Articolo metodologico

Piattaforma di imaging senza lenti distribuibile sul campo per un'analisi rapida e senza marcatura dell'attivazione delle cellule natural killer

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DOI:

10.3791/68834

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8 agosto 2025

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1Department of Electronics and Information Engineering, Korea University, 2Department of Biotechnology and Bioinformatics, Korea University, 3Metaimmunetech Inc., 4Department of Gastroenterology and Hepatology, Guro Hospital, Korea University College of Medicine, 5Department of Laboratory Medicine, Anam Hospital, Korea University College of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo label-free per l'analisi rapida di singole cellule della conta e dell'attività delle cellule natural killer (NK) utilizzando la tecnologia di imaging shadow senza lenti. Questo metodo quantifica i cambiamenti morfologici nelle singole cellule NK mediante analisi computerizzata dei loro modelli di diffrazione.

Abstract

Le cellule natural killer (NK) sono importanti effettori dell'immunità innata che eliminano le cellule infette da virus e maligne. Il monitoraggio dell'attività delle cellule NK è essenziale per valutare la funzione immunitaria. Tuttavia, i metodi convenzionali, come la citometria a flusso, sono laboriosi e richiedono molto tempo. Questo protocollo descrive una tecnica label-free per l'analisi rapida dell'attività delle cellule natural killer (NK) utilizzando la tecnologia di imaging delle ombre senza lenti (LSIT). Le cellule NK isolate dal sangue periferico e stimolate con un attivatore proprietario sono state analizzate utilizzando la piattaforma LSIT entro 5 minuti. La piattaforma LSIT acquisisce immagini olografiche, note come immagini d'ombra, create dall'interferenza della luce con le cellule NK, e ne monitora lo stato di attivazione analizzando i cambiamenti nei parametri dell'ombra. I parametri chiave derivati dalle immagini delle ombre, tra cui la distanza picco-picco (PPD) e la deviazione standard della larghezza massima secondaria (WSM-SD), riflettevano quantitativamente la morfologia cellulare e la complessità interna. Questi parametri sono stati integrati nel parametro ombra combinato (CSP) e nell'indice di immunità innata (I3) per fornire una valutazione e una quantificazione complete dell'attività delle cellule NK sulla base dei cambiamenti morfologici nelle cellule. I3, calcolato come variazione percentuale di CSP dopo l'attivazione, è servito come misura diretta dell'attività delle cellule NK. Le cellule NK di individui sani hanno mostrato costantemente valori di I3 significativamente più alti rispetto a quelle di individui immunocompromessi. La piattaforma LSIT consente una profilazione immunitaria rapida ed economica, adatta per la diagnostica point-of-care.

Introduzione

La morfologia cellulare sta emergendo come un indicatore chiave dei meccanismi molecolari. Non solo fornisce una rappresentazione visiva della struttura cellulare, ma offre anche preziose informazioni sui processi e le funzioni sottostanti delle singole cellule1. L'analisi della forma, delle dimensioni e dell'attività delle cellule immunitarie a livello di singola cellula fornisce informazioni cruciali sul loro comportamento, eterogeneità e ruoli nella salute e nella malattia 2,3,4,5,6.

Tra queste cellule cruciali ci sono le cellule natural killer (NK), che sono un componente centrale del sistema immunitario innato 7,8. Eliminano le cellule infettate da virus e cancerose e regolano la risposta immunitaria adattativa attraverso il rilascio di citochine 9,10,11. Il cancro, le infezioni virali e le immunodeficienze spesso riducono il numero di cellule NK e ne compromettono le funzioni 12,13,14. Pertanto, l'attivazione delle cellule NK funge da importante biomarcatore e fornisce informazioni sulla salute generale del sistema immunitario. Di conseguenza, la valutazione rapida dell'attivazione delle cellule NK da parte di una singola cellula è essenziale per la prognosi, la diagnosi, il monitoraggio della malattia e la stratificazione dei pazienti 15,16,17,18.

Attualmente, l'attività delle cellule NK è valutata in base alla loro capacità citotossica (capacità di uccidere le cellule bersaglio) e alla produzione di citochine 19,20,21,22. Metodi convenzionali per misurare la citotossicità cellulo-mediata23, come i saggi di rilascio di cromo-51 (51Cr)24,25, i saggi citofluorimetrici26,27 e i saggi di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per quantificare l'interferone-gamma (IFN-γ) secreto dalle cellule NK dopo la stimolazione 28,29,30 hanno diverse limitazioni. Questi includono la mancanza di standardizzazione, i protocolli lunghi (ad esempio, l'incubazione ELISA notturna), la dipendenza dalla marcatura cellulare e gli elevati costi delle apparecchiature 31,32,33. Queste sfide evidenziano la necessità di metodi innovativi che offrano risultati rapidi, economicità, analisi senza etichette e alta produttività. Inoltre, la valutazione dell'attivazione delle cellule NK a livello di singola cellula fornisce informazioni dettagliate sull'eterogeneità della popolazione e sulle risposte cellulari individuali alla stimolazione.

Tra le tecnologie emergenti volte a superare queste limitazioni, la tecnologia di imaging delle ombre senza lenti (LSIT) è una soluzione particolarmente efficace 34,35,36. LSIT, un'olografia digitale in linea (DIH) semplificata, consente un'analisi rapida, senza marcatura e ad alto rendimento dell'attivazione delle cellule NK con risoluzione di una singola cellula 37,38,39. Il DIH cattura i modelli di interferenza tra la luce laser diffusa e un raggio di riferimento collineare su un sensore digitale per ricostruire informazioni tridimensionali (3D) su oggetti microscopici40,41. L'LSIT semplifica questo approccio utilizzando un LED parzialmente coerente, un microforo stenopeico e un sensore CMOS per catturare i modelli di diffrazione (cioè le immagini delle ombre) delle celle 42,43,44,45. Il razionale di questa tecnica si basa sull'osservazione che l'attivazione delle cellule immunitarie spesso causa cambiamenti morfologici, tra cui variazioni nelle dimensioni, nella forma, nella granularità citoplasmatica e nella struttura nucleare delle cellule 46,47,48,49,50. L'LSIT è altamente sensibile a questi cambiamenti, che hanno un effetto diretto sui modelli di diffrazione 51,52,53.

Basandosi sulla sensibilità della LSIT a questi cambiamenti morfologici e ai loro effetti sui modelli di diffrazione, questo protocollo presenta un nuovo metodo per la quantificazione rapida e accurata della conta delle cellule NK e dell'attività funzionale a livello di singola cellula utilizzando la piattaforma Cellytics NK, di seguito denominata piattaforma LSIT54. Come mostrato nella Figura 1A, la piattaforma LSIT integra l'elaborazione dei campioni, l'attivazione e l'imaging delle ombre in un flusso di lavoro multicanale compatto. Le cellule NK sono state isolate da sangue intero, stimolate con un cocktail di stimolatori di attivazione (ASC) appositamente formulato e caricate su un chip di analisi dedicato. L'ASC induce cambiamenti morfologici nelle cellule NK entro 1 ora dall'esposizione, come l'aumento delle dimensioni cellulari e della complessità interna, che possono essere rilevati con precisione utilizzando la piattaforma LSIT55,56.

La piattaforma LSIT utilizza una sorgente luminosa a LED e un sensore CMOS per catturare i modelli DIH (ombre) delle singole celle (Figura 1B). Uno speciale algoritmo analizza quindi questi modelli di ombre ed estrae parametri chiave, come la distanza picco-picco (PPD), che è correlata alla dimensione della cellula, e la deviazione standard dell'ampiezza del massimo secondario (WSM-SD), che è correlata alla complessità e all'irregolarità del citoplasma (Figura 1C, D). Confrontando i valori prima e dopo la stimolazione, la piattaforma calcola indici compositi: il parametro ombra combinato (CSP = PPD × WSM-SD) e l'indice di immunità innata (I³), che riflettono la variazione percentuale di CSP dopo l'attivazione. Il motivo per l'introduzione della CSP è che l'attivazione immunitaria comporta sia l'ingrossamento cellulare che l'aumento della complessità citoplasmatica. Affidarsi a uno solo dei due criteri può non riuscire a far perdere l'attivazione borderline o essere influenzato da rumori, come detriti o illuminazione irregolare. Il CSP migliora la classificazione richiedendo cambiamenti coerenti in entrambe le metriche. Questi indici classificano gli stati di attivazione di diverse popolazioni cellulari senza marcatura fluorescente o elaborazione complessa del campione.

Questo protocollo è particolarmente utile per ricercatori e clinici che richiedono un metodo rapido, quantitativo e privo di marcatura per monitorare i cambiamenti morfologici indotti dall'attivazione nelle cellule immunitarie. È adatto per la ricerca immunologica di base, lo screening preclinico dei farmaci e la valutazione delle immunoterapie e può essere utilizzato come strumento diagnostico o prognostico in contesti clinici in cui è essenziale una rapida valutazione dello stato immunitario. Questo metodo richiede popolazioni cellulari isolate, l'accesso alla piattaforma LSIT e uno specifico cocktail di attivazione delle cellule NK.

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Protocollo

Tutta la ricerca ha seguito le linee guida istituzionali ed è stata approvata dall'Institutional Review Board del Korea University Anam Hospital (numero di approvazione: 2021AN0040). I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Raccolta e manipolazione dei campioni

NOTA: Maneggiare tutti i campioni di sangue umano utilizzando le precauzioni standard di biosicurezza e i dispositivi di protezione individuale appropriati.

  1. Raccogliere il sangue intero periferico dal paziente in una provetta sterile per eparina in modo asettico.
  2. Capovolgere delicatamente il tubo 8-10 volte per mescolare l'anticoagulante con il sangue.
  3. Analizzare il campione di sangue immediatamente dopo la raccolta. Se l'analisi è ritardata, conservare il campione in una provetta eparinizzata a 2-8 °C e utilizzare entro 48 ore.
    NOTA: Non congelare il sangue intero. Utilizzare campioni freschi per preservare l'integrità cellulare.

2. Isolamento e attivazione delle cellule NK

NOTA: Questo protocollo presenta un flusso di lavoro ottimizzato e completo per l'isolamento e l'attivazione di cellule NK direttamente dal sangue intero umano utilizzando l'NK Prep Kit, che consiste nell'NK Sep Kit per l'isolamento cellulare e nell'NK Activation Kit per la stimolazione. Questo kit integra la selezione e la stimolazione negativa basata su biglie magnetiche per consentire una rapida valutazione fenotipica tramite una piattaforma di citometria per immagini senza lenti.

  1. Configurazione pre-test
    1. Estrarre i kit dal frigorifero e portarli a temperatura ambiente (15-28 °C).
      NOTA: Il kit NK Sep include i seguenti componenti:
      a) Coperchio verde: provetta di reazione contenente il cocktail di anticorpi.
      b) Coperchio rosso: provetta di separazione 1 contenente particelle magnetiche nel mezzo di diluizione (1,5 mL).
      (c) Coperchio viola: tubo di separazione 2 contenente le particelle magnetiche.
      (d) Coperchio grigio: tubo di recupero (pulito e vuoto).
      Il kit di attivazione NK include i seguenti componenti:
      (a) Veicolo: otto tubi trasparenti in un sacchetto di alluminio sigillato.
      (b) ASC: otto provette gialle in un sacchetto di alluminio sigillato.
      Rimuovere solo i tubi necessari dai sacchetti sigillati. Richiudere e refrigerare tutti i componenti inutilizzati.
    2. Preparare l'attrezzatura necessaria: separatore magnetico, pipette con puntali sterili e un'incubatrice calibrata o un blocco riscaldante impostato a 37 °C.
  2. Procedura di isolamento delle cellule NK
    1. Aggiungere 0,5 mL di sangue intero alla provetta di reazione con il tappo verde contenente il cocktail di anticorpi. Mescolare delicatamente capovolgendo la provetta 2-3 volte e incubare per 5 minuti.
    2. Trasferire l'intero contenuto nella provetta di separazione 1 con un tappo rosso. Mescolare delicatamente 2-3 volte.
    3. Posizionare la provetta su un separatore magnetico e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
    4. Con il magnete in posizione, trasferire circa 1,5 mL di surnatante nella provetta di separazione 2 con tappo viola. Mescolare delicatamente 2-3 volte.
    5. Posizionare la provetta di separazione due sul supporto magnetico e incubare per 10 minuti.
    6. Con il magnete ancora attaccato, trasferire circa 1,0 mL di surnatante in una provetta di recupero con coperchio grigio. Mescolare accuratamente.
  3. Attivazione delle cellule NK
    1. Aggiungere 100 μl della sospensione a celle NK isolate al tubo del veicolo e altri 100 μl al tubo ASC
    2. Mescolare accuratamente il contenuto dei due tubi.
    3. Incubare le provette a 37 °C per 1 ora.
      NOTA: Utilizzare un blocco riscaldante calibrato per mantenere una temperatura di incubazione costante.

3. Imaging e analisi con la piattaforma LSIT

NOTA: Le cellule devono essere analizzate immediatamente dopo l'incubazione. Se l'analisi immediata non è possibile, conservare le cellule incubate a 2-8 °C e analizzarle entro 6 ore. La piattaforma LSIT valuta la morfologia e la conta cellulare in campioni di sangue umano utilizzando DIH. Per analizzare l'attività immunitaria, sia le cellule NK non stimolate che quelle stimolate da ASC sono state caricate su uno speciale vetrino, inserite nel dispositivo e sottoposte automaticamente a immagini.

  1. Configurazione e calibrazione del dispositivo
    NOTA: Eseguire sempre la calibrazione dello sfondo prima di analizzare un campione.
    1. Accendere la piattaforma LSIT. Assicurarsi che il LED, la ventola e la fotocamera funzionino.
    2. Avviare il software LSIT Capture . Accedi inserendo il tuo ID e la tua password.
    3. Vai su Impostazioni e seleziona Calibra.
    4. Premere il pulsante Apri sul touchscreen o utilizzare il pulsante fisico della porta scorrevole per aprire la porta. Quando il cassetto si apre, rimuovere la slitta di calibrazione e riporla.
    5. Assicurarsi che non sia presente alcun vetrino di prova. Chiudere il cassetto.
      NOTA: Utilizzare solo salviette ottiche per pulire le superfici dei vetrini.
    6. Fare clic su Imposta sfondo per calibrare l'intensità ottica.
    7. Riposizionare la slitta di calibrazione e chiudere il cassetto.
    8. Fare clic su Avvia calibrazione.
      NOTA: In caso di versamento di liquido sul dispositivo, spegnerlo immediatamente. Puliscilo. Non smontare il dispositivo.
  2. Preparazione e caricamento dei vetrini per il test
    1. Rimuovere un vetrino di analisi dalla sua custodia, etichettarlo con i dati del campione e posizionarlo su una superficie piana e pulita.
    2. Pipettare 10 μl del campione del veicolo (non stimolato) nei canali A e B.
    3. Pipettare 10 μl del campione stimolato con ASC nei canali C e D.
      NOTA: Evitare la formazione di bolle e il riempimento eccessivo.
    4. Premere Apri per espellere il cassetto, rimuovere il vetrino di calibrazione e riporlo in una scatola di conservazione.
    5. Inserire il vetrino del saggio preparato e premere Chiudi.
  3. Acquisizione dell'immagine: Menu Test 1 - Attività delle cellule NK
    NOTA: Se l'acquisizione dell'immagine non riesce, controllare l'illuminazione e il volume del campione. Ricalibrare se necessario.
    1. Accedi al sistema LSIT e seleziona il test di attività cellulare NK nella schermata principale.
    2. Immettere l'ID del campione o utilizzare lo scanner di codici a barre.
      NOTA: Per recuperare l'ID del campione dall'elenco archiviato, utilizzare il pulsante Recupera.
    3. Premere Capture per avviare la registrazione.
    4. Dopo aver catturato l'immagine, fare clic su Analizza
    5. Controllare l'attività delle cellule NK (%) e il numero di cellule visualizzati sullo schermo.
      NOTA: I risultati validi vengono visualizzati numericamente. Se I3 è inferiore all'intervallo, viene visualizzato "≤100%". Al di sopra dell'intervallo, viene visualizzato ">300%".
    6. Scarica i risultati su una USB o stampali utilizzando il menu touchscreen.
  4. Acquisizione dell'immagine: Menu Test 2 - conteggio delle cellule
    1. Selezionare l'opzione Conteggio celle nel menu Test 2 nell'interfaccia principale.
    2. Caricare 10 μl del campione su un nuovo canale del vetrino.
    3. Inserire il vetrino, chiudere il cassetto e inserire l'ID del campione.
    4. Inserire il fattore di diluizione, se applicabile.
    5. Premere Conta.
      NOTA: Se il risultato rientra nell'intervallo di test, il numero di celle NK viene visualizzato come valore numerico sullo schermo del sistema. Per i risultati al di sotto dell'intervallo di test, viene visualizzato "≤ 10 celle/μL", per i risultati superiori a "> 1.000 cellule/μL".
    6. Visualizza i risultati come celle/μL.
      NOTA: Attiva o disattiva il campo nero dei risultati per visualizzare il conteggio effettivo delle celle nelle immagini.
    7. Rivedi i risultati e scaricali o stampali.
      NOTA: Assicurarsi che sia stato inserito il fattore di diluizione corretto per ottenere risultati accurati.

4. Pulizia post-analisi

  1. Aprire il cassetto utilizzando il pulsante Apri o l'interruttore a levetta fisico.
  2. Rimuovere la slitta usata.
  3. Riposizionare il cursore di calibrazione nel cassetto per proteggere il sensore.
  4. Chiudere il cassetto.
  5. Smaltire le provette, i puntali e i vetrini usati in conformità con le normative per i rifiuti di laboratorio.

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Risultati

Seguendo questo protocollo, la piattaforma LSIT consente una valutazione quantitativa e senza marcatura dell'attivazione delle cellule NK in base ai cambiamenti morfologici nelle cellule. La Figura 2A mostra le preparazioni di citospin colorate con Hema-3 di cellule NK primarie da donatori sani dopo 2 ore di incubazione con o senza ASC. L'attivazione da parte dell'ASC provoca cambiamenti marcati, principalmente l'allargamento cellulare e un aumento della complessità o granularità interna, ri...

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Discussione

Questo protocollo presenta un metodo standardizzato e senza marcatura per quantificare l'attivazione delle cellule NK che combina l'isolamento e l'attivazione cellulare utilizzando l'NK Prep Kit, con l'analisi tramite la piattaforma LSIT. Offre un'alternativa rapida e quantitativa ai saggi convenzionali come il rilascio di 51Cr, la citometria a flusso e l'ELISA. Il protocollo è stato sviluppato per i laboratori dotati della piattaforma LSIT e fornisce risultati sempli...

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Dichiarazioni

I.L., S.H., H.S.J. e S.S. sono affiliate a Metaimmunetech Inc., una società coinvolta nello sviluppo e nella commercializzazione della piattaforma LSIT presentata in questo studio. In particolare, H.S.J. è il fondatore e l'amministratore delegato, S.H. è l'amministratore delegato e S.S. è il CTO dell'azienda. Tuttavia, gli autori affermano che i risultati e le interpretazioni in questo manoscritto sono riportati in modo oggettivo e non sono influenzati da interessi commerciali di alcun tipo. Tutti gli altri autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo studio è stato supportato dai programmi di ricerca scientifica di base della National Research Foundation (NRF) della Corea (Grant#: RS-2024-00353675, Grant#: 2021R1I1A3056109), dal programma di supporto ITRC (Information Technology Research Center) supervisionato dall'IITP (Institute for Information and Communications Technology Planning and Evaluation) e dalla Commercialization Promotion Agency for R&D Outcomes (COMPA) finanziata dal Ministero della Scienza e delle TIC (MSIT), Corea (Sovvenzione#: IITP-2025-RS-2023-00258971(50%), Sovvenzione#: 2710084652), il programma di supporto del Korea Institute of Marine Science and Technology Promotion (KIMST) finanziato dal Ministero degli Oceani e della Pesca, Corea (Sovvenzione#: 20210660) e la Korea University Grant. Gli autori ringraziano Metaimmunetech Inc. per la loro collaborazione, basata sulla tecnologia trasferita dall'Università della Corea, nello sviluppo del dispositivo Cellytics NK.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette per microcentrifuga da 1,7 mLAXYGENMCT-175-CSterile, privo di DNasi/RNasi
Vetrino per testMetaimmunetechAS050-GVetrino dedicato per Cellytics system
50 vetrini in scatola
Sistema Cellytics con softwareMetaimmunetechCS001Piattaforma di imaging delle ombre senza lenti
Centrifuga (rotore a secchiello oscillante)LABOGENE1580R300– 500 &volte; Gamma G
Sensore di immagine CMOSIncluso con il dispositivo CellyticsIntegratoUtilizzato per l'imaging a diffrazione
Centrifuga CytospinNasco coreaTXT3 Cyto CentrifugaPer colorazione con citospin
Blocco riscaldante digitale (37 ° C)Daihan ScientificoDH. WHB00349Per incubazione cellulare
Kit ELISA (IFN-γ)R& Sistema DDIF50CIFN umano-γ Kit ELISA
Citometro a flusso Guava easyCyteMillipore0500-5005Per l'analisi dell'espressione di CD107a
Pacchetto statistiche Hema 3ThermoFisher122-911Per colorazione con citospin
IL-12 (Umano ricombinante)R& Sistema DComponente di ASC
IL-2 (umano ricombinante)Peprotech200-02Componente di ASC
Rack di separazione magneticoMetaimmunetechMotore M13R8Per la separazione delle microsfere
Vetrini per microscopioMarienfeld1000612Per preparazioni di citospin
Kit di attivazione NKMetaimmunetechMIT2301V, MIT2301APer l'attivazione delle cellule NK
Kit NK SetMetaimmunetechMIT2301-500Per l'isolamento delle cellule NK
PE Topo Anti-Umano CD107a, 100testBD bioscienze555801Per l'analisi dell'espressione di CD107a
Apertura stenopeicaIncluso con il dispositivo CellyticsIntegratoUtilizzato nel percorso di illuminazione LSIT
Pipette (2– 20 µ L, 20– 200 µ L)AXYGENT-200-YVolume regolabile
Diapositiva di calibrazione delle ombreMetaimmunetechAS050-GPer la calibrazione del dispositivo.
1 vetrino di calibrazione in 1 scatola di vetrini per saggi
Miscelatore a vorticeMerckSI-0246APer la risospensione

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