Articolo metodologico

Costruzione di profili coppia-velocità-potenza a carico costante (isotonico) e a velocità costante (isocinetica) in vivo per i flessori plantari di ratto

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DOI:

10.3791/68858

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3 ottobre 2025

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1Neuromechanical Performance Research Lab, Department of Human Health and Nutritional Sciences, College of Biological Sciences, University of Guelph, 2Aurora Scientific Inc.

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un nuovo protocollo per misurare in modo non invasivo la relazione coppia-velocità angolare-potenza in vivo nei flessori plantari di ratto utilizzando la stimolazione muscolare transcutanea. Questa configurazione consente di testare facilmente le contrazioni muscolari isotoniche su un trasduttore di forza/sistema di controllo della lunghezza per rappresentare meglio la natura a carico costante dei movimenti quotidiani.

Abstract

Comprendere la relazione coppia-velocità-potenza del muscolo è fondamentale per valutare le prestazioni dinamiche dei muscoli, che hanno implicazioni per la salute e la malattia. Mentre gli studi dinamometrici sull'uomo utilizzano contrazioni isocinetiche (velocità costante) o isotoniche (carico costante) per valutare questa relazione, i modelli di roditori si sono basati quasi esclusivamente su contrazioni isocinetiche a causa della complessità dell'esecuzione di esperimenti di bloccaggio del carico isotonico su sistemi disponibili in commercio. Le contrazioni isotoniche si allineano meglio con le condizioni di carico costante dei movimenti che si verificano al di fuori del laboratorio. Qui, presentiamo un protocollo di stimolazione elettrica transcutanea nuovo e minimamente invasivo e un flusso di lavoro passo-passo per valutare la relazione isotonica coppia-velocità angolare-potenza in vivo per i flessori plantari di ratto. Le curve coppia-velocità angolare isotonica e isocinetica sono state confrontate in 10 ratti Sprague-Dawley. Le contrazioni isotoniche hanno prodotto una velocità massima di accorciamento (Vmax) e una potenza di picco più elevate rispetto alle contrazioni isocinetiche che utilizzavano una coppia media. Tuttavia, la potenza di picco isocinetica corrispondeva meglio alla potenza di picco isotonica quando si misurava la coppia di picco dalle contrazioni isocinetiche a causa di una riduzione della curvatura della curva coppia-velocità angolare. Inoltre, la coppia e la velocità alla potenza di picco differivano a seconda del tipo di protocollo utilizzato. Tutti i set di dati si adattano fortemente all'equazione di Hill (R2 > 0,98), sebbene i dati isotonici avessero gli adattamenti "più deboli", probabilmente a causa della natura più variabile delle contrazioni a carico costante. Sulla base di questi risultati, si raccomanda l'uso di contrazioni isotoniche quando possibile, soprattutto se si mira a valutare il Vmax o la potenza di picco. Se invece si devono utilizzare i test isocinetici, qui viene fornita una guida preziosa per comprendere i limiti e massimizzare la traducibilità a contrazioni a carico costante.

Introduzione

L'indagine di base su come le prestazioni muscolari cambiano con l'esercizio, la maturazione, l'invecchiamento o la malattia spesso include solo valutazioni della produzione di forza o coppia durante le contrazioni isometriche (cioè lunghezza muscolare costante o angolo articolare, rispettivamente). Tuttavia, dal lavoro pionieristico di A.V. Hillnegli anni '30, gli esperimenti sulle prestazioni muscolari si sono gradualmente ampliati fino a incorporare condizioni dinamiche, valutando la relazione tra forza, velocità e il loro prodotto, potenza 2,3,4,5,6,7,8. All'aumentare della velocità di accorciamento, la probabilità di formare ponti trasversali actina-miosina che producono forza si riduce, creando la forma iperbolica inversa della curva forza-velocità 1,2. Pertanto, la potenza fornisce una rappresentazione complessiva delle prestazioni dinamiche di un muscolo, mostrando il compromesso tra forza submassimale e velocità submassimale nel raggiungimento della potenza massima9. Gli studi sull'uomo, in particolare, sono passati all'uso della dinamometria di tutto il corpo (ad esempio, HUMAC o Biodex), che consente di valutare la relazione coppia-velocità-potenza utilizzando l'isocinetica10 (velocità angolare costante) o l'isotonico 11,12,13,14,15,16 movimenti (a carico costante). Di questi due tipi di movimento, le contrazioni isotoniche si allineano meglio con le condizioni di carico costante dei movimenti che si verificano al di fuori del laboratorio, ponendo la sfida di spostare un carico sui muscoli coinvolti, mentre le contrazioni isocinetiche sono più innaturali in quanto il braccio di leva che trasduce la forza del dinamometro può muoversi solo a una velocità angolare fissa 12,16,17, 18.

Gli ultimi due decenni hanno anche visto progressi significativi nei piccoli sistemi dinamometrici per la valutazione delle prestazioni muscolari nei roditori 19,20,21,22,23,24. I modelli di roditori consentono possibilità quasi infinite per l'indagine preclinica di malattie che influenzano negativamente il muscolo, tra cui il diabete di tipo25, l'obesità26, la cachessia tumorale27, la sarcopenia19,28, la paralisi cerebrale spastica29,30, la distrofia muscolare di Duchenne31, la desminopatia32e altro ancora. Misure longitudinali ripetute delle prestazioni muscolari utilizzando animali vivi sono diventate possibili impiegando la stimolazione elettrica dei nervi periferici o dei muscoli percutanei in anestesia33,34. Sfortunatamente, poiché queste contrazioni devono essere evocate elettricamente, sono state più favorevoli alla natura semplicistica e controllata delle contrazioni isocinetiche piuttosto che isotoniche (che richiedono un approccio più sfumato) per costruire la relazione coppia-velocità-potenza. Inoltre, l'impianto di polsini dei nervi periferici o la stimolazione muscolare diretta tramite un elettrodo ad ago sono procedure invasive, che richiedono un intervento chirurgico o un attento inserimento di elettrodi a permanenza attraverso la pelle, e quindi l'uso ripetuto presenta rischi di effetti avversi o incongruenze che potrebbero confondere i risultati tra sessioni di test ripetute sullo stesso animale.

Qui, viene presentata una nuova configurazione per valutare la relazione in vivo coppia-velocità angolare-potenza nei ratti utilizzando una procedura coerente e minimamente invasiva di stimolazione muscolare transcutanea (cioè fuori dalla pelle) su un trasduttore di forza/sistema di controllo della lunghezza. Inoltre, questo studio fornisce un confronto tra le curve isotoniche e isocinetiche di coppia-velocità-potenza costruite con questa tecnica, con raccomandazioni tecniche/metodologiche basate sulle sfumature di entrambe le procedure.

Protocollo

Tutti i protocolli sono stati approvati dall'Animal Care Committee dell'Università di Guelph (AUP # 4905) e hanno seguito le linee guida del Canadian Council on Animal Care.

NOTA: I materiali elencati nella Tabella dei materiali sono necessari per la costruzione della configurazione del portaelettrodo, per il posizionamento del ratto all'interno del sistema di controllo della forza-trasduttore/lunghezza e per la raccolta dei dati di coppia, posizione e velocità angolare.

1. Animali

  1. Ottieni 10 femmine di ratti Sprague Dawley (età: 11 settimane; massa corporea: 228 ± 21 g).
  2. Alloggiare i ratti a 23 °C in gruppi di due o tre e dare accesso ad libitum a una dieta globale per roditori Teklad con il 18% di proteine e acqua a temperatura ambiente.

2. Portaelettrodo su misura

  1. Costruire il portaelettrodo su misura per la stimolazione transcutanea principalmente da parti di costruzione disponibili in commercio, le cui istruzioni per la costruzione sono presentate nel file supplementare 1.
  2. Progettazione personalizzata e stampa 3D del pezzo portaelettrodo con il file STL allegato nel file supplementare 1.
    NOTA: Questo pezzo portaelettrodo contiene fori montati per contenere chiodi di finitura lisci in acciaio zincato da 1-1/2". Il posizionamento dei chiodi in questi fori deve essere regolato in base alle dimensioni/posizione del singolo ratto da testare. A questi chiodi sono saldati fili catodici e anodici che si collegano a uno stimolatore bifase ad alta potenza per fornire la stimolazione transcutanea dei flessori plantari.

3. Configurazione iniziale dei test meccanici in vivo

  1. Accensione del sistema in vivo
    1. Accendere la pompa di calore e impostarla a 37 °C.
    2. Accendere il computer. Aprire il software DMCv5.5.
    3. Sulla scatola dello stimolatore, premere l'interruttore di alimentazione On grande e l'interruttore di uscita On più piccolo.
    4. Accendere l'interruttore di accensione per il sistema di leve a doppia modalità.
    5. Fare clic su Protocollo nel software. Caricare un protocollo che fornisca una contrazione di 500 ms a 100 Hz (larghezza dell'impulso 0,1 ms) con un angolo della caviglia di 90° (ovvero l'angolo neutro predefinito per il software).
      NOTA: I passaggi per la progettazione di un protocollo vanno oltre lo scopo del presente studio e possono essere consultati nei manuali operativi per un determinato sistema.
    6. Impostare la forza di offset a 350 mN×m (la coppia massima che può essere registrata da questo sistema; è improbabile che un ratto superi quel valore28,35,36,37,38), quindi caricare il protocollo.
    7. Spingere l'interruttore sul sistema su Esegui. Assicurarsi che il pedale (etichettato nella Figura 1) si blocchi in posizione.
  2. Preparare il ratto
    1. Anestetizzare il ratto tramite isoflurano utilizzando procedure operative standard presso l'istituto di ricerca applicabile39 (ad esempio, qui, sono state utilizzate le linee guida della formazione sull'anestesia dei roditori dell'Università di Guelph, con isoflurano impostato al 4% e velocità di flusso di ossigeno impostata a 2,5 L/min per l'induzione iniziale, e isoflurano ridotto a 1,5-2% e portata di ossigeno a 1,5 L/min per il mantenimento). Posizionare il ratto con la bocca/il naso in un cono boccale su una piattaforma riscaldata (Figura 1). Monitorare la respirazione e la frequenza cardiaca del ratto per garantire una profondità di anestesia costante e sicura, facendo riferimento alle procedure operative standard39.
    2. Spalmare un unguento sugli occhi per evitare che gli occhi si secchino.
    3. Radere completamente i peli della gamba sinistra utilizzando un rasoio elettrico.
    4. Stendere una crema depilatoria disponibile in commercio su tutta la gamba utilizzando un batuffolo di cotone (ad es. cotton fioc). Attendere 3 minuti, quindi raschiare via la crema con tanti batuffoli di cotone quanto necessario. Cerca di avere la gamba il più nuda possibile.
      NOTA: Questo passaggio è necessario perché i peli interromperanno il contatto tra gli elettrodi, il gel conduttivo e la pelle quando si tenta di fornire una stimolazione elettrica.
    5. Pulisci completamente la gamba bagnando batuffoli di cotone con acqua distillata e strofinandoli sulla gamba.
    6. Asciugare la gamba con un tovagliolo di carta.
  3. Posizionamento del ratto
    1. Avvolgere il nastro chirurgico attorno al piede e al pedale per fissare il piede in posizione. Deve essere il più stretto possibile. Assicurarsi, in particolare, che il tallone sia fissato nella fessura nella parte inferiore del pedale. Utilizzare la manopola di regolazione 3 (etichettata nella Figura 1) per avvicinare o allontanare il pedale secondo necessità per garantire che il ginocchio sia esteso.
    2. NOTA: La vera estensione completa del ginocchio è difficile da ottenere qui, quindi non preoccuparti se il ginocchio non è completamente esteso.
    3. Imposta il morsetto, spingendo nella tibia medio-prossimale per fissare la parte inferiore della gamba in posizione (vedere la Figura 1per una rappresentazione visiva). Utilizzare le manopole di regolazione 1 e 2 (etichettate nella Figura 1) per posizionare il pedale in modo che sia in linea con il clamp.
  4. Posizionamento degli elettrodi
    1. Usando una pinzetta, stendere il gel conduttivo su entrambi gli elettrodi e sulla parte posteriore della zampa del ratto.
    2. Posizionare gli elettrodi come mostrato nella Figura 1, assicurandosi che ci sia del gel tra gli elettrodi e la gamba. L'elettrodo distale va appena distalmente al gastrocnemi, mentre l'elettrodo prossimale va all'estremità prossimale del gastrocnemi, dove incontra l'articolazione del ginocchio. Trova queste posizioni palpando il "rigonfiamento" dei gastrocnemi sul lato posteriore della parte inferiore della gamba.
    3. Ruotare l'ingranaggio (etichettato nella Figura 1) per sollevare gli elettrodi in posizione e garantire un contatto costante durante le stimolazioni. Non spingerlo verso l'alto con troppa forza, altrimenti eserciterà una coppia passiva indesiderata sul pedale. Ci deve essere solo una leggera flessione nell'asse (etichettato nella Figura 1) che trattiene gli elettrodi per garantire che rimanga in posizione durante la stimolazione.
  5. Abilitazione del salvataggio automatico
    1. Tornare al software DMCv5.5. In alto, fai clic su Configurazione, quindi su Salvataggio automatico cartella.
    2. Vai alla cartella scelta in cui salvare i file di dati, quindi fai clic su Cartella corrente.
    3. Digita un nome di base (ad esempio, il codice di identificazione del ratto) nella casella Salvataggio automatico base , quindi fai clic su Abilita salvataggio automatico. Tutti i file di dati verranno salvati nella cartella selezionata con il nome di base del salvataggio automatico. Non dimenticare di aggiungere il nome di base a seconda del protocollo in esecuzione (ad esempio, "C1Black-70deg" per una contrazione di 100 Hz con un angolo di 70° alla caviglia; come nome del file, questo apparirà come "C1Black-70deg.ddf" nella cartella AutoSave scelta).

4. Ottimizzazione della corrente per la stimolazione a 100 Hz

  1. Il protocollo a 100 Hz a 90° è già caricato dal passaggio 3.1.5. Impostare lo stimolatore su 20 mA. Questo sarà un livello di stimolazione molto basso e farà sapere al ricercatore se è necessario apportare modifiche al posizionamento dell'elettrodo/gel (ad esempio, se la traccia di coppia sembra irregolare o la gamba scivola fuori dal morsetto) senza indurre molto affaticamento muscolare 28,35,36,37,38.
  2. Fare clic su Avvia test per eseguire il protocollo. I muscoli che si contraggono dovrebbero essere visibili. Dopo l'esecuzione del protocollo, fare clic su Analisi per verificare la quantità di coppia prodotta, assicurandosi che la casella di correzione della linea di base sia selezionata.
  3. Dopo aver lasciato 2 minuti di riposo, aumentare a 30 mA ed eseguire nuovamente il protocollo. Fare clic su Analisi per verificare la quantità di coppia prodotta, assicurandosi che sia selezionata la casella di correzione della linea di base (questa casella garantisce che la coppia passiva venga sottratta dalla coppia totale per ottenere una misurazione della coppia attiva).
    NOTA: L'utilizzo di questo strumento di correzione della linea di base funziona solo su questa configurazione a una caviglia di 90°. In tutte le altre angolazioni, per calcolare la coppia attiva è necessario utilizzare il metodo descritto al punto 5.1. Mentre 2 minuti di riposo sono raccomandati qui nei ratti giovani e sani, questo tempo di riposo potrebbe dover essere più lungo (ad esempio, 3-5 minuti) nei modelli di invecchiamento o malattia.
  4. Ripetere il passaggio precedente per 40 mA. Se la coppia è diminuita rispetto a 30 mA, 30 mA è lo stimolo ottimale. Se la coppia di 40 mA era maggiore, aumentare a 50 mA e stimolare nuovamente dopo 2 minuti di riposo. Se la coppia è diminuita, 40 mA era la corrente di stimolo ottimale.
  5. Ripetere questo processo fino a quando non è stato trovato lo stimolo ottimale (cioè, non si vede più un aumento della produzione di coppia dopo un ulteriore aumento della corrente di stimolazione). Di solito, la corrente di stimolo ottimale è di 40 mA o 50 mA.

5. Contrazioni isotoniche per la relazione coppia-velocità-potenza

  1. Creare un protocollo che induca una contrazione isometrica di 500 ms a 100 Hz con un angolo della caviglia di 70° (ovvero l'angolo più dorsiflesso a cui andrà questo sistema di leve) (file di protocollo disponibile nel file supplementare 2). Esegui questo protocollo. Registrare la coppia attiva massima (cioè la coppia totale meno la coppia passiva basale prima della stimolazione) prodotta durante questa contrazione. Utilizzare questo valore per determinare i morsetti di carico nei protocolli isotonici.
  2. Nella schermata Protocollo , creare un protocollo per spostare la caviglia in posizione dorsiflessa, quindi stimolare per 500 ms prima di tornare in posizione neutra (Figura 2; file di protocollo .dpf fornito nel File supplementare 2).
  3. Calcolare i carichi isotonici corrispondenti al 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% e 80% della coppia attiva massima a 70° registrata al punto 5.1. Assicurarsi di aggiungere anche la coppia passiva di base sul morsetto di carico (vedere l'esempio nella Figura 2). Eseguire questi morsetti di carico in ordine casuale utilizzando i passaggi descritti di seguito.
  4. Nel software DMCv5.5, nella casella Forza di offset (che attualmente è impostata a 350 dal passaggio 3.1.6), digitare il valore di coppia calcolato (cioè dei valori calcolati al punto 5.3 sopra) corrispondente alla prima pinza di carico da eseguire. Ora, carica il protocollo isotonico creato nel passaggio 5.2 e verrà applicata questa nuova forza di offset. Impostando questa forza di offset submassimale, l'accorciamento si verificherà quando la coppia prodotta dai flessori plantari raggiunge questo valore e rimarrà fissa a questo valore (Figura 2).
  5. Fare clic su Avvia test per eseguire il protocollo. Si verificherà una contrazione isotonica.
  6. Ripetere i due passaggi precedenti con 2 minuti di riposo tra ciascun morsetto di carico isotonico fino a quando tutte e otto le contrazioni isotoniche (10-80%) sono state eseguite.

6. Contrazioni isocinetiche per la relazione coppia-velocità-potenza

  1. Impostare la forza di offset su 350 mN×m se non è già presente.
  2. Creare otto protocolli di accorciamento isocinetico corrispondenti a velocità di accorciamento di 50, 100, 200, 300, 400, 600, 800 e 1000°/s (file di protocollo disponibili nel file supplementare 2). In questi protocolli, prima spostare passivamente la caviglia a 70° (cioè l'angolo più dorsiflesso disponibile su questo sistema), quindi impostare la stimolazione a 100 Hz in modo che avvenga all'inizio dell'accorciamento e continuare mentre la caviglia si sposta a 120° (cioè l'angolo più flesso plantare disponibile su questo sistema) (Figura 3). Al termine della stimolazione, impostare la caviglia in modo che torni all'angolo neutro predefinito del sistema di 90°.
  3. Esegui ciascuno di questi test isocinetici in ordine casuale, con 2 minuti di riposo tra ogni test.

7. Analisi dei file di test isotonici e isocinetici

  1. Analisi del test isotonico
    1. Poiché i test isotonici utilizzano un carico costante, registrare la velocità angolare durante l'accorciamento. Per analizzare la velocità angolare da questi test, aprire il file di dati. Ingrandisci la parte della traccia di posizione che rappresenta quando si è verificato l'accorciamento isotonico. Fare clic su Analisi muscolare.
    2. Per calcolare la pendenza media durante l'accorciamento, guarda la colonna Posizione ed esegui il calcolo: Velocità angolare media = (Posizione minima - posizione massima)/Tempo totale. Si noti che la "Posizione minima" rappresenta l'angolo più dorsiflesso, che è la posizione di partenza dell'articolazione.
  2. Analisi del test isocinetico
    1. Poiché i test isocinetici utilizzano una velocità costante, registrare la coppia prodotta durante l'accorciamento.
      NOTA: Il presente studio mostra due diversi metodi di registrazione della coppia da questi protocolli: coppia media durante l'accorciamento e coppia massima durante l'accorciamento. I vantaggi e gli svantaggi di ciascuno di essi sono presentati nei Risultati Rappresentativi.
    2. Aprire il file di dati. Per registrare la coppia media, ingrandire la traccia di coppia durante la fase di accorciamento. Fare clic per aprire la finestra Analisi muscolare . Dai valori indicati nella colonna della coppia, registrare la coppia media come: Coppia media = Integrazione/Tempo totale.
    3. Dalla stessa finestra di Analisi muscolare , registrare la coppia di picco come il valore indicato nella casella Coppia massima .

8. Adattamento della curva ai dati di coppia e velocità angolare

  1. In un foglio di calcolo, crea un foglio separato per i dati isotonici e i dati isocinetici per ogni ratto. In ogni foglio, organizza i dati in due colonne: forza e velocità. Includere in questi dati la coppia massima a 70°, corrispondente a una velocità di 0°/s. Etichettare ogni foglio come [Nome ratto] seguito da [ISOT] o [ISOK], corrispondenti rispettivamente ai dati isotonici o isocinetici (ad esempio, "C1BLACK ISOT" o "C1BLACK AVG ISOK" dove C1BLACK è il nome del ratto; vedere la Figura 4 per ulteriori esempi).
    NOTA: queste convenzioni di denominazione sono necessarie per il codice Python utilizzato nel passaggio successivo. Queste convenzioni di denominazione specifiche sono richieste solo in questo file di foglio di calcolo.
  2. Seguire il collegamento nel file supplementare 3 per eseguire il codice Python personalizzato, utilizzando le istruzioni aggiuntive relative al codice fornite nel file supplementare 3. Una volta eseguito il codice, apparirà una finestra che chiederà al ricercatore di selezionare il foglio di calcolo contenente i singoli fogli per i dati isotonici e isocinetici di ciascun ratto che è stato realizzato nel passaggio 8.1. Se organizzato correttamente in base alla descrizione nel passaggio 8.1 e nella Figura 4, questo codice visualizzerà una finestra che mostra una curva coppia-velocità-potenza adattata per ogni set di dati (esempi nella Figura 4). In questo codice, tutti i dati sono adattati alla seguente equazione1:
    figure-protocol-1
    Dove Fmax è la coppia isometrica massima di 100 Hz a 70°, F e V rappresentano rispettivamente la coppia della pinza di carico isotonica e la velocità angolare e a e b rappresentano le costanti termodinamiche di Hill con le unità di coppia (N•m) e velocità (°/s), rispettivamente.
    NOTA: Dopo che il codice ha selezionato ogni insieme di dati di forza e velocità, produrrà un nuovo file Excel contenente, per ogni curva adattata, i seguenti dati: velocità massima di accorciamento (Vmax), Fmax, i coefficienti a e b, la curvatura della curva coppia-velocità (a / Fmax), potenza di picco, il valore di coppia che corrisponde alla potenza di picco, il valore della velocità angolare che corrisponde alla potenza di picco e il valore R2 che rappresenta l'adattamento dei dati raccolti all'equazione (Figura 4).

9. Confronto dei profili di coppia-velocità-potenza isotonici e isocinetici

  1. Per eliminare il rischio di distorsioni legate all'ordine dei test, 1) alternare tra l'esecuzione dei test isotonici e l'esecuzione dei test isocinetici; e 2) randomizzare l'ordine di contrazione all'interno di ciascuna serie di contrazioni isotoniche (pinze di carico di 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 e 80% di coppia massima) e isocinetiche (velocità angolari di 50, 100, 200, 300, 400, 600, 800 e 1000 °/s). Selezionare l'intervallo di velocità angolari isocinetiche in accordo con studi precedenti sui flessori plantari in vivo nel ratto23.
  2. Utilizzare un'ANOVA a misure ripetute a due vie per valutare le somiglianze e le differenze tra le curve coppia-velocità-potenza prodotte dai tre metodi qui impiegati (isotonica, isocinetica con coppia media durante l'accorciamento e isocinetica con coppia di picco durante l'accorciamento) per le seguenti variabili: Vmax, coefficienti a e b , curvatura, potenza di picco, coppia alla potenza di picco, velocità angolare alla potenza di picco, e R2. Applicare una correzione di Bonferroni a tutti i confronti a coppie. Imposta il livello alfa su α = 0,05.

Risultati

La Figura 5A mostra le relazioni coppia-velocità generate dai punti dati grezzi e la Figura 5B utilizza la media Fmax e i coefficienti a e b per tracciare questi dati adattati all'equazione1 di Hill insieme alle curve coppia-potenza, in cui coppia e velocità sono state moltiplicate insieme per calcolare la potenza. Tutti i metodi (isotonico, isocinetico utilizzando la coppia media, isocinetico utilizzando la coppia di picco) mostrano la forma attesa della relazione coppia-velocità, con la velocità di accorciamento angolare che diminuisce iperbolicamente con l'aumentare della coppia e viceversa e con la potenza di picco prodotta a livelli submassimali sia di coppia che di velocità.

La Figura 6 mostra i dati ottenuti dall'adattamento della curva ai dati di coppia e velocità angolare. La curva ottenuta dai test isotonici prevede un Vmax maggiore di entrambe le curve isocinetiche (P = 0,002 rispetto a entrambe; Figura 6A). La curva isotonica ha anche prodotto una potenza di picco maggiore rispetto alla curva isocinetica utilizzando la coppia media (P = 0,006), ma questa discrepanza è stata superata utilizzando invece la coppia di picco dei test isocinetici, producendo una potenza di picco che non differiva da quella della curva isotonica (P = 1,00) (Figura 6B). Questo aumento della potenza di picco utilizzando la coppia di picco nella curva isocinetica è stato ottenuto matematicamente riducendo la curvatura della curva coppia-velocità rispetto all'utilizzo della coppia media (P < 0,001) (Figura 6G), nonostante mantenga lo stesso Vmax (P = 1,00) (Figura 6A). Questa riduzione della curvatura dovuta all'utilizzo della coppia di picco dei test isocinetici ha anche comportato una sovrastima della coppia alla potenza di picco rispetto alla curva isotonica (P < 0,001), mentre la curva isocinetica che utilizza la coppia media corrispondeva meglio alla coppia di picco alla potenza di picco dalla curva isotonica (P = 1,00) (Figura 6C). Detto questo, la curva isocinetica che utilizza la coppia media ha sottostimato la velocità alla potenza di picco rispetto alla curva isotonica (P < 0,001) (Figura 6D). L'uso della coppia di picco per la curva isocinetica ha portato la velocità alla potenza di picco più vicina a quella della curva isotonica, ma con ancora una leggera sottostima (P = 0,043) (Figura 6D). Infine, mentre tutti i set di dati si adattavano fortemente all'equazione di Hill (tutti R2 > 0,98), la curva isotonica era leggermente più debole rispetto alle altre due (P = 0,015-0,029). Collettivamente, questi risultati dimostrano come le contrazioni dinamiche a carico costante, che assomigliano meglio ai movimenti del mondo reale, producano risultati diversi rispetto alle contrazioni dinamiche a velocità costante più comunemente utilizzate nella valutazione della relazione coppia-velocità-potenza.

Tutti i singoli dati sono disponibili al pubblico all'indirizzo: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.29099018.v2

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Figura 1: Rappresentazione di come il ratto è impostato per il test in vivo della funzione meccanica dei flessori plantari. Il ratto viene posizionato su una piattaforma riscaldata sotto anestesia con isoflurano. Il piede è fissato saldamente al pedale con il tallone sicuro e un morsetto viene spinto nella tibia per fissare la parte inferiore della gamba in posizione. Le manopole di regolazione 1, 2 e 3 aiutano il posizionamento ottimale della gamba in una posizione estesa al ginocchio e l'allineamento anatomico con l'asse del pedale. Il gel conduttivo è distribuito sui siti prossimali e distali del gruppo muscolare flessore plantare. Il portaelettrodo fissa gli elettrodi in posizione per la stimolazione transcutanea. L'ingranaggio sul dispositivo di tenuta dell'elettrodo personalizzato spingeva gli elettrodi contro la pelle sovrastante i muscoli flessori plantari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Esempio di coppia grezza, posizione e tracce di stimolazione per una stimolazione isometrica a 100 Hz con un angolo della caviglia di 70°, che è stata poi utilizzata per determinare la coppia di picco nelle contrazioni isotoniche con carichi impostati dal 10% all'80% della coppia di picco. È incluso un esempio di calcolo e impostazione del carico isotonico per una contrazione isotonica del 30%. Si noti che nell'impostazione del morsetto di carico ("Forza di offset"), il carico calcolato rappresenta una percentuale della coppia attiva di picco di 100 Hz (cioè la coppia totale meno la coppia passiva di base), ma la coppia passiva di base viene aggiunta di nuovo perché il sistema non è in grado di distinguere tra coppia totale e coppia attiva. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Esempio di coppia grezza e tracce di posizione delle contrazioni isocinetiche, da cui sono state misurate la coppia di picco e media durante l'accorciamento. I test presentati sono a velocità di 50, 100, 200, 300, 400, 600, 800 e 1000°/s (indicate nei pannelli di tracciamento della posizione). Le linee verticali tratteggiate nella lettura "Stimolazione" indicano l'inizio e la fine della stimolazione elettrica (la stimolazione reale non è visibile in queste fotografie delle letture dei dati). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Rappresentazione dei passaggi necessari per l'adattamento della curva dei dati di coppia (qui etichettati come "forza") e velocità. Dopo aver organizzato ogni singolo set di dati di coppia e velocità nel proprio foglio etichettato come [Nome ratto] [ISOK o ISOT] (ISOT = isotonico, ISOK = isocinetico), il codice viene eseguito. Apparirà una finestra che richiede di selezionare un file Excel. Dopo aver selezionato il file contenente tutti i fogli etichettati, ogni curva apparirà una alla volta, consentendo di ispezionarli visivamente per assicurarsi che non ci siano errori nei dati inseriti. Ogni curva mostra la velocità massima di accorciamento (Vmax), il valore massimo di coppia (Fmax) che sarebbe stato inserito dai dati misurati, i coefficienti a e b della curva, la curvatura della curva coppia-velocità (a / Fmax), la potenza di picco, il valore di coppia che corrisponde alla potenza di picco ("Opt Force"), il valore della velocità angolare che corrisponde alla potenza di picco ("Opt Vel"), e il valore R2 che rappresenta il grado di adattamento dei dati raccolti all'equazione. Dopo aver fatto clic su ciascuna curva, verrà generato automaticamente un file Excel contenente tutti i dati prodotti dall'adattamento della curva per ogni curva su cui si è appena fatto clic. Ricordati di salvare questo file prima di chiuderlo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Curve coppia-velocità angolare-potenza. (A) Le curve coppia-velocità angolare costruite a partire dai dati grezzi per le prove isotoniche (verde), le prove isocinetiche utilizzando la coppia media durante l'accorciamento (blu) e le prove isocinetiche utilizzando la coppia di picco durante l'accorciamento (arancione). (B) Le curve medie generate dall'adattamento di questi dati all'equazione di Hill1 insieme alle curve coppia-potenza create moltiplicando insieme coppia e velocità angolare. I dati nel pannello A sono presentati come media ± deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Dati ottenuti dall'adattamento della curva dei dati di coppia e velocità angolare. Confronto tra (A) Vmax, (B) potenza di picco, (C) coppia alla potenza di picco, (D) velocità alla potenza di picco, (E) coefficiente a, (F) coefficiente b, (G) curvatura e (H) R2 tra le curve generate dai test isotonici (ISOT), dai test isocinetici utilizzando la coppia media (ISOK AVG) e dai test isocinetici utilizzando la coppia di picco (ISOK PEAK). *Differenza significativa (P < 0,05). I dati sono presentati come media ± deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Istruzioni per la costruzione del portaelettrodo e file di stampa 3D (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28574951.v1)

File supplementare 2: file di protocollo .dpf per il sistema 3-in-1 di Aurora Scientific (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.29099018.v2)

File supplementare 3: Codice Python per i dati di coppia di adattamento della curva alla velocità angolare (https://github.com/ahinks192/Torque-Velocity-Curve)

Discussione

Il presente studio mostra una nuova configurazione per il test in vivo della funzione meccanica dei flessori plantari di ratto utilizzando la stimolazione elettrica transcutanea. In particolare, il presente studio dimostra come valutare la relazione coppia-velocità angolare-potenza utilizzando contrazioni isotoniche, che si allineano meglio con le condizioni di carico costante e dipendenti dalla velocità dei movimenti che si verificano al di fuori del laboratorio rispetto alle contrazioni isocinetiche. Tuttavia, viene presentato anche il modo in cui le misurazioni di una relazione isocinetica coppia-velocità angolare-potenza possono essere ottimizzate per imitare i risultati delle contrazioni isotoniche. A causa della natura ripetibile di questa configurazione sperimentale, queste valutazioni delle prestazioni dinamiche a livello articolare hanno il potenziale per migliorare notevolmente la comprensione di come l'età, la malattia, l'immobilizzazione e vari interventi di esercizio fisico influiscono sulla funzione contrattile muscolare nei modelli di roditori. Infatti, questa configurazione è stata precedentemente utilizzata per confrontare la funzione meccanica dei flessori plantari tra ratti giovani e anziani, e prima e dopo gli interventi di fusione e allenamento 35,36,37,38,28.

Un importante vantaggio dell'impiego dei protocolli isotonici rispetto ai protocolli isocinetici è che i protocolli isotonici possono essere più individualizzati per un dato ratto. I protocolli isotonici iniziano con la determinazione della massima capacità di produzione di coppia, quindi le pinze di carico vengono normalizzate a quel valore specifico (cioè, la curva isotonica ha variazioni sia negli assi di coppia che in quelli di velocità nella Figura 5A). Con i protocolli isocinetici, Vmax non può essere determinato in anticipo, quindi non è possibile normalizzare l'intervallo di velocità angolari submassimali a un valore di velocità massimo e utilizzare invece un intervallo standardizzato di velocità angolari (cioè, la curva isocinetica ha solo una variazione nell'asse di coppia). Questo intervallo standardizzato potrebbe diventare un problema per i ratti che hanno intrinsecamente una capacità di produzione di velocità più lenta (ad esempio, con un invecchiamento di16,40), poiché i test catturerebbero solo un intervallo più piccolo della loro curva coppia-velocità angolare, con alcune delle velocità standardizzate che potenzialmente scendono vicino o oltre V max. Le contrazioni isotoniche, quindi, consentono una migliore sicurezza nel catturare una rappresentazione completa della curva coppia-velocità angolare, e quindi della produzione di energia, in qualsiasi momento per qualsiasi stato di salute. In altre parole, come recentemente notato da Thompson18, i test isocinetici non forniscono alcuna distinzione tra le misurazioni della coppia di picco e della potenza perché le velocità sono limitate tra tutti i partecipanti, mentre i test isotonici disaccoppiano le misurazioni della coppia e della potenza individualizzando i carichi in base alla capacità di coppia massima di un dato partecipante e catturando meglio il compromesso tra coppia e velocità.

La capacità di una migliore individualizzazione delle contrazioni isotoniche può spiegare perché la relazione coppia-velocità-potenza costruita dalle contrazioni isotoniche ha prodotto un Vmax più elevato rispetto a entrambi i metodi isocinetici (Figura 6A). Quindi, se l'obiettivo principale di uno studio è valutare le variazioni del Vmax (ad esempio, prima rispetto a dopo un intervento di allenamento), dovrebbero essere utilizzate le contrazioni isotoniche perché le contrazioni isocinetiche potrebbero sottostimare questo valore. Tuttavia, se uno studio è invece interessato a chiarire le variazioni della potenza di picco, i valori di potenza ottenuti dalle contrazioni isocinetiche possono essere simili alle contrazioni isotoniche registrando la coppia di picco (al contrario della coppia media) durante l'accorciamento isocinetico (Figura 6B).

La misurazione della coppia al picco di potenza e della velocità al picco di potenza può anche essere utile per valutare se la produzione di coppia o velocità è più affidabile per le prestazioni dinamiche. Ad esempio, se una malattia non mostra alcun cambiamento nella potenza di picco, ma un aumento della coppia alla potenza di picco e una diminuzione della velocità alla potenza di picco, questa malattia influisce in modo sproporzionato sulla velocità e la produzione di coppia compensa per preservare la potenza erogata. Se si tenta di ottenere valori di coppia alla potenza di picco e di velocità alla potenza di picco da contrazioni isocinetiche simili ai valori ottenuti dalle contrazioni isotoniche, dovrebbero essere impiegati entrambi i metodi isocinetici presentati nel presente studio. Per la coppia alla potenza di picco, la registrazione della coppia media delle contrazioni isocinetiche corrisponde strettamente a quella ottenuta dalla relazione coppia-velocità isotonica (Figura 6C). Al contrario, per la velocità alla potenza di picco, la registrazione della coppia di picco dalle contrazioni isocinetiche corrisponde più da vicino a quella ottenuta dalla relazione coppia-velocità isotonica, tuttavia, ancora con una sottostima del 15% (Figura 6D). Un recente commentoha osservato che, se si mira a descrivere in modo completo le capacità funzionali di un muscolo, potrebbe essere desiderabile registrare sia i test isotonici che quelli isocinetici a prescindere, con i test isotonici raccomandati per valutare la potenza di picco e i test isocinetici necessari per valutare la produzione di coppia di picco durante l'accorciamento muscolare.

La configurazione sperimentale mostrata nel presente studio presenta anche vantaggi per migliorare il flusso di lavoro di laboratorio rispetto ai metodi tradizionali (ad esempio, elettrodi a permanenza, polsini dei nervi periferici) per valutare le prestazioni meccaniche in vivo nei roditori. Il portaelettrodo personalizzato consente una rapida regolazione dell'altezza degli elettrodi e la regolazione della distanza tra gli elettrodi (tramite i fori nel pezzo portaelettrodo rosso; Figura 1) per adattarsi alla lunghezza delle zampe di ogni singolo ratto. Queste caratteristiche facilitano anche l'abbinamento del posizionamento/posizione degli elettrodi sullo stesso ratto tra sessioni di test separate, il che è particolarmente utile per gli studi di allenamento longitudinale. Infatti, una tipica sessione di allenamento di resistenza (4 serie da 8-10 ripetizioni) su questa configurazione è stata completata a una velocità di ~15 minuti per ratto, o 10 ratti in ~2,5 ore con test continui 35,36,37. Inoltre, anche se non è l'obiettivo qui, il presente gruppo di ricerca ha sviluppato un pezzo di supporto dell'elettrodo più piccolo per testare la funzione meccanica in vivo del flessore plantare del topo41.

Nonostante i vantaggi metodologici di questa configurazione, ci sono alcune limitazioni da notare. Qui abbiamo utilizzato una gamma di movimento della caviglia da 70° a 110° perché questo è il limite del sistema di trasduttori di forza che abbiamo utilizzato, e una posizione della gamba più estesa per ottimizzare la produzione di coppia come indicato dai nostri precedenti esperimenti 35,36,37,38,28 - tuttavia, questa configurazione consente la modifica di queste posizioni (ad esempio, posizione del ginocchio piegato, diverso range di movimento della caviglia, diverse impostazioni di attivazione) per adattarsi alle esigenze sperimentali di un determinato ricercatore. Va inoltre notato che questa configurazione non cattura completamente il comportamento dinamico e a lunghezza variabile caratteristico della funzione muscolare in vivo durante la locomozione, poiché possono verificarsi cambiamenti nel carico durante le transizioni tra gli angoli articolari che purtroppo non possono essere implementati in questi esperimenti controllati a singola articolazione. Infine, il presente protocollo ha utilizzato l'equazione di Hill per adattare i dati di coppia e velocità angolare, che assumono una curva di forma iperbolica. Sebbene questa forma della curva sia affidabile per determinare la potenza di picco (che si verifica a livelli submassimali di forza e velocità), può sovrastimare Vmax a causa della forma a doppia iperbolica spesso osservata della relazione forza-velocità 2,42. Quindi, se l'obiettivo di un ricercatore è quello di valutare principalmente il Vmax utilizzando la configurazione sperimentale qui presentata, si potrebbe raccomandare di adattare questi dati a una curva iperbolica doppia più complessa 2,42.

Le relazioni isotoniche e isocinetiche coppia-velocità angolare-potenza qui presentate avevano tutte forti (R2 > 0,98) si adattano all'equazione di Hill (Figura 6H). Tuttavia, date le limitazioni sopra indicate per le relazioni coppia isocinetica-velocità angolare-potenza, si consiglia di utilizzare test isotonici quando possibile, soprattutto se si mira a valutare la potenza di picco. Se invece si devono utilizzare i test isocinetici, i risultati di questo articolo possono essere utilizzati come guida per comprendere i limiti e massimizzare la traducibilità alle contrazioni a carico costante.

Dichiarazioni

Christopher Rand e Matthew Borkowski lavorano per Aurora Scientific, Inc.

Ringraziamenti

Ringraziamo il personale della cura degli animali per la salute umana e le scienze nutrizionali per l'assistenza nella cura dei nostri ratti. Questo progetto è stato supportato dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), numero di sovvenzione RGPIN-2024-03782, e da una sovvenzione NSERC Alliance (ALLRP 603969-25) con Aurora Scientific inc.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1-1/2" chiodi con finitura liscia in acciaio zincato  The Hillman Group Canada ULC, Pickering, Ontario, Canadahttps://shop.hillmangroup.ca/ccrz__ProductDetails?sku=461146&cclcl=en_USPer il portaelettrodi su misura (istruzioni di costruzione fornite nella Figura Supplementare 1)
Apparecchiatura per rattiAurora Scientific Inc. (Aurora, Ontario, Canada)806D 
Accessorio personalizzato per fissare elettrodi progettato in Tinkercad (software open source) e stampato in 3DAutodesk Tinkercad www.tinkercad.comPer il portaelettrodi su misura (istruzioni di costruzione fornite nella Figura Supplementare 1)
Stimolatore ad alta potenza bifaseAurora Scientific Inc. (Aurora, Ontario, Canada)701C
Parti LEGOBrickLink.comVedi la Figura Supplementare S1 per i codici BrickLink.com di tutti i LEGO® PartiPer il portaelettrodi su misura (istruzioni di costruzione fornite nella Figura Supplementare 1)
Spectrum 360 Electrode GelSpectrahttps://www.orthocanada.com/en/spectra-electrode-gel?utm_term=&utm_campaign=Canada+EN+-+Search+-+OrthoCanada&utm_source=adwords&utm_medium=ppc&hsa_acc=1971735470&hsa_cam=136169080&hsa_grp=139530010212&hsa_ad=586754644289&hsa_src=g&hsa_tgt=dsa-19959388920&hsa_kw=&hsa_mt=&hsa_net=adwords&hsa_ver=3&gad_source=1&gad_campaignid=136169080&gbraid=0AAAAAD1V26BmzV4eR9tkH_8Truu4W7uu6&gclid=Cj0KCQjwnJfEBhCzARIsAIMtfKLpFSpoPZdXDBtyR8sRgHYCfYuELZFPs4g8U6r8t4_chBuz5KF0pBIaAoQ3EALw_wcB
Unguento per gli occhi lubrificante notturno SystaneSystanehttps://www.amazon.ca/dp/B004RSQGWC?ref=nb_sb_ss_w_as-reorder_k0_1_12&=&crid=38CVEZ82H7F4&=&sprefix=eye+ointment
Dieci femmine di ratti Sprague-DawleyCharles River Laboratories (Senneville, QC, Canada)Codice di deformazione: 001
Nastro chirurgico transpore3M (Milton, Ontario, Canada)1527
Crema Depilatoria Veet PureVeethttps://www.walmart.ca/en/ip/Veet-Pure-Hair-Removal-Cream-Legs-Body-Sensitive-Skin-400-mL/10032637
Scaldabagno/CircolatoreAurora Scientific Inc. (Aurora, Ontario, Canada)827A & nbsp;

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