Un'analisi R potente e facile da usare di set di dati su larga scala

Con la maggiore disponibilità di grandi set di dati in campo scientifico, è importante sviluppare strumenti di facile utilizzo per consentire ai ricercatori di analizzare rapidamente questi grandi set di dati con precisione e facilità. Un tipo di set di dati comuni di grandi dimensioni deriva dall'uso del gene della luciferasi come reporter, che ha permesso un esame facile, continuo e non invasivo dell'espressione genica in cellule e organismi vivi. L'automazione nella registrazione della luminescenza ha trasformato la misurazione della luminescenza della luciferasi e ha portato a un'espansione della raccolta dei dati, in particolare nel campo dell'orologio circadiano ^1,2. Utilizzando micropiastre a 96 pozzetti e un lettore automatico di piastre con stacker, migliaia di campioni che esprimono il gene della luciferasi possono essere analizzati individualmente in serie temporali, a volte a intervalli di un'ora per giorni, in un unico esperimento. Tali esperimenti ad alto rendimento hanno portato alla produzione di grandi set di dati che gli esperimenti tradizionali di espressione genica che utilizzano la raccolta manuale di campioni, seguita dall'elaborazione dell'RNA, non potrebbero raggiungere. L'analisi tempestiva di set di dati di tali dimensioni è importante, ma può essere impegnativa.

Sebbene esista una pletora di strumenti per analizzare i dati per la ritmicità, molti degli strumenti analizzano i saggi basati sul comportamento animale piuttosto che l'espressione del reporter di luminescenza 3,4,5,6,7 (Tabella supplementare S1). Alcuni strumenti richiedono ai ricercatori di avere precedenti competenze di programmazione informatica, come le competenze Python o l'accesso a MATLAB. Altri strumenti richiedono l'acquisto di software, che può essere costoso. Alcune soluzioni praticabili gratuite sono disponibili online. Uno di questi strumenti è BioDare2⁸, che offre una varietà di metodi diversi per analizzare i dati sulla ritmicità. BioDare2 è uno strumento online di facile utilizzo e richiede competenze computazionali minime. Gli utenti devono caricare i dati di input online e scaricare i dati di output dall'interfaccia online per un'ulteriore elaborazione.

In questo articolo presentiamo script R di facile utilizzo con più funzionalità per l'analisi semplice di set di dati su larga scala. Per eseguire gli script utilizziamo il software gratuito e open source RStudio⁹, un'interfaccia per R e Python. RStudio può essere utilizzato su vari sistemi informatici, inclusi Windows, Mac e Linux. In questo report vengono fornite istruzioni dettagliate per guidare gli utenti su come utilizzare gli script R, in particolare nelle sezioni 1 e 2 del protocollo. Questo metodo richiede un input minimo da parte dell'utente. Un principiante che non ha conoscenze preliminari di R e che non ha esperienza di programmazione sarà in grado di utilizzare il metodo per analizzare grandi set di dati da saggi di luciferasi o altri tipi di set di dati con dati di serie temporali. Tutti i dati di input e output vengono archiviati su un computer locale e, pertanto, un'analisi può essere eseguita ovunque senza la restrizione dell'accesso a Internet, una volta che tutti i pacchetti R pertinenti sono stati scaricati per la prima volta. I dati di output vengono ordinati in cartelle ben organizzate con risultati pronti per essere elaborati per le pubblicazioni. Anche le analisi statistiche sono incluse come parte dell'output per fornire una rapida valutazione delle differenze tra i campioni. Pertanto, il metodo R potrebbe fornire una soluzione semplice e potente per i ricercatori nell'analisi di set di dati di grandi dimensioni.

1. Analisi dell'orologio circadiano basata sulla luciferasi

1. Configurazione sperimentale per il dosaggio della luciferasi
   NOTA: Il dosaggio della luciferasi è un metodo comune utilizzato per misurare l'attività dell'orologio circadiano in tempo reale. La luminescenza, emessa dal reporter della luciferasi trasportato da organismi e/o cellule transgeniche vive, può essere registrata automaticamente, portando alla produzione di set di dati di serie temporali su larga scala. Il nostro laboratorio utilizza principalmente piantine di Arabidopsis thaliana che esprimono il gene della luciferasi come reporter. La Figura 1 e la Figura 2 mostrano un diagramma di flusso del tipico setup sperimentale per il saggio della luciferasi con piantine in un formato a 96 pozzetti nel nostro laboratorio, modificato sulla base di una precedente descrizione².
   1. Sterilizzare i semi con il vapore di candeggina generato aggiungendo 3 mL di HCl al 36% (p/p) a 100 mL di candeggina domestica in un becher per 3 ore. Mettere il becher in una campana di vetro con un coperchio sigillato, posto in una cappa chimica. Dopo la sterilizzazione, impiattare i semi su piastre da 1/2MS contenenti lo 0,5% di saccarosio e lo 0,8% di agar (pH 5,7), utilizzando una pipetta sterile in vetro Pasteur, in una camera a flusso laminare. Raccogli i rifiuti chimici in un barattolo con coperchio e smaltiscili collaborando con il servizio di salute ambientale istituzionale.
   2. Mettere le piastre a 4 °C per 2 giorni prima di spostarle in una camera di coltura tissutale con 12 ore di luce e 12 ore di ciclo di luce scura (LD).
   3. Lascia crescere le piantine per 4 giorni in LD.
   4. Trasferire le piantine in una piastra a 96 pozzetti; ogni pozzetto contiene 180 μL di terreno di prova (1/2 MS, 0,5% saccarosio, 0,4% agar, 0,25 mM luciferina). Posizionare le piastre per 1 giorno in LD seguito da 1 giorno in 24 ore di luce costante (LL).
   5. Aggiungere trattamenti o simulare la soluzione ai pozzetti e registrare la luminescenza a intervalli di 1 ora per 5-7 giorni in LL. Impostare la lente del filtro di emissione a 3.600 per il guadagno e il tempo dell'intervallo di misurazione a 1 s.
      NOTA: L'ora di inizio della registrazione può essere in qualsiasi momento. Tuttavia, poiché lo script R accetta solo numeri interi (numeri interi), gli intervalli di registrazione devono essere un numero intero. Ad esempio, è consentito un intervallo di 1 ora, ma un intervallo di 15 minuti non è consentito per lo script R.
   6. Al termine della registrazione, scatta una foto del piatto per registrare la crescita della piantina.
   7. Salvataggio dei dati grezzi come file CSV per l'analisi R, utilizzando la funzione Salva con nome con il software di analisi dei dati per il lettore di piastre.
2. Spiegazione graduale dell'analisi R di dati circadiani basati sulla luciferasi
   NOTA: questa analisi R utilizza lo script RFile supplementare 1(LUC_2025.R), sviluppato per l'analisi dei dati circadiani, e il file di inputFile supplementare 2(NO7.csv). Lo script R insieme al file di input è disponibile pubblicamente tramite la piattaforma di repository online Github (https://github.com/elvenfire29/Circadian-Luciferase-Analysis).
   1. Scarica il software RStudio compatibile con il sistema informatico ^9,10.
   2. Scaricare i pacchetti algoritmici RStudio richiesti dal file supplementare 1 (LUC_2025.R): MetaCycle¹¹: algoritmo ARSER¹² del pacchetto MetaCycle, ggplot2¹³, dplyr¹⁴, magrittr¹⁵, stringr¹⁶, filesstrings¹⁷, circular¹⁸, AICcmodavg¹⁹ e broom²⁰.
      NOTA: Vedere anche la parte superiore dello script R per l'elenco dei pacchetti.
   3. Modificare l'input dell'utente I (in base a un set di dati specifico su un computer locale, inclusa la directory di lavoro, il nome del file di input, le etichette per i trattamenti e l'ora relativa di inizio del test.
      NOTA: i passaggi 1.2.1 e 1.2.2 devono essere completati una sola volta; dopodiché la console dell'interfaccia RStudio è pronta a ricevere l'input dell'utente, con modifiche per ogni nuova analisi. Ci sono due parti nella sezione Input dell'utente (Figura supplementare S1).
      1. Selezionare la directory di lavoro. Indicare la posizione in cui risiede il file di input. La stessa cartella sarà la posizione per i file di output.
      2. Selezionare il file di input, un file CSV formattato correttamente per lo script R (Figura 2B). In particolare, la riga superiore contiene le serie temporali e la prima colonna contiene le singole posizioni dei campioni su una piastra a 96 pozzetti.
         NOTA: Un esempio di tale file CSV di input è disponibile nel file supplementare 2 (NO7.csv).
      3. Nominare i campioni e/o i trattamenti. Poiché questa analisi viene utilizzata per i dati ottenuti da impostazioni a 96 pozzetti con un andamento temporale, progettare gli esperimenti come 8 repliche per trattamento per un totale di un massimo di 12 trattamenti per piastra, o come 12 repliche per trattamento per un totale di un massimo di 8 trattamenti per piastra. Assicurati di inserire il numero corretto di campioni, 8 o 12, perché il numero di campioni conta; Se il conteggio dei campioni non è 8 o 12, il codice non verrà eseguito. Tuttavia, se ci sono file di pozzetti vuoti, basta elencarli come tali nello spazio per i nomi dei trattamenti, ad esempio, nominando come vuoto 1, vuoto 2...
         NOTA: Per i nomi dei campioni, si dovrebbe evitare di utilizzare barre rovesciate o simboli simili in quanto potrebbero causare problemi con i nomi dei file. Inoltre, si dovrebbe anche evitare di usare "NA" come etichetta quando si sceglie di utilizzare ANOVA in User Input II. Tutti i trattamenti con lo stesso identico nome saranno combinati in un unico grande gruppo di trattamento.
      4. Indicare l'ora relativa di inizio del saggio. Per un dato giorno di 24 ore, l'alba soggettiva è quando la luce della camera viene accesa durante un normale ciclo luce/buio. Ad esempio, se la luce è accesa alle 7 del mattino, considera questa volta il tempo circadiano 0. Se un test della luciferasi inizia alle 9 del mattino, l'orario del test è al tempo circadiano 2; input 2 come ora di inizio relativa.
         NOTA: L'ora di inizio relativa deve essere un numero intero e non può essere negativa. Ciò influenzerà la lettura di fase dei campioni.
   4. Modifica le opzioni di User Input II in base alle esigenze specifiche.
      NOTA: Le istruzioni seguenti forniscono una spiegazione più dettagliata delle sezioni Input dell'utente e una guida passo passo per apportare le modifiche.
      1. Includi grafici: curve di luminescenza, grafici per il periodo, la fase e l'ampiezza per genotipo e trattamento.
      2. Usa il test ANOVA con Tukey HSD per confrontare i trattamenti in base al periodo, alla fase e all'ampiezza. Scegliere un controllo per l'uscita del test ANOVA; specificare il controllo per il test ANOVA o lasciare vuota l'opzione per utilizzare ciascun trattamento come controllo nel confronto a coppie. In alternativa, scegliere se numerare i file di output ANOVA per una consultazione e un'organizzazione più rapide.
      3. Usa un test t per confrontare i trattamenti in base al loro periodo, fase e ampiezza. Scegli se il test t deve essere un confronto a coppie; Se è selezionato un test T a coppie, selezionare se i dati sono accoppiati. Scegli un controllo per il t-test; Specificare il controllo per il test t o lasciare vuota l'opzione per utilizzare ciascun trattamento come controllo. Scegli se numerare i file di output del t-test per una consultazione e un'organizzazione più rapide.
         NOTA: Questo dovrebbe essere utilizzato solo per confrontare due trattamenti contemporaneamente, ad esempio due linee dello stesso genotipo con l'aggiunta di SA o Mock. I valori p mostrati non vengono regolati per tenere conto di più confronti con la stessa linea.
      4. Scegli se arrotondare i punti temporali. Se i punti temporali sono sfasati solo di un minuto o due, arrotonda all'ora più vicina e utilizza questa analisi.
         NOTA: Questo codice calcola il periodo, la fase e l'ampiezza utilizzando il metodo ARS¹². L'esecuzione di questo metodo richiede una serie temporale coerente in ore.
      5. A seconda di come il lettore di piastre registra i pozzetti, modificare il modo in cui viene letto l'input. Scegli l'elenco dei dati standard dei pozzetti per A1, A2, A3... o quello per pozzi elencati da A1, B1, C1...
   5. Esegui l'analisi semplicemente facendo clic sul pulsante Sorgente nell'angolo in alto a destra della console.
      NOTA: il completamento dell'analisi richiede meno di 1 minuto. L'output dell'analisi R verrà visualizzato automaticamente nella stessa cartella di file del set di dati di input.
   6. Visualizza output: la cartella di output contiene diversi documenti e sottocartelle per fornire un'analisi completa, comprese le informazioni statistiche del periodo medio, della fase e dell'ampiezza per le repliche di ciascun genotipo e/o trattamento.
      NOTA: Per il file di input File supplementare 2 (NO7.csv), un elenco dei documenti di output generati dallo script File supplementare 1 (LUC_2025.R) nella sezione del protocollo 1 è descritto nella Tabella 1 e può essere comodamente visualizzato con la struttura ad albero nella Figura supplementare S2.

2. Saggio ROS basato su luminol

1. Configurazione sperimentale per il saggio ROS
   1. Taglia dischi fogliari di 4 mm di diametro dalla quarta alla settima foglia di piante di 25 giorni con un perforatore per biopsia.
   2. Far galleggiare i dischi fogliari con il lato peloso rivolto verso l'alto sopra 100 μl di acqua sterile in una piastra a 96 pozzetti.
   3. Copri la piastra con carta stagnola pulita e mettila in una camera di crescita LD per una notte.
   4. Sostituire l'acqua con 100 μL di soluzione di luminol (300 μM in tampone MOPS da 10 mM con pH 7,4 e 1 μM flg22 o un altro elicitore). Usa la soluzione fittizia al posto di flg22 come controllo.
   5. Iniziare immediatamente a registrare le letture della luminescenza ogni minuto per 40-60 minuti.
2. Spiegazione graduale dell'analisi R dei dati ROS
   NOTA: questa analisi R utilizza Rstudio, lo script R,  il file supplementare 3 (ROS_2025.R) e i file di input file supplementari 4 (ROS_flg22.csv) o file supplementari 5 (ROS_elf26.csv). Lo script R insieme al file di input Supplemental File 4 (ROS_flg22.csv) è disponibile pubblicamente tramite la piattaforma di repository online Github (https://github.com/elvenfire29/ROS-Luminol-Analysis)
   1. Scarica i pacchetti RStudio: gplot2¹³, dplyr¹⁴, magrittr¹⁵, stringr¹⁶ e filesstrings¹⁷.
      NOTA: i passaggi 2.2.1 devono essere completati una sola volta. Per aiutare gli utenti ad adattare ogni analisi a un insieme specifico di dati sul computer, è stata creata una sezione chiamata "Input dell'utente" per consentire agli utenti di indicare parametri specifici per i loro esperimenti (Figura supplementare S3).
   2. Modificare l'input dell'utente I in base a un set di dati specifico su un computer locale, inclusa la directory di lavoro, il nome del file di input, le etichette per i trattamenti e l'ora di inizio relativa del test.
      1. Selezionare la directory di lavoro. Indicare la posizione in cui risiede il file di input. La stessa cartella sarà la posizione per i file di output.
      2. Selezionare il file di input, un file CSV formattato correttamente per lo script R (Figura 2B). In particolare, la riga superiore contiene le serie temporali e la prima colonna contiene le singole posizioni dei campioni su una piastra a 96 pozzetti.
         NOTA: Un esempio di tale file CSV di input può essere trovato nel materiale supplementare, File supplementare 4 (ROS_flg22.csv) o File supplementare 5 (ROS_elf26.csv).
      3. Nominare i campioni e/o i trattamenti. Poiché questa analisi viene utilizzata per i dati ottenuti da impostazioni a 96 pozzetti con un andamento temporale, progettare gli esperimenti come 8 repliche per trattamento per un totale di un massimo di 12 trattamenti per piastra, o come 12 repliche per trattamento per un totale di un massimo di 8 trattamenti per piastra. Se ci sono file di pozzetti vuoti, elencali come tali nello spazio per i nomi dei trattamenti, ad esempio, nominandoli come vuoto 1, vuoto 2...
         NOTA: È importante inserire il numero corretto di campioni, 8 o 12, perché il numero di campioni conta. Se il conteggio dei campioni non è 8 o 12, il codice non verrà eseguito. Per i nomi degli esempi, evitare di utilizzare barre rovesciate o simboli simili in quanto potrebbero causare problemi con i nomi dei file. Evitare inoltre di utilizzare "NA" come etichetta quando si sceglie di utilizzare ANOVA in User Input II. A differenza dello script File supplementare 1 (LUC_2025.R), i trattamenti con lo stesso nome non vengono combinati in un singolo gruppo in questo script File supplementare 3 (ROS_2025.R).
   3. Modifica le opzioni di User Input II in base alle esigenze specifiche dell'utente.
      NOTA: L'esempio di input dell'utente può essere visto nella Figura S3 supplementare.
      1. Utilizzare il test ANOVA con Tukey HSD per confrontare le somme di luminescenza del trattamento.
      2. Utilizzare un t-test a due facce per confrontare i dati di due soli trattamenti contemporaneamente.
         NOTA: I valori p mostrati non sono regolati per tenere conto di confronti multipli con la stessa linea.
      3. Rappresentare graficamente le curve di fluorescenza e un grafico a barre che confronta la somma totale della fluorescenza. Aggiungi la deviazione standard o l'errore standard della media ai grafici.
      4. A seconda di come il lettore di piastre registra i pozzetti, modificare il modo in cui viene letto l'input. O utilizzare l'elenco dei dati standard dei pozzi per A1, A2, A3... o quello per pozzi elencati da A1, B1, C1...
3. Esegui l'analisi semplicemente facendo clic sul pulsante Sorgente nell'angolo in alto a destra della console.
   NOTA: il completamento dell'analisi richiede meno di 1 minuto. L'output dell'analisi R verrà visualizzato automaticamente nella stessa cartella di file del set di dati di input.
4. Visualizza output: la cartella di output contiene diversi documenti e sottocartelle per fornire un'analisi completa.
   NOTA: Per il file di input Supplemental File 4 (ROS_flg22.csv), nella Figura supplementare S4 viene mostrata una struttura ad albero dei documenti di output generati dallo script Supplemental File 3 (ROS_2025.R) descritto nella sezione 2 del protocollo.

Caso di studio 1. Il test di luminescenza per l'attività dell'orologio circadiano con piantine di Arabidopsis

In precedenza abbiamo dimostrato che il gene GLYCINE-RICH RNA-BINDING PROTEIN 7 (GRP7) è controllato dalla proteina dell'orologio principale CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1 (CCA1) e che l'espressione circadiana di GRP7 è importante per il suo ruolo nella difesa delle piante, utilizzando piante transgeniche Col-0 che esprimono la luciferasi reporter sotto il controllo del promotore wildtype di GRP7 (pGRP7wt:LUC)21. Abbiamo analizzato le attività dell'orologio circadiano di queste piante transgeniche insieme all'impianto di controllo CCA1:LUC/Col-0, utilizzando lo script R denominato LUC_2025.R (Supplemental File 1 nella sezione 1 del protocollo).

Il file di input denominato NO7.csv (Supplemental File 2) contiene letture di luminescenza per sette linee pGRP7wt:LUC indipendenti e il controllo CCA1:LUC/Col-0 ( Supplemental File 2 (NO7.csv)). Dopo aver eseguito lo script, la sottocartella di output denominata output NO7 verrà generata nella stessa cartella del file di input NO7.csv (File supplementare 2 (NO7.csv)). I file della cartella di output NO7 sono descritti nella Tabella 1 e possono essere comodamente visualizzati con la struttura ad albero nella Figura S2 supplementare. I valori nella cartella di output NO7 sono stati ulteriormente elaborati per creare la Figura 3 e la Figura 4. La Figura 3 mostra che il reporter CCA1:LUC ha mostrato un'ampiezza di 3.000 RLU, un periodo di 23,5 ore e una fase di 3,5 ore. Questi parametri dell'orologio sono in gran parte coerenti con i rapporti precedenti22,23. Un diverso modello di espressione è stato osservato per le linee pGRP7wt:Luc. Mentre tutte le linee pGRP7wt:LUC sembravano essere simili nel periodo e nella fase, c'erano differenze nei valori di ampiezza di queste linee, probabilmente a causa dell'effetto posizionale dei transgeni nei cromosomi. Queste osservazioni sono state ulteriormente confermate quando i parametri di periodo, ampiezza e fase sono stati calcolati tramite lo script R (Figura 4). Per convalidare questa analisi, lo stesso set di dati è stato rianalizzato utilizzando BioDare2, una piattaforma online gratuita per l'analisi dei dati circadiani8. I risultati dell'analisi R sono stati paragonabili a quelli ottenuti dall'algoritmo BioDare2 FFT-NLLS (NLLS) 8,24 (Figura 4).

Caso di studio 2. Il test di luminescenza per l'attività dell'orologio circadiano con cellule di mammifero
Lo script R LUC_2025.R (Supplemental File 1) è stato ulteriormente utilizzato per analizzare l'attività dell'orologio circadiano mostrata dalle cellule di mammifero25. La linea cellulare U2 OS che esprime un reporter dell'orologio circadiano è una linea cellulare modello comunemente usata per misurare le attività dell'orologio circadiano dei mammiferi26,27. Abbiamo rianalizzato i dati delle serie temporali generati con cellule OS U2 che esprimono il reporter Per2d:Luc coltivate in una piastra a 96 pozzetti. Le cellule sono state trattate con molecole di siRNA che hanno come bersaglio geni specifici. La Figura 5 mostra che le cellule di controllo negative, che non sono state trattate con siRNA, hanno mostrato un periodo di 23,3 ore, una fase di 2,8 ore e un'ampiezza di 184,8 RLU. Come previsto, il siRNA che ha come bersaglio il gene CRY2 ha smorzato significativamente l'ampiezza e ha influenzato il periodo e la fase del reporter. I geni PSMD4 e PSMD7 codificano per proteine che fanno parte del componente del coperchio del proteasoma 26S per la degradazione delle proteine. Coerentemente con il precedente rapporto25, l'analisi R mostra che l'abbattimento di PSMD4 o PSMD7 da parte dei rispettivi siRNA non influisce sui parametri dell'orologio. Pertanto, questo script R è facilmente applicabile a diversi sistemi sperimentali per studi sull'orologio circadiano.

Caso di studio 3. Il test ROS per una risposta difensiva
Oltre ai grandi set di dati provenienti da saggi di orologio circadiano luminescente, lo script R può essere adattato per analizzare altri tipi di dati. Qui presentiamo una di queste applicazioni per quantificare le specie reattive dell'ossigeno (ROS). È noto che le piante hanno sviluppato varie strategie per combattere l'invasione di agenti patogeni. Una delle strategie consiste nel riconoscere le molecole non autonome da un agente patogeno e successivamente attivare le risposte immunitarie innate. Una di queste risposte immunitarie precoci è un'esplosione di ROS, che si verifica in pochi minuti quando un ospite incontra una molecola non self. Un tipico test ROS è stato condotto con una piastra a 96 pozzetti, contenente 12 dischi fogliari per genotipo per trattamento (sezione 2 del protocollo). Qui, due molecole di elicitor comuni, flg22, un peptide di 22 aminoacidi derivato dalla regione conservata delle proteine flagelliniche batteriche28, e elf26, un peptide di 26 aminoacidi dal fattore di allungamento Tuproteina 29, sono state utilizzate per indurre lo scoppio dei ROS. Lo script, Supplemental File 3 (ROS_2025.R), è stato sviluppato per l'analisi dei dati ROS. Due file CVS dei saggi ROS, il File Supplementare 4 (ROS_flg22.csv) e il File Supplementare 5 (ROS_elf26.csv), che sono stati convertiti nel formato dell'analisi R, possono essere scaricati dalla sezione Materiale supplementare. Dopo l'analisi R, le cartelle di output devono essere generate nella stessa cartella di ciascun file di input nel proprio computer, contenenti le curve di burst ROS e i valori ROS totali durante il tempo di analisi, insieme alle analisi statistiche (Figura S4 supplementare). I dati sono stati ulteriormente elaborati per creare la Figura 6. I risultati mostrati qui sono simili a quelli pubblicati, che sono stati elaborati manualmente30.

Figura 1: Diagramma di flusso del dosaggio della luciferasi per l'analisi R. Le piantine che esprimevano un reporter di luciferasi guidato da un promotore dell'orologio sono state sterilizzate e coltivate su terreni 1/2 MS in LD per 4 giorni. Le piantine sono state trasferite in piastre a 96 pozzetti contenenti 180 μL di terreno 1/2 MS contenente D-luciferina. Ogni pozzetto conteneva una piantina. Dopo 1 giorno in LD seguito da 1 giorno in LL, la luminescenza è stata registrata con un lettore di piastre. Le piantine su una piastra sono state tipicamente registrate per la luminescenza in LL a intervalli di 1 ora per 5-7 giorni. Dopo la registrazione, le piastre sono state fotografate per valutare la crescita delle piantine e i dati grezzi sono stati salvati come file CSV per l'analisi R. Abbreviazioni: LD = 12 h luce/12 h buio; LL = luce costante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Diagramma di flusso dell'acquisizione dei dati di luminescenza e dell'analisi R. (A) Viene delineata una procedura in cinque fasi per l'analisi dell'orologio circadiano utilizzando lo script R. Passaggio 1. Impostare gli esperimenti come 8 o 12 piantine per genotipo e/o per trattamento; Passaggio 2. Registrare la luminescenza in LL a intervalli di 1 ora per 5-7 giorni; Passaggio 3. Ottenere e formattare i dati in un file CSV; Passaggio 4. Analizzare i dati utilizzando R; e Passaggio 5. Visualizzare i dati di output. L'ora di inizio della registrazione può essere in qualsiasi momento. Tuttavia, poiché lo script R accetta solo numeri interi (numeri interi), gli intervalli di registrazione devono essere un numero intero. (B) Screenshot di un file CSV di input formattato correttamente per lo script R. Il file di input originale, NO7.csv, può essere trovato nel file supplementare 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Espressione circadiana di pGRP7wt:LUC in piante transgeniche. Sono mostrate tracce di luminescenza di pGRP7wt:LUC. Le barre sotto l'asse x indicano il giorno soggettivo (barre aperte) e la notte (barre grigie). La traccia di luminescenza di ciascun genotipo è in media di 12 repliche. Le barre di errore non venivano mostrate a causa dell'elevato numero di curve. Abbreviazione: RLU = Unità di luminescenza relativa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Confronto dei dati di output dallo script R e da BioDare2. Lo stesso insieme di dati mostrato nella Figura 3 è stato analizzato dallo script R e da BioDare2 per i parametri dell'orologio circadiano, l'ampiezza, il periodo e la fase. I dati rappresentano la media ± SEM (n=12). Lettere diverse indicano una differenza significativa tra i campioni (P < 0,05; ANOVA a una via con test HSD di Tukey post hoc). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Analisi dell'attività dell'orologio circadiano con cellule di mammifero. I dati delle serie temporali generati con cellule OS U2 che esprimono il reporter Per2dLuc coltivate su una piastra a 96 pozzetti in DD sono stati descritti in precedenza 25. Per trattare le cellule sono state utilizzate molecole di siRNA che hanno come bersaglio CRY2, PSMD4 o PSMD7. (A) Tracce di luminescenza. ( B) Ampiezza, periodo e fase di Per2d:Luc. I dati rappresentano la media ± SEM (n = 3). Lettere diverse nel pannello ( B indicano una differenza significativa tra il controllo negativo e un campione trattato con siRNA (P<0,05; ANOVA a una via con test HSD di Tukey post hoc). Abbreviazione: RLU = unità di luminescenza relativa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Analisi del burst di ROS di R. Le piantine sono state registrate per l'unità di luminescenza relativa immediatamente dopo essere state trattate con 1 μM flg22 (a sinistra) o 1 μM elf26 (a destra). (A) Tracce di luminescenza mediate da 12 piantine per genotipo (n = 12) in un corso temporale post elicitazione. I valori medi per genotipo per trattamento fanno parte dell'output R. (B) Conta media della luminescenza totale per ciascun genotipo con trattamento flg22 o elf26. I dati rappresentano la media ± SEM (n = 12). Lettere diverse indicano una differenza significativa tra i campioni (P < 0,05; ANOVA a una via con test HSD di Tukey post hoc). Abbreviazione: RLU = unità di luminescenza relativa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Un elenco dei documenti di output dell'analisi R. Questo è un elenco dei documenti di output generati dallo script LUC_2025.R (File supplementare 1) e dal file di input NO7.csv (File supplementare 2).

Figura supplementare S1: Schermate per l'ingresso I e l'ingresso II nella sezione 1 del protocollo. L'input dell'utente I deve essere modificato per adattare l'analisi a un set di dati specifico su un computer locale. Le modifiche all'input utente II sono facoltative, a seconda dell'impostazione sperimentale. È importante notare che lo script Supplemental File 1 (LUC_2025.R) prevede che tutti i pozzetti siano presenti nel file e non solo i pozzetti selezionati o utilizzati. Clicca qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare S2: Struttura ad albero per i documenti di output. Questo output è stato generato utilizzando lo script LUC_2025.R (file supplementare 1) e il file di input NO7.csv (file supplementare 2). Lo script LUC_2025.R genera una cartella di output in base al nome del file di input. Per ulteriori dettagli sui file di output, vedere la Tabella 1. Le caselle rappresentano le cartelle di file. Clicca qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare S3: Schermate per l'input utente I e l'input utente II nella sezione 2 del protocollo. Lo script File supplementare 3 (ROS_2025.R) utilizza lo stesso formato di input generale dello script File supplementare 1 (LUC_2025.R). L'input dell'utente I deve essere modificato per adattare l'analisi a un set di dati specifico su un computer locale. Le modifiche all'input utente II sono facoltative, a seconda dell'impostazione sperimentale. È importante notare che lo script Supplemental File 3 (ROS_2025.R) prevede che tutti i pozzetti siano presenti nel file e non solo i pozzetti selezionati o utilizzati. Clicca qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare S4: Struttura ad albero per i documenti di output. Questo output è stato generato utilizzando lo script ROS_2025.R (file supplementare 3) e il file di input ROS_flg22.csv (file supplementare 4). Lo script ROS_2025.R genera una cartella di output in base al nome del file di input. All'interno di quella cartella c'è un file per i conteggi ROS totali e un file per i grafici. Ci sono anche sottocartelle per PRISM e dati grafici, il test ANOVA e i test t. Le caselle rappresentano le cartelle di file. Clicca qui per scaricare questa figura.

Tabella supplementare S1: Un elenco di strumenti bioinformatici disponibili per l'analisi dei dati circadiani. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 1: LUC_2025.R. Questo è lo script R utilizzato per analizzare i dati dell'orologio circadiano. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: NO7.csv. Questo è il file di input contenente un esempio di dati dell'orologio circadiano. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: ROS_2025.R. Questo è lo script R utilizzato per analizzare i dati ROS. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 4: ROS_fig22.csv. Questo è il file di input contenente un esempio di dati ROS. I ROS sono stati indotti dal trattamento con flg22 da 1 μM. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 5: ROS_elf26.csv. Questo è il file di input contenente un esempio di dati ROS. I ROS sono stati indotti dal trattamento con 1 μM elf26. Clicca qui per scaricare questo file.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.