Articolo metodologico

Quantificazione dell'assorbimento endoteliale degli acidi grassi mediante analoghi fluorescenti degli acidi grassi

DOI:

10.3791/68859

⸱

15 agosto 2025

 ,  , 
1Department of Biology, Union College, 2Department of Biology, University of North Carolina Chapel Hill, 3Department of Pathology & Laboratory Medicine and McAllister Heart Institute, University of North Carolina Chapel Hill

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive in dettaglio un test in vitro per misurare l'assorbimento lipidico cellulare nelle cellule endoteliali dopo stimolazione con analoghi fluorescenti BODIPY-C12 e BODIPY-C16 di acidi grassi saturi a catena lunga e molto lunga. Questo metodo è efficiente e adattabile ad altri tipi di cellule, offrendo un approccio utile per lo studio del metabolismo dei lipidi.

Abstract

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Le cellule endoteliali (EC) svolgono un ruolo centrale nella regolazione del trasporto degli acidi grassi (FA) dal flusso sanguigno ai tessuti metabolici, ma gli strumenti per quantificare l'assorbimento di EC FA in modo affidabile e scalabile rimangono limitati. Qui, presentiamo un saggio rapido, quantitativo ed economico per misurare l'assorbimento di FA nelle EC utilizzando analoghi fluorescenti di FA (BODIPY-C12 e BODIPY-C16), che consentono di studiare le dinamiche di assorbimento specifiche della lunghezza della catena in un formato di piastra a 96 pozzetti. Il protocollo incorpora controlli positivi (3-idrossiisobutirrato, lattato) e negativi (niclosamide) ed è validato sia in linee EC primarie (HUVECs) che immortalizzate (EA.hy926). Il test rileva l'assorbimento di FA dipendente dal tempo e dalla dose, con risultati normalizzati al numero di cellule utilizzando la colorazione nucleare di Hoechst e corretti per il background utilizzando controlli appropriati. Può essere adattato a una varietà di tipi di cellule, modalità di imaging e condizioni sperimentali, tra cui l'imaging di cellule vive e i formati di inseguimento dell'impulso. Rispetto alla tradizionale colorazione dei lipidi o ai traccianti radiomarcati, questo metodo offre maggiore sicurezza, velocità e versatilità durante l'acquisizione dinamica dell'assorbimento dinamico di FA nelle cellule vive. Questo test fornisce una solida piattaforma per studiare la regolazione del trasporto lipidico endoteliale e il suo contributo alla malattia metabolica.

Introduzione

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Affinché i nutrienti trasmessi dal sangue come i lipidi entrino nel tessuto metabolico, come il muscolo scheletrico, devono prima attraversare la barriera delle cellule endoteliali (EC) che comprende le pareti dei vasi sanguigni capillari. Sebbene si sia a lungo creduto che gli acidi grassi (FA) si diffondessero semplicemente attraverso questa barriera per raggiungere il tessuto sottostante, prove emergenti suggeriscono che le EC regolano attivamente questo processo attraverso meccanismi di trasporto specializzati evoluti per spostare molecole idrofobiche attraverso mondi extra- e intracellulari acquosi1.

Nel flusso sanguigno, gli acidi grassi liberi legati all'albumina (FFA) o sono impacchettati all'interno di lipoproteine ricche di trigliceridi (TRL) come i chilomicroni e le lipoproteine a bassissima densità (VLDL)2. Sulla superficie luminale delle EC, la lipoproteina lipasi (LPL) idrolizza i TRL per rilasciare FFA per l'assorbimento. Una varietà di proteine sono coinvolte nel trasporto dell'FA, tra cui il CD36, che effettua l'effettivo assorbimento dell'FA nella cellula; proteine di trasporto degli acidi grassi (FATP) e acil-CoA sintetasi (ACSL), che mediano il trasporto vettoriale; proteine leganti i grassi (FABP), che agiscono come chaperoni lipofili, e innumerevoli altre, alcune ancora da scoprire e classificare 2,3. Anche il tessuto sottostante utilizza meccanismi simili per assorbire il grasso trasportato, sebbene le isoforme specifiche presenti spesso differiscano in base al tipo di cellula.

Studi recenti hanno dimostrato che le EC si coordinano con le cellule vicine attraverso la segnalazione paracrina per modulare il trasporto di FA nei tessuti bersaglio. Ad esempio, i miociti scheletrici secernono una serie di fattori paracrini come il 3-idrossiisobutirrato (3-HIB), il fattore di crescita dell'endotelio vascolare B (VEGFB) e l'apelina per promuovere il trasporto di FA da parte dell'endotelio vicino 4,5,6. È interessante notare che anche il sistema endocrino può essere coinvolto, come nel caso in cui l'insulina stimola gli adipociti a rilasciare lattato, che stimola anche le EC ad assorbire gli acidi grassi7.

Le EC agiscono quindi come guardiani modulatori del grasso, suggerendo che svolgono un ruolo chiave nei disturbi metabolici lipidici come le malattie cardiovascolari o il diabete di tipo 2. Prove recenti hanno dimostrato che le EC stesse accumulano goccioline lipidiche (LD) in risposta al sovraccarico di grasso, agendo potenzialmente come un tampone che regola il rilascio di acidi grassi ai tessuti sottostanti 8,9. Nel caso di un elevato consumo di grassi, come nel caso delle diete moderne, l'accumulo eccessivo di questi LD può contribuire alla disfunzione vascolare e alle malattie, tra cui l'ipertensione10. Nel complesso, una migliore comprensione di come le EC assorbono e trasportano gli acidi grassi può fornirci nuovi strumenti terapeutici per affrontare le malattie trasmesse dai lipidi.

In questo studio, descriviamo un test semplice, rapido ed economico per misurare l'assorbimento endoteliale di FA utilizzando analoghi fluorescenti di FA a catena lunga BODIPY-C12 e BODIPY-C16. Questi reagenti sono abbastanza economici e abbastanza sicuri, soprattutto rispetto ai FA radioattivi o marcati con isotopi pesanti, che sono stati tradizionalmente utilizzati per misurare l'assorbimento di grasso cellulare 11,12. È importante notare che questi reagenti sono distinti dal colorante BODIPY "libero" non coniugato, che si accumula passivamente nelle regioni idrofobiche della cellula, principalmente nelle LD13. Al contrario, coniugando BODIPY a una catena di FA alifatica (ad esempio, C12 o C16) si produce una molecola che imita strutturalmente le FA native a catena lunga. Questa modifica consente la misurazione specifica dell'assorbimento dinamico degli acidi grassi nelle cellule, piuttosto che riflettere l'accumulo di lipidi intracellulari o la formazione di goccioline.

Un punto di forza di questo approccio è la sua flessibilità. I ricercatori possono utilizzare altri tipi di cellule, tempi di incubazione variabili e una gamma di analoghi FA coniugati con BODIPY per studiare l'assorbimento dipendente dalla lunghezza della catena, o anche lipidi naturalmente fluorescenti come l'acido grasso cis-parinarico14. Nel complesso, questo protocollo fornirà ai ricercatori un modo semplice per testare l'assorbimento cellulare di FA in molteplici condizioni e aprirà la strada per rispondere a domande fondamentali sul metabolismo dei lipidi, sulla biologia endoteliale e sulle malattie metaboliche (Figura 1).

Protocollo

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Tutte le cellule endoteliali di derivazione umana (HUVEC) utilizzate in questo studio sono state ottenute da fonti de-identificate disponibili in commercio in conformità con le linee guida istituzionali e dei fornitori per l'uso etico di materiali biologici umani. Eseguire tutte le fasi in un ambiente sterile sotto una cappa a flusso laminare. Vedere la Tabella dei materiali per un elenco di tutti i reagenti e le attrezzature.

1. Rivestimento in gelatina di una piastra a 96 pozzetti

  1. Preparare una soluzione di gelatina allo 0,1% diluendo 25 mL di brodo di gelatina al 2% in 500 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
  2. Miscelare accuratamente e sterilizzare con filtro utilizzando un filtro sottovuoto da 0,2 μm (o autoclave).
  3. Aggiungere 100 μl per pozzetto di gelatina allo 0,1% in una piastra nera a fondo trasparente a 96 pozzetti.
  4. Incubare a 37 °C per almeno 30 minuti o idealmente durante la notte.

2. Semina cellulare

  1. Preparare una sospensione a cellula singola di EC in un terreno completo.
    1. Preparare il terreno completo integrando il terreno basale appropriato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina/streptomicina (v/v per entrambi).
      NOTA: Il terreno basale differirà in base al tipo di cella specifico; in questo studio, il terreno di crescita endoteliale (EGM-2) e il terreno di Eagle's modificato di Dulbecco (DMEM) sono stati utilizzati rispettivamente per le cellule HUVEC e EA.hy926.
  2. Pipettare 100 μl della sospensione cellulare in ciascun pozzetto a una densità di semina che consenta alle cellule di raggiungere la confluenza entro il giorno successivo.

3. Preparazione e applicazione del reagente di trattamento

  1. Preparare tutti i reagenti in PBS bivalente (con Ca2+ e Mg2+) e preriscaldare a 37 °C.
    1. Preparare 3-HIB (controllo positivo) come soluzione di lavoro da 20 mM. Sciogliere la soluzione madre a 1 M in acqua bidistillata e conservare a 4 °C.
    2. Preparare il lattato (controllo positivo) come soluzione di lavoro da 20 mM. Sciogliere la soluzione madre a 1 M in acqua bidistillata e conservare a 4 °C.
    3. Preparare la niclosamide (controllo negativo) a una concentrazione finale di 1 μM. Sciogliere la soluzione madre a 10 mM in DMSO. Aliquotare in volumi più piccoli per evitare cicli di gelo-disgelo e conservare a -20 °C.
  2. Lavare le celle una volta con PBS bivalente preriscaldato.
  3. Aggiungere 50 μl per pozzetto del reagente di trattamento appropriato (3-HIB, lattato o niclosamide) e incubare a 37 °C per 30 minuti (per niclosamide) o 60 minuti (per 3-HIB e lattato).

4. BODIPY-FA: Preparazione e applicazione complessa del BSA

  1. Preparare i complessi BODIPY-FA: BSA alle concentrazioni finali di 0,5 μM, 1 μM o 2 μM in PBS, utilizzando un rapporto molare FA: BSA di 2:1. Per una soluzione BODIPY-FA da 2 μM, incubare con 1 μM di BSA privo di FA in PBS. Per 1 μM BODIPY-FA, utilizzare 0,5 μM BSA e così via. Proteggere sempre i complessi dalla luce durante l'incubazione.
  2. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti prima dell'uso.
  3. Aggiungere 50 μl del complesso ai pozzetti trattati.
    NOTA: Utilizzare solo le 10 colonne centrali per evitare effetti sui bordi. Riservare le colonne esterne come controlli di autofluorescenza, aggiungendo solo PBS a questi pozzetti.
  4. Incubare la piastra a 37 °C per 1 minuto, 5 minuti o 10 minuti.

5. Quenching della fluorescenza e rilevamento del segnale intracellulare

  1. Preparare 1 μM di BSA privo di FA in PBS come tampone di lavaggio e preriscaldare a 37 °C.
  2. Rimuovere BODIPY-FA: BSA e lavare l'intera piastra due volte con 50 μL di BSA preriscaldato da 1 μM privo di FA in PBS. Eseguire ogni lavaggio per 1,5 min.
  3. Aggiungere 50 μl di blu di tripano allo 0,08% per spegnere la fluorescenza extracellulare.
  4. Misurare immediatamente la fluorescenza intracellulare utilizzando un lettore di micropiastre con le seguenti impostazioni: Eccitazione: 488 nm, Emissione: 515 nm, Cutoff: 495 nm, Modalità: Bottom-read.
    NOTA: Sottrarre il fondo di autofluorescenza utilizzando pozzetti della colonna esterna contenenti cellule che non sono state trattate con BODIPY-FA nella fase 4.

6. Colorazione nucleare di Hoechst per la normalizzazione cellulare

  1. Rimuovere la soluzione di Trypan Blue e lavare delicatamente con PBS.
    NOTA: Le cellule possono essere alquanto fragili e inclini a sfaldarsi. Prestare attenzione durante il lavaggio.
  2. Aggiungere 4 μg/mL di Hoechst in terreno al 10% e incubare per 30 minuti a 37 °C.
    NOTA: Il tempo di incubazione di Hoechst potrebbe richiedere un'ottimizzazione. A seconda del tipo di cella, potrebbero essere necessari da 5 a 60 minuti per ottenere una marcatura nucleare uniforme e un'intensità del segnale sufficiente. Non aggiungere Hoechst alle colonne esterne.
  3. Lavare la piastra una volta con PBS.
  4. Aggiungi PBS fresco e misura la fluorescenza Hoechst utilizzando le seguenti impostazioni: Eccitazione: 350 nm, Emissione: 461 nm, Cutoff: 455 nm, Modalità: Bottom-read.
    NOTA: Sottrarre il fondo di autofluorescenza di Hoechst utilizzando i pozzetti della colonna esterna.
  5. Normalizzare la fluorescenza di BODIPY-FA al numero di cellule dividendo i valori corretti per l'autofluorescenza dal passaggio 5.3 per i corrispondenti valori di Hoechst ottenuti nel passaggio 6.4. Utilizzare valori corretti in background sia per i segnali BODIPY che per quelli di Hoechst.
    NOTA: I valori finali rappresentano l'assorbimento di BODIPY-FA normalizzato al numero di cellule, corretto per l'autofluorescenza sia nei canali BODIPY che in quelli di Hoechst.

7. Analisi statistica

  1. Eseguire analisi statistiche per la Figura 2 utilizzando l'ANOVA bidirezionale per valutare gli effetti del tempo, della concentrazione e della loro interazione. Applica il test post hoc di Tukey per confronti multipli.
  2. Per la Figura 3 e la Figura 4, utilizzare il test t a due code non accoppiato di Student quando si confrontano due condizioni. Per gli esperimenti che coinvolgono tre o più condizioni, utilizzare l'ANOVA unidirezionale seguita dal test di Dunnett per confronti multipli.

Risultati

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Come illustrato nella Figura 1, questo test utilizza un formato di piastra a 96 pozzetti in cui le EC vengono seminate direttamente nei pozzetti. Gli acidi grassi marcati con BODIPY sono coniugati all'albumina sierica bovina (BSA) e applicati sia ai pozzetti sperimentali che a quelli di controllo. Prima del trattamento con FA, le EC possono essere manipolate attraverso trattamenti farmacologici o perturbazioni genetiche come la trasfezione di siRNA o l'editing genico CRISPR. Fondamentalmente, tali manipolazioni consentono anche l'inclusione di controlli positivi e negativi appropriati per garantire l'affidabilità del test.

Un chiaro aumento dose-dipendente e tempo-dipendente del segnale intracellulare BODIPY-C12 è stato osservato dopo l'incubazione di BODIPY-C12 a 0,5 μM, 1 μM e 2 μM per 1 min, 5 min e 10 min sia in HUVEC che in cellule EA.hy926 (Figura 2). Per tenere conto delle potenziali variazioni del numero di cellule per pozzetto, i valori di BODIPY-C12 sono stati normalizzati alla colorazione nucleare di Hoechst e misurati in fluorescenza. L'autofluorescenza di fondo è stata corretta utilizzando pozzetti di controllo no-BODIPY e no-Hoechst.

Per convalidare la riproducibilità e l'intervallo del saggio, i modulatori noti del metabolismo degli acidi grassi sono stati testati in EC EA.hy926 utilizzando BODIPY-C12 (Figura 3). Il trattamento di 1 ora con concentrazioni crescenti di lattato (0 mM, 5 mM, 20 mM) o 3-HIB (0 mM, 5 mM, 20 mM) ha migliorato l'assorbimento di BODIPY-C12 in modo dose-dipendente, confermando il loro ruolo di regolatori positivi dell'assorbimento di FA. Al contrario, è stato precedentemente dimostrato che la sostanza chimica niclosamide può inibire l'assorbimento degli acidi grassi attraverso il disaccoppiamento mitocondriale15. In effetti, risultati simili sono stati riprodotti qui, poiché 30 minuti di trattamento con niclosamide (1 μM) hanno ridotto significativamente il segnale BODIPY-C12 rispetto al controllo del veicolo, convalidando la sua utilità come controllo negativo. Sebbene questi dati siano normalizzati in Hoechst per tenere conto di eventuali differenze nel numero di cellule, nessuno di questi trattamenti ha alterato la vitalità cellulare o i valori di fluorescenza di Hoechst.

Al fine di valutare l'adattabilità del test a diversi analoghi degli acidi grassi, BODIPY-C16, che può essere considerato un proxy di un acido grasso a catena molto lunga, è stato somministrato agli HUVEC e il suo assorbimento è stato misurato dopo incubazioni di 5 minuti (Figura 4). È stato osservato che il trattamento con lattato (0 mM, 10 mM, 20 mM) ha aumentato il segnale di BODIPY-C16 in modo dose-dipendente, mentre la niclosamide (1 μM) ha ridotto il segnale, rispecchiando i risultati osservati con BODIPY-C12.

Nel complesso, questo test ha permesso una quantificazione robusta e riproducibile dell'assorbimento di FA sia nelle EC primarie (HUVEC) che in quelle immortalizzate (EA.hy926). Inoltre, questi risultati dimostrano la versatilità del test tra FA di varie lunghezze di catena, oltre a mostrare la validità di controlli sia positivi che negativi.

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Figura 1: Schema del saggio di assorbimento degli acidi grassi utilizzando acidi grassi marcati con BODIPY. Le cellule endoteliali vengono seminate in una piastra nera a 96 pozzetti a fondo chiaro e incubate con analoghi degli acidi grassi (FA) coniugati con BODIPY per consentire l'assorbimento intracellulare. Dopo l'incubazione, la fluorescenza extracellulare viene spenta con Trypan Blue e il segnale intracellulare viene misurato utilizzando un lettore di micropiastre a fluorescenza a lettura inferiore. La colorazione nucleare di Hoechst viene applicata dopo la misurazione della fluorescenza per quantificare il numero di cellule per la normalizzazione. Il trattamento farmacologico o le perturbazioni genetiche possono essere applicati prima dell'incubazione di BODIPY-FA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Quantificazione dell'assorbimento di BODIPY-C12 in cellule endoteliali primarie e immortalizzate. (A) Aumento dipendente dal tempo e dalla concentrazione dell'assorbimento di BODIPY-C12 negli HUVEC dopo incubazioni di 1 minuto, 5 minuti e 10 minuti a 0,5 μM, 1 μM e 2 μM di BODIPY-C12 complessato rispettivamente a 0,25 μM, 0,5 μM e 1 μM di BSA privo di FA. (B) Le cellule EA.hy926 hanno mostrato un assorbimento simile di BODIPY-C12 dipendente dal tempo e dalla dose in condizioni identiche. L'intensità media della fluorescenza è stata normalizzata ai nuclei colorati con Hoechst (numero di cellule) e ai controlli senza BODIPY. I dati sono mostrati come media ± SD. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando l'ANOVA a due vie per valutare gli effetti del tempo, della concentrazione e della loro interazione, seguita dal test post hoc di Tukey per confronti multipli. Effetti principali significativi sono stati osservati per il tempo (p < 0,0001), la concentrazione (p < 0,0001) e la loro interazione (p = 0,0443). I confronti a coppie statisticamente significativi identificati dal test di Tukey sono indicati sul grafico a barre come segue: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 e ****p < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Convalida del test utilizzando controlli positivi e negativi in EA.hy926. (A) Il trattamento con lattato di 1 ora (0 mM, 5 mM, 20 mM) ha aumentato l'assorbimento di BODIPY-C12 in modo dose-dipendente. (B) Il trattamento con 3-HIB di 1 ora (0 mM, 5 mM, 20 mM) ha aumentato in modo simile l'assorbimento di FA. (C) Il trattamento con niclosamide di 30 minuti (1 μM) ha soppresso significativamente l'assorbimento di BODIPY-C12 rispetto al controllo del veicolo (DMSO). L'intensità media della fluorescenza è stata normalizzata ai nuclei colorati con Hoechst (numero di cellule) e ai controlli senza BODIPY. I dati sono mostrati come media ± SD. 2 μM BODIPY-C12 (complessato a 1 μM di BSA priva di acidi grassi) sono stati incubati per 5 minuti per tutti gli esperimenti. Le statistiche per (A) e (B) sono state determinate utilizzando l'ANOVA unidirezionale con il test di Dunnett per confronti multipli e per C utilizzando il test T a due code non accoppiato di Student. p < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Convalida del saggio con BODIPY-C16 in HUVEC. (A) Il trattamento con lattato (0 mM, 10 mM, 20 mM per 1 ora) ha aumentato l'assorbimento di BODIPY-C16 in modo dose-dipendente. (B) Il trattamento con niclosamide (1 μM per 1 ora) ha ridotto significativamente il segnale BODIPY-C16 rispetto al controllo trattato con veicolo. L'intensità media della fluorescenza è stata normalizzata ai nuclei colorati con Hoechst (numero di cellule) e ai controlli senza BODIPY. I dati sono mostrati come media ± SD. 2 μM di BODIPY-C16 (complessato a 1 μM di BSA priva di acidi grassi) sono stati incubati per 5 minuti per tutti gli esperimenti. Le statistiche per (A) sono state determinate utilizzando l'ANOVA a una via con il test di Dunnett per confronti multipli e per B utilizzando il test T a due code non accoppiato di Student. *p < 0,05, ***p < 0,001 e ****p < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Questo test offre un metodo rapido, quantitativo ed economico per misurare l'assorbimento di FA nelle EC utilizzando un formato basato su piastra a 96 pozzetti e analoghi fluorescenti di FA a catena lunga. Incorporando controlli positivi e negativi e convalidando tra EC primarie (HUVEC) e immortalizzate (EA.hy926), questo protocollo dimostra robustezza, riproducibilità e ampia applicabilità.

Le analisi basate sulla fluorescenza sono state determinanti per scoprire i regolatori paracrini del trasporto lipidico endoteliale, come menzionato in precedenza 4,5,7. Questi esempi evidenziano come un sistema standardizzato possa continuare a chiarire in modo affidabile la regolazione del trasporto lipidico guidata dai metaboliti in un contesto controllato in vitro. Il protocollo qui descritto stabilisce i parametri chiave per misure affidabili dell'assorbimento di FA, incluso l'uso di BODIPY-C12 e BODIPY-C16 a concentrazioni multiple (0,5-2 μM) e tempi di incubazione (1 min, 5 min e 10 min). Ha anche rilevato efficacemente un aumento dell'assorbimento in risposta al 3-HIB e al lattato e una riduzione dell'assorbimento dopo il trattamento con niclosamide, confermando sia la sua sensibilità che la gamma dinamica. Sebbene ottimizzato per le EC, questo test può essere facilmente adattato ad altri tipi di cellule come adipociti, miotubi o epatociti con aggiustamenti ai rapporti BODIPY: BSA e alle condizioni di trattamento. Può anche essere modificato per l'imaging di cellule vive utilizzando piastre compatibili o adattato in un formato pulse-chase per valutare la ritenzione, il metabolismo o l'efflusso intracellulare di FA.

Rispetto ad altri approcci, questo metodo offre vantaggi distinti: è scalabile, quantitativo e adattabile a varie lunghezze di catena FA. Inoltre, è conveniente, richiede solo una manciata di passaggi e strumenti non più complessi di un comune lettore di micropiastre, consentendo ai nuovi utenti, compresi gli studenti, di padroneggiare rapidamente questo protocollo. Infine, a differenza dei metodi basati sulla microscopia qualitativa o delle colorazioni endpoint come Oil Red O, che riflettono il contenuto lipidico cumulativo, questo protocollo acquisisce l'assorbimento di FA in tempo reale senza richiedere fissazione o lisi.

Tuttavia, è necessario notare diverse limitazioni. L'uso di un sistema di coltura statica 2D non ricapitola completamente la complessità fisiologica dell'ambiente vascolare. Fattori chiave come lo stress da taglio o la lipolisi mediata da LPL, così come le interazioni endoteliale-parenchimale, sono assenti da questo modello semplificato. I sistemi avanzati, come le co-colture 3D basate su microfluidici o organoidi, imitano meglio l'architettura e la segnalazione in vivo, sebbene richiedano maggiori competenze tecniche e infrastrutture16,17. Ad esempio, i bioreattori microfluidici forniscono un ambiente in cui le EC possono imitare la formazione di microvascolarizzazione e interagire con altri tipi di tessuto, consentendo ai ricercatori di modellare la dinamica paracrina in un ambiente più fisiologico18. Inoltre, lavori recenti hanno dimostrato che è possibile sviluppare sistemi specializzati per eseguire l'imaging fluorescente dal vivo in colture 3D di idrogel19. Tali progressi forniscono la certezza che questo test potrebbe un giorno essere adattato a sistemi di coltura cellulare più fisiologicamente rappresentativi, ma sarebbe necessario eseguire un'ottimizzazione.

In sintesi, questo test rappresenta una piattaforma flessibile, accessibile e riproducibile per studiare l'assorbimento cellulare di FA in diverse condizioni. Sebbene sia più adatto per studi meccanicistici in vitro , le increzioni ottenute da questo sistema possono informare il lavoro futuro utilizzando modelli fisiologicamente più rilevanti di trasporto dei lipidi endoteliali.

Dichiarazioni

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Gli autori hanno dichiarato che non esiste alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Tanisha Choudhury è stata finanziata da una borsa di ricerca universitaria estiva dell'Ufficio per la ricerca universitaria presso l'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill. Boa Kim è stato supportato da NHLBI (R56HL162660) e AHA (24CDA1264317). Ayon Ibrahim è stato sostenuto dal Fondo di ricerca della facoltà dell'Union College.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
3-Idrossiisobutirato (3-HIB)Cayman Chemicals26105Controllo positivo, concentrazione finale di 5 o 20 mM
Micropiastra di polistirene nera a 96 pozzi, fondo trasparenteSigma-AldrichCLS3603-48EAPer le celle di placcatura da analizzare
BODIPY FL C12 (Bodipy-FA)Thermo Fisher ScientificD3822Acido grasso a catena lunga fluorescente verde
BODIPY FL C16 (Bodipy-FA)Thermo Fisher ScientificD3821Acido grasso a catena molto lunga fluorescente verde
Soluzione di albumina sierotica bovinaSigma-AldrichA9205-50MLUtilizzato per preparare il complesso Bodipy:BSA
Dimetilsolossido (DMSO)Sigma-AldrichD2650Solvente per azioni farmaceutiche
Serbatoi di pipettolamento usa e gettaVWR89094-680Contiene le varie soluzioni da pipettare sulle celle
Dulbecco' s Modified Eagle' s MediumScienze della Vita di Corning10-013-CVSupporti per celle EA.hy926
Celle EA.hy926ATCCCRL-2922 Linea ibrida di cellule endoteliali immortalate
EGM-2 Endotelial Cell Growth Medium-2 BulletKitLonzaCC-3162Media per HUVEC
Siero fetale bovino (FBS) e nbsp;VWR97068-085Integrazione al 10% in EGM-2 e DMEM
Lettore di micropiastre a fluorescenzaVariN/AQualsiasi lettore di microplacche in grado di misurare la fluorescenza
Soluzione gelatinicaSigma-AldrichG1393-100mlUsata per rivestire le piastre a una concentrazione di lavoro dello 0,1%
Soluzione Hoechst 33342Scienze della Vita62249Colorazione nucleare per la normalizzazione cellulare (4 & mu; M)
Cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC)LonzaC2519ACellule endoteliali primarie umane
Pipetta multicanaleVWR76627-768Per pipettare in una piastra a 96 pozzi
Niclosamide Millipore SigmaN3510-50GControllo negativo, 1 & mu; M  Concentrazione finale
PBS, con calcio e magnesioFisher Scientific21031CVUsata per la preparazione dei trattamenti e come tampone di lavaggio (con BSA)
PBS, senza calcio e magnesioGenesee Scientific25-508Per la diluizione della gelatina, la colorazione Hoechst e i lavaggi generali
Penicillina/StreptomicinaThermo Fisher Scientific15140122Integratore dell'1% in EGM-2 e DMEM
L-lattato di sodioSigma-AldrichL7022-5GControllo positivo, concentrazione finale di 5 o 20 mM
Soluzione Trypan BlueSigma-AldrichT8154-20MLUsata allo 0,08% per smorzare la fluorescenza extracellulare
Sistemi di filtri a vuoto, membrana PES da 500 ml, 0,45 e micro; mGenClone25-227Per sterilizzare la soluzione di gelatina

Riferimenti

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  1. Schwenk, R. W., Holloway, G. P., Luiken, J. J. F. P., Bonen, A., Glatz, J. F. C. Fatty acid transport across the cell membrane: regulation by fatty acid transporters. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 82 (4-6), 149-154 (2010).
  2. He, Q., Chen, Y., Wang, Z., He, H., Yu, P. Cellular uptake, metabolism and sensing of long-chain fatty acids. Front Biosci (Landmark Ed). 28 (1), 10(2023).
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