Imaging di cellule vive della segregazione cromosomica durante la meiosi degli ovociti di topo

Sommario

Qui, riassumiamo le tecniche di imaging su cellule vive per lo studio della segregazione cromosomica negli ovociti di topo, utilizzando H2B-RFP per la cromatina e SiR-Tubulina per la visualizzazione del fuso. Descriviamo in dettaglio la preparazione del campione, la microiniezione, la coltura, l'impostazione dell'imaging e l'analisi, offrendo una guida pratica per ottenere un imaging ad alta risoluzione e minimamente fototossico della dinamica dei cromosomi meiotici.

Abstract

Un'accurata segregazione cromosomica durante la meiosi degli ovociti è essenziale per garantire un corretto sviluppo embrionale e prevenire i disturbi correlati alle aneuploidia. L'imaging di cellule vive combinato con tecniche di marcatura a fluorescenza è diventato un approccio potente per lo studio della dinamica dei cromosomi meiotici con un'elevata risoluzione spaziotemporale. In questo protocollo, riassumiamo le metodologie chiave per visualizzare la segregazione cromosomica in ovociti di topo vivi, concentrandoci sull'uso dell'istone H2B-RFP per la marcatura della cromatina e della SiR-Tubulina per il tracciamento del fuso. Descriviamo le procedure per la preparazione del campione, la microiniezione di mRNA, la coltura degli ovociti, l'impostazione della camera di imaging di cellule vive e le impostazioni della microscopia confocale, tutte ottimizzate per ottenere immagini ad alta risoluzione riducendo al minimo la fototossicità. Inoltre, evidenziamo considerazioni sperimentali critiche come la fototossicità, l'elaborazione delle immagini e l'analisi quantitativa degli eventi meiotici. Fornendo una valutazione completa delle metodologie attuali, questo protocollo funge da guida pratica per i ricercatori che cercano di studiare la dinamica cromosomica negli ovociti vivi e migliorare l'accuratezza e la riproducibilità degli studi meiotici.

Introduzione

La visualizzazione accurata della dinamica cromosomica e dei fusi durante la meiosi degli ovociti è fondamentale per comprendere i meccanismi che regolano la maturazione dei gameti femminili e il rischio di aneuploidia 1,2,3,4,5. Gli ovociti dei mammiferi subiscono una serie altamente coordinata di eventi meiotici, tra cui la rottura delle vescicole germinali (GVBD), la condensazione cromosomica, l'assemblaggio del fuso e la divisione asimmetrica⁶. Sebbene l'imaging a punto temporale fisso abbia fornito preziose istantanee di questi processi, manca di risoluzione temporale e non è in grado di catturare eventi transitori o rapidi che si verificano tra gli intervalli di campionamento. Al contrario, l'imaging su cellule vive di cromosomi e microtubuli marcati in fluorescenza offre un approccio potente per monitorare questi processi dinamici in tempo reale ^2,3,7. Ciò consente l'osservazione diretta dei tempi, della durata e della sequenza degli eventi meiotici all'interno dei singoli ovociti e consente l'identificazione di eventi transitori che altrimenti potrebbero essere persi in campioni fissi. Tuttavia, il mantenimento della vitalità e dell'integrità fisiologica degli ovociti durante la microiniezione e l'imaging richiede una manipolazione meticolosa e condizioni ottimizzate⁸.

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro completo per la microiniezione di ovociti in stadio di vescicola germinale di topo (GV) con cRNA H2B-RFP, consentendo la marcatura fluorescente della cromatina, seguita dall'imaging confocale time-lapse dei cromosomi e dal comportamento del fuso durante la meiosi⁴. Il metodo integra passaggi chiave tra cui l'innesco ormonale, l'isolamento degli ovociti, la microiniezione in condizioni di temperatura controllata e l'imaging dal vivo utilizzando la microscopia confocale con controllo ambientale ^4,9. L'obiettivo generale di questo articolo è quello di presentare un flusso di lavoro robusto e riproducibile per la visualizzazione in tempo reale della dinamica cromosomica e del fuso in ovociti di topo vivi, fornendo una piattaforma per studiare i meccanismi molecolari e cellulari alla base della regolazione meiotica e del rischio di aneuploidia.

Sebbene questo protocollo fornisca un'elevata risoluzione temporale e spaziale, si basa sull'espressione di reporter esogeni, che potrebbe non replicare completamente la dinamica delle proteine endogene e potrebbe potenzialmente interferire con i processi meiotici nativi se sovraespressa. I ricercatori dovrebbero considerare queste limitazioni e convalidare i risultati utilizzando approcci complementari, ove possibile.

Questo protocollo è progettato per supportare gli studi che indagano i meccanismi meiotici, gli errori di segregazione cromosomica e l'impatto delle perturbazioni genetiche o ambientali sulla qualità degli ovociti. Fornisce una solida piattaforma sia per la ricerca di base che per le applicazioni traslazionali nella biologia riproduttiva.

Protocollo

Tutti gli esperimenti devono essere condotti in conformità con i protocolli approvati dal Comitato Etico Animale locale. Le procedure sperimentali devono attenersi rigorosamente ai principi delle 3R: sostituzione, riduzione e perfezionamento. I topi devono essere alloggiati in una struttura per animali accreditata in condizioni ambientali standardizzate (22 °C, 60% di umidità) con libero accesso a cibo e acqua.

1. Raccolta e preparazione degli ovociti

NOTA: Tutte le apparecchiature e i reagenti devono essere sterili. Eseguire tutte le manipolazioni degli ovociti utilizzando una pipetta orale al microscopio stereoscopico (vedere Tabella dei materiali). Coprire tutte le goccioline del terreno di coltura con olio minerale (Figura 1A-E).

1. Stimolazione ormonale
   1. Iniettare topi femmina di 3-4 settimane per via intraperitoneale con 5 unità internazionali (UI) di gonadotropina sierica di cavalla gravida (PMSG; vedi Tabella dei materiali) 46-48 ore prima del prelievo degli ovociti.
      NOTA: B6CBAF1 topi (progenie F1 di C57BL/6J × CBA/CaCrl) sono preferiti a causa della resa ovocitaria superiore e delle caratteristiche di maturazione favorevoli.
2. Preparazione di terreni di coltura
   1. Filtrare i mezzi M2 e M16 (vedere la tabella dei materiali) utilizzando un filtro per siringa da 0,2 μm. Integrare con IBMX fino a una concentrazione finale di 100 μM diluendo da un materiale da 100 mM.
   2. Preparare 5-6 goccioline di M2-IBMX (~30 μL ciascuna) e 3 goccioline di M16-IBMX in piastre di coltura tissutale in plastica da 35 mm. Sovrapporre tutte le goccioline con olio minerale. Posizionare le piastre M2-IBMX su un blocco caldo a 37 °C (Figura 1A) e le piastre M16-IBMX in un incubatore a 37 °C, CO₂ al 5% per almeno 30 minuti prima dell'isolamento degli ovociti (Figura 1C).
   3. Preparare un piatto aggiuntivo contenente 800-1.000 μl di M2-IBMX (senza olio) per la dissezione ovarica. Posizionare su una piastra riscaldante a 37 °C montata su uno stereomicroscopio (Figura 1B).
3. Isolamento degli ovociti
   1. Sacrificare i topi per lussazione cervicale. Pulire il basso addome con etanolo al 70%, quindi praticare una piccola incisione orizzontale nella pelle e nel peritoneo per entrare nella cavità peritoneale. Estendere l'incisione separando i bordi dell'incisione con le dita.
   2. Usando una pinza, spazza via l'intestino per esporre le ovaie nella parte superiore dell'addome, situata al polo superiore dei reni. Utilizzando pinze sottili e microforbici, asportare accuratamente le ovaie evitando danni al tessuto. Trasferire immediatamente le ovaie in una provetta da 1,5 mL contenente 100-200 μL di terreno M2-IBMX preriscaldato.
   3. Trasferire le ovaie in 1 mL di terreno M2-IBMX preriscaldato e passare a un tavolino riscaldato per microscopio di dissezione (Figura 1B). Rimuovere con cura il tessuto adiposo e i resti oviduttali.
      NOTA: Maneggiare delicatamente le ovaie per evitare danni ai follicoli o agli ovociti. Mantenere le ovaie in un mezzo caldo durante il trasferimento dalla stanza degli animali al laboratorio.
   4. Rilascia i complessi cumulo-ovocita (COC) perforando i follicoli con un ago da 27 G (Figura 1A-B). Raccogliere i COC e trasferirli in goccioline da 25-30 μL di M2-IBMX (Figura 1D).
   5. Dissociare le cellule del cumulo mediante pipettaggio ripetuto con una pipetta Pasteur in vetro a foro stretto (Figura 1E).
      NOTA: Mentre il pipettaggio orale è comunemente usato per la manipolazione degli ovociti, i pipettatori meccanici o i micromanipolatori offrono alternative, soprattutto in ambienti in cui il pipettaggio orale è limitato o non fattibile. Queste alternative sono state impiegate con successo in protocolli simili^10,11.
   6. Identificare e selezionare gli ovociti allo stadio GV completamente cresciuti sulla base di un diametro maggiore e di un GV posizionato centralmente utilizzando uno stereomicroscopio con ingrandimento 20x-40x. Trasferire in 30 μl di goccioline M2-IBMX fresche su un blocco caldo a 37 °C, al riparo dalla luce.
      NOTA: Mantenere gli ovociti a 37 °C durante tutte le procedure per preservarne l'integrità fisiologica. Preriscalda tutti i terreni e utilizza tavolini a temperatura controllata per tutte le manipolazioni e le microiniezioni al microscopio.
   7. Lasciare recuperare gli ovociti per 20 minuti su una fase riscaldata a 37 °C prima della microiniezione.

2. Preparazione del cRNA H2B-RFP

NOTA: Eseguire tutti i passaggi indossando i guanti in un ambiente pulito e privo di RNasi. Utilizzare solo acqua e reagenti privi di RNasi e lavorare preferibilmente in presenza di inibitori della RNasi.

1. Verifica della sequenza del plasmide H2B-RFP (vedi Tabella dei materiali) mediante sequenziamento Sanger utilizzando primer che fiancheggiano l'inserto. Amplificare il plasmide trasformando E. coli competente (ad esempio, DH5α), selezionando una singola colonia e coltivandola in brodo LB con antibiotici appropriati. Purificare il plasmide utilizzando un kit standard midi o maxi prep. Per le procedure dettagliate, vedere Green e Sambrook¹².
2. Purificare il DNA plasmidico utilizzando un kit miniprep commerciale secondo le istruzioni del produttore. Quantificare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro.
3. Linearizzare 2-4 μg di DNA plasmidico a valle dell'inserto utilizzando un enzima di restrizione adatto che taglia una volta nella spina dorsale del vettore (NotI è stato utilizzato per H2B-RFP). Impostare la reazione di digestione utilizzando il tampone e la concentrazione enzimatica appropriati come descritto nella Tabella 1 e incubare a 37 °C per 1-2 ore. Confermare la linearizzazione completa mediante elettroforesi su gel di agarosio. Più bande indicano una digestione incompleta. Se si utilizza un kit commerciale, seguire le istruzioni del produttore.
   NOTA: Scegliere un enzima di restrizione che tagli con precisione a valle dell'inserto e in condizioni di digestione ottimali. Verificare la linearizzazione facendo scorrere una piccola aliquota su un gel di agarosio.
4. Rimuovere la contaminazione da RNasi incubando la reazione di digestione con 1 μL di proteinasi K (10 μg/mL), 5,3 μL di SDS al 10% e 50 μL di acqua priva di nucleasi a 50 °C per 1 ora.
   NOTA: Questo passaggio è essenziale per eliminare i contaminanti RNasi e proteici. Utilizzare solo reagenti privi di RNasi e mantenere condizioni di lavoro pulite.
5. Estrarre il DNA digerito con fenolo:cloroformio:alcol isoamilico (25:24:1), seguito da un'estrazione di cloroformio.
   NOTA: Per ridurre al minimo la tossicità e semplificare la manipolazione dei campioni, al posto dell'estrazione fenolo/cloroformio possono essere utilizzati anche metodi di purificazione commerciali basati su colonne o microsfere (ad esempio, sistemi a membrana di silice o a biglie magnetiche).
6. Precipitare il DNA aggiungendo 3 M di acetato di sodio ed etanolo al 100%. Incubare a −80 °C per almeno 2 ore.
7. Pellettare il DNA mediante centrifugazione a 12.000-14.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Lavare il pellet con etanolo al 70%, centrifugare nuovamente alla stessa velocità per 5 minuti a 4 °C, asciugare brevemente all'aria (2-5 minuti) e risospendere in 6 μL di acqua priva di RNasi.
   NOTA: Dopo la precipitazione e la centrifugazione dell'etanolo, sul fondo della provetta dovrebbe formarsi un pellet traslucido o bianco visibile. Se non si vede alcun pellet, ripetere la centrifugazione a una velocità maggiore o rivalutare la concentrazione di DNA.
8. Eseguire la trascrizione in vitro utilizzando il kit T7 mMESSAGE mMACHINE (vedere la Tabella 2), seguendo il protocollo del produttore.
9. Incubare la reazione di trascrizione a 37 °C per almeno 2 ore. Estendere l'incubazione se la lunghezza del trascritto supera i 5 kb.
10. Rimuovere il DNA stampo mediante trattamento con DNasi utilizzando 1 U di DNasi I per 10 μL di volume di reazione, incubato a 37 °C per 15 minuti.
11. Purificare il cRNA sintetizzato utilizzando la precipitazione del cloruro di litio¹³. Dopo la precipitazione e la centrifugazione, sul fondo del tubo dovrebbe formarsi un pellet traslucido o bianco visibile. Lavare il pellet di RNA con etanolo al 70%.
12. Risospendere il pellet finale di cRNA in 20 μL di acqua priva di RNasi. Misurare la concentrazione di RNA e confermare la presenza e la lunghezza della coda di poli(A) eseguendo la RT-PCR seguita dal sequenziamento del prodotto della PCR. Aliquotare il cRNA in volumi di 1 μL e conservarlo a -80 °C.

3. Preparazione e microiniezione di ovociti

NOTA: Durante tutta la procedura, mantenere gli ovociti a 37 °C utilizzando terreni preriscaldati e tavolini al microscopio a temperatura controllata per preservare la qualità degli ovociti.

1. Preparazione
   1. Scongelare le aliquote di cRNA H2B-RFP su ghiaccio, centrifugare brevemente e diluire alla concentrazione desiderata (ad esempio, 250 ng/μL).
      NOTA: La concentrazione ottimale di cRNA può variare a seconda del costrutto, del sistema di espressione e degli obiettivi sperimentali. Si consiglia di titolare la concentrazione di cRNA (ad esempio, nell'intervallo di 50-300 ng/μL) per ridurre al minimo gli artefatti di sovraespressione, garantendo al contempo un segnale sufficiente. Gli utenti dovrebbero anche monitorare la progressione meiotica (ad esempio, GVBD, formazione del fuso ed estrusione del corpo polare) come lettura funzionale della salute e della vitalità degli ovociti dopo l'espressione del costrutto. È stato riportato che le concentrazioni iniettabili di cRNA variano tipicamente da 0,2 a 1 μg/μL, con risultati ottimali spesso raggiunti a 0,5 μg/μL 2,3,4,5,7,8,9.
   2. Preparare gli aghi per microiniezione dai capillari in vetro borosilicato (OD = 1,5 mm, diametro interno = 0,86 mm, lunghezza = 100 mm) utilizzando un estrattore per pipette (Figura 2A).
      NOTA: Utilizziamo un estrattore per pipette verticale (vedi Tabella dei materiali; Figura 2A). Ottimizza empiricamente i parametri di trazione. La punta dell'ago deve essere abbastanza fine da ridurre al minimo il danno agli ovociti, ma abbastanza larga da evitare l'intasamento e consentire una consegna regolare del cRNA.
   3. Caricare 0,5-1,5 μL di soluzione di cRNA nella punta dell'ago utilizzando punte per microloader prive di RNasi. Rimuovere eventuali bolle d'aria prima dell'iniezione.
2. Configurazione della piastra per microiniezione
   1. Preparare una piastra per microiniezione con 100 μL di terreno M2-IBMX e ricoprirla completamente con olio minerale per evitare l'evaporazione e gli sbalzi di osmolarità.
3. Microiniezione di ovociti
   1. Montare le pipette di tenuta e di iniezione sul sistema di micromanipolatore (Figura 2B, C).
   2. Posizionare la capsula per microiniezione sul tavolino del microscopio. Utilizzando una pipetta per bocca, trasferire gli ovociti nella gocciolina M2-IBMX.
   3. Portare le pipette di mantenimento e di iniezione sullo stesso piano orizzontale degli ovociti.
   4. Catturare un ovocita mediante aspirazione delicata con la pipetta di mantenimento (Figura 2B e C).
   5. Inserire l'ago per iniezione attraverso la zona pellucida e l'oolemma, mirando al citoplasma ed evitando il nucleo.
   6. Erogare il cRNA H2B-RFP utilizzando un breve impulso di capacità negativa attraverso un elettrometro intracellulare (Figura 2B-E). Mantenere il volume di iniezione pari a circa il 5% del volume dell'ovocita. Un'iniezione riuscita è tipicamente visibile come una piccola ma distinta dispersione del citoplasma. Regolare la pressione di iniezione e la fasatura di iniezione per evitare danni alla membrana.
   7. Estrarre l'ago rapidamente e senza intoppi con la stessa angolazione per ridurre al minimo lo strappo della membrana.
   8. Rilasciare l'ovocita dalla pipetta di contenimento e riposizionarlo in un'area separata della piastra per distinguere gli ovociti iniettati da quelli non iniettati (Figura 2F). Per questa configurazione, organizzare il flusso di lavoro mantenendo gli ovociti non iniettati nella parte superiore della piastra e spostando quelli iniettati sul fondo.
   9. Ripetere i passaggi 3.3.4-3.3.8 per tutti gli ovociti rimanenti. I tassi di sopravvivenza post-iniezione variano a seconda della tecnica e delle proprietà dell'mRNA. Aspettatevi una vitalità del 60%-80%.
4. Manipolazione post-iniezione
   1. Trasferire gli ovociti iniettati in una gocciolina fresca di terreno M16-IBMX in una piastra di coltura pulita.
   2. Incubare a 37 °C per 1-4 ore per consentire l'espressione di H2B-RFP. Regolare la durata dell'incubazione in base alla concentrazione di cRNA, alle dimensioni del trascritto e all'efficienza dell'espressione.

4. Imaging timelapse di cromosomi marcati con H2B-RFP durante la meiosi

1. Preparazione di attrezzature e terreni
   1. Preriscaldare il microscopio confocale, il tavolino, l'incubatore e la camera ambientale a 37 °C per ≥ 30 minuti prima dell'uso (Figura 3A). Accendere il regolatore del gas e avviare il flusso di gas per mantenere la camera al 5% di CO₂ e O₂ ambiente. Assicurarsi che la camera sia umidificata per supportare la salute degli ovociti durante l'imaging prolungato di cellule vive.
   2. Preparare le gocce di coltura: Porre 5-6 gocce da 50 μl di terreno M16 integrato con SiR-Tubulina (concentrazione finale di 100 nM) in una piastra di Petri da 35 mm. Sovrapporre con olio minerale. In una capsula di imaging separata con fondo di vetro, posizionare tre gocce da 5 μL di M16 + SiR-Tubulina e sovrapporle con olio minerale. Preriscaldare entrambe le stoviglie a 37 °C per ≥ 30 minuti prima dell'uso.
2. Trasferimento e lavaggio degli ovociti
   1. Lavaggio degli ovociti: trasferire gli ovociti iniettati in sequenza attraverso le gocce da 50 μL di M16 + SiR-Tubulina per lavare via l'IBMX residuo (si consigliano 5 lavaggi). Eseguire lavaggi delicati per evitare danni agli ovociti.
      NOTA: L'IBMX residuo può inibire la ripresa della meiosi, quindi un lavaggio accurato è fondamentale.
   2. Trasferimento finale: Dopo i lavaggi, trasferire 15-20 ovociti nella goccia da 5 μl di M16 + SiR-Tubulina nella capsula di imaging preriscaldata con fondo di vetro.
3. Configurazione del microscopio
   1. Montaggio del piatto di imaging: posizionare il piatto con fondo di vetro sul tavolino del microscopio confocale (Figura 3A). Lasciare riposare gli ovociti per ~10 minuti.
   2. Posizionamento sul palco: utilizzando l'imaging in campo chiaro, centrare gli ovociti nel campo visivo. Salvataggio delle posizioni utilizzando il software del microscopio.
      NOTA: In questo studio, abbiamo utilizzato un microscopio confocale Leica TCS SP8 con un obiettivo a immersione in acqua HC PL APO 20x/1.0 NA. Tuttavia, a seconda della disponibilità, è possibile utilizzare altri sistemi confocali e obiettivi con specifiche simili.
   3. Configurazione della pompa dell'acqua per obiettivi a immersione in acqua: se si utilizza una lente dell'obiettivo a immersione in acqua, azionare il sistema della pompa dell'acqua per fornire acqua in modo intermittente a intervalli di 5-10 minuti. Questo flusso periodico mantiene la colonna d'acqua tra la lente e la capsula di imaging con fondo di vetro, prevenendo l'essiccazione e garantendo condizioni di imaging stabili durante gli esperimenti a lungo termine. Per le lenti a immersione in olio, questa configurazione del flusso d'acqua non è necessaria.
4. Impostazioni di imaging
   1. Passa alla modalità di scansione laser. Impostare le intensità laser come segue: 561 nm allo 0,5% (~100 μW all'obiettivo) per H2B-RFP (cromosomi); 633 nm al 3% (~300 μW all'obiettivo) per SiR-Tubulina (microtubuli fusi; Figura 3B, E).
      NOTA: Seguire le linee guida di sicurezza del laser corrette. Ridurre al minimo l'esposizione al laser per proteggere la vitalità del campione.
5. Acquisizione Z-stack
   1. Acquisizione di stack Z di 30-50 μm con un passo di 2-4 μm (Figura 3B, C).
   2. Acquisisci immagini a intervalli di 5-10 minuti utilizzando una velocità di scansione di 600 Hz (Figura 3B, D). La durata totale dell'imaging può variare da 12 a 16 ore, a seconda dello stadio meiotico monitorato, ed è limitata dalla fototossicità e dalla tolleranza degli ovociti alla coltura in vitro estesa.
6. Acquisizione sequenziale delle immagini
   1. Sui sistemi di microscopio, eseguire la scansione sequenziale con due rivelatori HyD: H2B-RFP: Eccitazione a 561 nm; emissioni raccolte a 580-630 nm; Eccitazione della SiR-Tubulina a 633 nm; emissioni raccolte a 650-700 nm (Figura 3E).
7. Avvio dell'imaging time-lapse
   1. Prima di iniziare l'acquisizione time-lapse a lungo termine, verificare la qualità del segnale scattando un'immagine di prova. I segnali fluorescenti dovrebbero essere distribuiti uniformemente: H2B-RFP dovrebbe marcare distintamente la cromatina e SiR-tubulina dovrebbe evidenziare le strutture dei microtubuli senza uno sfondo eccessivo. Conferma la stabilità dell'autofocus e il fotobleaching minimo in brevi esecuzioni preliminari di imaging.
   2. Avviare l'imaging time-lapse facendo clic su Avvia.
      NOTA: GVBD, che segna l'ingresso nella fase M, si verifica in genere 60-90 minuti dopo il washout IBMX (Figura 4A). In questa configurazione, gli ovociti C57BL/6 estrudono il primo globulo polare circa 8-9 ore dopo la GVBD (Figura 4A). I tempi possono variare in base al ceppo del topo e alle condizioni di coltura.

5. Elaborazione post-imaging

1. Aprire il file di imaging in un software di analisi delle immagini selezionando File > Apri e scegliendo il file .lif dalla sessione di imaging.
2. Genera proiezioni Z per i canali H2B RFP e SiR-Tubulin selezionando Elaborazione > Genera proiezione. Impostare il tipo di proiezione su Massima intensità di proiezione. Seleziona entrambi i canali RFP e SiR Tubulin, quindi fai clic su Esegui.
   NOTA Non eseguire una proiezione Z per il canale DIC, poiché potrebbe risultare in un'immagine sfocata. Identificare e selezionare invece il singolo piano DIC più nitidamente focalizzato. Utilizzare questa immagine DIC focalizzata in combinazione con le proiezioni di massima intensità dei canali H2B-RFP e SiR-Tubulina per ottenere una visualizzazione ottimale.
3. Estrai un singolo piano focale in campo chiaro. Torna a Strumenti di elaborazione e seleziona Modifica > Ritaglia. Scegli il canale Campo chiaro, usa il cursore Z per trovare il piano focale ottimale e fai clic su Applica.
4. Unisci le immagini di proiezione e in campo chiaro aprendo Strumenti di elaborazione, selezionando Unisci > Aggiungi canali. Aggiungi la proiezione RFP, la proiezione SiR-Tubulina e la singola immagine in campo chiaro. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul set unito , quindi scegliere Applica.
5. Esporta l'immagine finale unita selezionando File > Esporta > immagine. Scegliete il formato TIFF per ottenere un output non compresso di alta qualità.
   NOTA: Si consiglia l'esportazione in formato TIFF per l'analisi a valle e la preparazione delle figure.

Risultati

Come mostrato nella Figura 4A, B, questo protocollo consente l'imaging di alta qualità su cellule vive dei cromosomi (H2B-RFP) e dei microtubuli fusiformi (SiR-tubulina) negli ovociti, fornendo così informazioni spaziotemporali complete durante la maturazione meiotica.

Il canale H2B-RFP nella Figura 4A rivela tutti gli aspetti del movimento cromosomico dall'allineamento iniziale dopo la GVBD (Figu...

Discussione

Il protocollo qui presentato delinea un metodo robusto per la microiniezione e l'imaging di cellule vive di ovociti di topo, consentendo la visualizzazione della dinamica cromosomica durante la meiosi con un'elevata risoluzione temporale e spaziale. Fondamentale per il successo di questo approccio è la gestione meticolosa degli ovociti in ogni fase della procedura, dalla raccolta e microiniezione all'imaging. Gli ovociti sono altamente sensibili alle fluttuazioni ambientali e le deviazio...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siringhe da 1 ml	Terumo	SS+01T Tubercolina	Siringhe per iniezioni precise di PMSG.
Gel di agarosio	Invitrogen	16500500	Utilizzato per l'elettroforesi su gel di DNA e RNA per separare gli acidi nucleici in base alle dimensioni, per conformare la sequenza H2B-RFP
Bruciatore ad alcool	Laboratorio Tek	LW15557-01	Utilizzato per la sterilizzazione e la preparazione della pipitte orale.
Terreni di coltura batterica (brodo LB)	Sigma-Aldrich	L3022	Terreno standard utilizzato per la coltivazione di E. coli e altre colture batteriche.
Piastre per colture cellulari (35 volte 10 mm e 60 volte 15 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430165, CLS430166	Utilizzato per la coltura di ovociti; Disponibile in varie dimensioni.
Centrifuga (da banco)	Eppendorf	5424R	Una centrifuga compatta per piccoli volumi di campioni comunemente utilizzata nei laboratori di ricerca.
Provette da centrifuga (15 ml e 50 ml)	Corning	352096, 352070	Provette più grandi per la centrifugazione, comunemente utilizzate per la lavorazione di cellule e proteine.
Cloroformio	Sigma-Aldrich	Codice: C2432	Un solvente comunemente usato nei protocolli di biologia molecolare, in particolare nell'estrazione di DNA/RNA.
Incubatore a CO2	Sanyo	(modello: MCO-18AIC)	Incubatore progettato per mantenere un'atmosfera controllata di CO2 per la coltura di ovociti.
Aghi ultrasottili monouso (27 G & volte; 1/2")	Hanke Sass Lupo	4710004012	Aghi sottili per la raccolta degli ovociti
DNasi I (senza RNasi)	Thermo Fisher Scientifico	EN0521	Enzima utilizzato per rimuovere il DNA contaminante dai preparati di RNA.
Blocco riscaldante a secco	Strumenti di sovvenzione	(modello: QBD4)	Un blocco utilizzato per riscaldare campioni o reazioni a temperature precise senza la necessità di acqua.
Etanolo (grado di biologia molecolare)	Sigma-Aldrich	E7023	Utilizzato per la precipitazione di DNA e RNA, nonché nelle procedure di sterilizzazione.
Forbici da dissezione fine	Met-App Strumenti Scientifici e Chirurgici	2235	Utilizzato per la dissezione precisa degli ovociti di topo
Pinze fini	Met-App Strumenti Scientifici e Chirurgici	2127	Utilizzato per la dissezione precisa degli ovociti di topo
Sistema di elettroforesi su gel	Bio-Rad	1645050	Un sistema per eseguire l'elettroforesi di acidi nucleici o proteine in gel.
Gentamicina solfato	Sigma-Aldrich	G1264	Antibiotico utilizzato per prevenire la contaminazione batterica nelle colture cellulari.
Pipette in vetro Pasteur (230 mm)	VWR	6121702	Pipette in vetro utilizzate per la pipetta della bocca degli ovociti.
IBMX	Sigma-Aldrich	I5879	Un inibitore della fosfodiesterasi usato per prevenire la GVBD
Microscopio invertito	Nikon		Un microscopio progettato per osservare cellule o organismi vivi da sotto il piatto di coltura.
Olio minerale leggero adatto per la coltura di embrioni di topo	Sigma-Aldrich	Motore M5310	Utilizzato per coprire gli ovociti in coltura per prevenire l'evaporazione e mantenere la temperatura.
Cloruro di litio	Sigma-Aldrich	L9650	Utilizzato nei metodi di precipitazione dell'RNA.
Sistema di imaging di cellule vive	Leica	LAS X	Sistema di imaging progettato per l'osservazione in tempo reale di cellule viventi utilizzando tecniche avanzate di microscopia.
Terreno M16 (per coltura in vitro)	Sigma-Aldrich	Codice: M7292	Un terreno progettato per la coltura di ovociti ed embrioni di topo e altre applicazioni in vitro.
Provette per microcentrifuga (0,6 ml e 1,6 ml)	Nettuno	3735.X, 3745.X	Provette di piccolo volume per centrifugazione, spesso utilizzate nei protocolli di biologia molecolare e biochimica.
Provette per microcentrifuga (senza RNasi)	Eppendorf / Nettuno	022431081 (Eppendorf)	Le provette prive di RNasi per l'RNA lavorano per prevenire la degradazione dell'RNA.
Aghi per microiniezione	Strumenti Sutter	P-30 Estrattore per pipette	Aghi per microiniezione precisa negli ovociti
Sistema di microiniezione	Apparato di Harvard	FemtoJet, PicoPump	Sistemi utilizzati per iniettare cRNA in ovociti di topo con elevata precisione.
Kit Miniprep	Qiagen	27106 (Kit Miniprep Spin QIAprep)	Un kit per isolare il DNA plasmidico da colture batteriche per applicazioni di biologia molecolare.
Gruppo tubo aspiratore bocca	Sigma-Aldrich	Codice: A5177	per aspirazione di ovociti
Vernice a pellet	Merck Millipore	69049-3	Un prodotto per la visualizzazione della formazione di pellet durante la centrifugazione.
Fenolo:Cloroformio:Alcool isoamilico	Thermo Fisher Scientifico	15593031	Una soluzione utilizzata nell'estrazione H2B-RFP per la separazione di fase.
Plasmide codificante H2B-RFP	Addgene	Plasmide #20972	Plasmide utilizzato per marcare i cromosomi con la proteina a fluorescenza rossa (RFP)
PMSG	Prospettiva	HOR-272	Per la superovalazione del topo
proteinasi K	Thermo Fisher Scientifico	EO0491	Un enzima utilizzato per digerire le proteine, comunemente usato nelle procedure di estrazione di DNA/RNA.
Enzima di restrizione NotI	Biolaboratori del New England (NEB)	R3189S	Un enzima di restrizione utilizzato nel clonaggio del DNA e nelle applicazioni di biologia molecolare, per la linearizzazione del plasmide H2B-RFP.
Inibitore della RNasi (opzionale)	Biolaboratori del New England (NEB)	Codice: M0314S	Enzima utilizzato per prevenire la degradazione dell'RNA durante esperimenti correlati all'RNA.
Guanti senza RNasi	VWR / Fisher Scientific	Varia in base alle dimensioni	Guanti trattati per prevenire la contaminazione da RNasi, utilizzati nei protocolli di manipolazione dell'RNA.
Puntali per pipette privi di RNasi	Axygen / Thermo Fisher	T-300-R-S	Puntali per pipette progettati per essere privi di contaminazione da RNasi per applicazioni correlate all'RNA.
Acqua priva di RNasi	Thermo Fisher Scientifico	AM9932	Acqua purificata per rimuovere gli enzimi RNasi, essenziali per il lavoro dell'RNA per evitare la degradazione.
SDS (10%)	Sigma-Aldrich	L3771	Sodio dodecil solfato utilizzato per denaturare le proteine nell'elettroforesi e in altri esperimenti.
SiR-Tubulina	Spirocromo	SC002	Un colorante fluorescente che si lega specificamente alla tubulina per l'imaging di cellule vive del fuso
Acetato di sodio (3 M)	Sigma-Aldrich	Episodio 7899	Utilizzato come tampone e per la precipitazione del DNA nelle procedure di biologia molecolare.
Spettrofotometro	Thermo Fisher (NanoDrop)	ND-ONE-W	Strumento utilizzato per quantificare gli acidi nucleici, le proteine e altre sostanze misurando l'assorbanza.
Stereomicroscopio	Leica Microsystems	Motore M165C	Un microscopio progettato per l'osservazione di campioni in tre dimensioni a bassi ingrandimenti, utile per le dissezioni.
Unità filtro siringa (0,22-µ m)	Merck	SLGP033RS	Utilizzato per la filtrazione sterile di liquidi, in particolare in applicazioni di microbiologia e biologia molecolare.
Siringhe e assemblaggio dell'ago	Terumo	Siringhe per tubercolina SS+01T	utilizzato per un'erogazione precisa PMSG.
T7 mMESSAGE mMACHINE Kit	Thermo Fisher Scientifico	AM1344	Un kit per la trascrizione in vitro di RNA da un promotore T7 per la preparazione di cRNA H2B-RFP.
Bagnomaria / blocco riscaldante	Strumenti di sovvenzione	Trasmissione QBD4	Utilizzato per mantenere temperature precise negli esperimenti che richiedono calore.