regolare i parametri si trovano a pagina 20 nella sezione "3 note" del manuale CT-FIRE, che si trova nella cartella dell'applicazione CTFIRE. Ulteriori suggerimenti possono essere trovati nell'articolo di Liu et al. nella sezione 3.5.215.
  5. Se lo si desidera, regolare le impostazioni di output per limitare le fibre che appaiono sulle immagini di output. Per seguire questo protocollo, utilizzare le seguenti impostazioni predefinite: Lunghezza minima della fibra [pixel]: 30; Immagine [dpi]: 300; Larghezza della linea in fibra [0-2]: 0,5; Larghezza massima della fibra [pixel]: 15
  6. Per convertire le unità di larghezza da pixel a μm, apri l'immagine originale nelle Figi. Utilizzare le dimensioni dell'immagine che appaiono sia in pixel che in μm nell'angolo in alto a sinistra della finestra di visualizzazione per calcolare un rapporto.

5. Analisi delle immagini di densità delle fibre, curvatura, allineamento, lacunarità, unità di crescita ifali e dimensione frattale utilizzando TWOMBLI16

  1. Scarica TWOMBLI da https://github.com/wershofe/TWOMBLI.
  2. Segui le istruzioni nel file: TwombliDocumentation sotto "Installazione e dipendenze".
  3. Aprire la cartella TWOMBLI_v1/programmi e sostituire AnamorfProperties.xml file con AnamorfPropertiesEH.xml file (File supplementare 1).
  4. Nella cartella TWOMBLI_v1/programs sostituire il file Twombli_v1.ijm con il file Twombli_v2.ijm (file supplementare 2).
  5. Crea una cartella con cartelle vuote al suo interno chiamate "test HDM", "test masks", "HDM" e "masks".
  6. Converti le immagini in tif a 8 bit.
  7. Metti 3-5 immagini in una cartella "test set input".
  8. Metti tutte le immagini da analizzare in un'unica cartella senza sottocartelle chiamata "idonea".
  9. Nelle Figi, fai clic su Plugin | Macro | Corsa | scegli Twombli_v2.ijm in twombli/Programmi.
  10. Segui le istruzioni per eseguire TWOMBLI. Per seguire questo protocollo, utilizzare i seguenti parametri: Saturazione del contrasto, 0,35; larghezza minima della linea, 3; Larghezza massima della linea, 3; finestra di curvatura minima, 40; finestra di curvatura massima, 40; lunghezza minima del ramo, 10; Visualizzazione massima HDM, 100; Diametro minimo della fessura, 0
    NOTA: Potrebbe essere necessario regolare i parametri per le immagini. Il software guiderà l'utente nella scelta dei parametri e ulteriori istruzioni possono essere trovate nel file TwombliDocumentation.docx, fornito con il programma.

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Risultati

Un occhio di ciascuno dei tre giovani suini adulti (una femmina di 4 mesi, un maschio di 5 mesi e una femmina di 6 mesi) è stato ripreso dopo aver sezionato l'occhio su un piano assiale attraverso il limbus inferiore. Sei posizioni di imaging sono state acquisite nel piano di sezionamento X-Y, distanziate di 4 mm l'una dall'altra. In ogni posizione di imaging, è stata ottenuta una griglia contigua 4 x 4 di immagini da 70 μm x 70 μm (Figura 8). Per ogni suino, ogni immagine è stata analizzata...

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Discussione

I precedenti metodi di imaging del vitreo mostravano un'aggregazione artefattuale delle fibre13, perdita dell'organizzazione, dell'orientamento e della posizione delle fibre17, o si basavano su una risoluzione molto più elevata con un campo visivo più piccolo, limitando le informazioni sulla distribuzione delle fibre10. La microscopia a riflettanza confocale di tessuto fresco ex vivo, sezionato grossolanamente, forni...

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Dichiarazioni

Tutti gli autori non segnalano conflitti di interesse rilevanti.

Ringraziamenti

National Institutes of Health Core Grant EY014800; Sovvenzione illimitata dalla ricerca per prevenire la cecità, New York, NY, al Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive dell'Università dello Utah; NIH NEI K08 EY034549; Fondazione dell'Ospedale Pediatrico Primario; Fondazione E. Matilda Ziegler; Ringraziamo i dottori Guillaume L. Hoareau e M. Austin Johnson per gli occhi suini.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Agarose IVWR0710-500G
Silicone tuttofare 1 sigillatore, trasparenteGE2795576
Spugna di cellulosa (Weck-Cel Eye Spear)Beaver -Visitec000865
Piedistallo personalizzato a 3 poli  NANA
Adattatore personalizzato per montare grandi vetri a coperturaNANA
Vetro grande a copertura, 1,42" x  2,36" n.1Ted Pella260460-100
Lego (classica base plate, 1 x 8 piastrelle, 1 x 8 mattoni, 1 x 6 piatto)Lego11023, 3008, 3666, 4162
Lame microtome (alto profilo) & nbsp;Lieca Biosystems14035838926
Obiettivo in silicone Olympus UPlanSApo 30xOlimpoUPLSAPO30XS
Vassoio grande per cubetti di ghiaccio in silicone (Samuelworld)Amazzone713243280060
Salviette di tessuto (Kimwipes) e nbsp;Kimberly Clark34120

Riferimenti

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