Articolo metodologico

Studio del meccanismo della modulazione del LINC00511 mediata da β-elemene per sopprimere la resistenza al cisplatino nel carcinoma polmonare

DOI:

10.3791/68825

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19 agosto 2025

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1School of Pharmacy, Changchun University of Traditional Chinese Medicine, 2Health Care Department, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 3Teaching Department, The Third Affiliated Clinical Hospital of Changchun University of Chinese Medicine, 4The Research Center of The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 5Northeast Asia Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, 6Affiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine

In questo articolo

Sommario

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La resistenza al cisplatino (DDP) limita l'efficacia della chemioterapia nel carcinoma polmonare. Questo studio mirava a chiarire come β-Elemene(β-Ele) inverte la resistenza nelle cellule A549/DDP sottoregolando LINC00511. Le analisi in vitro e RNA-seq hanno dimostrato che questa regolazione inibisce la glicolisi aerobica e la segnalazione Wnt/β-catenina, offrendo una potenziale strategia per superare la chemioresistenza.

Abstract

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La resistenza al cisplatino limita significativamente l'efficacia della chemioterapia nel carcinoma polmonare non a piccole cellule, rendendo necessario lo sviluppo di nuove strategie per superare questa barriera. Questo studio in vitro mirava a chiarire il meccanismo attraverso il quale β-Ele inverte la resistenza al cisplatino nelle cellule di adenocarcinoma polmonare attraverso la glicolisi mediata da LINC00511 e le vie di segnalazione Wnt/β-catenina. La linea cellulare di adenocarcinoma polmonare umano resistente al cisplatino (A549/DDP), con sovraespressione LINC00511 o knockdown, è stata stabilita attraverso la trasfezione plasmidica. L'efficienza della trasfezione è stata valutata utilizzando la reazione a catena quantitativa della polimerasi trascrittasi inversa (qRT-PCR) per rilevare i livelli di espressione LINC00511. La valutazione tramite il test 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU) ha indicato una significativa inibizione mediata da β-Ele della proliferazione cellulare A549/DDP. Ulteriori analisi dell'RNA-seq hanno rivelato che l'effetto inibitorio del β-elemene sulla resistenza al cisplatino era strettamente associato all'interferenza della glicolisi cellulare e alla soppressione dell'attivazione della via di segnalazione Wnt/β-catenina. L'analisi Western blot di proteine chiave, tra cui il trasportatore del glucosio 1 (GLUT1), la piruvato chinasi M2 (PKM2), la lattato deidrogenasi A (LDHA), la β-catenina e la glicogeno sintasi chinasi 3β (GSK-3β), ha mostrato che β-Elemene ha invertito la resistenza al cisplatino inibendo la glicolisi aerobica e bloccando l'attivazione della via di segnalazione Wnt/β-catenina attraverso la sottoregolazione del LINC00511. Nel complesso, questi risultati dimostrano che β-Elemene supera la resistenza al cisplatino nel carcinoma polmonare prendendo di mira LINC00511 e la sua via associata alla glicolisi aerobica/Wnt/β-catenina. Ciò stabilisce un quadro teorico per le future indagini precliniche e cliniche, rivelando al contempo potenziali bersagli terapeutici.

Introduzione

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Tra i tumori maligni in tutto il mondo, il carcinoma polmonare mostra tassi di incidenza e mortalità eccezionalmente elevati, caratterizzati dalla trasformazione maligna e dalla crescita invasiva delle cellule epiteliali bronchiali 1,2. In base alle caratteristiche istopatologiche, il carcinoma polmonare è classificato come carcinoma non a piccole cellule (NSCLC) o carcinoma a piccole cellule (SCLC)3. Vale la pena ricordare che il NSCLC rappresenta circa l'85% dei casi totali di cancro al polmone 4,5. Come standard chemioterapico di prima linea per il NSCLC, il cisplatino (DDP) è clinicamente indispensabile6. Tuttavia, le osservazioni cliniche hanno rivelato che le cellule tumorali possono sviluppare resistenza ai farmaci attraverso molteplici meccanismi, che coinvolgono principalmente l'attivazione delle vie di fuga immunitaria, le mutazioni nei geni bersaglio dei farmaci e la disregolazione delle vie del metabolismo dei farmaci 7,8,9.

Gli RNA lunghi non codificanti (lncRNA) rappresentano trascritti > 200 nucleotidi (nt) privi di capacità di codifica delle proteine10. Prove crescenti indicano che lncRNA può invertire la resistenza al cisplatino nelle cellule tumorali attraverso molteplici meccanismi, come funzionare come RNA endogeni concorrenti (ceRNA) per spugnare i miRNA e rilasciare i loro geni bersaglio11, modulare le vie di segnalazione dell'apoptosi12, partecipare alla riparazione del danno al DNA13 e regolare l'autofagia cellulare14. Inoltre, con l'avanzare della ricerca sulla riprogrammazione metabolica tumorale, sono emerse prove sostanziali che dimostrano che gli lncRNA svolgono un ruolo regolatore critico in questo processo. L'effetto Warburg, che denota la glicolisi aerobica, costituisce una caratteristica metabolica fondamentale delle cellule maligne15. Non solo fornisce energia per una rapida proliferazione cellulare, ma genera anche metaboliti intermedi che fungono da precursori per la biosintesi, supportando la sintesi di proteine e lipidi per soddisfare le esigenze della crescita dei tumori maligni16. Nel carcinoma polmonare, è stato confermato che l'lncRNA influenza significativamente la progressione tumorale e la resistenza alla chemioterapia regolando la via della glicolisi aerobica17,18.

Tra questi, è stato riportato che LINC00511, una molecola di lncRNA ampiamente studiata negli ultimi anni, è strettamente associata all'inizio e allo sviluppo di vari tumori maligni19. Questi risultati non solo chiariscono i meccanismi specifici del coinvolgimento degli lncRNA nella riprogrammazione metabolica del tumore, ma forniscono anche una base teorica per le strategie di trattamento del tumore mirate agli lncRNA, aprendo potenziali strade terapeutiche.

Derivato dai rizomi della Curcuma zedoaria, β-Ele è un sesquiterpenoide bioattivo con un'efficacia antitumorale consolidata. I nostri studi precedenti hanno dimostrato che β-Ele funge da inibitore selettivo della via di segnalazione PI3K/Akt/mTOR e produce un effetto sinergico con il cisplatino mirando al metabolismo tumorale. Ha soppresso significativamente la crescita tumorale nel modello di xenotrapianto di topo NSCLC20. Indagini successive dimostrano la capacità di β-Ele di attenuare la glicolisi aerobica nelle cellule NSCLC attraverso la modulazione dell'asse di segnalazione miR-301a-3p/AMPKα, con conseguenti esiti oncostatici21. Sulla base dei nostri risultati precedenti, abbiamo confermato che LINC00511 attenua la resistenza al cisplatino nel cancro del polmone; Tuttavia, l'esatto meccanismo molecolare d'azione deve ancora essere completamente chiarito.

Considerando il ruolo fondamentale della glicolisi aerobica nella riprogrammazione metabolica tumorale e il ruolo critico della LINC00511 nello sviluppo e nella progressione tumorale, questo studio mira a indagare se β-Ele può invertire la resistenza al cisplatino nel carcinoma polmonare modulando la via della glicolisi aerobica mediata da LINC00511.

Prove precedenti indicano che β-Ele può invertire la resistenza al cisplatino e migliorare i suoi effetti antitumorali attivando le vie apoptotiche22, regolando la secrezione di esosomi23 e arrestando il ciclo cellulare24. Tuttavia, questi meccanismi noti mostrano tipicamente effetti ampi e mancano di una regolazione precisa di specifici bersagli molecolari, limitando così la loro traducibilità clinica. Pertanto, vi è un urgente bisogno di esplorare nuove strategie che siano più mirate, abbiano meccanismi ben definiti e dimostrino un forte potenziale di traduzione clinica per superare la resistenza al cisplatino. In contrasto con ricerche precedenti che sottolineavano le azioni biologiche immediate di β-Ele, questo studio caratterizza l'impatto di β-Ele sul metabolismo di Warburg e sulla via di segnalazione Wnt/β-catenina nelle cellule A549/DDP attraverso la regolazione delle vie molecolari mediate da lncRNA, con l'obiettivo di chiarire un nuovo meccanismo alla base della sua inversione della chemiosensibilizzazione nel cancro del polmone. Questo articolo non solo svela un nuovo approccio per β-Ele per invertire la chemioresistenza prendendo di mira lncRNA, ma fornisce anche una nuova base teorica e potenziali obiettivi di intervento per la gestione clinica del cancro del polmone. Questi risultati, attraverso la loro dettagliata delucidazione di uno specifico bersaglio molecolare (LINC00511) e delle principali vie di segnalazione (Warburg e Wnt/β-catenina), dimostrano un potenziale traslazionale clinico significativamente migliorato. Si prevede che forniscano una solida base scientifica per migliorare la sensibilità alla chemioterapia nei pazienti con carcinoma polmonare e migliorare la loro qualità di vita, nonché per far progredire lo sviluppo di strategie di trattamento di precisione per il cancro del polmone.

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Protocollo

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1. Preparazione del solvente

  1. Preparazione della soluzione del terreno per le cellule A549/DDP: Coltivare le cellule A549/DDP nel terreno completo F-12K di Ham (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli), integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS, vedere la Tabella dei materiali per i dettagli), la soluzione di penicillina-streptomicina all'1% (P/S, vedere la Tabella dei materiali per i dettagli) e 2 μg/mL di cisplatino (DDP, vedere la Tabella dei materiali per i dettagli).
    1. Preparazione della soluzione di terreno completo: Preparare una soluzione di terreno completo aggiungendo 50 mL di FBS e 5 mL di P/S a 500 mL di terreno F-12K di Ham, seguito da un'accurata miscelazione.
    2. Preparazione della soluzione completa del terreno contenente cisplatino: pesare 1 mg di polvere di cisplatino (DDP, vedere la tabella dei materiali per i dettagli) e scioglierla in 1 ml di acqua distillata doppia (ddH2O) per preparare la soluzione madre. Aggiungere 200 μl della soluzione madre a 100 mL di terreno completo (preparato secondo la fase 1.1.1) e mescolare accuratamente per preparare una soluzione di lavoro di terreno completo contenente 2 μg/mL di cisplatino.
      NOTA: Poiché il cisplatino è una sostanza citotossica, eseguire tutte le procedure in una cappa aspirante o in una cabina di biosicurezza e indossare dispositivi di protezione come guanti, camici da laboratorio e occhiali.
  2. Soluzione per la somministrazione di β-Ele: La concentrazione del farmaco utilizzata in questo studio si basava sui risultati di precedenti esperimenti condotti dal nostro team di ricerca20,21. Sciogliere 1 mg di β-Ele (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli) in 20 μL di dimetilsolfossido (DMSO, vedere la Tabella dei materiali per i dettagli) per preparare la soluzione madre. Diluire la soluzione madre a 25 mL utilizzando un terreno completo per ottenere una soluzione di lavoro β-Ele da 40 μg/mL.
    NOTA: Poiché il DMSO può migliorare l'assorbimento di altre sostanze attraverso la pelle, eseguire tutte le fasi operative in una cappa aspirante o in una cabina di biosicurezza e indossare dispositivi di protezione come guanti, indumenti da laboratorio e occhiali.

2. Coltura cellulare 

  1. Utilizzare la linea cellulare resistente al cisplatino dell'adenocarcinoma polmonare umano (A549/DDP, Procell, vedere la Tabella dei materiali per i dettagli) in questo studio. Verificare che questa linea cellulare sia stata identificata mediante analisi di ripetizione tandem breve (STR) e abbinata con successo ai lignaggi standard in ATCC e in altri database.
    1. Per il metodo di analisi STR, raccogliere circa 1 x 106 cellule ed estrarre il DNA genomico utilizzando un kit di estrazione del DNA commerciale (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli).
    2. Utilizzare un sistema STR multiplex convalidato adatto alla tipizzazione del DNA per amplificare 20 loci STR insieme al locus che determina il genere. Eseguire l'amplificazione PCR nelle seguenti condizioni di cicli termici: denaturazione iniziale a 95 °C per 2 minuti, seguita da 29 cicli di denaturazione a 94 °C per 30 s, ricottura a 59 °C per 45 s ed estensione a 72 °C per 45 s, con una fase di estensione finale a 72 °C per 10 min.
    3. Analizza i prodotti PCR risultanti tramite elettroforesi capillare utilizzando un analizzatore genetico automatizzato secondo le istruzioni del produttore. In questo caso, la tipizzazione degli alleli è stata condotta utilizzando un software di analisi dei frammenti (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli), con una soglia di rilevamento del picco impostata a 150 unità di fluorescenza relativa (RFU).
      NOTA: Il profilo STR a 20 locus generato è stato confrontato con i profili di riferimento delle linee cellulari A549/DDP disponibili nei database pubblici. Un tasso di corrispondenza superiore all'80% è stato considerato indicativo di omologia. L'assenza di picchi allelici estranei ha ulteriormente confermato l'assenza di contaminazione crociata.
  2. Recuperare le celle dall'azoto liquido e metterle in un bagno d'acqua a 37 °C per un rapido scongelamento fino a quando il liquido non sarà completamente sciolto. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 5 mL, aggiungere due volumi di soluzione di terreno completo e risospendere delicatamente la miscela. Dopo la centrifugazione (358 × g, 5 min, temperatura ambiente), scartare accuratamente il surnatante.
    NOTA: Quando si utilizzano provette per crioconservazione cellulare da azoto liquido, indossare guanti antigelo e occhiali protettivi o una maschera facciale e non essere rivolti verso la bocca della provetta.
  3. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno completo con pipettaggio delicato, quindi diluire la sospensione a 10 mL aggiungendo 9 mL di terreno completo. Seminare le cellule in piastre di coltura cellulare da 100 mm e coltivarle in un incubatore (vedere la tabella dei materiali per i dettagli) a 37 °C e 5% di CO2. Il rapporto di passaggio delle cellule è stato mantenuto tra 1:2 e 1:3.
    NOTA: Il cisplatino è un farmaco chemioterapico a base di platino con citotossicità. In questo metodo, le cellule A549/DDP vengono coltivate con terreno contenente cisplatino. Pertanto, raccogliere il terreno di coltura dei rifiuti contenente cisplatino in uno speciale barile di liquidi di scarto e inviarlo regolarmente all'azienda di trattamento dei rifiuti pericolosi per lo smaltimento professionale.

3. Trasfezione plasmidica 

  1. Utilizzare un costrutto plasmidico per la sovraespressione LINC00511 e un LINC00511 di targeting siRNA gene-specifico (ID gene: 400619; ID trascrizione: NR_033876.1) per la trasfezione cellulare. Le sequenze di siRNA utilizzate sono fornite nella Tabella 1.
Sequenze di siRNA
NomeSenso 5'-3'Antisenso 5'-3'
LINC00511-Homo-1625
CAGCUGUGAACUUCCUUUATT
UAAAGGAAGUUCACAGCUGTT

Tabella 1: elenco delle sequenze di siRNA

  1. Selezionare in modo casuale le cellule A549/DDP che sono state passate alla terza generazione dopo la rianimazione e inocularle uniformemente in piastre a 6 pozzetti a una densità di 1 x 105 cellule/pozzetto. Ogni pozzetto è stato numerato in modo casuale e i pozzetti sono stati assegnati a gruppi sperimentali in base a questi numeri casuali.
  2. Trasfettare le cellule utilizzando un reagente di trasfezione (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli) quando la loro densità raggiunge circa il 70%.
    1. Preparare la soluzione di trasfezione siRNA.
      1. Miscelare 250 μl di terreno minimo essenziale ottimizzato (Opti-MEM, vedere la tabella dei materiali per i dettagli) con 5 μl di reagente di trasfezione, agitare delicatamente 3-5 volte per garantire l'omogeneità e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
      2. Diluire 5 μL di siRNA (50 nM) in 250 μL di Opti-MEM, agitare delicatamente 3-5 volte per miscelare accuratamente. Combinare il reagente di trasfezione diluito con la soluzione di siRNA e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per formare il complesso di trasfezione siRNA.
    2. Preparare la soluzione di trasfezione plasmidica.
      1. Miscelare 250 μl di Opti-MEM con 5 μl di reagente di trasfezione, agitare delicatamente 3-5 volte per garantire l'omogeneità e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
      2. Diluire 2 μg di plasmide in 250 μl di Opti-MEM, agitare delicatamente 3-5 volte per garantire una miscelazione accurata. Combinare il reagente di trasfezione diluito con la soluzione plasmidica e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per preparare la soluzione di trasfezione plasmidica.
      3. Aggiungere rispettivamente la soluzione di trasfezione siRNA e la soluzione di trasfezione plasmidico alle piastre a 6 pozzetti. Aggiungere 1.500 μl di terreno completo a ciascun pozzetto. Mescolare delicatamente le piastre cellulari prima e dopo l'aggiunta per garantire una distribuzione uniforme. Incubare le piastre a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore dopo la trasfezione prima dell'analisi.

4. Rilevamento dell'efficienza di trasfezione mediante reazione a catena quantitativa della polimerasi trascrittasi inversa (qRT-PCR)

NOTA: Prelevare le cellule dopo la trasfezione per 24 ore al punto 3.3 per il rilevamento della qRT-PCR secondo la seguente procedura. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in tre repliche biologiche indipendenti (n = 3).

  1. Estrazione dell'RNA
    1. Utilizzare un kit di estrazione dell'RNA ultrapuro (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli). Gettare il terreno nella piastra a 6 pozzetti secondo le istruzioni del kit e lavare le celle con PBS. Successivamente, aggiungere 500 μl di soluzione reagente di lisi a base di fenolo-guanidina in ciascun pozzetto, soffiare delicatamente le cellule con la punta della pistola per sospenderle completamente e trasferire la miscela in una provetta da centrifuga. Lasciare agire per 5 minuti per garantire la completa lisi del campione cellulare.
    2. Aggiungere 100 μl di reagente di lisi isotiocianato fenolo-guanidina, agitare energicamente per 15 s e lasciare agire per 2 minuti a temperatura ambiente. Infine, aspirare con cura la fase acquosa superiore, trasferirla nella colonna di adsorbimento e centrifugare a 13.400 x g per 10 min a 4 °C.
    3. Legare l'RNA alla membrana del gel di silice. Lavalo con Buffer RW1 e Buffer RW2 per rimuovere le proteine. Successivamente, aggiungere DNasi I per digerire il DNA residuo ed eseguire un lavaggio secondario con il tampone RW2 per garantire la completa rimozione delle impurità. Infine, raccogliere campioni di RNA eluendo l'RNA con acqua priva di RNasi e centrifugando a 13.400 x g per 1 minuto.
  2. Misurare la concentrazione di RNA.
    1. Posizionare ogni 1,5 μL di soluzione di RNA campione in un rivelatore di acidi micronucleici (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli) e leggere i valori A260/A280.
      NOTA: Se i valori misurati di A260/A280 sono compresi tra 1,8 e 2,0 e la concentrazione di RNA è compresa tra 20 ng/μL e 200 ng/μL, ciò indica che la qualità dell'RNA è accettabile e può essere utilizzata per esperimenti successivi.
    2. Sulla base delle misurazioni, diluire la soluzione di RNA con acqua di dietil pirocarbonato (DEPC) per garantire concentrazioni costanti di RNA per tutti i campioni, utilizzando la concentrazione minima di RNA misurata come punto di riferimento, seguita da esperimenti di PCR.
  3. Trascrizione inversa dell'RNA
    1. Utilizzare l'RNA totale estratto come modello e sintetizzare il cDNA secondo le istruzioni del kit di trascrizione inversa (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli). Preparare il sistema di reazione in base ai requisiti del kit.
    2. Aggiungere la soluzione di RNA estratta e il sistema di reazione a un tubo a otto file e impostare due pozzetti di replica in ciascun gruppo. Iniziare la reazione con condizioni sequenziali: 15 minuti di incubazione a 37 °C, 5 s di denaturazione termica a 85 °C, 5 minuti di raffreddamento a 4 °C.
  4. Reazione PCR
    1. Condurre l'amplificazione PCR su un sistema di PCR quantitativa a fluorescenza in tempo reale (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli) utilizzando la master mix PCR premiscelata a base di SYBR Green (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli). Utilizzare GADPH come gene di riferimento, con le sequenze di primer elencate nella Tabella 2, e preparare la miscela di reazione come segue: aggiungere in sequenza 0,4 μL del primer corrispondente, 2 μL di stampo di cDNA e la miscela di reazione in una provetta a otto pozzetti per ottenere il volume finale di reazione.
    2. Eseguire l'amplificazione PCR: 95 °C 30 s (1 ciclo), 95 °C 5 s (40 cicli), 60 °C 20 s (40 cicli). Calcolare i livelli di espressione relativi dei geni bersaglio utilizzando il metodo 2 -ΔΔCt 25. Ripeti in modo indipendente tutti gli esperimenti tre volte per garantire l'affidabilità dei dati.
      NOTA: I rifiuti chimici generati durante le procedure sperimentali devono essere raccolti in appositi contenitori per rifiuti pericolosi e smaltiti da servizi certificati di gestione dei rifiuti pericolosi in conformità con le politiche istituzionali.
Sequenze di primer
AbbecedarioSequenza(5'-3')
umano-LINC00511-FTTTCCCAGCACAGCTCAATC
umano-LINC00511-RTCCCTTCTCCCTCGGTCA
GAPDH-FAATCCCATCACCATCTTCCA
GAPDH-RAAATGAGCCCCAGCCTTCT

Tabella 2: Sequenze di primer per saggi PCR

5. Rilevamento EdU

  1. Valutare l'effetto dell'espressione LINC00511 alterata sulla proliferazione delle cellule A549/DDP utilizzando un kit di saggi EdU (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli).
    1. Selezionare in modo casuale le cellule A549/DDP che sono state passate alla terza generazione dopo la rianimazione e inocularle uniformemente in piastre a 24 pozzetti a una densità di 2 x 104 cellule/pozzetto.
      NOTA: Qui, tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in tre repliche biologiche indipendenti (n = 3).
    2. Numera casualmente ogni pozzetto e assegna i pozzetti a uno dei quattro gruppi sperimentali in base a questi numeri casuali: gruppo di controllo, gruppo β-Ele, gruppo β-Ele + LINC00511 overexpression (β-Ele + OV-LINC00511) e gruppo β-Ele + LINC00511 knockdown (β-Ele + si-LINC00511).
  2. Quando la densità cellulare raggiunge circa il 70%, eseguire la trasfezione plasmidica e il trattamento di interferenza secondo il passaggio 3.3. Dopo 24 ore di trasfezione, scartare il terreno originale e aggiungere 1 mL di soluzione di terreno contenente β-Ele (40 μg/mL) a ciascun pozzetto del gruppo di trattamento farmacologico.
  3. Incubare le cellule con EdU per la marcatura dopo averle trattate con 40 μg/mL di β-Ele per 24 ore. Quindi fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 10 minuti e permeabilizzarle con Triton X-100 allo 0,5%.
  4. Aggiungere la soluzione di reazione click (preparata sciogliendo una fiala del reagente Click Additive fornito in kit in 1,3 mL di acqua deionizzata con un'accurata miscelazione) al buio e mantenere la reazione al buio per 30 minuti. Lavare le cellule con PBS al termine della reazione, quindi colorare con Hoechst per 5 minuti. Infine, osservare i risultati utilizzando la microscopia a fluorescenza (Figura 1 e Figura 2).
    NOTA: Il DMSO è un liquido altamente permeabile e infiammabile. In questo schema, la soluzione di amministrazione β-Ele contiene DMSO. Pertanto, dopo l'uso, raccogliere la soluzione per la somministrazione di β-Ele in uno speciale fusto di liquidi di scarto e consegnarla regolarmente all'azienda di trattamento dei rifiuti pericolosi per lo smaltimento professionale.

6. Rilevamento del contenuto di glucosio 

NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in tre repliche biologiche indipendenti (n = 3).

  1. Selezionare in modo casuale le cellule A549/DDP che sono state passate alla terza generazione dopo la rianimazione e inocularle uniformemente in piastre a 6 pozzetti a una densità di 1 x 105 cellule/pozzetto. Numera casualmente ogni pozzetto e assegna i pozzetti a gruppi sperimentali in base a questi numeri casuali.
  2. Quando la densità cellulare raggiunge circa il 70%, procedere con la trasfezione e l'interferenza plasmidica come descritto nel passaggio 3.3. Dopo 24 ore di trasfezione, trattare le cellule dei gruppi trattati con 40 μg/mL di β-Ele.
  3. Dopo 24 ore di trattamento farmacologico, raccogliere il terreno di coltura superiore dalle cellule e centrifugarlo a 1000 × g per 5 minuti. Raccogli il surnatante. Secondo le istruzioni contenute nel kit per il test del glucosio (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli), preparare la soluzione di reazione e mescolarla accuratamente con il surnatante.
  4. Posizionare i campioni in piastre da 96 pozzetti con cinque pozzetti di replica per gruppo. Agitare delicatamente le piastre e incubarle a 37 °C per 10 minuti. Misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto utilizzando un lettore di micropiastre a una lunghezza d'onda di 505 nm e calcolare il contenuto di glucosio utilizzando la formula fornita nel kit di test:
    figure-protocol-1
    Qui, Cstandard = 5,55 mmol/L, N = fattore di diluizione.
    NOTA: I rifiuti chimici generati durante le procedure sperimentali devono essere raccolti in appositi contenitori per rifiuti pericolosi e smaltiti da servizi certificati di gestione dei rifiuti pericolosi in conformità con le politiche istituzionali.

7. Rilevamento del contenuto di acido lattico 

NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in tre repliche biologiche indipendenti (n = 3).

  1. Selezionare in modo casuale le cellule A549/DDP che sono state passate alla terza generazione dopo la rianimazione e inocularle uniformemente in piastre a 6 pozzetti (1 × 105 cellule/pozzetto). Numera casualmente ogni pozzetto e assegna i pozzetti a gruppi sperimentali in base a questi numeri casuali. Quando la densità cellulare raggiunge circa il 70%, procedere con la trasfezione e l'interferenza plasmidica come descritto nel passaggio 3.3. 24 ore dopo la trasfezione, trattare le cellule dei gruppi trattati con 40 μg/mL di β-Ele.
  2. Dopo 24 ore di trattamento farmacologico, raccogliere il terreno di coltura superiore dalle cellule e centrifugarlo a 1000 x g per 5 minuti. Raccogli il surnatante. Secondo le istruzioni contenute nel kit per il test dell'acido lattico (vedere la tabella dei materiali per i dettagli), preparare la soluzione di reazione e mescolarla accuratamente con il surnatante.
  3. Aggiungere un totale di 250 μl di campione a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, impostando cinque pozzetti di replica per ciascun gruppo. Agitare delicatamente la piastra e incubarla a 37 °C per 10 minuti. Misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a una lunghezza d'onda di 530 nm utilizzando un lettore di micropiastre (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli) e calcolare il contenuto di lattato utilizzando la formula fornita nel kit di test:
    figure-protocol-2
    Qui, Cstandard = 3 mmol/L, N = fattore di diluizione.
    NOTA: I rifiuti chimici generati durante le procedure sperimentali devono essere raccolti in appositi contenitori per rifiuti pericolosi e smaltiti da servizi certificati di gestione dei rifiuti pericolosi in conformità con le politiche istituzionali.

8. RNA-seq di massa

  1. Creare un database di esempio
    1. Selezionare le celle A549/DDP per l'esperimento e dividerle nei seguenti gruppi: gruppo di controllo, gruppo DDP, gruppo β-Ele (40 μg/mL) + DDP (48 μM), gruppo β-Ele+ DDP + OV-LINC00511 e gruppo β-Ele + DDP + si-LINC00511. Includi 3 campioni in ogni gruppo.
    2. Estrarre l'RNA totale da ciascun gruppo cellulare. Utilizzare un kit di isolamento dell'mRNA basato su biglie magnetiche (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli) per arricchire l'mRNA eucariotico, in cui le perle rivestite di Oligo(dT) si legano selettivamente alle code di poli(A) dell'mRNA tramite l'accoppiamento di basi A-T. Aggiungere un tampone di frammentazione (1 μL/μg di RNA, vedere la Tabella dei materiali per i dettagli) e incubare a 94 °C per 7 minuti per frammentare l'mRNA in segmenti corti.
    3. Procedere con la sintesi del cDNA del primo filamento utilizzando primer esamero casuali secondo le istruzioni del produttore. Per la sintesi del cDNA del secondo filamento, aggiungere quantità appropriate di tampone di reazione, RNasi H e DNA polimerasi I per completare il processo.
    4. Eseguire la riparazione finale e l'A-tailing su cDNA a doppio filamento mediante incubazione a 25 °C per 30 minuti (fine riparazione), immediatamente seguita da 72 °C per 30 minuti (A-tailing). Adattatori di sequenziamento Ligate ai frammenti riparati all'estremità.
    5. Purificare e selezionare le dimensioni dei prodotti legati utilizzando perle di silice magnetica modificata con carbossile (vedere la tabella dei materiali per i dettagli). Infine, costruire la libreria di sequenziamento mediante amplificazione PCR.
    6. Dopo la preparazione del campione, analizzare la libreria di sequenziamento sulla piattaforma DNBSEQ-T7 (per i dettagli, vedere la Tabella dei materiali ). Caricare il campione su un chip di microarray Patterned Array per il sequenziamento.
      NOTA: Lo strumento ha raccolto, letto e identificato i segnali ottici utilizzando un sistema di imaging ad alta risoluzione per determinare le informazioni sulla sequenza delle singole basi. Successivamente, eseguire ulteriori cicli di sequenziamento per ottenere la sequenza delle basi successive. Dopo più cicli, sono stati generati i dati grezzi di sequenziamento.
  2. Analisi bioinformatica
    1. Sequenziare i campioni sulla macchina per ottenere i dati grezzi, noti anche come dati esterni alla macchina. Inoltre, elaborare i dati di sequenziamento utilizzando fastp (v 0.21.0). Rimuovi le letture contenenti sequenze di adattatori da 3' ed elimina le letture di bassa qualità con un punteggio di qualità medio inferiore a Q20 come parte dei criteri di filtraggio primari. Conduci tutte le analisi a valle sulla base di dati puliti e di alta qualità.
      NOTA: Eseguire il filtraggio iniziale dei dati di sequenziamento utilizzando fastp. Fare riferimento alla documentazione ufficiale per i set di dati trascrittomici (https://github.com/OpenGene/fastp#rna-seq-processing) per i parametri specifici della riga di comando.
    2. Utilizzare FastQC (v 0.12.0) per valutare la qualità dei dati di sequenziamento puliti. I requisiti di qualità sono i seguenti: almeno il 90% delle basi deve avere un punteggio di qualità superiore a Q20 e la percentuale delle sequenze di adattatori rimanenti non deve superare l'1%. I dati che soddisfano questi criteri sono considerati qualificati e possono essere utilizzati per l'analisi a valle.
      NOTA: Valutare la qualità dei dati di sequenziamento puliti utilizzando FastQC, seguendo le linee guida ufficiali (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/).
  3. Analisi dell'espressione genica
    1. Utilizzare il software DESeq2 per eseguire l'analisi dell'espressione differenziale tra i due gruppi di confronto.
      1. Innanzitutto, inserisci i dati nel software per costruire un DESeq DataSet. Quindi, filtrare i geni con una conta totale inferiore a 10 in tutti i campioni.
      2. Infine, condurre l'analisi genica differenziale ed estrarre i risultati. Le condizioni per lo screening dei geni differenzialmente espressi sono le seguenti: il cambiamento di piega nell'espressione |log2FoldChange| > 1 e la significatività padj ≤ 0,05.
        NOTA: Per le fasi operative dettagliate del software DESeq2, fare riferimento ai passaggi dettagliati sul sito Web ufficiale: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html.

9. Rilevazione delle variazioni del livello di espressione proteica mediante Western blot (WB) 

NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in tre repliche biologiche indipendenti (n = 3).

  1. Eseguire il Western blotting per quantificare i livelli di espressione proteica cellulare.
    1. Selezionare in modo casuale le cellule A549/DDP che sono state passate alla terza generazione dopo la rianimazione e inocularle uniformemente in piastre a 6 pozzetti a una densità di 1 x 105 cellule/pozzetto.
    2. Numera casualmente ogni pozzetto e assegna i pozzetti a uno dei sei gruppi sperimentali in base a questi numeri casuali: Control, β-Ele, OV-LINC00511, si-LINC00511, β-Ele + OV-LINC00511 e β-Ele + si-LINC00511.
    3. Quando la densità cellulare raggiunge circa il 70%, eseguire la trasfezione e l'interferenza plasmidica come descritto nel passaggio 3.3. Dopo 24 ore di trasfezione, esporre il gruppo di trattamento a β-Ele (40 μg/mL), fornendo al contempo terreno fresco al gruppo di controllo. Cultura entrambi i gruppi per ulteriori 24 ore.
    4. Successivamente, raccogliere i pellet cellulari mediante centrifugazione a 1675 × g per 5 min. Lisi ogni gruppo di cellule con 500 μL di tampone di lisi RIPA contenente 1 mM di PMSF su ghiaccio per 30 minuti (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli).
  2. Centrifugare i lisati cellulari a 13.400 × g per 10 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante. Misurare le concentrazioni proteiche utilizzando il kit per il dosaggio della concentrazione proteica BCA (per i dettagli, vedere la Tabella dei materiali ). Separare quantità uguali di campioni proteici con SDS-PAGE al 10% e trasferirli su membrane di fluoruro di polivinilidene (PVDF) tramite elettroforesi.
  3. Immergere le membrane in una soluzione bloccante (latte scremato al 5%/soluzione salina tamponata con Tris-tampone con Tween-20 allo 0,1% (TBST)) per 2 ore a temperatura ambiente e incubarle per una notte a 4 °C con anticorpi primari contro GLUT1, PKM2, LDHA, β-catenina, GSK-3β (1:1000) e β-actina (1:2000, vedere la Tabella dei materiali per i dettagli).
    1. Il giorno successivo, lavare le membrane tre volte con TBST, 5 minuti ciascuna, a temperatura ambiente con agitazione delicata.
  4. Il giorno successivo, incubare le membrane con soluzioni di anticorpi secondari (HRP-marcate con capra anti-coniglio IgG, 1:2000) e agitare delicatamente a temperatura ambiente per 1 ora.
  5. Infine, aggiungere 0,1 mL/cm2 di soluzione cromogenica ECL disponibile in commercio per coprire completamente le membrane in PVDF. Incubare per 1 minuto a temperatura ambiente prima dell'esposizione. Visualizza e analizza le bande utilizzando un sistema di chemiluminescenza avanzato (vedi Tabella dei materiali per i dettagli). Fare riferimento alla Figura 4C e alla Figura 5B.
    NOTA: I rifiuti chimici generati durante le procedure sperimentali devono essere raccolti in appositi contenitori per rifiuti pericolosi e smaltiti da servizi certificati di gestione dei rifiuti pericolosi in conformità con le politiche istituzionali.

10. Analisi statistica 

NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in tre repliche biologiche indipendenti (n = 3).

  1. Organizzare i dati sperimentali per gruppo e inserirli nel software GraphPad Prism (versione 8.0.2; vedere la tabella dei materiali per i dettagli). Eseguire la visualizzazione dei dati e l'analisi della significatività statistica in conformità con le linee guida del software. I dati di misurazione sono stati espressi come media ± deviazione standard. Le differenze statistiche tra i gruppi sono state valutate utilizzando l'ANOVA unidirezionale con il calcolo della dimensione dell'effetto di η² (eta-quadrato), seguito dal test di confronto multiplo26 di Tukey. Considera **P < 0,01 come statisticamente significativo.

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Risultati

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β-Ele sopprime significativamente la proliferazione delle cellule A549/DDP

In questo esperimento, le concentrazioni di somministrazione di β-Ele e DDP sono state determinate sulla base dei risultati dei nostri studi precedenti20,21. Le cellule A549/DDP sono state trattate con β-Ele, da solo o in combinazione con DDP, per analizzarne l'impatto sulla chemi...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio si è concentrato sulla questione clinica critica della resistenza al cisplatino nel carcinoma polmonare. Il cancro del polmone, responsabile del più alto numero di decessi per cancro a livello globale, continua ad avere un tasso di sopravvivenza a cinque anni inferiore al 20%29,30. Il cisplatino, come pietra angolare dei farmaci chemioterapici a base di platino, è un agente antitumorale efficiente e ad ampio spettro...

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Dichiarazioni

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Tutti gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

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Il finanziamento per questo studio è stato fornito dalla Fondazione provinciale di scienze naturali di Jilin nell'ambito del premio n. YDZJ202401058ZYTS.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Celle A549/DDPProcellaCL-0519URL:https://www.procell.com.cn/p/a549-ddp--cl-0519
Un banco da lavoro eccezionalmente pulitoSuzhou Antai AirtechSW-CJ-2FDURL:http://www.sz-antai.com
Kit per il dosaggio della concentrazione di proteine BCADistretto di SolarbioPC0020URL:https://www.solarbio.com
Centrifuga da bancoTermoPico17URL:https://www.thermofisher.com
Camera per coltura cellulareTermo3111URL:https://www.thermofisher.com
Piatto per coltura cellulareBIOFILTCD000100URL:http://www.biofil.com.cn
Analizzatore di chemiluminescenzaStrumenti Qinxiang4300URL:https://www.clinx.cn/about_us
CisplatinoAladdinC295225-250 mgURL:https://www.aladdin-e.com/
Strumento di sequenziamento genico DNBSEQ-T7MGI Tech CO., LtdT7URL:https://www.mgitech.cn/
EasyPure  Kit DNA Micro GenomicoTransGen BiotechEE181-01URL:https://www.transgen.com/
Soluzione cromogenica ECLDistretto di SolarbioPE0010URL:https://www.solarbio.com
Kit di rilevamento EDUBeyotimeC0071SURL:https://www.beyotime.com
Strumento marcato con enzimiAttrezzatura per legareHBS-1096AURL:https://www.detiebio.cn/
Siero fetale bovino FBS)CLARKFB15015URL:https://zn.clarkbio.com/
Buffer Frag/Prime YeasenCodice 11277ESURL:https://www.yeasen.com/products/detail/2151
GeneMapper  Software  6TermoVersione 6Software per l'analisi dei frammenti. URL:https://www.thermofisher.cn/   
Piattaforma GenReaderBeijing Yuewei Gene Technology Co., Ltd.https://yyigou.com/product/detail/0000037250.htmlAnalizzatore genetico automatizzato utilizzato per l'elettroforesi capillare
Kit per il test del glucosioJiancheng BioA154-1-1URL:http://www.njjcbio.com
GLUT1 Anticorpo policlonaleGruppo Proteintech21829-1-APURL:https://www.ptglab.com
Prisma GraphPadGraphPad SoftwareVersione 8.0.2URL:https://www.graphpad.com
GSK-3β AnticorpoAffinitàAF5016URL:https://www.affbiotech.com
F-12K di HamProcellaPM150910URL:https://www.procell.com.cn/
Perline di selezione del DNA Hieff NGSYeasenCodice 12601ESURL:https://www.yeasen.com/products/detail/939
Kit master per l'isolamento dell'mRNA HieffNGSYeasenCodice 12603ZHURL:https://www.yeasen.com/products/detail/1119
HRP marcato capra anti-coniglio IgGServicebioGB23303URL:https://www.servicebio.cn
Kit di test del lattatoJiancheng BioA019-2-1URL:http://www.njjcbio.com
Anticorpo policlonale specifico per LDHAGruppo Proteintech19987-1-APURL:https://www.ptglab.com
Cycler di luce 96RocheLC96URL:https://lifescience.roche.com
Lipofectamina 2000Invitrogen11668-019URL:https://www.thermofisher.com/invitrogen
Opti-MEMGibco31985-070URL:https://www.thermofisher.com/gibco
Penicillina-streptomicina (P/S)BiosharpBL505AURL:https://www.biosharp.cn/
Anticorpo policlonale specifico per PKM2Gruppo Proteintech15822-1-APURL:https://www.ptglab.com
PMSF BeyotimeST506URL:https://www.beyotime.com
Kit di reagenti PrimeScript RT (Perfect Real Time)TakaraRR037AURL:https://www.takarabio.com
Lisato di RIPABeyotimeP0013BURL:https://www.beyotime.com
Piattaforma di sequenziamentoBGIDNBSEQ-T7URL:https://www.bgi.com/global
TB Premix Verde Ex TaqTakaraRR420AURL:https://www.takarabio.com
Tester di acidi nucleici in tracceStrumento AoshengNano-100URL:http://www.hzaosheng.com
TRIzon PaICanvax BiotecnologieCW0597SURL:https://www.canvaxbiotech.com
TripsinaBiosharpBL501AURL:https://www.biosharp.cn/
Kit di RNA ultrapuro (DNasi I)Canvax BiotecnologieCW0597SURL:https://www.canvaxbiotech.com
Anticorpo β-actinaGruppo Proteintech60008-1-IgURL:https://www.ptglab.com
β-catenina Anticorpo AffinitàDF6794URL:https://www.affbiotech.com
β-ElemeneSigma63965-25MGURL:https://www.sigmaaldrich.com

Riferimenti

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