È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Imaging chimico ad altissimo contenuto informativo con microscopia Raman anti-ictus coerente a banda larga e microscopia a fluorescenza a due fotoni

1K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/68845

⸱

7 ottobre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology, 3School of Electrical and Computer Engineering, Georgia Institute of Technology

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo articolo dimostra la piattaforma di imaging amvitazionale che combina lo scattering Raman anti-Stokes coerente a banda larga (BCARS), la fluorescenza di eccitazione a due fotoni (TPEF) e la microscopia di imaging a fluorescenza a fluorescenza a due fotoni (2p-FLIM), consentendo il bioimaging chimico ad altissimo contenuto di informazioni.

Abstract

La spettroscopia di impronte digitali Raman e l'imaging del tempo di vita della fluorescenza sono strumenti emergenti per lo studio dei profili metabolici dei campioni biologici. Mentre la spettroscopia di impronte digitali Raman rileva vibrazioni molecolari intrinseche che riflettono la composizione molecolare e l'ambiente chimico di un campione, l'imaging a fluorescenza misura i cambiamenti nel tempo di vita dello stato eccitato dei fluorofori sensibili ai loro microambienti. Qui, presentiamo una piattaforma di imaging multimodale che combina la microscopia a banda larga coerente anti-Stokes Raman scattering (BCARS) e la microscopia a fluorescenza a due fotoni (2p-FLIM) in grado di acquisire spettri di impronte Raman biologicamente rilevanti e segnali di durata della fluorescenza in vivo e simultaneamente. Le enormi informazioni chimiche ottenute dalle immagini BCARS e 2p-FLIM co-registrate spazialmente ci permettono di caratterizzare le sottili differenze tra i compartimenti subcellulari e di verificare i potenziali risultati falsi positivi generati dalla sola imaging a fluorescenza. Ciò è dimostrato confrontando direttamente i segnali BCARS, 2p-FLIM e la fluorescenza di eccitazione a due fotoni (TPEF) ottenuti simultaneamente dallo stesso organello colorato con colorante nel C. elegans vivo e intatto che esprime un marcatore di proteina fluorescente verde (GFP). In questo lavoro, introduciamo lo schema di configurazione BCARS/2p-FLIM/TPEF, le fasi di acquisizione delle immagini, l'elaborazione dei dati e i risultati rappresentativi che mostrano che il metodo di imaging cross-mode consente una caratterizzazione rigorosa e il rilevamento in vivo a risoluzione subcellulare. Questo protocollo fornisce un quadro per l'imaging simultaneo del ciclo di vita chimico e della fluorescenza per migliorare l'accuratezza dell'interpretazione biologica in sistemi viventi complessi.

Introduzione

Una sfida negli studi biologici è quella di rilevare con precisione i materiali da costruzione biologici nel loro stato nativo e all'interno dell'architettura intatta di cellule e tessuti. La spettroscopia Raman mostra un potenziale senza precedenti per la rilevazione di metaboliti intrinseci e specie chimiche all'interno di campioni biologici ed è stata recentemente riconosciuta come uno strumento emergente per la profilazione metabolica di campioni biologici1. Analizzando i picchi di vari gruppi metabolici mostrati negli spettri delle impronte digitali Raman, prove crescenti dimostrano che le caratteristiche delle impronte digitali possono essere utilizzate per rilevare le prime fasi di malattie come il cancro 2,3,4, i disturbi cardiaci 5,6 e le malattie neurodegenerative 7,8 ed è particolarmente utile per affrontare problemi biologici fondamentali 9,10 compreso l'imaging di strutture intracellulari senza alcuna perturbazione della marcatura11, la differenziazione di vari stati cellulari12,13 e la classificazione del tipo di cellula 14,15,16. La maggior parte delle informazioni chimiche (> 90%) codificate negli spettri Raman si trovano nella regione delle impronte digitali (da 500 a 1800 cm-1), rendendo questa regione di gran lunga la più utile per discriminare le composizioni chimiche nei campioni biologici17. Tuttavia, il debole segnale Raman in questa gamma di frequenze rende difficili le applicazioni della spettroscopia di impronte digitali Raman agli studi biologici, in particolare per i campioni biologici vivi e intatti1.

Gli approcci di imaging Raman coerente (CRI) riducono significativamente il tempo di acquisizione dei segnali Raman, ma la maggior parte di questi acquisisce segmenti spettrali relativamente stretti e sono ottimizzati per i forti segnali di allungamento CH tra 2800 e 3100 cm-1. Le CAR a banda stretta e lo scattering Raman stimolato (SRS) (Figura 1A, B) utilizzano due impulsi di picosecondi, di solito per acquisire una porzione stretta del forte segnale CH 18,19,20,21,22,23. Gli approcci CRI multiplex, come i multiplex CARS (Figura 1C), utilizzano una combinazione di impulsi a picosecondi e ~100 fs per ottenere un intervallo spettrale moderato (solitamente ≤ 400 cm-1) solitamente nella regione CH 24,25,26,27,28,29,30. L'acquisizione di un intero spettro Raman biologicamente rilevante (da 600 a 3200 cm-1) per pixel utilizzando questi approcci di imaging è solitamente proibitivo perché la maggior parte dei segnali delle impronte digitali sono 10-100 volte più deboli dei segnali CH-stretch31. A differenza della maggior parte degli approcci CRI, lo scattering Raman anti-Stokes coerente a banda larga (BCARS) è ottimizzato per l'acquisizione a banda larga single-shot che copre le regioni dell'impronta digitale e del tratto CH 31,32,33. BCARS utilizza le interazioni intra-impulso di un impulso di ~10 fs per eccitare in modo efficiente le vibrazioni a bassa frequenza (impronta digitale) (Figura 1D) e utilizza lo stesso meccanismo del multiplex CARS, la combinazione dell'impulso fs con un impulso ps per generare coerenza vibrazionale nella regione di allungamento CH (Figura 1C)32,33. Inoltre, i segnali BCARS sono intrinsecamente calibrati a causa della loro interazione con il fondo non risonante (NRB), risultando in uno spettro Raman completo quantitativo e invariante allo strumento per impulso laser ad ogni pixel31, con la capacità di acquisire rapidamente dati ad alto contenuto di informazioni da cellule, tessuti intatti e organismi biologici vivi 32,34,35,36,37,38,39.

Gli spettri grezzi BCARS acquisiti contengono un forte cosiddetto "fondo non risonante" (NRB). L'NRB è il contributo della risposta elettronica agli impulsi laser che non è chimicamente specifico. L'NRB interferisce coerentemente con il segnale vibrazionalmente risonante, agendo come un amplificatore eterodina32. L'NRB distorce, inoltre, lo spettro Raman sottostante (Figura 2A), ma lo spettro Raman può essere recuperato a condizione che vengano acquisite sezioni spettrali contigue significative. Attualmente, non è disponibile alcun metodo di post-elaborazione per separare il segnale CARS risonante dalla componente non risonante utilizzando un approccio CARS a banda stretta. Il recupero del segnale Raman dal segnale CARS a banda larga può essere ottenuto utilizzando la relazione di Kramers-Kronig nel dominio del tempo (o trasformata di Hilbert)33,40 (Figura 2B), l'entropia massima 41,42 o l'apprendimento automatico 43,44,45,46,47,48 Approcci. Si noti che i primi due metodi recuperano analiticamente la fase (il segnale Raman risonante) dagli spettri grezzi BCARS, gli approcci di apprendimento automatico possono dipendere fortemente dalla strumentazione e dai modelli di addestramento.

Mentre la microscopia BCARS consente la caratterizzazione senza marcatura del profilo metabolico di campioni biologici, lo stesso laser supercontinuum (950 - 1200 nm per la configurazione BCARS presentata in questo lavoro) utilizzato per la generazione del segnale BCARS può anche eccitare un'ampia gamma di coloranti, come coloranti a base di rodamina, a base di Bodipy, Alexa Fluor e coloranti a base di cianina e varie proteine fluorescenti, tra cui GFP e mCherry49, 50. Rispetto all'eccitazione a singolo fotone con laser a onda continua visibile (CW), la microscopia a fluorescenza multifotone, come la microscopia a fluorescenza a due fotoni (2p-FLIM) e la microscopia a fluorescenza a fluorescenza a due fotoni (TPEF), che utilizza la luce nel vicino infrarosso (NIR) offre una profondità di penetrazione del campione più profonda, una capacità intrinseca di sezionamento 3D, immagini ad alto contrasto e una buona risoluzione paragonabile alla microscopia confocale all'avanguardia, rendendola uno strumento interessante per la biologia ricerca 51,52. La microscopia a fluorescenza con tempo di percorrenza (FLIM) che utilizza un approccio di conteggio di singoli fotoni correlato al tempo (TCSPC) rileva i segnali di decadimento della fluorescenza ripetutamente eccitati da una sorgente laser modulata nel tempo53,54. Lo spettro di fluorescenza di un dato fluoroforo può cambiare in base a fattori ambientali come la polarità del solvente, ma questi cambiamenti sono solitamente sottili. D'altra parte, i tempi di vita della fluorescenza spesso variano di due o più fattori con cambiamenti ambientali come valori di pH55, viscosità56, polarità57 e concentrazione di specie ioniche58,59, interazioni di legame, presenza di quencher o cambiamenti strutturali53,54. Questa proprietà unica del tempo di vita della fluorescenza fornisce un ulteriore contrasto del segnale nell'imaging a fluorescenza e ha affrontato con successo i problemi dell'interferenza dell'autofluorescenza nell'imaging cellulare e tissutale60, la dismiscelazione di più fluorofori utilizzando un approccio FLIM a risoluzione spettrale61, la diagnosi del cancro e il monitoraggio del trattamento62, il rilevamento senza marcatura dell'eterogeneità cellulare63 e le alterazioni metaboliche64,65.

In questo lavoro, introduciamo una piattaforma di imaging multimodale che combina BCARS, 2p-FLIM e TPEF. Per quanto ne sappiamo, questa è la prima volta che presentiamo una piattaforma di imaging che consente l'imaging simultaneo BCARS e 2p-FLIM/TPEF. Dimostriamo le capacità di imaging in vivo di questo strumento utilizzando un organismo modello geneticamente trattabile ampiamente utilizzato, Caenorhabditis elegans (C. elegans). Mostriamo che gli spettri BCARS, i decadimenti 2p-FLIM del rosso del Nilo (un colorante lipidico vitale) e i segnali GFP a fluorescenza a due fotoni di un marcatore lipidico riportato (DHS-3::GFP) possono essere acquisiti simultaneamente in vivo da vermi colorati con rosso del Nilo. Una guida pratica per l'approccio di imaging qui presentato include (i) il campione deve essere otticamente trasparente e con uno spessore tipicamente inferiore a 100 μm; (ii) la condizione di colorazione può essere diversa a seconda dei coloranti e dei campioni. Nella colorazione con rosso Nilo di C. elegans qui mostrata, la concentrazione di rosso Nilo è a livello di ~μM e il tempo di colorazione può variare da poche ore a66 durante la notte; (iii) è necessario un ambiente campione buio per evitare la dispersione di luce visibile nei rivelatori 2p-FLIM/TPEF. Queste condizioni di imaging sono identiche alle condizioni di imaging della maggior parte della microscopia ottica e a fluorescenza non lineare. Inoltre, il nostro sistema qui dimostrato può essere ulteriormente applicato per rilevare altri coloranti e reporter fluorescenti oltre al rosso Nilo e alla GFP introducendo un laser fs Ti:Sapphire aggiuntivo che copre l'intervallo 700 -950 nm per l'eccitazione a fluorescenza a due fotoni. Pertanto, mentre i risultati rappresentativi descritti in questo protocollo sono l'imaging in vivo di C. elegans colorato con colorante che esprime GFP, la piattaforma di bioimaging chimico ad altissimo contenuto informativo ha applicazioni ampie e di vasta portata.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. C . Preparazione del campione elegans e colorazione Nile Red Vital

NOTA: C. elegans è stato ampiamente utilizzato per molteplici tecniche di imaging grazie alla sua trasparenza su tutto il corpo. Gli organi interni e i tessuti possono essere facilmente visualizzati nell'animale intatto senza dissezione. Inoltre, l'approvazione etica non è richiesta per la ricerca che coinvolge C. elegans, in quanto non sono considerati vertebrati e non sono soggetti alle stesse norme etiche degli animali superiori come i roditori. Questa sezione descrive la sincronizzazione dei vermi C. elegans e la preparazione di campioni colorati con rosso del Nilo per l'imaging a fluorescenza. I vermi adulti sincronizzati di un giorno sono ottenuti tramite un protocollo di deposizione delle uova di due generazioni e colorati utilizzando piastre Nile Red-OP50 appena preparate.

  1. Mantenere i ceppi di C. elegans (ad es. N2, LIU1 ldrIs1 [dhs-3p::d hs-3::GFP + unc-76(+)]) su piastre standard con terreno di crescita per nematodi (NGM) seminate con batteri OP50 a 20 °C.
  2. Sincronizzare i worm
    1. Raccogli 10-20 vermi adulti gravidi su una piastra NGM con semi OP50 appena fatta.
    2. Incubare la piastra a 20 °C per 1-3 ore per consentire la deposizione delle uova.
    3. Eliminate tutti i vermi adulti, lasciando nel piatto solo le uova appena deposte.
    4. Incubare la piastra a 20 °C fino a quando i vermi raggiungono lo stadio adulto di un giorno.
    5. Ripetere i passaggi precedenti per un'ulteriore generazione per migliorare la precisione della sincronizzazione.
  3. Preparare la soluzione madre di Nile Red
    1. Sciogliere 15,92 mg di rosso del Nilo in 10 mL di DMSO a una concentrazione finale di 5 mM.
    2. Sonicare per 10-30 minuti, se necessario, per favorire la dissoluzione.
  4. Preparare le piastre di colorazione Nile Red-OP50.
    1. Miscelare accuratamente il liquame batterico OP50 con il brodo rosso del Nilo per ottenere una concentrazione finale di 5 μM per piastra NGM. Ad esempio, mescolare 10 μL di brodo Nile Red con 20 μL di liquame batterico OP50, quindi applicare immediatamente l'intera miscela su una piastra di agar NGM non seminata da 6 cm (con ~10 mL di volume) per ottenere una concentrazione finale di Nile Red di 5 μM per piastra NGM.
    2. Distribuire uniformemente il composto su piastre NGM da 6 cm senza semi.
    3. Conservare le piastre al buio a temperatura ambiente per una notte per consentire la crescita batterica e l'assorbimento del colorante.
  5. Vermi sincronizzati con macchie
    1. Trasferire 30-50 vermi adulti sincronizzati di un giorno su ciascuna piastra Nile Red-OP50 preparata.
    2. Incubare i vermi al buio a 20 °C per 1-2 ore prima dell'imaging.
  6. Immobilizza i vermi per l'imaging
    1. Applicare una goccia di 100 mM di azoturo di sodio su un tampone di agarosio al 2% su un vetrino da microscopio (circa 10-15 μl per 20 vermi)
    2. Trasferire i vermi colorati nell'agente anestetizzante (azoturo di sodio) e coprire i vermi con un vetrino coprioggetti prima della microscopia.
      NOTA: Quando si raccolgono 10-20 adulti gravidi su una piastra NGM OP50 appena fatta nella prima fase della sincronizzazione della deposizione delle uova, raccogliere solo gli adulti, ma non le uova o le larve randagi. Questo per assicurarsi che tutte le uova rimanenti sui piatti siano prodotte dai vermi raccolti entro la finestra temporale di 1-3 ore per la deposizione delle uova. Inoltre, l'azide di sodio è classificata come materiale pericoloso, sebbene richieda una quantità molto piccola per l'anestesia dei nematodi. L'utilizzo e lo smaltimento dei rifiuti di sodio azidrico devono seguire le linee guida della direzione istituzionale di Salute e Sicurezza Ambientale.

2. Generazione del fascio di sonda

NOTA: Questo protocollo descrive la generazione del fascio di sonda a picosecondi (ps) utilizzando un oscillatore parametrico ottico (OPO) costruito in casa, seguita dalla generazione di seconda armonica (SHG) con un sistema di loop di feedback del segnale costruito in casa per stabilizzare la potenza di uscita del fascio di sonda.

  1. Accendere il laser con pompa OPO da 1030 nm (Figura 3A o il laser con pompa OPO da quasi 1ps, ~3 W mostrato nella Figura 4) e attendere almeno 2 ore per l'equilibrio termico. Un'uscita stabile è fondamentale per il funzionamento dell'OPO.
  2. Guidare l'uscita verso la cavità OPO
    1. Selezionare il periodo di polarizzazione appropriato sul cristallo OPO PPLN (Figura 3A) in modo che corrisponda alla lunghezza d'onda del segnale target.
    2. Dirigere il raggio nel primo specchio curvo (CM) (Figura 3A), che fa parte di una cavità lineare.
    3. Assicurarsi che il raggio passi attraverso il cristallo di niobato di litio (PPLN) OPO periodicamente polarizzato (Figura 3A) per facilitare la conversione parametrica ottica verso il basso (Figura 3B).
    4. Assicurarsi che il raggio si rifletta su un secondo specchio curvo (CM) e poi sullo specchio terminale (EM) (Figura 3A) per formare l'anello della cavità.
    5. Configurare l'accoppiatore di uscita (OC) (Figura 3A) per estrarre il raggio di segnale generato dalla cavità.
  3. Regolare la temperatura del cristallo OPO PPLN utilizzando il regolatore di temperatura (TC) (Figura 3A) per selezionare la lunghezza d'onda del segnale. Una lunghezza d'onda tipica del segnale è di 1530 nm, corrispondente a una potenza di uscita di circa 0,8 W quando pompato con 3 W a 1064 nm.
  4. Ottimizza l'allineamento OPO
    1. Regola la posizione e l'inclinazione di due CM ed EM per massimizzare la potenza di uscita e la qualità del raggio.
    2. Regolare la lunghezza della cavità per spostare lo spettro del segnale alla frequenza desiderata.
  5. Instradare il fascio di segnale OPO attraverso una serie di ottiche di collimazione e focalizzazione e guidarlo nello stadio SHG.
    1. Selezionare il periodo di polarizzazione appropriato sul cristallo SHG PPLN (Figura 3A) in modo che corrisponda alla lunghezza d'onda del segnale target.
    2. Controlla con precisione la temperatura del cristallo utilizzando un regolatore di temperatura per massimizzare l'efficienza SHG.
    3. Dirigere il fascio nel cristallo SHG PPLN per la generazione di seconda armonica, convertendo il segnale OPO da 1530 nm a 765 nm (Figura 3C). L'efficienza di conversione SHG tipica è di circa il 30% in condizioni di allineamento ottimali.
    4. Inserire un filtro passa-corto da 1300 nm (SPF nella Figura 3A, specifiche nella Tabella dei materiali) dopo l'SHG PPLN per rimuovere la luce fondamentale residua da 1530 nm.
    5. Collimare il fascio risultante di 765 nm utilizzando una lente appropriata (come L nella Figura 3A).
  6. Implementare la stabilizzazione dell'alimentazione
    1. Utilizzare una finestra a cuneo (WW) per campionare il fascio SHG e dirigerlo verso un fotodiodo (PD).
    2. Assicurarsi che un anello di retroazione confronti il segnale del fotodiodo (PD nella Figura 3A) con un valore di riferimento e aziona il Picomotor sullo specchio terminale (EM) per regolare la lunghezza della cavità OPO in tempo reale, stabilizzando così la potenza di uscita SHG.
      NOTA: Per determinare il valore di riferimento, scansionare prima la posizione EM utilizzando il Picomotor durante la registrazione della potenza di uscita SHG. Identificare l'intensità di picco in questo profilo, quindi impostare il valore di riferimento al 90% del picco. Questa scelta garantisce una chiara direzione di correzione del feedback, consentendo al sistema di compensare sia l'andamento crescente che quello decrescente della potenza e di stabilizzare efficacemente la potenza di uscita nel tempo.

3. Generazione di supercontinuum (SC) per BCARS

NOTA: Lo schema semplificato del sistema multimodale basato su BCARS è mostrato nella Figura 4. Questo protocollo descrive la generazione del fascio SC.

  1. Regolare il pre-chirp (Group Delay Dispersion, GDD) sull'uscita dell'impulso a femtosecondi (fs) (1030 nm, 150 fs, ~1 W) per ottenere una larghezza di banda SC sufficientemente ampia che copra i segnali della regione dell'impronta digitale (larghezza di banda SC ≥ 1800 cm-1). A tale scopo, regolare la separazione di una coppia di reticoli (vedere la Figura 4), in modo da ottenere un controllo preciso della dispersione.
    NOTA: L'applicazione del GDD pre-compensato è fondamentale per generare l'impulso desiderato e ottimizzare la generazione di SC. Il valore GDD richiesto può variare a seconda delle caratteristiche specifiche del sistema laser utilizzato.
  2. Incorporare un telescopio a fascio costituito da due lenti con le stesse lunghezze focali per regolare la divergenza del raggio della pompa.
    NOTA: Quando il raggio viaggia per metri prima di entrare nella fibra di allargamento, il controllo preciso della divergenza del fascio diventa essenziale. Il mantenimento di un fascio collimato durante questa distanza è fondamentale per garantire un'efficiente generazione di SC.
  3. Configurare l'autoallineatore (Figura 4) utilizzando supporti per specchi cinematici dotati di attuatori piezoelettrici per lo sterzo del raggio. Combinali con zoccoli ottici e un rilevatore di rilevamento della posizione (PSD) per monitorare attivamente e correggere l'allineamento del raggio.
  4. Posizionare i componenti in modo che la distanza tra il cuneo e il primo specchio sia uguale alla distanza tra il cuneo e il primo PSD. Questa configurazione simmetrica garantisce la stabilità del puntamento del fascio nella fibra di allargamento.
    NOTA: L'allineamento attivo è essenziale per massimizzare l'efficienza di ampliamento spettrale e ridurre al minimo il rischio di danni all'ingresso della fibra.
  5. Utilizzare una piastra a semionda (HWP) e un divisore di fascio polarizzatore (PBS) per controllare la potenza del laser prima dell'accoppiamento nella fibra. Ruotare l'HWP per regolare l'angolo di polarizzazione rispetto al PBS, regolando così la potenza trasmessa. Sebbene questi componenti non siano mostrati nella Figura 4, sono fondamentali per l'allineamento sicuro e il controllo dell'alimentazione.
  6. Accoppiare circa 1 W di potenza laser in una fibra a cristalli fotonici (PCF) LMA-PM-5 (Large-Mode-Area Polarization Keeping) da 10 cm utilizzando un accoppiatore in fibra. La procedura di accoppiamento è la seguente:
    1. Innanzitutto, ridurre la potenza del laser a ~20-50 mW durante l'allineamento iniziale per evitare danni alla fibra.
    2. Dirigere il raggio collimato nella fibra, assicurandosi che una parte della luce emerga dall'altro lato. Ottimizza il percorso del raggio regolandone la posizione per massimizzare la potenza di uscita.
    3. Inserire la lente asferica (Figura 4), regolare nuovamente il raggio per massimizzare la potenza di uscita.
    4. Regolare la posizione z della lente asferica per garantire una messa a fuoco precisa sulla sfaccettatura della fibra.
    5. Ripetere le regolazioni dell'allineamento e della messa a fuoco in modo iterativo per massimizzare l'efficienza dell'accoppiamento.
    6. Aumentare la potenza del laser a 1 W per il funzionamento.
  7. Collimare l'uscita del supercontinuum a banda larga (SC) risultante dal PCF utilizzando uno specchio parabolico fuori asse (OAP) con lunghezza focale f = 15 mm, come mostrato nella Figura 4.
    NOTA: Le ottiche riflettenti, come lo specchio OAP, sono preferite per i fasci a banda larga per ridurre al minimo l'aberrazione cromatica introdotta dagli elementi rifrattivi.
  8. Guidare l'uscita del supercontinuum a banda larga collimato (SC) in un compressore a prisma (Figura 4) costituito da una coppia di prismi Schott Flint (SF10).
    1. Dirigere il fascio SC verso l'apice del primo prisma per avviare la dispersione spettrale.
    2. Posizionare il secondo prisma in modo che il raggio disperso entri attraverso il suo apice.
    3. Montare entrambi i prismi su un sistema di binari per consentire una regolazione grossolana della separazione dei prismi. Traslare il secondo prisma lungo il binario per regolare la lunghezza del percorso ottico e la compressione complessiva. La separazione per questo sistema è di 44 cm.
    4. Monta il primo prisma su uno stadio di traslazione lineare di precisione. Regolare la profondità di inserimento del primo prisma per regolare con precisione la compensazione della dispersione.
    5. Regolare iterativamente sia la separazione del prisma che la lunghezza di inserimento del secondo prisma per ottenere una compressione temporale ottimale dell'impulso SC. Determinare la compressione temporale ottimale abbinando il segnale di miscelazione degenere a quattro onde (DFWM) osservato sperimentalmente con risultati simulati che tengono conto della dispersione del ritardo di gruppo (GDD) e della dispersione del terzo ordine (TOD). Questo approccio prevede l'esecuzione di una simulazione del processo di generazione del supercontinuum, incorporando gli effetti di GDD e TOD, che fornisce un riferimento per le caratteristiche temporali e spettrali attese degli impulsi SC compressi in modo ottimale. Quindi, regolare iterativamente i parametri del compressore del prisma per compensare il GDD e il TOD presenti nel sistema fino a quando il segnale DFWM sperimentale non corrisponde alle previsioni della simulazione. Un risultato tipico del profilo spettrale della SC è mostrato nella Figura 5.
      NOTA: Un'adeguata compensazione della dispersione migliora la coerenza spettrale dell'SC. In condizioni di allineamento ottimale, l'uscita SC ha una potenza di circa 150 mW, una lunghezza d'onda centrale di circa 1060 nm e copre un intervallo spettrale da 950 a 1200 nm (corrispondente a 1800 cm-1). Questi valori possono variare leggermente a seconda dell'allineamento e dell'efficienza di accoppiamento delle fibre.
  9. Combinare i fasci della sonda e del supercontinuo utilizzando uno specchio dicroico (vedere DM nella Figura 4). Allineali con un paio di fori stenopeici per assicurarti che entrambi i raggi siano collineari. Focalizzare i raggi combinati su un fotodiodo ad alta frequenza (larghezza di banda di 1 GHz). Per una qualità ottimale del segnale, entrambi i raggi devono essere sovrapposti sia nel dominio spaziale che in quello temporale. Il processo è il seguente:
    1. Dirigere l'uscita dal fotodiodo a un oscilloscopio ad alta frequenza (larghezza di banda di 500 MHz). Utilizzare il grilletto laser come orologio di riferimento.
    2. Bloccare il fascio della sonda e misurare gli impulsi SC. Registrare le differenze temporali tra gli impulsi SC e il riferimento laser.
    3. Bloccare il fascio SC e misurare gli impulsi della sonda. Regolare la linea di ritardo meccanica (come mostrato nella Figura 4) in modo che gli impulsi della sonda si sovrappongano agli impulsi SC nel tempo. Assicurarsi che i due raggi raggino il loro massimo contemporaneamente.
    4. Rimuovere il fotodiodo e lasciare che il raggio proceda nel microscopio.
      NOTA: I passaggi precedenti descrivono una regolazione grossolana per la sovrapposizione del raggio. Un'ulteriore ottimizzazione per un allineamento più preciso è illustrata nei passaggi da 6.1 a 6.9.

4. Impostazione del rilevamento della fluorescenza per 2p-FLIM e TPEF e introduzione di un laser Ti:Sapphire fs aggiuntivo

  1. Accendi il laser Ti:Sapphire e lascialo raggiungere l'equilibrio termico. Attendere circa 2 ore per garantire una potenza di uscita stabile e il puntamento del raggio.
    NOTA: In questo studio, l'imaging TPEF e FLIM è stato eseguito utilizzando la sorgente SC, che fornisce un'ampia copertura spettrale e una potenza sufficiente per fluorofori come GFP e Nile Red. Il laser Ti:Sapphire è incluso nel sistema come sorgente di eccitazione opzionale per fluorofori con picchi di assorbimento di due fotoni inferiori a 950 nm, che potrebbero non essere eccitati in modo efficiente dal SC.
  2. Attiva il meccanismo di blocco della modalità sul laser Ti:Sapphire. Confermare il blocco della modalità stabile tramite il monitor integrato.
  3. Pre-chirp degli impulsi Ti:Sapphire per una compressione temporale ottimale sul campione utilizzando un compressore a prisma. Disporre i prismi in una configurazione simile a quella descritta al punto 3.8 e regolare la lunghezza di inserimento del secondo prisma per regolare con precisione la durata dell'impulso.
    NOTA: Una corretta compressione temporale garantisce l'intensità di picco e un'efficiente eccitazione a due fotoni sul piano del campione.
  4. (Facoltativo) Accoppiare il fascio Ti:Sapphire in una fibra monomodale che mantiene la polarizzazione se il laser si trova su un tavolo ottico separato. Regolare l'ottica di accoppiamento dell'ingresso e monitorare l'uscita della fibra per ridurre al minimo le perdite di accoppiamento.
  5. Combinare il fascio Ti:Zaffiro con il supercontinuum (SC) e sondare i fasci utilizzando uno specchio dicroico (vedere il punto di combinazione al PBS mostrato nella Figura 3). Allineare attentamente i raggi per garantire la sovrapposizione spaziale al dicroico e la co-propagazione verso il microscopio.
  6. Guidate i fasci combinati verso il microscopio e regolate con precisione la loro sovrapposizione spaziale. Utilizzare un campione fluorescente (ad esempio, un vetrino con perle di polistirene fluorescente da 1 μm) per verificare l'allineamento del fascio di Ti:Zaffiro rispetto al percorso di eccitazione BCARS. Regolare gli specchi di allineamento Ti:Sapphire per garantire che l'emissione di fluorescenza sia co-localizzata con il punto focale BCARS all'interno dello stesso campo di imaging. Confermare la colocalizzazione visualizzando la sovrapposizione tra le immagini BCARS e TPEF acquisite contemporaneamente, dove l'offset spaziale deve essere inferiore a un pixel.
    NOTA: Ottenere la sovrapposizione spaziale tra i segnali di fluorescenza e BCARS è essenziale per la registrazione multimodale delle immagini.
  7. Inserire uno specchio dicroico prima dell'input del microscopio per riflettere la fluorescenza retrodiffusa verso il percorso di rilevamento. Selezionare un dicroico con una lunghezza d'onda di taglio appropriata per separare in modo efficiente la fluorescenza dai fasci di eccitazione.
  8. Inserire un secondo specchio dicroico a valle nel percorso di emissione per suddividere il segnale di fluorescenza in due rami di rivelazione:
    1. Trasmetti lunghezze d'onda ≥ 550 nm al rivelatore FLIM.
    2. Rifletti lunghezze d'onda ≤ 550 nm verso un tubo fotomoltiplicatore (PMT) per il rilevamento analogico a fluorescenza eccitata a due fotoni (TPEF).
      NOTA: Installare filtri passa-banda in ogni ramo di rilevamento per bloccare la luce di eccitazione residua e per isolare specifiche bande di emissione.
  9. Collegare l'uscita PMT a un preamplificatore e alimentare il segnale analogico amplificato in un dispositivo di acquisizione dati (DAQ). Condividere il trigger di sincronizzazione globale dall'FPGA (Field Programmable Gate Array) con il DAQ per garantire l'allineamento temporale tra le modalità di imaging (Figura 7).
  10. Collegare l'uscita del rivelatore FLIM a un modulo di conteggio di singoli fotoni correlati al tempo (TCSPC).
    1. Collegare il segnale del rivelatore FLIM all'ingresso di avvio del modulo TCSPC.
    2. Collegare l'uscita di sincronizzazione del laser Ti:Sapphire (o BCARS SC) all'ingresso di riferimento del modulo TCSPC.
    3. Collegare il trigger globale della telecamera (generato dall'FPGA) all'ingresso di sincronizzazione dei fotogrammi del modulo TCSPC per sincronizzarlo con l'acquisizione di immagini a scansione lineare.

5. Impostazione del percorso di rilevamento BCARS

NOTA: Questo protocollo descrive l'impostazione di un percorso di rilevamento descansionato per l'imaging iperspettrale a scansione lineare. Lo specchio galvo 1D scansiona il fascio di eccitazione lungo l'asse y con un tempo di permanenza di 2-4 ms per pixel per un'integrazione del segnale sufficiente. Dopo ogni scansione lineare, lo stadio del campione avanza di un passo lungo l'asse x. La descansione utilizzando uno specchio galvo secondario sincronizzato è essenziale per mantenere una registrazione spaziale coerente del segnale spettrale sulla fotocamera durante la scansione rapida del raggio, eliminando la diafonia del segnale tra pixel adiacenti e preservando la fedeltà spaziale-spettrale39.

  1. Introdurre il supercontinuum (SC) e i fasci di sonda in uno scanner galvo unidimensionale (1D) (come mostrato nella Figura 4 e maggiori dettagli nel riferimento39). Posizionare lo specchio galvo coniugato all'apertura posteriore dell'obiettivo di messa a fuoco per consentire una scansione accurata del raggio in tutto il campo visivo.
  2. Espandere ciascun raggio utilizzando un espansore di fascio riflettente (come mostrato nella Figura 4) in modo che corrisponda all'apertura posteriore dell'obiettivo di eccitazione. Ciò garantisce una messa a fuoco ottimale e la massima risoluzione spaziale sul piano del campione.
    NOTA: Utilizzare ottiche riflettenti per ridurre al minimo l'aberrazione cromatica e mantenere il contenuto spettrale a banda larga del raggio SC.
  3. Posizionare un target di allineamento sul piano di apertura posteriore dell'obiettivo di eccitazione. Regolare i raggi SC e sonda in modo che entrambi passino attraverso il centro del bersaglio, garantendo il co-allineamento lungo l'asse ottico.
    NOTA: La precisa sovrapposizione spaziale massimizza la potenza del segnale BCARS e garantisce la massima risoluzione spaziale nel punto focale.
  4. Focalizzare i fasci sul campione utilizzando un obiettivo di eccitazione ad alta NA (ad esempio, 1,2 NA, obiettivo a immersione in acqua 60x) montato su un microscopio invertito.
  5. Preparare un campione di allineamento inserendo una goccia d'acqua tra due vetrini coprioggetti per creare un vetrino da microscopio sigillato. Posizionare il vetrino preparato sul tavolino del microscopio e regolare la messa a fuoco per portare il campione in vista.
  6. Raccogli il segnale anti-Stokes generato in trasmissione utilizzando un obiettivo di raccolta posizionato di fronte al percorso di eccitazione.
  7. Implementare un sistema di descanning 4f (come mostrato nella Figura 4) per preservare la mappatura spaziale del segnale anti-Stokes su file fisse del rivelatore.
    1. Relè il piano focale posteriore (BFP) dell'obiettivo di raccolta sull'asse dello specchio galvo di descansione utilizzando un sistema ottico 4f. Questo è costituito da due lenti tubolari di precisione (vedi Tabella dei materiali), disposte in modo tale che:
      1. La prima lente viene posizionata una lunghezza focale (200 mm) dopo il BFP dell'obiettivo di raccolta.
      2. La seconda lente è posizionata una lunghezza focale prima dello specchio galvo.
    2. Sincronizza il galvo di descansione con il galvo di scansione utilizzando un generatore di forme d'onda controllato da FPGA.
    3. Integra un potenziometro digitale a 7 bit nel sistema di controllo FPGA per consentire la regolazione dell'ampiezza del galvo di descansione.
      NOTA: Lo specchio galvo di descansione compensa le deflessioni angolari introdotte dal galvo a scansione primaria. Regolando dinamicamente il suo angolo in sincronia, contrasta il movimento del fascio, assicurando che il segnale anti-Stokes rimanga allineato lungo l'asse ottico che porta allo spettrometro. Questa stabilizzazione è essenziale per mantenere la registrazione spaziale sul rivelatore e prevenire lo spostamento laterale dell'immagine spettrale durante la scansione.
  8. Configurare il sistema FPGA (vedere la tabella dei materiali) per sincronizzare la scansione galvo e l'attivazione della telecamera.
    1. Genera uscite analogiche per la scansione e il descanning dei galvo.
    2. Accetta un trigger della fase di input per contrassegnare l'inizio di ogni scansione di linea.
    3. Segnali di trigger di acquisizione del frame in uscita alla fotocamera scientifica a semiconduttore di ossido di metallo complementare (sCMOS) in ogni posizione di scansione.
    4. Controlla in modo indipendente l'ampiezza del descanning per adattarsi a diversi obiettivi di raccolta.
      NOTA: Un tipico treno di impulsi FPGA include un segnale di pilotaggio galvo a scansione, un segnale di pilotaggio galvo a descansione, un ingresso trigger Stage e un pixel clock per la temporizzazione sincronizzata dei fotogrammi.
  9. Far passare il segnale anti-Stokes collimato attraverso due filtri passa-corto per bloccare la pompa residua e la luce di eccitazione SC.
  10. Focalizzare il segnale anti-Stokes filtrato attraverso la fessura d'ingresso dello spettrometro e sul rivelatore sCMOS. Regolare gli angoli delle galvos di scansione e di descansione per garantire che il raggio venga scansionato parallelamente all'asse lungo della fenditura, allineando il piano ottico dell'immagine con la fenditura. Questo allineamento preciso massimizza la risoluzione spettrale e riduce al minimo la diafonia laterale del segnale tra le file del rivelatore.
  11. Configurare lo spettrometro in modo che disperda verticalmente lo spettro anti-Stokes lungo le file della telecamera. Selezionare un reticolo appropriato (ad esempio, 300 linee/mm, fiammato a 700 nm) per una copertura spettrale ottimale.

6. Ottimizzazione del segnale e calibrazione della risoluzione spettrale

  1. Avvia il software di acquisizione costruito in casa e inizia il monitoraggio del segnale in tempo reale dalla telecamera sCMOS. Il software di acquisizione è costruito internamente in Python 3.8+ (Windows 10) con dipendenze che includono i driver Hamamatsu DCAM-API e Measurement Computing Universal Library, che emettono dati in formato HDF5. Il software è disponibile su ragionevole richiesta dell'autore corrispondente.
  2. Preparare un campione di calibrazione spettrale posizionando una goccia di benzonitrile tra due vetrini coprioggetti per formare un vetrino sigillato. Posizionare il vetrino sul tavolino del microscopio e metterlo a fuoco utilizzando l'obiettivo di eccitazione.
  3. Individuare il segnale BCARS sulla fotocamera sCMOS. Regolare la posizione z dell'obiettivo di raccolta per massimizzare l'intensità del segnale anti-Stokes.
  4. Regolare la posizione laterale dell'obiettivo di raccolta per assicurarsi che la luce anti-Stokes sia correttamente focalizzata attraverso la fessura d'ingresso dello spettrometro. Questo allineamento garantisce un accoppiamento ottimale nello spettrometro e una migliore fedeltà spettrale.
  5. Ottimizza la sovrapposizione spaziale tra il supercontinuum (SC) e i fasci della sonda sul piano del campione. Utilizzare gli specchi nel percorso del fascio della sonda per regolare con precisione la posizione laterale e l'angolo di incidenza.
  6. Traslare la linea di ritardo ottico nel percorso del fascio della sonda per garantire la sovrapposizione temporale con gli impulsi SC. Monitorare l'intensità del segnale e regolare fino a massimizzare il segnale anti-Stokes, confermando la corretta sincronizzazione temporale.
  7. Identificare un picco Raman forte e nitido nel benzonitrile (ad esempio, 1002 cm-1) sull'immagine sCMOS.
  8. Registrare la lunghezza d'onda della sonda e la posizione dei pixel corrispondente sulla fotocamera. Utilizzare la linea di Rayleigh (0 cm-1 alla lunghezza d'onda della sonda) e i picchi Raman noti del benzonitrile a 1002 cm-1 e 3073 cm-1 per stabilire una mappatura lineare pixel-numero d'onda attraverso il rivelatore sCMOS. La linea di Rayleigh fornisce il riferimento del numero d'onda zero, mentre i picchi del benzonitrile determinano l'incremento del numero d'onda per pixel.
    NOTA: Poiché l'analisi richiede solo informazioni sul numero d'onda relativo (mappatura tra la posizione dei pixel e lo spostamento Raman), non è necessaria la calibrazione assoluta della lunghezza d'onda utilizzando lampade a emissione.
  9. Inserire la mappatura del numero d'onda pixel nel software di acquisizione. Questa calibrazione dovrebbe rimanere valida a meno che non vengano apportate modifiche al percorso ottico, all'impostazione del reticolo nello spettrometro o all'allineamento.

7. Acquisizione del segnale

  1. Caricare il campione di C. elegans preparato nei passaggi da 1.1 a 1.6 sul tavolino del microscopio. Individua una regione di interesse e mettila a fuoco utilizzando l'obiettivo di eccitazione.
  2. Identificare una regione del vetrino priva di segnale Raman-attivo (fondo d'acqua o vetrino coprioggetti nudo) che funga da riferimento per il fondo non risonante (NRB).
  3. Localizzare il segnale BCARS sul rilevatore sCMOS. Regolare con precisione la posizione z dell'obiettivo di raccolta per massimizzare l'intensità del segnale anti-Stokes.
  4. Regolare la posizione laterale dell'obiettivo di raccolta per assicurarsi che la luce anti-Stokes sia allineata correttamente attraverso la fessura di ingresso dello spettrometro.
  5. Avvia la scansione sincronizzata e la descansione degli specchi galvo utilizzando l'FPGA. Regolare l'ampiezza del galvo di descansione utilizzando il potenziometro digitale fino a quando la deflessione angolare della scansione primaria non è completamente compensata. Il segnale anti-Stokes deve rimanere confinato entro ~12 righe sulla fotocamera per l'intero intervallo di scansione.
  6. Definire una sequenza di acquisizione temporale
    1. Acquisire un segnale di correlazione incrociata tra l'SC e gli impulsi della sonda ritardando l'impulso della sonda. Per acquisirlo, tracciare il segnale BCARS a tre colori integrato rispetto al ritardo dell'impulso della sonda. Il segnale più forte apparirà al tempo 0 quando gli impulsi SC e sonda sono temporalmente sovrapposti.
      NOTA: Poiché i sistemi di rilevamento FLIM e TPEF condividono lo stesso trigger di BCARS, i loro segnali vengono acquisiti simultaneamente durante questo punto temporale.
    2. Registrare con un ritardo successivo del fascio della sonda (ad esempio, 1-2 ps) per BCARS e un ritardo successivo del fascio SC per fondo non risonante (spettri NRB in Figura 6A). Quando viene applicato un ritardo all'impulso a banda stretta (sonda), l'NRB nel segnale CARS a tre colori può essere efficacemente soppresso e quindi il rapporto segnale/rumore può essere migliorato67.
    3. Acquisire un'immagine scura senza sovrapposizione temporale tra l'SC e la sonda per catturare il rumore del rivelatore di base (riferimento scuro).
    4. Salva tutte le immagini BCARS, NRB e scure, inclusi i metadati all'interno di un singolo file h5.
  7. Protocollo di elaborazione del segnale BCARS
    1. Aprire il software CRIkit268.
    2. Caricare tutti i set di dati necessari utilizzando lo strumento Open HDF come mostrato nella Figura 6B: Caricare i dati iperspettrali BCARS, il riferimento NRB e il riferimento scuro. Selezionare la regione di frequenza all'interno della larghezza di banda di generazione del segnale BCARS utilizzando lo strumento Finestra Freq (da 400 cm-1 a ≥ 3200 cm-1 per il sistema BCARS illustrato qui).
    3. Eseguire le fasi di pre-elaborazione:
      1. Utilizzare lo strumento Anscombe (come mostrato nella Figura 6B) per stabilizzare la varianza dei set di dati BCARS e NRB.
      2. Utilizzare lo strumento Riduzione rumore per eseguire la decomposizione al valore singolare (SVD): Conservare i componenti principali in base all'ispezione visiva. Preserva i componenti che presentano distribuzioni spaziali che corrispondono alla morfologia del campione e scarta i componenti dominati da rumore non strutturato o simile a macchie. Questa fase di riduzione del rumore migliora il rapporto segnale/rumore (SNR), in particolare per le caratteristiche spettrali a bassa intensità.
      3. Utilizzare lo strumento Inverse Anscombe per ripristinare i dati nel dominio originale.
        NOTA: questi passaggi possono essere saltati se si esegue l'elaborazione in tempo reale durante l'acquisizione.
    4. Recupera spettri simili a Raman utilizzando la trasformata di Kramers-Kronig (KK):
      1. Aprire lo strumento KK (come mostrato nella Figura 6B).
      2. Abilitare Norm to NRB per garantire un'adeguata normalizzazione del riferimento spettrale.
      3. Imposta i parametri tra cui la polarizzazione NRB, il fattore pad e la media dei pixel del bordo.
      4. Eseguire la trasformata KK per ottenere gli spettri Raman recuperati.
    5. Eseguire correzioni di errori post-KK
      1. Correggere gli errori di fase utilizzando il livellamento Savitzky-Golay: aprire lo strumento di correzione degli errori di fase (Figura 6B). Regola le dimensioni della finestra di levigatura e l'ordine dei polinomi. Esamina gli spettri originali rispetto a quelli corretti utilizzando il pannello di anteprima .
      2. Correggere gli errori di scala: aprire lo strumento di correzione degli errori di scala (Figura 6B). Normalizza gli spettri per correggere il ridimensionamento dell'intensità relativa nel set di dati. Garantisci la coerenza tra le dimensioni spaziali e spettrali.
    6. Calibrare l'asse spettrale (opzionale, se disallineato): aprire lo strumento di calibrazione (Figura 6B). Confrontare i numeri d'onda misurati con i picchi di riferimento noti. Applicare la pendenza/intercetta corretta per riallineare l'asse spettrale.
    7. Definisci ed estrai i dati dalle regioni di interesse (ROI)
      1. Usa il ROI Spect. o Pt Spect. (Figura 6B) per contrassegnare le regioni spaziali di interesse o i punti di interesse nell'immagine BCARS.
      2. Visualizza e confronta il contenuto spettrale di diversi ROI.
      3. Esportazione degli spettri recuperati per ulteriori analisi quantitative o chemiometriche.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

La Figura 5 mostra gli spettri misurati della sonda a banda stretta e gli impulsi del supercontinuum a banda larga (SC) utilizzati per l'eccitazione BCARS. L'impulso della sonda, generato tramite la generazione di una seconda armonica di un segnale di ~1530 nm da un oscillatore parametrico ottico costruito in casa (OPO, Figura 3), è centrato a 764,2 nm con una larghezza completa a metà massima (FWHM) di 0,2 nm, fornendo la risoluzione spettrale a ~6,8 <...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Questo lavoro dimostra in dettaglio l'architettura di BCARS e della piattaforma di imaging 2p-FLIM/TPEF. Mentre nella nostra configurazione attuale viene utilizzato un laser a doppia uscita da 1030 nm, la maggior parte dei laser a fibra fs 1030 nm ad alta potenza può essere utilizzata come sorgente laser master per la costruzione di un microscopio BCARS. Scegliendo attentamente la lunghezza e il periodo dei cristalli OPO / SHG PPLN, è possibile generare un impulso di sonda di pochi ps co...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare e non hanno interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

W-W.C. riconosce il sostegno del NIH (R21AG086974). M.T.C. riconosce il sostegno del Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti (DOE BERDE-SC0022121).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Macchina fotograficaHamamatsuORCA-FusionesCMOS, 2304&volte; 2304 pixel
Obiettivo della collezione  Olimpo  LUMPLFLN60XW  Immersione in acqua, 1.0 NA
DAQ  Diligente  Interruttore magnetotermico USB-1208HS  scheda di acquisizione dati
Linea di ritardo  Newport  DL225  Ritardo meccanico per impulso della sonda
Dicroico  Semrock  FF925-DI01  combinazione di sonda e SC
Dicroico  Semrock  FF705-DI01  Rilevamento della fluorescenza epi-mode
Dicroico  Thorlabs  DMLP550R  separazione del segnale FLIM e del segnale TPEF
Obiettivo di eccitazione  Olimpo  UPLSAPO60XWIR  Immersione in acqua, 1,2 NA
Filtro  Semrock  FF01-1326/SP-25  Rifiutare il laser fondamentale dopo l'SHG
Filtro  Semrock  FF01-758/SP  Rifiuta il laser fondamentale prima della fotocamera BCARS
Filtro  Thorlabs  FESH0650  Rifiutare il laser fondamentale prima della modalità di fluorescenza
FLIM PMT  PicoQuant  Ibrido PMA  Rivelatore a singolo fotone FLIM
FPGA  Redpitaya  STEMlab 125-14  Sincronizzazione e attivazione della scansione
Galvo  Thorlabs  GVS101  Per la scansione e la descansione
Grata  Coerente  LightSmyth 1040nm  1000 Groves/mm, pre-chirp per SC
Piastra a semionda  Thorlabs  AHWP05M-980  Controllo della polarizzazione
Cubo K  Thorlabs  KPA101 Driver PSD per l'auto-allineatore
Laser  Strumenti prospettici  FSX-Doppio  Laser a femtosecondi a doppia uscita
Laser  Coerente  Mira-900  Laser a femtosecondi per l'eccitazione della fluorescenza
PBS  Thorlabs  PBS255  Combinazione di fasci per SC e sonda
PCF  Thorlabs  LMA-PM-5  Fibra di cristallo fotonica da 10 cm per la generazione SC
PD  Thorlabs  PDA100A2  Ciclo di feedback OPO
Supporto per specchio piezoelettrico  Thorlabs  POLARIS-K1S2P  Regolatore piezoelettrico per l'auto-allineatore
Preamplificatore  EdmundOttica  59-179  Preamplificatore TPEF
Prisma  Ottica Lambda Research  Processore EQP-30SF10  Compressione SC
PSD  Thorlabs  PDQ80A  Rilevatore sensibile alla posizione per l'auto-allineatore
Spettrometro  Teledyne Princeton Strumenti  IsoPlane 160  Griglia da 300 g/mm, centrata a 700 nm
Palco  ASI  MS-2000  Tavolino motorizzato a 3 assi
TCSPC  PicoQuant  MultiHarp 150  Dispositivo di conteggio dei fotoni per FLIM
TPEF PMT  Hamamatsu  H9305-03  Rilevatore TPEF
Lente tubolare  Thorlabs  TL200-2P2  Utilizzato nel sistema di descanning

Riferimenti

  1. Cutshaw, G., et al. The emerging role of Raman spectroscopy as an omics approach for metabolic profiling and biomarker detection toward precision medicine. Chem Rev. 123 (13), 8297-8346 (2023).
  2. Kong, K., Kendall, C., Stone, N., Notingher, I. Raman spectroscopy for medical diagnostics - from in vitro biofluid assays to in vivo cancer detection. Adv Drug Deliv Rev. 89, 121-134 (2015).
  3. Abramczyk, H., et al. Aberrant protein phosphorylation in cancer by using Raman biomarkers. Cancers (Basel). 11 (12), 2017(2019).
  4. Contorno, S., Darienzo, R. E., Tannenbaum, R. Evaluation of aromatic amino acids as potential biomarkers in breast cancer by Raman spectroscopy analysis. Sci Rep. 11 (1), 1698(2021).
  5. John, R. V., et al. Micro-Raman spectroscopy study of blood samples from myocardial infarction patients. Lasers Med Sci. 37 (9), 3451-3460 (2022).
  6. You, A. Y. F., et al. Raman spectroscopy imaging reveals interplay between atherosclerosis and medial calcification in the human aorta. Sci Adv. 3 (12), e1701156(2017).
  7. Carlomagno, C. Human salivary Raman fingerprint as biomarker for the diagnosis of amyotrophic lateral sclerosis. Sci Rep. 10 (1), 10175(2020).
  8. Morasso, C. F., et al. Raman spectroscopy reveals biochemical differences in plasma derived extracellular vesicles from sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Nanomedicine. 29, 102249(2020).
  9. Pezzotti, G. Raman spectroscopy in cell biology and microbiology. J Raman Spectrosc. 52 (12), 2348-2443 (2021).
  10. Dodo, K., Fujita, K., Sodeoka, M. Raman spectroscopy for chemical biology research. J Am Chem Soc. 144 (43), 19651-19667 (2022).
  11. Hamada, K., et al. Raman microscopy for dynamic molecular imaging of living cells. J Biomed Opt. 13 (4), 044027(2008).
  12. Ichimura, T., et al. Non-label immune cell state prediction using Raman spectroscopy. Sci Rep. 6 (1), 37562(2016).
  13. Germond, A., Panina, Y., Shiga, M., Niioka, H., Watanabe, T. M. Following embryonic stem cells, their differentiated progeny, and cell-state changes during IPS reprogramming by Raman spectroscopy. Anal Chem. 92 (22), 14915-14923 (2020).
  14. Zahn, J., Germond, A., Lundgren, A. Y., Cicerone, M. T. Discriminating cell line specific features of antibiotic-resistant strains of Escherichia coli from Raman spectra via machine learning analysis. J Biophotonics. 15 (7), e202100274(2022).
  15. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  16. Nitta, N., et al. Raman image-activated cell sorting. Nat Commun. 11 (1), 3452(2020).
  17. Shipp, D. W., Sinjab, F., Notingher, I. Raman spectroscopy: techniques and applications in the life sciences. Adv Opt Photon. 9 (2), 315-428 (2017).
  18. Kong, C., et al. High-contrast, fast chemical imaging by coherent Raman scattering using a self-synchronized two-colour fibre laser. Light Sci Appl. 9 (1), 25(2020).
  19. Mutlu, A. S., Duffy, J., Wang, M. C. Lipid metabolism and lipid signals in aging and longevity. Dev Cell. 56 (10), 1394-1407 (2021).
  20. Fueser, H., Pilger, C., Kong, C., Huser, T., Traunspurger, W. Polystyrene microbeads influence lipid storage distribution in C. elegans as revealed by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Environ Pollut. , 294-118662 (2022).
  21. Lee, J., et al. Label-free multiphoton imaging of microbes in root, mineral, and soil matrices with time-gated coherent Raman and fluorescence lifetime imaging. Environ Sci Technol. 56 (3), 1994-2008 (2022).
  22. Sheng, M., et al. Single source CARS-based multimodal microscopy system for biological tissue imaging. Biomed Opt Express. 15 (1), 131-141 (2024).
  23. Zeng, Q., et al. Label-free Raman imaging for screening of anti-inflammatory function food. Food Chem X. 22, 101297(2024).
  24. Zhang, J., et al. High-throughput single-cell sorting by stimulated Raman-activated cell ejection. Sci Adv. 10 (50), eadn6373(2024).
  25. Yang, L., Iyer, R. R., Sorrells, J. E., Renteria, C. A., Boppart, S. A. Temporally optimized and spectrally shaped hyperspectral coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Opt Express. 32 (7), 11474-11490 (2024).
  26. Pegoraro, A. F., Stolow, A. Chirp modulation stimulated Raman scattering microscopy. Opt Express. 32 (18), 31297-31310 (2024).
  27. Zhang, Y., et al. Rapid coherent Raman hyperspectral imaging based on delay-spectral focusing dual-comb method and deep learning algorithm. Opt Lett. 48 (3), 550-553 (2023).
  28. Sorrells, J. E., et al. Programmable hyperspectral coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Opt Lett. 49 (9), 2513-2516 (2024).
  29. De la Cadena, A. Multiplex chemical imaging based on broadband stimulated Raman scattering microscopy. J Vis Exp. (185), e63709(2022).
  30. Zhang, S., He, Y., Yue, S. Coherent Raman scattering imaging of lipid metabolism in cancer. J Innov Opt Health Sci. 16 (3), 2230015(2023).
  31. Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nat Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
  32. Camp, C. H. High-speed coherent Raman fingerprint imaging of biological tissues. Nat Photonics. 8 (8), 627-634 (2014).
  33. Camp, C. H., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Quantitative comparable coherent anti-Stokes Raman scattering spectroscopy: correcting errors in phase retrieval. J Raman Spectrosc. 47 (4), 408-415 (2015).
  34. Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nat Chem Biol. 16 (10), 1087-1095 (2020).
  35. Poorna, R., Chen, W. W., Qiu, P., Cicerone, M. T. Toward gene-correlated spatially resolved metabolomics with fingerprint coherent Raman imaging. J Phys Chem B. 127 (25), 5576-5587 (2023).
  36. Vernuccio, F., et al. Full-spectrum CARS microscopy of cells and tissues with ultrashort white-light continuum pulses. J Phys Chem B. 127 (21), 4733-4745 (2023).
  37. Murakami, Y., et al. Molecular fingerprinting of mouse brain using ultrabroadband coherent anti-stokes Raman scattering microspectroscopy empowered by multivariate curve resolution-alternating least squares. Chem Biomed Imaging. 2 (10), 689-697 (2024).
  38. Muddiman, R., Harkin, S., Butler, M., Hennelly, B. Broadband CARS hyperspectral classification of single immune cells. J Biophotonics. 18 (3), e202400382(2025).
  39. Dixon, J. Z., Chen, W. W., Xu, H., Audier, X., Cicerone, M. T. Broadband coherent anti-stokes Raman scattering microscopy for rapid, label-free biological imaging. Rev Sci Instrum. 96 (4), 043706(2025).
  40. Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Opt Lett. 34 (9), 1363-1365 (2009).
  41. Rinia, H. A., Bonn, M., Müller, M., Vartiainen, E. M. Quantitative CARS spectroscopy using the maximum entropy method: The main lipid phase transition. Chemphyschem. 8 (2), 279-287 (2007).
  42. Cicerone, M. T., Aamer, K. A., Lee, Y. J., Vartiainen, E. Maximum entropy and time-domain Kramers-Kronig phase retrieval approaches are functionally equivalent for CARS microspectroscopy. J Raman Spectrosc. 43 (5), 637-643 (2012).
  43. Houhou, R., et al. Deep learning as phase retrieval tool for CARS spectra. Opt Express. 28 (14), 21002-21024 (2020).
  44. Wang, Z., et al. Vector: Very deep convolutional autoencoders for non-resonant background removal in broadband coherent anti-stokes Raman scattering. J Raman Spectrosc. 53 (6), 1081-1093 (2022).
  45. Camp, C. H. Raman signal extraction from CARS spectra using a learned-matrix representation of the discrete Hilbert transform. Opt Express. 30 (15), 26057-26071 (2022).
  46. Junjuri, R., Saghi, A., Lensu, L., Vartiainen, E. M. Evaluating different deep learning models for efficient extraction of Raman signals from CARS spectra. Phys Chem Chem Phys. 25, 16340-16353 (2023).
  47. Vernuccio, F., et al. Non-resonant background removal in broadband CARS microscopy using deep-learning algorithms. Sci Rep. 14 (1), 23903(2024).
  48. Yao, B., et al. Recent progress in deep learning for improving coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Laser Photonics Rev. 18 (11), 2400562(2024).
  49. Bestvater, F., et al. Two-photon fluorescence absorption and emission spectra of dyes relevant for cell imaging. J Microsc. 208 (2), 108-115 (2002).
  50. Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nat Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
  51. Zhu, H., Fan, J., Du, J., Peng, X. Fluorescent probes for sensing and imaging within specific cellular organelles. Acc Chem Res. 49 (10), 2115-2126 (2016).
  52. Wu, L., Liu, J., Li, P., Tang, B., James, T. D. Two-photon small-molecule fluorescence-based agents for sensing, imaging, and therapy within biological systems. Chem Soc Rev. 50, 702-734 (2021).
  53. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chem Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
  54. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications. J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).
  55. Lin, H. J., Herman, P., Lakowicz, J. R. Fluorescence lifetime-resolved pH imaging of living cells. Cytometry A. 52 (2), 77-89 (2003).
  56. Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. Molecular rotor measures viscosity of live cells via fluorescence lifetime imaging. J Am Chem Soc. 130 (21), 6672-6673 (2008).
  57. Wang, B., et al. Bipolar and fixable probe targeting mitochondria to trace local depolarization via two-photon fluorescence lifetime imaging. Analyst. 140, 5488-5494 (2015).
  58. Despa, S., Vecer, J., Steels, P., Ameloot, M. Fluorescence lifetime microscopy of the Na+ indicator sodium green in HeLa cells. Anal Biochem. 281 (2), 159-175 (2000).
  59. Wilms, C. D., Eilers, J. Photophysical properties of Ca2+-indicator dyes suitable for two-photon fluorescence-lifetime recordings. J Microsc. 225 (3), 209-213 (2007).
  60. König, K. Review: Clinical in vivo multiphoton FLIM tomography. Methods Appl Fluoresc. 8 (3), 034002(2020).
  61. Scipioni, L., Rossetta, A., Tedeschi, G., Gratton, E. Phasor s-FLIM: a new paradigm for fast and robust spectral fluorescence lifetime imaging. Nat Methods. 18 (5), 542-550 (2021).
  62. Ouyang, Y., Liu, J., Wang, Z. M., Liu, Z., Wu, M. FLIM as a promising tool for cancer diagnosis and treatment monitoring. Nano Micro Lett. 13 (1), 133(2021).
  63. Shirshin, E. A., et al. Label-free sensing of cells with fluorescence lifetime imaging: The quest for metabolic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (9), e2118241119(2022).
  64. Liu, Z. Mapping metabolic changes by noninvasive, multiparametric, high-resolution imaging using endogenous contrast. Sci Adv. 4 (3), eaap9302(2018).
  65. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Label-free optical metabolic imaging in cells and tissues. Annu Rev Biomed Eng. 25, 413-443 (2023).
  66. Chen, W. W., et al. Identifying lipid particle sub-types in live Caenorhabditis elegans with two-photon fluorescence lifetime imaging. Front Chem. 11, 1161775(2023).
  67. Littleton, B., Shah, P., Kavanagh, T., Richards, D. Three-color coherent anti-stokes Raman scattering with optical nonresonant background removal. J Raman Spectrosc. 50 (9), 1303-1310 (2019).
  68. Crikit2 software for BCARS data processing. , https://github.com/ccampjr/crikit2 (2025).
  69. Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol Cell Proteomics. 11 (8), 317-328 (2012).
  70. Hulsey-Vincent, H. J., Cameron, E. A., Dahlberg, C. L., Galati, D. F. Spectral scanning and fluorescence lifetime imaging microscopy enable separation and characterization of C. elegans autofluorescence in the cuticle and gut. Biol Open. 13 (12), bio060613(2024).
  71. Gottlieb, D., Asadipour, B., Kostina, P., Ung, T. P. L., Stringari, C. FLUTE: A Python GUI for interactive phasor analysis of FLIM data. Biol Imaging. 3, e21(2023).
  72. Weber, G. Resolution of the fluorescence lifetimes in a heterogeneous system by phase and modulation measurements. J Phys Chem. 85 (8), 949-953 (1981).
  73. Ranjit, S., Malacrida, L., Jameson, D. M., Gratton, E. Fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging data using the phasor approach. Nat Protoc. 13 (9), 1979-2004 (2018).
  74. Smolen, J. A., Wooley, K. L. Fluorescence lifetime image microscopy prediction with convolutional neural networks for cell detection and classification in tissues. PNAS Nexus. 1 (5), pgac235(2022).
  75. Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nat Biomed Eng. 5 (1), 77-88 (2021).
  76. Vu, T., et al. Spatial transcriptomics using combinatorial fluorescence spectral and lifetime encoding, imaging and analysis. Nat Commun. 13 (1), 169(2022).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Imaging a tempo di vita di fluorescenzaspettroscopia Raman a impronta digitalemicroscopia a due fotoniprofilazione metabolicarisoluzione subcellulareimaging in vivoC elegansproteina fluorescente verde
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.