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Articolo metodologico

Perfezionamento della produzione di ribosomi grezzi e PURE di OnePot per una sintesi proteica riproducibile senza cellule

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DOI:

10.3791/68826

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22 agosto 2025

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1Centre for Engineering Biology, Institute of Quantitative Biology, Biochemistry and Biotechnology, School of Biological Sciences, University of Edinburgh, 2Biophoundry Inc.

In questo articolo

Sommario

Presentiamo un protocollo aggiornato per la produzione del sistema OnePot "Protein synthesis Using Recombinant Elements" (PURE) e di ribosomi grezzi per la sintesi proteica cell-free, concentrandosi sul controllo della crescita cellulare per ridurre al minimo le variazioni da lotto a lotto.

Abstract

I recenti progressi hanno permesso di produrre in singoli laboratori il sistema privo di cellule PURE (Protein synthesis Using Recombinant Elements) in modo economico e con un carico di lavoro ridotto. Tuttavia, la preparazione dei 36 componenti proteici e del ribosoma, che compongono PURE, è ancora un'impresa complessa, con molto margine di variazione ed errore. Presentiamo una procedura dettagliata e aggiornata per la produzione di PURE basata sul protocollo OnePot recentemente pubblicato, che prevede la regolazione di una serie di passaggi chiave, in particolare, l'inoculazione delle colture utilizzando scorte di glicerolo normalizzate per densità ottica (OD), un attento monitoraggio della crescita cellulare e il controllo delle concentrazioni finali di glicerolo. Utilizzando questo approccio, riportiamo preparazioni riproducibili di PURE da più repliche biologiche e utilizzatori. Questo protocollo funge da punto di riferimento e di partenza per altri laboratori per la produzione e la risoluzione dei problemi dei propri sistemi PURE, aumentando così la democratizzazione delle numerose applicazioni che PURE consente, come la costruzione dal basso verso l'alto di sistemi biomolecolari e lo sviluppo di cellule sintetiche.

Introduzione

La sintesi proteica libera da cellule (CFPS) è maturata come tecnologia per diverse applicazioni, tra cui la bioproduzione, il biorilevamento e la diagnostica, la prototipazione di parti e percorsi genetici e metabolici, l'ingegneria rapida delle proteine e l'istruzione 1,2. I sistemi CFPS che utilizzano componenti purificati, originariamente sviluppati come sistemaPURE (Protein synthesis Using Recombinant Elements) 3, offrono una serie di vantaggi rispetto alle loro alternative a base di lisato. I sistemi PURE hanno una composizione definita, costituita da 36 fattori proteici, il ribosoma di E. coli 70S e una miscela definita di substrati chimici tra cui nucleosidi trifosfati (NTP), amminoacidi e tRNA, che possono essere adattati a piacimento all'applicazione richiesta. Sono quindi molto adatti a studi come l'incorporazione di amminoacidi non canonici, la modellazione meccanicistica e la costruzione dal basso verso l'alto di sistemi biomolecolari e cellule sintetiche1. Sebbene PURE sia disponibile presso i fornitori commerciali, il suo costo (0,34-1,63 dollari per reazione da 1 μL) è proibitivo per la sperimentazione su larga scala; e la strategia alternativa di produrre PURE internamente è stata finora ostacolata da protocolli ad alta intensità di lavoro che coinvolgono la purificazione parallela di 36 proteine e ribosomi4, che sono difficili da eseguire in modo robusto e riproducibile, in particolare per gli utenti inesperti.

I recenti sviluppi hanno favorito la produzione artigianale di PURE. Ad esempio, Wang et al. hanno ingegnerizzato ceppi di E. coli per includere tag di esa-istidina genomicamente integrati sul macchinario di traduzione, facilitando una purificazione in un unico passaggio5. I geni che codificano per tutte le proteine PURE sono stati assemblati in un piccolo numero di plasmidi, che sono stati utilizzati in modo simile per ridurre il lavoro di purificazione6. Villareal et al. hanno ingegnerizzato eleganti consorzi di ceppi PURE, che bilanciano l'espressione al fine di produrre proteine al rapporto corretto, consentendo allo stesso tempo la purificazione in un unico passaggio7.

L'innovativo sistema OnePot PURE sviluppato da Lavickova et al. è molto promettente per la facilità d'uso 8,9. In questo sistema, i ceppi originali di PURE vengono co-coltivati e purificati tramite un'unica fase cromatografica. Sebbene non sia possibile definire con precisione la composizione del sistema PURE risultante, gli autori hanno dimostrato che più lotti del sistema sono ampiamente riproducibili e che un livello di controllo grossolano può essere raggiunto variando il volume di inoculazione di ciascun ceppo. Il compromesso tra un controllo preciso della composizione e la facilità di produzione è accettabile per molti utenti, dato che la resa complessiva della sintesi proteica del sistema OnePot è simile a quella ottenuta commercialmente. Tuttavia, sebbene esistano protocolli dettagliati per il sistema OnePot, è stato difficile riprodurre completamente i risultati di Lavickova et al. in altri laboratori. Ad esempio, sono stati osservati instabilità del vettore di espressione, ceppi a crescita lenta e proteolisi10.

In questo lavoro, presentiamo un protocollo OnePot PURE dettagliato e perfezionato, che controlla la crescita cellulare utilizzando scorte di glicerolo standardizzate e aggiustamenti dei terreni, fornisce indicazioni sul monitoraggio della crescita e dell'OD del raccolto e normalizza la quantità di glicerolo nella purificazione finale. In secondo luogo, presentiamo una procedura ottimizzata di purificazione del ribosoma grezzo utilizzando solo l'ultracentrifugazione differenziale, che bilancia il compromesso tra l'attività del ribosoma e il costo e la complessità di metodi più sofisticati.

Sebbene ciò introduca più passaggi nel protocollo OnePot, consente all'utente una maggiore opportunità di risolvere i problemi della procedura in modo più approfondito, se necessario, nonché di modificarla in base alle proprie esigenze. Dimostriamo la riproducibilità del processo mostrando più repliche biologiche eseguite da più utenti nello stesso laboratorio. Riteniamo che il controllo sia dei componenti PURE che della preparazione dei ribosomi sia fondamentale per garantire elevate prestazioni CFPS del sistema.

La preparazione di PURE e del ribosoma richiede rispettivamente 4 o 5 giorni e può essere eseguita in sequenza da un utente o contemporaneamente da due utenti. La preparazione PURE prevede 4x500 mL di coltura liquida, ciascuna delle quali produce ~2 g di pellet cellulare e ~1 mL di proteine PURE a una concentrazione di ~15 mg/mL. La preparazione dei ribosomi prevede 4 × 500 mL = 2 L di coltura liquida, portando a un totale di ~3 g di pellet cellulare e producendo ~1 mL di ribosomi grezzi a una concentrazione di ~17 μM. L'attuale protocollo produce sistemi PURE con rese di sintesi fino a ~100 μg/mL GFP o ~130 μg/mL di mCherry in 2 ore di reazione batch11, che si confronta favorevolmente con l'originale OnePot e con i sistemi commerciali (~140-160 μg/mL)8,12. Pertanto, è un punto di partenza adatto per un'ulteriore ottimizzazione attraverso l'integrazione o la modulazione di componenti sensibili come sali, agenti di affollamento e singoli fattori proteici.

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Protocollo

Il protocollo è diviso in tre parti. Per motivi di concisione e chiarezza, sottolineiamo gli importanti cambiamenti specifici di questo lavoro, e quindi si fa riferimento a dettagli che sono gli stessi esistenti in altre pubblicazioni.

I lavori preliminari devono essere eseguiti una sola volta. Le quattro sezioni prevedono la preparazione di stock di glicerolo e piastre di avviamento per le proteine PURE, nonché la verifica e la misurazione dei tempi di espressione dei ceppi. L'uso di piastre di avviamento elimina la variabilità associata all'inoculazione diretta da scorte di glicerolo raschiate. È fondamentale assicurarsi che questo lavoro sia svolto a fondo prima di procedere alla fase di produzione. A causa dell'elevato numero di diversi stock di glicerolo coinvolti nella preparazione di PURE, è essenziale verificare l'integrità e l'espressione del plasmide di ogni ceppo prima di tentare di produrre il sistema.

Uno schema del flusso di lavoro è fornito nella Figura 1 e un calendario consigliato nella Tabella 1. I materiali richiesti e le fasi in cui vengono utilizzati sono riportati nella Tabella dei materiali e lo schema dei buffer e dei mezzi necessari in ogni fase è riassunto nella Figura S1 supplementare.

1. Lavori preliminari

  1. Generazione di scorte di glicerolo
    NOTA: Tutti i plasmidi sono disponibili da Addgene.
    1. Generare il 25% p/v di scorte di glicerolo di tutti i ceppi elencati nella Tabella 2, seguendo le procedure standard9, e conservare in crioviali a -80 °C.
  2. Preparazione delle piastre di avviamento PURE (durante la notte)
    1. Preparare 20 mL di terreno LB integrati con 100 μg/mL di ampicillina (LB+AMP).
    2. Etichettare 36 provette sterili per microcentrifuga da 1,5 mL da #1 a #36.
    3. Aggiungere 500 μl di LB+AMP in ciascuna provetta. Inoculare ogni provetta con il ceppo corrispondente utilizzando una punta di pipetta per raschiare una piccola quantità dal brodo di glicerolo originale. Assicurarsi che le scorte di glicerolo non si scongelino. Vortice per mescolare accuratamente.
    4. Aliquotare 300 μl da ciascuna provetta inoculata nel pozzetto corrispondente di una piastra sterile da 1 mL 96 a pozzetti profondi seguendo lo schema mostrato nella Figura 2.
      NOTA: In tutte le fasi successive che coinvolgono le targhe, mantenere la stessa disposizione delle piastre per tutto il tempo.
    5. Incubare la piastra per una notte in un agitatore per piastre a 37 °C, 1.000 giri/min per 15 ore.
    6. Il giorno successivo, preparare 25 mL di terreno LB integrati con 100 μg/mL di ampicillina (LB+AMP) e 15 mL di glicerolo sterile al 50% (v/v).
    7. Trasferire 30 μl di ciascuna coltura dalla piastra a pozzetti profondi sul fondo di una piastra ottica a 96 pozzetti, utilizzando una pipetta multicanale. Aggiungere 270 μl di terreno LB+AMP in ciascun pozzetto contenente le colture, per ottenere una diluizione 10 volte superiore di ciascuna coltura.
    8. Misurare il diametro esterno600 di ciascuna coltura utilizzando un lettore di piastre. Calcolare il volume di ciascuna coltura necessario per inoculare 650 μL di LB+AMP fresco a un ODiniziale di 600 di 0,2. Un foglio di calcolo per facilitare i calcoli viene fornito come Tabella supplementare S1.
    9. Preparare tre nuove piastre sterili da 1 mL 96 a pozzetti profondi. In una piastra, aggiungere 650 μL di LB+AMP a 36 pozzetti e inoculare ogni pozzetto con il volume calcolato di coltura notturna per ottenere OD600 = 0,2.
    10. Trasferire 300 μl di coltura inoculata in ciascuna delle altre due piastre. Una piastra sarà la coltura e l'altra sarà utilizzata per monitorare l'OD. Incubare le due piastre in un agitatore per piastre a 37 °C, 1000 RPM, fino a quando le colture raggiungono OD600 ~ 1 (~1,5-2 h). Monitorare l'OD a 1 ora, e poi di nuovo secondo necessità, rimuovendo campioni da 30 μl dalla seconda piastra e aggiungendoli a 270 μl di LB+AMP per una diluizione 10x.
    11. Quando i singoli pozzetti raggiungono OD600 ~ 1, rimuoverli dall'agitatore. Aggiungere un volume uguale di glicerolo sterile al 50% (v/v) a ciascuna coltura per ottenere una concentrazione finale di OD600 = 0,5 in glicerolo al 25%. Mescolare accuratamente e conservare questi tubi sul ghiaccio. Questi sono i ceppi di lavoro principali.
    12. Aliquotare un massimo di 40 μl di ogni master stock in piastre PCR a 96 pozzetti, mantenendo il modello originale dei pozzetti. Distribuire nel maggior numero possibile di piatti in base alla capacità di stoccaggio. Sigillare con le guarnizioni della piastra di alluminio e conservare queste piastre di avviamento PURE a -80 °C.
      NOTA: Queste piastre di avviamento devono essere scongelate al massimo 3 volte. Sostituire con piastre nuove se si supera questo limite per mantenere l'integrità e la riproducibilità della deformazione.
  3. Determinazione dei tempi di crescita della coltura starter (durante la notte)
    1. Scongelare una piastra di avviamento PURE con ghiaccio.
    2. Aggiungere 50 μL di 100 mg/mL di ampicillina a 50 mL di terreno sterile LB in una provetta conica sterile (LB+AMP).
    3. Etichettare 36 provette sterili per microcentrifuga da 1,5 mL da #1 a #36 e aggiungere 1 mL di LB+AMP a ciascuna provetta.
    4. Aggiungere 10 μl di ciascuna delle scorte di glicerolo alla provetta etichettata corrispondente e mescolare bene agitando.
    5. Aggiungere 300 μl della coltura inoculata da ciascuna provetta nel pozzetto corrispondente di una piastra sterile da 1 mL a 96 pozzetti. Sigillare le piastre con un sigillo traspirante e incubare la piastra di coltura in un agitatore per piastre a 1000 giri/min, 37 °C. Determinare e registrare il tempo necessario alle colture per raggiungere OD600 ~ 2-3 senza superare OD600 = 3. Stabilire questo parametro prima di procedere.
      NOTA: Nel nostro laboratorio, questo richiede 15 ore.
  4. Prova di espressione di ceppi PURE
    1. Preparare 38 mL di terreno LB integrati con 100 μg/mL di ampicillina (LB+AMP), 10 mM di stock IPTG e 1x reagente per l'estrazione delle proteine.
    2. Scongelare una piastra di avviamento PURE con ghiaccio.
    3. Aggiungere 1 mL di LB+AMP a ciascuno dei 36 pozzetti di una piastra sterile da 2 mL 96 a pozzetti profondi. Inoculare ogni pozzetto con 20 μl della coltura starter corrispondente. Incubare la piastra in un agitatore per piastre a 1000 giri/min, 37 °C, per circa 1 ora, o fino a raggiungere OD600 = 2.
    4. Indurre l'espressione proteica aggiungendo 10 μL di 10 mM di IPTG a ciascun pozzetto, per una concentrazione finale di IPTG di 0,1 mM. Continuare l'incubazione per 3 ore a 1000 RPM, 37 °C.
    5. Al termine del periodo di espressione di 3 ore, trasferire 700 μL di ciascuna coltura in 36 provette sterili da microcentrifuga da 1,5 mL. Centrifugare a 20.000 × g per 10 min a 4 °C. Eliminare con cautela il surnatante.
    6. Risospendere ogni pellet in 70 μl di 1x reagente per l'estrazione delle proteine. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente con una leggera agitazione per consentire la lisi cellulare.
    7. Centrifugare lisati a 20.000 × g per 10 minuti a 4 °C per pellettare la frazione insolubile.
    8. Eseguire la purificazione His-tag su piccola scala di ciascuna proteina utilizzando biglie magnetiche Ni-NTA secondo le istruzioni del produttore.
    9. Analizzare le proteine purificate utilizzando SDS-PAGE per confermare l'espressione di ciascuna proteina e/o la contaminazione incrociata tra i ceppi9.
      NOTA: I ceppi che esprimono proteine mostreranno bande distinte su SDS-PAGE corrispondenti al peso molecolare atteso della proteina bersaglio. Se non vengono rilevate bande, il ceppo potrebbe non esprimere la proteina. In questi casi, isolare e sequenziare il plasmide per confermare l'identità e l'integrità della sequenza e, se necessario, sostituire il plasmide.

2. Purificazione delle proteine OnePot PURE (4 giorni)

NOTA: Una singola preparazione del sistema PURE richiede l'elaborazione di 500 mL di coltura liquida. Si consiglia di produrre contemporaneamente 4 preparazioni da 500 ml per produrre quattro lotti PURE indipendenti in un'unica corsa. Questi lotti possono poi essere quantificati in modo indipendente o, se necessario, combinati. Il protocollo di 4 giorni può essere ridotto a 3 giorni eseguendo la fase di incubazione della resina durante la notte, ma ciò comporta un lungo terzo giorno. Entrambe le opzioni sono descritte di seguito.

  1. Giorno 1: preparazione dei materiali e crescita delle colture starter
    1. Preparare le soluzioni madre e i tamponi per la preparazione PURE come descritto nella Tabella S2 e nella Figura S1.
      NOTA: Preparare i supporti e i buffer necessari immediatamente prima dell'esecuzione di ciascuna parte del protocollo e conservarli solo per il numero massimo di giorni prima dell'uso, come indicato.
    2. Scongelare una piastra di avviamento PURE con ghiaccio.
    3. Aggiungere 50 μL di 100 mg/mL di ampicillina a 50 mL di terreno sterile LB in una provetta conica sterile da 50 mL (LB+AMP).
    4. Etichettare 36 provette sterili per microcentrifuga da 1,5 mL da #1 a #36 e aggiungere 1 mL di LB+AMP a ciascuna provetta.
    5. Aggiungere 10 μl di ciascuna delle scorte di glicerolo alla provetta etichettata corrispondente e mescolare bene agitando.
      NOTA: Per monitorare facilmente l'inoculazione di ciascun ceppo, dopo aver aggiunto il ceppo a ciascuna provetta, espellere il puntale della pipetta nel pozzetto corrispondente della piastra di avviamento PURE. Ripeti questo processo per tutte le varietà. Una volta completati, rimuovere con cura i puntali della pipetta dalla piastra prima di richiudere con un foglio e nastro adesivo per autoclave e conservarli a -80 °C.
    6. Aggiungere 300 μl della coltura inoculata da ciascuna provetta nel pozzetto corrispondente di una piastra sterile da 1 mL a 96 pozzetti, ad eccezione del ceppo #25 (EF-Tu). Piastre di tenuta con una guarnizione traspirante. Incubare la piastra di coltura in un agitatore per piastre a 1.000 giri/min, 37 °C, per 14 ore.
    7. Aggiungere 1 mL di coltura inoculata dalla provetta #25 a 10 mL di LB in una provetta conica da 50 mL per preparare la coltura starter EF-Tu. Incubare la provetta in un'incubatrice a 260 giri/min, 37 °C per 14 ore.
      NOTA: Il ceppo #25, EF-Tu, è richiesto a una concentrazione molto più elevata rispetto agli altri componenti e viene quindi trattato separatamente, come descritto nel protocollo originale8.
    8. Mettere 2 L di terreno sterile 2x YTP in un flacone di vetro da 2 L e metterlo in un'incubatrice statica a 37°C per preriscaldare per una notte.
  2. Giorno 2: crescita e pellettatura
    1. Preparare i reagenti necessari:
      1. 2 L di 2 terreni sterili preriscaldati YTP (dal giorno 1)
      2. 2 mL di 100 mg/mL di ampicillina
      3. 100 mM IPTG, sterile
      4. 100 mL di PBS, sterile, ghiacciato
      5. 10 mL di terreno da libbra
    2. Trasferire 30 μl di ciascuna coltura starter dalla piastra di avviamento a pozzetti profondi e dalla provetta di avviamento EF-Tu sul fondo di una piastra ottica a 96 pozzetti, utilizzando una pipetta multicanale.
    3. Aggiungere 270 μl di terreno LB in ciascun pozzetto contenente le colture, per ottenere una diluizione 10x di ciascuna coltura.
    4. Misurare il diametro esterno600 di ciascuna coltura utilizzando un lettore di piastre. Tutti i ceppi dovrebbero essere a OD600 = 2-3.
      NOTA: Se una coltura è cresciuta oltre OD600 = 3, diluire a OD600 = 3 utilizzando 2x YTP+AMP (Tabella supplementare S1). La diluizione dei starter troppo cresciuti può richiedere molto tempo ed essere soggetta a errori. Pertanto, è consigliabile stabilire l'esatto tempo di incubazione necessario per raggiungere OD600 2-3 come descritto nella Sezione 1.3 dei lavori preliminari.
    5. Trasferire 500 mL di terreno preriscaldato 2x YTP e 500 μL di 100 mg/mL di ampicillina in un pallone sterile da 2,5 L (2x YTP+AMP).
    6. In una singola provetta conica sterile da 15 mL, aggiungere 55 μl di ciascuna coltura dalla piastra di coltura starter e 1675 μl della coltura EF-Tu. Mescolare bene a vortice.
      NOTA: Questa è la coltura OnePot che combina tutte le varietà PURE insieme. È in questa fase che i sistemi knockout (ΔPURE) possono essere creati tralasciando alcuni ceppi, oppure possono essere aggiunti altri componenti che richiedono la co-purificazione.
    7. Aggiungere il contenuto di questa provetta al pallone da 2,5 L contenente 500 mL di 2x YTP+AMP. Ripetere i passaggi 5-7 per ottenere 4x colture indipendenti.
    8. Incubare i matracci a 260 giri/min, 37 °C, per 1,5-2 ore, fino a OD600 = 0,2-0,3.
    9. Una volta raggiunto OD600 = 0,2-0,3, inoculare in ciascun pallone 500 μL di 100 mM IPTG, per una concentrazione finale di induzione di 0,1 mM IPTG.
    10. Incubare le colture per altre 3 ore a 260 giri/min, 37 °C.
    11. Durante l'incubazione, pesare ed etichettare quattro provette coniche sterili da 50 mL.
    12. Preraffreddare le centrifughe a 4 °C secondo necessità, quindi etichettare e preraffreddare quattro flaconi da centrifuga in polipropilene copolimero.
    13. Metti quattro bottiglie di vetro da 500 ml etichettate in un bagno di acqua ghiacciata.
    14. Al termine delle 3 ore di incubazione, decantare accuratamente ogni coltura in una bottiglia di vetro con ghiaccio per terminare la crescita.
      NOTA: Il trasferimento delle colture in bottiglie raffreddate è essenziale per arrestare rapidamente la crescita: posizionare le fiasche calde direttamente nel bagno di acqua ghiacciata non comporterà un'efficiente cessazione della crescita. Tutti i passaggi successivi vengono eseguiti sul ghiaccio, se non diversamente specificato.
    15. Aggiungere 250 mL di ciascuna coltura nelle corrispondenti bottiglie da centrifuga e centrifugare a 3.220 × g, 4 °C, per 10 minuti, mantenendo gli altri 250 mL nel bagno di acqua ghiacciata.
    16. Decantare accuratamente il surnatante e asciugarlo su carta assorbente.
    17. Aggiungere i restanti 250 ml di ciascuna coltura ai corrispondenti flaconi da centrifuga e centrifugare nuovamente a 3.220 × g, 4 °C, per 10 minuti.
    18. Decantare accuratamente il surnatante e asciugarlo su carta assorbente.
    19. Aggiungere 20 ml di PBS sterile ghiacciato in ciascun flacone da centrifuga e risospendere accuratamente il pellet cellulare.
    20. Trasferire ogni risospensione nelle provette coniche da 50 mL preparate.
    21. Centrifugare le provette a 2.000 × g, 4 °C, per 8 min.
    22. Rimuovere il surnatante decantando accuratamente.
    23. Centrifugare nuovamente le provette a 2.000 × g, 4 °C, per 2 minuti.
    24. Rimuovere il surnatante residuo mediante pipettaggio e mantenere i pellet cellulari sul ghiaccio.
    25. Ogni provetta contiene ora il pellet cellulare proveniente da una singola coltura da 500 mL. Pesare ogni tubo, calcolare la massa del pellet della cella (in genere, ~2 g) sottraendo il peso a vuoto di ciascun tubo e registrare.
    26. Agganciare i pellet delle celle di congelamento e conservarli a -80 °C fino alla lisi.
      NOTA: Opzionalmente, il protocollo può essere completato in 3 giorni, procedendo direttamente alla fase di lisi a questo punto.
  3. Giorno 3: lisi, purificazione e dialisi
    1. Preparare i reagenti necessari:
      1. Preparare 50 ml di tampone di risospensione.
      2. Preparare 0,5 m di TCEP.
    2. Scongelare i pellet di cella sul ghiaccio.
    3. Aliquotare 50 mL di tampone di risospensione in una provetta conica da 50 mL e aggiungere 100 μL di TCEP 0,5 M. Mescolare bene a vortice.
    4. Risospendere i pellet cellulari in tampone di risospensione + TCEP in un rapporto di 2 mL per 1 g di pellet cellulare. Vortice completamente per ririsospendere.
    5. Distribuire la risospensione cellulare in provette coniche da 50 mL in modo che ogni provetta abbia 5 mL di sospensione. Etichettare le provette come richiesto per tenere traccia delle 4 colture indipendenti. Conservare con ghiaccio.
    6. Lisi le cellule tramite sonicazione al 30% di ampiezza, 20s on, 20s off, per 10 cicli in un bagno di acqua ghiacciata utilizzando una sonda di sonicazione raffreddata (Figura 3A, B).
      NOTA: Circa 1000 J di energia devono essere trasferiti in ciascun tubo durante la sonicazione. Utilizzare un supporto sicuro per mantenere il tubo in posizione durante la sonicazione per garantire la coerenza del trasferimento di energia.
    7. Distribuire il lisato in provette sterili da microcentrifuga da 2 mL, in modo che ogni provetta contenga 1 mL di lisato. Ripetere i passaggi 2.3.6 e 2.3.7 per lisi tutte e quattro le lingue. I passaggi seguenti vengono eseguiti per 4 lisati in parallelo.
    8. Centrifugare a 15,923 × g, 4 °C, per 20 min.
    9. Durante la centrifugazione, lavare ed equilibrare 5 mL di resina per la purificazione delle proteine (preparare quattro colonne per i quattro lisati):
      1. Aggiungere 2 mL di resina per la purificazione di proteine fresche a una colonna per cromatografia a flusso gravitazionale.
      2. Lavare due volte la colonna con 30 ml di acqua distillata sterile per rimuovere l'etanolo di stoccaggio.
      3. Integrare 30 mL di tampone di risospensione con 60 μL di TCEP 0,5 M a una concentrazione finale di 1 mM.
      4. Poiché la colonna ha un volume di 30 mL, versare i tamponi direttamente nella colonna per riempirla. Assicurandosi che la valvola sia chiusa, equilibrare la colonna aggiungendo 30 mL di tampone di risospensione + TCEP.
      5. Aprire la valvola per consentire il passaggio di ~25 mL di tampone, prima di chiudere la valvola della colonna, lasciando ~5 mL di tampone sopra il letto di resina per evitare l'essiccazione. La colonna è ora pronta per l'uso.
    10. Dopo la centrifugazione, combinare tutto il surnatante chiarificato senza pellet di ciascuna coltura in 4 provette coniche fresche da 50 mL su ghiaccio.
    11. Risospendere la resina nei restanti 5 mL di tampone di risospensione + TCEP all'interno di ciascuna colonna e aggiungere tampone e resina in ciascuna delle provette coniche contenenti il surnatante del lisato.
    12. Chiudere e sigillare il coperchio con Parafilm e incubare in uno shaker girarrosto a 4 °C per 5 ore.
      NOTA: Se la lisi è stata eseguita immediatamente dopo la crescita, questo lisato può essere incubato con resina durante la notte.
    13. Preparare i reagenti necessari:
      1. Aggiungere TCEP a una concentrazione finale di 1 mM ai tamponi di lavaggio ed eluizione e conservare a 4 °C fino al momento dell'uso.
      2. Tenere pronto l'etanolo al 20% (v/v).
    14. Dopo l'incubazione, pulsare brevemente le provette in una centrifuga per raccogliere la resina sul fondo della provetta.
    15. Risospendere la resina utilizzando una pipetta e aggiungere nuovamente la resina nella colonna di purificazione delle proteine.
    16. Una volta che la resina si è depositata in un letto nella parte inferiore della colonna, lasciare scorrere il tampone.
      NOTA: Opzionalmente raccogliere il flusso e i lavaggi durante la purificazione delle proteine per l'analisi tramite SDS-PAGE per risolvere i problemi della procedura di purificazione
    17. Colonna di lavaggio con un volume di colonna di Wash Buffer + TCEP.
    18. Aggiungere 5 mL di tampone di eluizione + TCEP nella colonna, risospendere la resina alcune volte con una pipetta e incubare per 10 minuti.
    19. Dopo l'incubazione, raccogliere l'eluizione in una provetta da 5 ml etichettata e conservare in ghiaccio.
    20. Pulisci e conserva la resina per la purificazione delle proteine:
      1. Al termine dell'eluizione, lavare la colonna con 30 mL di tampone di eluizione per rimuovere le proteine legate rimanenti.
      2. Sciacquare la resina con 30 ml di acqua distillata sterile, ripetendo 3 volte.
      3. Far passare una volta 30 mL di etanolo al 20% (v/v) attraverso la colonna.
      4. Riempire la colonna con etanolo al 20% e sigillare con un coperchio o un parafilm. Conservare a 4 °C fino al prossimo utilizzo.
        NOTA: È necessaria solo la pulizia: non tentare di rimuovere il nichel dalla resina. La resina pulita è adatta per il riutilizzo nelle preparazioni standard del sistema PURE; tuttavia, per le varianti del sistema ΔPURE, utilizzare sempre resina fresca per evitare la contaminazione incrociata.
    21. Immergere una cassetta per dialisi da 15 ml da 2 kDa nel tampone HT (senza TCEP) per 10 minuti.
    22. Aggiungere 5 mL di soluzione proteica eluita nella cassetta per dialisi.
    23. Rimuovere quanta più aria possibile dalla cassetta prima di rimettere il coperchio.
    24. Dializzare 5 mL di proteina eluita contro 1 L di Buffer HT (senza TCEP) per 2 ore, seguiti da un ulteriore 1 L di Buffer HT fresco per una notte a 4 °C con agitazione delicata.
      NOTA: Se si combinano eluizioni da più purificazioni, è possibile dializzare fino a 10 mL di eluizione contro 2 L di Buffer HT per 2 ore, seguiti da ulteriori 2 L di Buffer HT durante la notte a 4 °C. Se l'incubazione della resina è stata eseguita durante la notte, la dialisi può essere eseguita durante il giorno utilizzando un protocollo di 2 ore seguito da 4 ore, seguito immediatamente dalle fasi di concentrazione proteica riportate di seguito.
  4. Giorno 4: concentrazione e conservazione
    1. Preparazione dei reagenti necessari:
      1. Preparare l'aggiornamento HT del buffer + TCEP.
      2. Prepara Stock-60 + TCEP.
    2. Dopo il completamento della dialisi, rimuovere 5 mL del campione dializzato dalla cassetta e distribuire 500 μL di aliquote in 5 provette sterili da microcentrifuga da 2 mL.
    3. Centrifugare per pellettare le proteine precipitate a 14.000 × g, 4 °C, per 10 minuti.
    4. Ricombinare il surnatante senza pellet e aggiungerlo a un'unità di filtro centrifugo MWCO da 3 kDa, quindi rabboccare il volume con 10 mL di Buffer HT Refresh + TCEP.
    5. Centrifugare a 3.220 × g, 4 °C, per 30 minuti OR fino a quando il volume del campione non si è ridotto a 1,5 mL.
      NOTA: La precipitazione delle proteine durante le fasi di concentrazione può ridurre significativamente le prestazioni complessive della CFPS. Dopo ogni ciclo di centrifugazione di 30 minuti, utilizzare una pipetta da 1 ml per risospendere il campione nella provetta del filtro centrifugo per rimuovere eventuali proteine precipitate dal fondo del filtro.
    6. Prelevare il campione dall'unità centrifuga e distribuire 500 μL di aliquote in 3 provette sterili da microcentrifuga da 2 mL.
    7. Centrifugare per pellettare le proteine precipitate a 14.000 × g, 4 °C, per 10 minuti.
    8. Ricombinare il surnatante senza pellet in una provetta da microcentrifuga sterile fresca con ghiaccio.
    9. Determinare la concentrazione di proteine in soluzione utilizzando un test Bradford, seguendo le istruzioni del produttore.
    10. Concentrare la soluzione proteica aggiungendola a un filtro MWCO fresco da 3 kDa e centrifugando a 14.862 × g, 4 °C, per 15 minuti O fino a raggiungere il volume del campione per ottenere una concentrazione finale di 25-30 mg/mL.
    11. Prelevare il campione dall'unità centrifuga e distribuire aliquote da 500 μL in provette sterili da microcentrifuga da 2 mL.
    12. Centrifugare per pellettare le proteine precipitate a 14.000 × g, 4 °C, per 10 minuti.
    13. Determinare la concentrazione proteica utilizzando un saggio di Bradford. Procedere alla fase successiva solo se la concentrazione è compresa tra 25 e 30 mg/mL.
    14. Ricombinare il surnatante senza pellet in una nuova provetta da microcentrifuga con ghiaccio.
    15. Aggiungere un volume uguale di Stock-60 + TCEP alla soluzione proteica concentrata e miscelare mediante pipettaggio delicato.
    16. Determinare la concentrazione proteica finale utilizzando un saggio di Bradford.
      NOTA: La proteina è ora in Buffer HT + 30% di glicerolo e qualsiasi diluizione aggiuntiva con Stock-30 non modifica la concentrazione di glicerolo.
    17. Se necessario, diluire il campione con Stock-30 + TCEP per ottenere una concentrazione finale di circa 12,5 mg/mL.
    18. Aliquotare la soluzione proteica PURE in provette PCR ad aliquote da 20 μL, congelare a scatto in azoto liquido e conservare a -80 °C.
      NOTA: È fondamentale determinare accuratamente la concentrazione proteica prima di aggiungere Stock-60, poiché la concentrazione di soluzioni proteiche contenenti glicerolo può comportare prestazioni di CFPS incoerenti, a causa di quantità variabili di glicerolo nella reazione finale di CFPS. Stock-60 deve quindi essere aggiunto solo dopo aver confermato che la concentrazione proteica rientra nell'intervallo ottimale di 25-30 mg/mL.

3. Preparazione del ribosoma grezzo (5 giorni)

NOTA: Il protocollo di purificazione dei ribosomi è stato ottimizzato per il trattamento di 2 L (4 fiasche da 500 mL) di coltura liquida, portando a un totale di ~3 g di pellet cellulare e producendo ~1 mL di ribosomi grezzi a una concentrazione di 15-24 μM.

  1. Giorno 1: preparazione e crescita delle colture starter
    1. Preparare le soluzioni madre e i tamponi per la preparazione del ribosoma come descritto nella Tabella S2 e nella Figura S1 Supplementare.
      NOTA: preparare i supporti e i buffer necessari immediatamente prima dell'esecuzione di ciascuna parte del protocollo e conservarli solo per il numero massimo di giorni prima dell'uso come indicato.
    2. Preparare due provette coniche da 50 mL: aggiungere 10 mL di terreno LB a una provetta e 5 mL di terreno LB all'altra.
    3. Rimuovere il brodo di glicerolo di BL21(DE3) dal congelatore a -80 °C e metterlo sul ghiaccio, assicurandosi che i passaggi successivi siano completati prima che il brodo si scongeli.
    4. Inoculare i 10 mL di terreno LB con un raschiamento delle cellule dallo stock di glicerolo, per creare una "mini-coltura" LB. Incubare a 37 °C, 220 giri/min, insieme all'altra provetta (non inoculata) per verificare la presenza di contaminazioni del terreno, poiché tutte le crescite vengono eseguite senza antibiotici.
    5. Riposizionare il brodo di glicerolo nel congelatore a -80 °C.
    6. Mettere 2,2 L di Terrific Brodo sterile (TB) in bottiglie di vetro sterili e conservare in un'incubatrice statica a 37 °C per preriscaldare durante la notte.
  2. Giorno 2: crescita e pellettatura
    1. Prima di procedere, rimuovere le colture dall'incubatore e assicurarsi che non vi siano contaminazioni nella provetta non inoculata o nel flacone del terreno preriscaldato.
    2. Preparare una diluizione 10x aggiungendo 100 μL della coltura di mini-coltura a 900 μL di LB in una cuvetta da 1 cm e misurare l'OD600 utilizzando uno spettrofotometro (verificare che sia ~4-6).
    3. Aggiungere 200 mL di TB pre-riscaldata a un pallone conico sterile da 500 mL e inoculare con un volume appropriato di mini-coltura per ottenere un OD iniziale600 = 0,05 (Tabella supplementare S1). Questa è la "cultura midi".
    4. Incubare la coltura midi a 37 °C, 220 RPM fino a OD600 = 1, che dovrebbe richiedere circa 1,5-2 ore.
    5. Aggiungere 500 mL di TB a ciascuno dei 4 palloni sterili da 2,5 L con deflettore. Inoculare ciascuno di essi con un volume appropriato di midi coltura per ottenere un OD iniziale600 = 0,05 (Tabella supplementare S1). Queste sono le 4 'maxi-culture'.
    6. Incubare le maxi-colture a 37 °C, 220 RPM fino a OD600 = 0,7-0,8, che dovrebbe richiedere circa 1,5-2 ore.
    7. Nel frattempo, etichettare e posizionare quattro flaconi da centrifuga in polipropilene copolimero pulito e 4 flaconi di vetro puliti da 500 ml sul ghiaccio per raffreddare.
      NOTA: Misurare la densità di coltura maxi ogni 15 minuti dopo 1 ora di crescita per evitare di superare OD600 = 0,7.
    8. Una volta raggiunto OD600 = 0,7, trasferire rapidamente le colture in bottiglie di vetro raffreddate e metterle in bagnomaria ghiacciato per 20 minuti per terminare la crescita.
      NOTA: Il trasferimento delle colture in bottiglie raffreddate è essenziale per arrestare rapidamente la crescita: posizionare le matracce direttamente nel bagno di acqua ghiacciata non comporterà un'efficiente cessazione della crescita. Tutti i passaggi successivi vengono eseguiti sul ghiaccio, se non diversamente specificato.
    9. Mentre le colture si raffreddano nel bagno di acqua ghiacciata, preraffreddare la centrifuga per la pellettizzazione cellulare e posizionare 500 ml di soluzione PBS sul ghiaccio per raffreddare.
    10. Dopo 20 minuti, trasferire 250 ml di ciascuna coltura nel flacone da centrifuga preraffreddato corrispondente e centrifugare a 3.220 × g, 4 °C, per 10 minuti, mantenendo gli altri 250 ml in ghiaccio.
    11. Decantare accuratamente il surnatante e asciugarlo su carta assorbente.
    12. Aggiungere i restanti 250 mL di ciascuna coltura al flacone da centrifuga corrispondente e centrifugare nuovamente a 3.220 × g, 4 °C, per 10 minuti.
    13. Rimuovere il surnatante mediante travaso e asciugare le bottiglie su carta assorbente prima di rimettere i pellet di cella sul ghiaccio.
    14. Aggiungere 30 ml di PBS sterile ghiacciato in ciascun flacone da centrifuga e risospendere accuratamente il pellet cellulare.
    15. Pesare ed etichettare 4 provette coniche pulite da 50 mL.
    16. Trasferire la sospensione cellulare nelle 4 provette coniche da 50 mL.
    17. Centrifugare nuovamente a 3.220 × g, 4 °C, per 10 min.
    18. Rimuovere il surnatante mediante travaso e asciugare i tubi su carta assorbente prima di rimettere i pellet di celle sul ghiaccio.
    19. Aggiungere 30 mL di PBS sterile ghiacciato in ciascuna provetta conica e risospendere accuratamente il pellet cellulare mediante vortex.
    20. Centrifugare nuovamente a 3.220 × g, 4 °C, per 10 min.
    21. Rimuovere il surnatante mediante travaso e asciugare i tubi su carta assorbente prima di rimettere i pellet di celle sul ghiaccio.
    22. Aggiungere 30 mL di PBS sterile ghiacciato in ciascuna provetta conica e risospendere accuratamente il pellet cellulare mediante vortex.
    23. Centrifugare nuovamente a 3.220 × g, 4 °C, per 10 min.
    24. Rimuovere il surnatante mediante travaso e asciugare le bottiglie su carta assorbente prima di rimettere i pellet di cella sul ghiaccio.
    25. Centrifugare un'ultima volta a 3.220 × g, 4 °C, per 2 min.
    26. Rimuovere l'eventuale surnatante in eccesso mediante pipettaggio.
    27. Pesare e registrare la massa di ciascun tubo conico. La massa del pellet di cella è la differenza tra questi valori e il peso a vuoto dei tubi (dovrebbe essere ~1 g).
    28. Spezzare i pellet delle celle di congelamento utilizzando azoto liquido e conservarli a -80 °C.
  3. Giorno 3: lisi, ultracentrifugazione e ammollo del tampone B
    1. Scongelare i pellet di cella sul ghiaccio.
    2. Aggiungere 50 mL di tampone ribosomiale A in una provetta conica pulita.
    3. Prelevare 100 μl di tampone ribosomiale A dalla provetta conica e aggiungerlo a una fiala di DTT No-Weigh. Sciogliere completamente il pellet DTT per ottenere uno stock DTT da 0,5 M.
      NOTA: Preparare le successive scorte DTT da 0,5 milioni come descritto qui, ma utilizzando il buffer appropriato per ogni fase.
    4. Aggiungere 100 μl di DTT 0,5 m nella provetta conica da 50 mL per ottenere una concentrazione finale di 1 mM DTT nel tampone ribosomiale A da 50 mL. Mantenere la soluzione in ghiaccio.
    5. Risospendere ogni pellet cellulare nel tampone ribosomiale A + DTT, in un rapporto di 2 mL per 1 g di pellet cellulare, mediante vortex completo. Combinare tutte le cellule risospese in un'unica provetta conica per verificare il volume totale dell'impasto risospeso, che dovrebbe essere di 10 mL da 2 L di coltura. Se necessario, rabboccare il volume a 10 ml con il tampone ribosomiale A + DTT aggiuntivo.
    6. Dividere l'impasto in 2 campioni da 5 ml in provette coniche separate.
    7. Lisare le cellule in ciascuna provetta mediante sonicazione al 30% di ampiezza, 20 s on, 20 s off per 10 cicli (3 min 20 s di durata totale del programma), in un bagno di acqua ghiacciata, utilizzando una sonda di sonicazione raffreddata (Figura 3A, 3C).
      NOTA: Durante la sonicazione, è necessario trasferire circa 1.000 J di energia per tubo. Utilizzare un supporto sicuro per mantenere il tubo in posizione durante la sonicazione per garantire la coerenza del trasferimento di energia.
    8. Rabboccare il volume di ciascun campione lisato a 25 mL con il tampone ribosomiale A + DTT e agitare brevemente per mescolare.
    9. Trasferire il contenuto in 2 provette da centrifugazione S30 raffreddate.
    10. Centrifugare a 30.000 × g per 1 ora a 4 °C (Figura 3E).
    11. Recuperare un massimo del 75% del surnatante privo di pellet (per evitare la contaminazione della membrana da parte del pellet) da ciascuna provetta S30 in due provette S30 pulite e preraffreddate.
    12. Centrifugare a 30.000 × g per 30 min a 4 °C.
    13. Recuperare un massimo del 75% del surnatante privo di pellet in due provette coniche pulite da 50 mL e rabboccare il volume di ciascuna a 25 mL con il tampone ribosomiale A + DTT.
    14. Trasferire il campione in due provette S100 pulite e preraffreddate.
      NOTA: Assicurarsi che le provette siano bilanciate accuratamente (differenza massima di 0,01 g tra le provette opposte) prima dell'ultracentrifugazione e che siano riempite a un volume di 25 mL (capacità massima della provetta S100).
    15. Centrifugare a 100.000 × g per 4 ore a 4 °C (Figura 3F).
    16. Trenta minuti prima della fine della corsa con l'S100, preparare un stock DTT da 0,5 M utilizzando il tampone ribosoma B ghiacciato come da istruzioni sopra e generare una soluzione finale di 1 mM di DTT in 50 mL di tampone ribosomiale B.
    17. Rimuovere il surnatante dalle provette dell'ultracentrifuga mediante travaso. Aggiungere 5 mL di tampone ribosomiale B + DTT ghiacciato in ciascuna provetta S100 contenente pellet ribosomiale. Conservare il rimanente tampone ribosomiale B + DTT a 4 °C per utilizzarlo il giorno successivo.
    18. Incubare le provette con ghiaccio in una cella frigorifera per lasciare che il pellet di ribosoma si impregni nel tampone ribosomiale B + DTT per una notte.
      NOTA: Assicurarsi che il pellet di ribosoma sia completamente immerso nel tampone ribosomiale B + DTT. Ciò può essere ottenuto posizionando i tubi nel ghiaccio ad angolo (Figura 3D).
  4. Giorno 4: ultracentrifugazione e ammollo del tampone C
    1. Il giorno successivo, aggiungere altri 5 ml di tampone ribosomiale B + DTT ghiacciato in ciascuna provetta S100 contenente il pellet di ribosoma imbevuto durante la notte.
    2. Tentare delicatamente la risospensione del pellet mediante pipettaggio. Utilizzare la punta della pipetta per raschiare il pellet dalla parete del tubo e risospendere in questo modo. Trasferire il contenuto in due provette S30 preraffreddate pulite.
    3. Aggiungere altri 10 mL di tampone ribosomiale B + DTT ghiacciato in ciascuna provetta S100 contenente il pellet di ribosoma e ripetere i passaggi di risospensione come sopra.
    4. Fascicolare la risospensione nello stesso tubo S30 di prima.
    5. Centrifugare a 30.000 × g per 1 ora a 4 °C (Figura 3G).
    6. Recuperare un massimo del 75% di surnatante privo di pellet in due provette coniche pulite da 50 mL e rabboccare il volume a 25 mL con il tampone ribosomiale B + DTT.
    7. Trasferire questo campione in due provette S100 pulite e preraffreddate.
      NOTA: Assicurarsi che le provette siano bilanciate accuratamente prima dell'ultracentrifugazione e riempite a un volume di 25 mL (capacità massima della provetta S100).
    8. Centrifugare a 100.000 × g per 4 ore a 4 °C (Figura 3H).
    9. Trenta minuti prima della fine della corsa con l'S100, preparare un stock DTT da 0,5 M utilizzando il tampone ribosoma C ghiacciato secondo le istruzioni sopra e generare una soluzione finale di 1 mM DTT in 5 mL di tampone ribosomiale C. Mantenere questo tampone sul ghiaccio.
    10. Dopo l'ultracentrifugazione, scartare il surnatante e rimuovere l'eventuale tampone residuo mediante pipettaggio. Lavorare velocemente per evitare di lasciare il pellet scoperto dal tampone per troppo tempo.
    11. Aggiungere 400 μl di tampone ribosomiale C + DTT ghiacciato in ciascuna provetta per ultracentrifuga contenente pellet ribosomiale.
    12. Incubare le provette con ghiaccio in una cella frigorifera per lasciare che il pellet di ribosoma si impregni nel tampone ribosomiale C + DTT per una notte.
      NOTA: Assicurarsi che il pellet di ribosoma sia completamente immerso nel tampone ribosomiale C + DTT. Ciò può essere ottenuto posizionando i tubi nel ghiaccio ad angolo.
  5. Giorno 5: ritiro
    1. Il giorno successivo, risospendere delicatamente il pellet di ribosoma utilizzando una pipetta da 1 ml e agitando delicatamente per dissolvere completamente il pellet di ribosoma chiaro halo.
      NOTA: Il pellet di ribosoma dovrebbe dissolversi completamente nel tampone in questa fase: a questo punto non dovrebbe esserci alcun pellet insolubile, ma se rimane un pellet insolubile giallo, non tentare di risospenderlo: risospendere solo il pellet di ribosoma chiaro halo.
    2. Trasferire la soluzione di ribosoma in due provette sterili da microcentrifuga da 2 ml e centrifugare a 20.000 × g per 10 minuti a 4 °C per pellettare il materiale insolubile rimasto.
    3. Raccogliere il surnatante senza pellet in una provetta pulita e conservarlo con ghiaccio (Figura 3I).
    4. Creare una diluizione 100x della soluzione di ribosoma aggiungendo 2 μL a 198 μL di tampone ribosomiale C, in triplicato.
    5. Misurare la concentrazione di RNA a 260 nm; 10 unità di assorbanza del campione diluito equivalgono a 24 μM di ribosomi13.
    6. Aliquotare le soluzioni ribosomiche (ad esempio, in aliquote da 50 μL, a seconda delle esigenze dell'utente), congelare a scatto in azoto liquido a una concentrazione massima di 24 μM e conservare a -80 °C fino all'uso.
      NOTA: Il protocollo dovrebbe portare a circa 1 mL di ribosomi a una concentrazione di 12-18 μM. Se i ribosomi sono troppo diluiti, la concentrazione può essere ottenuta utilizzando un filtro MWCO da 3 kDa8.

4. Impostazione degli esperimenti CFPS

  1. Lavoro preliminare
    1. Preparare il modello di DNA (lineare o plasmide) secondo i protocolli stabiliti9.
      NOTA: Nel nostro laboratorio, utilizziamo modelli di DNA basati sul sistema di espressione T7p14 ottimizzato per l'espressione libera da cellule14. I prodotti PCR purificati possono essere utilizzati come modelli lineari. È importante notare che i plasmidi devono essere ripuliti dopo la miniprep e che diversi kit commerciali producono risultati variabili15.
    2. Preparare 5 soluzioni energetiche come descritto nella Tabella 3.
    3. Preparare la soluzione a matrice 6x come descritto nella Tabella 4.
  2. Impostazione e monitoraggio di una reazione PURE
    NOTA: Questo protocollo descrive l'impostazione di una misurazione triplata utilizzando un master mix. Il numero di reazioni può essere aumentato o diminuito a seconda delle esigenze, utilizzando il foglio di calcolo fornito nella Tabella supplementare S3, ma si raccomanda un minimo di ripetizioni triplicate per una singola condizione sperimentale.
    1. Il disgelo ha richiesto aliquote di PURE, ribosomi, soluzione energetica e soluzione di matrice su ghiaccio.
    2. Preparare una miscela master per una singola serie di reazioni triplicate in una provetta PCR, per un totale di 17 μl, come mostrato nella Tabella 5, assemblando i componenti nel seguente ordine: soluzione energetica, proteine PURE, ribosomi, soluzione di matrice, acqua priva di nucleasi fino a 17 μl.
    3. Impostare la pipetta a 5,1 μl e aspirare delicatamente la soluzione 5-6 volte per miscelare, garantendo l'omogeneità.
    4. Utilizzando la stessa impostazione della pipetta (5,1 μl), caricare la miscela master in tre pozzetti singoli di una piastra ottica a 384 pozzetti. Evitare di spingere la pipetta oltre il primo arresto per evitare la formazione di bolle. Lasciare uno spazio a pozzetti tra ogni replica per ridurre al minimo la diafonia della fluorescenza.
    5. Sigillare la piastra utilizzando un sigillo adesivo per piastre.
    6. Procedere con l'incubazione a valle o le misurazioni del lettore di piastre, se necessario.
      NOTA: Quando si incorporano componenti aggiuntivi contenenti glicerolo (ad esempio, proteine potenziatrici), assicurarsi che il volume finale di tali componenti non superi il 10% del volume di reazione. Ad esempio, un componente con il 30% di glicerolo dovrebbe essere limitato a 1,7 μl per 17 μl di master mix.
      Non centrifugare la piastra a 384 pozzetti dopo il caricamento. La centrifugazione può causare la separazione dei componenti ricchi di glicerolo (ad esempio, il sistema PURE), con conseguenti livelli di espressione incoerenti. Il design della piastra supporta reazioni di piccolo volume e un pipettaggio accurato garantisce un'adeguata decantazione senza centrifugazione.

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Risultati

Il flusso di lavoro per le preparazioni PURE e ribosoma è mostrato nella Figura 1 e un calendario consigliato per il lavoro è mostrato nella Tabella 1. In genere, le reazioni vengono monitorate attraverso la produzione di proteine fluorescenti come GFP o mCherry e le letture RFU possono essere convertite in concentrazioni mediante calibrazione11. Tuttavia, le rese di CFPS dipendono dal...

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Discussione

Abbiamo presentato una procedura dettagliata che ci ha permesso di ottenere sistemi PURE riproducibili su più lotti e utenti nello stesso laboratorio. Per raggiungere questo obiettivo sono necessari una serie di passaggi critici.

Il primo passo importante è garantire l'integrità dei 36 ceppi PURE: oltre a sequenziare tutti i plasmidi, è essenziale effettuare una prova di espressione per verificare che tutti i ceppi sovraesprimano correttamente, poiché la perdi...

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Dichiarazioni

SL è co-fondatore e CTO di Biophoundry Inc., che sviluppa tecnologie prive di cellule per l'ingegneria dei fagi.

Ringraziamenti

NL, SL, AB e NZ sono supportati dalla UKRI Future Leaders Fellowship (MR/V027107/1) della NL. SL è inoltre supportato da Biophoundry Inc. SY è supportato da una borsa di dottorato Darwin Trust dell'Università di Edimburgo. CW è supportata da una borsa di dottorato BBSRC Eastbio. Gli autori ringraziano A. Pompa per l'assistenza nell'utilizzo dell'ultracentrifuga, che è stata supportata dal finanziamento della Wellcome Discovery Research Platform for Hidden Cell Biology [226791]. Inoltre, ringraziamo B. Lavickova e S. J. Maerkl per l'assistenza nella creazione del protocollo OnePot originale. Ai fini dell'accesso aperto, l'autore ha applicato una licenza Creative Commons Attribution (CC BY) a qualsiasi versione del manoscritto accettato dall'autore derivante da questa presentazione. La Figura 1 è stata parzialmente creata in BioRender. Laohakunakorn, N. (2025) [https://BioRender.com/wj65i81].

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2x YTSigmaY2377-250G
AminoacidiSigmaLAA21-1KT
Acetato di ammonio senza RNAsiThermo ScientificAM9070G
Cloruro di ammonioSigma09718-1KG
ampicillinaSigmaA8351-5G
BL21(DE3) competente per E. coliNEBC2527H
bottiglia, centrifuga (Nalgene)Thermo Scientific3120-9500Bottiglia di copolimero di polipropilene
bottiglia, vetro (Duran) 250 mL, 500 mL, 1 L, 2 LVWR215-1593, 215-1594, 215-1595, 215-1596
Analisi Bradford, Quick Start 1x Reagente di ColoranteBio-Rad5000205
centrifugaThermo ScientificHeraeus Megafuge 16R
centrifuga, microEppendorf5424R 
Colonna cromatografiaBio-Rad7321010
Fosfato di creatinaSigma27920
Cuvette, semi micro 1,6 mLFisherbrandFB55147
Di-sodico idrogeno ortofosforato diidratoFisher ChemicalS/4450/60
cassetta per dialisi, Slide-A-Lyzer G3, MWCO da 2 kDa, 15 mLThermo ScientificA52962
Idrogeno dipotassico ortofosfato anidroFisher ChemicalP/5240/60
DTT No-WeighThermo ScientificA39255
unità filtrante, MWCO Amicon Ultra 15 centrifugo da 3kDaEMD MilliporeUFC900324
fiaschetta, 500 mLVWR214-1133
fiaschetta, con un perlezione 2.5 L TunairSS-5013
Acido folinicoSigmaF7878-100MG
gliceroloSigmaG5516-1L
HclFisherbrandH/1200/PB17
Buffer HEPES, soluzione 1 M pH 7,3Thermo ScientificBP299
imidazoloSigmaI2399-500G
incubatriceEppendorfNew Brunswick Innova® 42
IPTGThermo ScientificR0392
Pellet KOHThermo ScientificP1767-500G
Acido L-glutammico sale di emimagnesio tetraidratoSigma49605-250G
L-Glutammico sale monopotassico monoidratoSigma49601-500G
Tetraidrato di acetato di magnesioSigmaM5661-50G
cloruro di magnesioFluka63020-1L
Configurazione di agitazione magneticaStuartUS152
NanodropThermo ScientificNanodrop 2000
Perline NEBExpress Ni-NTA MagNEBS1423S
ParafilmSigmaP7543-1EA
pipetta, multicanale Eppendorf Research Plus 30-300 e micro; LEppendorf3125000052
Sigillo adesivo per piastra per lettore di placcheExcelScientificSTR-SEAL-PLT (Sterile)
Sigillo traspirante a piastreStarlabE2796-3005
Guarnizione in laminaExcelScientificFCS-25
Lettore di targheBioTekSinergia H1
Agitatore per piastreAllshengMBI100-4A
Placca, 384° pozzoThermo Scientific242764
piatta, 96 pozzi profondi 1 mLThermo Scientific736-0601
piastra di 96 pozzi profondi 2 mLSarstedt82.1972.002
PCR a piastra a 96 pozziSarstedt721,978
Placca, pozzo ottico 96Thermo Scientific10057581
cloruro di potassioSigmaP5405-500G
Diidrogeno ortofosfato di potassioFisher ChemicalP/4800/53
Reagente per l'estrazione proteica (BugBuster)EMD Millipore70584-3
resina per purificazione proteica (cOmplete)Roche5893682001
Shaker a giroStarlabRM-Multi 1
cloruro di sodioFisher ChemicalS/3105/70
sonda di sonicazione, FisherBrand 15-50 mLThermo Scientific12931181
SonicatorFisher ScientificFB120
spettrofotometroJenwayGenova Plus
spermidinaSigmaS2626-1G
TCEP 0,5 MSupelco646547
Thermo Fisher NTP, Tris bufferatoThermo ScientificR1481
TRNA da E. coli MRE600Roche10109541001
triptoneFormediumTRP02
valvola, grado PCR da 0,2 mLSarstedt72,737,002
tubo, bijoux Sterilin 7 mL polistireneThermo Scientific129A
tubo, conico (Falcon) 15 mLSarstedt62.554.502
tubo, conico (Falcon) 50 mLSarstedt62.547.254
tubo, microcentrifuga (Eppendorf) 1,5 mLSarstedt72.690.001
tubo, microcentrifuga (Eppendorf) 2 mLSarstedt72.695.700
valvola, centrifugazione S100 & nbsp;Beckman-Coulter355619
valvola, centrifugazione S30 & nbsp;Thermo Scientific3118-0050
UltracentrifugaBeckman-CoulterOptima XPN-100
Rotore dell'ultracentrifugaBeckman-CoulterRotore ad angolo fisso 70Ti
Acqua distillata UltraPure DNase/RNaseThermo Scientific10977049
vorticeVWR444-2791
Estratto di lievitoOssassoideLP0021T

Riferimenti

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