Articolo metodologico

Rilevamento del DNA in loco di parassiti tripanosomatidi e nosema ceranae attraverso lisi alcalina accoppiata al sistema RPA/CRISPR/Cas12a

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DOI:

10.3791/68874

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18 luglio 2025

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1Group of Biochemical and Molecular Parasitology CTS-183, Department of Parasitology, University of Granada, 2Institute of Biotechnology, Faculty of Sciences, University of Granada, 3Apinevada S.L Parque Metropolitano Industrial de Granada

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Sommario

Qui, descriviamo una procedura semplice e rapida per rilevare il DNA da agenti patogeni delle api, come Lotmaria passim e Nosema ceranae, utilizzando una lisi cellulare pronta per l'amplificazione, l'amplificazione della polimerasi ricombinasi e i saggi CRISPR/Cas12a.

Abstract

Il rilevamento precoce in loco di agenti patogeni microscopici è essenziale per la gestione efficace e la salute delle colonie di api. Attualmente, il gold standard per la rilevazione molecolare dei patogeni delle api è la qPCR o RT-qPCR. Qui presentiamo un'alternativa rapida, sensibile ed economica per il rilevamento di agenti patogeni a DNA distribuibili sul campo. Questo metodo combina la lisi cellulare diretta e pronta per l'amplificazione degli addomi delle api operaie con l'amplificazione della polimerasi ricombinasi (RPA), la transscissione mediata da CRISPR/Cas12a delle sonde reporter e il rilevamento tramite saggi a flusso laterale. Abbiamo convalidato con successo questo protocollo in api mellifere infettate da Nosema ceranae e Lotmaria passim. Il protocollo descritto può essere eseguito utilizzando un semplice blocco termico o a temperatura ambiente ed è potenzialmente applicabile a qualsiasi agente patogeno basato sul DNA o al microbiota intestinale dell'ape mellifera. L'intero processo richiede circa 180 minuti e raggiunge una sensibilità paragonabile alla qPCR, rilevando solo 96 copie di parassiti/μL. In conclusione, questo approccio offre uno strumento promettente per una diagnosi affidabile e rapida sul campo delle infezioni delle api mellifere senza la necessità di complesse apparecchiature di laboratorio, rendendolo ideale per la sorveglianza delle colonie in loco.

Introduzione

Le api sono specie chiave implicate nell'impollinazione delle piante e sono essenziali per la riproduzione delle piante, la biodiversità e la sicurezza alimentare1. I loro servizi di impollinazione vanno a beneficio di un'ampia gamma di colture con un alto valore economico, contribuendo con circa 235-577 miliardi di dollari all'anno all'agricoltura globale. Tuttavia, il declino mondiale delle popolazioni di api ha sollevato serie preoccupazioni a causa delle sue potenziali conseguenze per la stabilità ecologica e la produttività delle colture, che hanno comportato una perdita stimata di 4,8-16,3 miliardi di dollari nei paesi poveri fortemente indebitati2. La massa della scomparsa delle api comporta molteplici interazioni tra diversi fattori: applicazione di pesticidi, perdita di habitat, cambiamenti climatici e infezioni da agenti patogeni, tra cui virus, batteri, funghi e protisti.

Tra questi microrganismi, Nosema spp., un fungo microsporidico che disturba il funzionamento dell'intestino, e i parassiti tripanosomatidi - in particolare Lotmaria passim - sono ampiamente distribuiti nelle colonie di api in tutto il mondo3, 4. Recenti scoperte mostrano che le infezioni da L. passim , anche quando asintomatiche, possono sottoregolare i geni immuno-correlati e alterare il metabolismo energetico nelle api, compromettendo potenzialmente la loro resilienza in caso di stress aggiuntivo5. Allo stesso modo, le infezioni da Nosema spp. riducono la longevità delle api, sopprimono la funzione immunitaria e interrompono le dinamiche di foraggiamento della colonia, portando a una riduzione della produzione di miele e a un aumento della mortalità delle colonie. Inoltre, le coinfezioni che coinvolgono sia Nosema spp. che i tripanosomatidi possono avere effetti sinergici, esacerbando lo stress fisiologico e indebolendo le difese dell'ospite. Questi risultati sottolineano l'importanza di monitorare più agenti patogeni contemporaneamente.

Affrontare queste minacce richiede lo sviluppo di strumenti diagnostici rapidi e accurati, che a loro volta dipendono da una comprensione più profonda della biologia, della trasmissione e delle strategie di sopravvivenza di questi patogeni6. L'individuazione di questi agenti patogeni attraverso metodi tradizionali, tra cui la microscopia ottica e l'amplificazione molecolare, rimane affidabile ma deve affrontare alcune limitazioni. Esempi di qPCR, RTqPCR (richiede cicli a temperature diverse) e metodi isotermici, come l'amplificazione mediata da loop (LAMP, funziona a temperatura costante), sono stati sviluppati per parassiti fungini, virali, batterici o protozoari 6,7,8,9,10. Tuttavia, l'implementazione di questi metodi richiede attrezzature specializzate, insieme a personale addestrato e strutture di laboratorio ben attrezzate, il che limita la loro praticità per le applicazioni sul campo e il monitoraggio su larga scala. Per affrontare questi problemi, sono state sviluppate nuove tecniche molecolari - l'amplificazione di bersagli di DNA con l'amplificazione della ricombinasi polimerasi (RPA), insieme al rilevamento basato su CRISPR/Cas12a - un approccio rapido, specifico e sensibile. Il metodo funziona in modo isotermico e produce risultati visivi che lo rendono adatto per la diagnostica in loco o point-of-care, secondo Shao et al.11 e Xiao et al.12.

L'RPA è un metodo di amplificazione del DNA semplice e rapido che funziona a una temperatura costante, tipicamente compresa tra 37 °C e 42 °C. Si basa su enzimi ricombinasi, proteine leganti il DNA a filamento singolo e una polimerasi che sposta il filamento per amplificare il DNA senza la necessità di cicli termici. L'RPA è particolarmente adatto per i test in loco e la diagnostica sul campo grazie alla sua velocità, ai requisiti minimi di attrezzatura e alla compatibilità con i campioni grezzi 11,12,13. Per migliorare la specificità, il prodotto RPA può essere rilevato utilizzando l'endonucleasi Cas12a, che funziona anche all'interno dello stesso intervallo di temperatura. Cas12a si lega a un RNA guida CRISPR (gRNA), un RNA corto che guida Cas12a verso la sequenza bersaglio amplificata e si lega alla sequenza complementare nel DNA. Dopo il legame, Cas12a si attiva e mostra un'attività collaterale (trans) di scissione, in particolare contro il DNA a filamento singolo (ssDNA). Ciò consente l'uso di molecole reporter di ssDNA marcate con fluorofori o biotina, in grado di generare segnali visivi o di fluorescenza, comprese le letture delle strisce di flusso laterale. Insieme, RPA e CRISPR/Cas12a formano una potente piattaforma diagnostica molecolare rapida, sensibile e adatta per l'uso sul campo o in contesti con risorse limitate12.

Per migliorare ulteriormente la praticità di questo approccio diagnostico molecolare, abbiamo anche implementato un metodo semplificato di lisi cellulare (ARCL) pronto per l'amplificazione basato sulla lisi dell'idrossido di sodio (NaOH) degli addomi delle api11,14, eliminando la necessità di un'ampia preparazione del campione e di reagenti di laboratorio. Questa tecnica di estrazione rapida degli acidi nucleici, combinata con l'amplificazione isotermica e il sistema di rilevamento CRISPR/Cas12a, consente un flusso di lavoro realmente implementabile sul campo che riduce significativamente sia i tempi che i costi. È importante sottolineare che il test mantiene la qualità, l'elevata sensibilità e la specificità paragonabili alla qPCR, l'attuale gold standard per il rilevamento di agenti patogeni nelle api.

Qui, abbiamo applicato con successo questa metodologia per la rilevazione di Nosema ceranae e L. passim nelle api mellifere (Figura 1). Abbiamo confrontato questo metodo con i saggi qPCR standard e ne abbiamo convalidato le prestazioni utilizzando campioni infetti naturalmente. I nostri risultati mostrano che questo approccio è un'alternativa pratica e affidabile per il monitoraggio sul campo della salute delle api, con un forte potenziale per la sorveglianza su larga scala e gli sforzi di intervento precoce nell'apicoltura.

Protocollo

Tutte le procedure sono state condotte in conformità con le linee guida istituzionali e nazionali per il lavoro con gli invertebrati e utilizzando il minor numero di api necessario per la prova del concetto. Le api mellifere sono state trasportate in apposite scatole ad alveare con ventilazione e temperatura adeguata e conservate in laboratorio a -20 °C fino all'analisi.

1. Lisi cellulare alcalina HotSHOT

  1. Preparazione della soluzione
    1. HotSHOT Preparazione di tampone di lisi da 100 mL
      1. Pesare 99,993 mg di NaOH e 8,32 mg di EDTA, aggiungere 90 ml di acqua distillata e mescolare. Regolare il pH a 12 e il volume a 100 mL; autoclave.
    2. 40 mM di Tris-HCl, pH 5
      1. A 484,544 mg di Tris, aggiungere 90 ml di acqua deionizzata, regolare il pH a 5 con HCl e portare il volume a 100 ml.
  2. Protocollo di lisi
    1. Sezionare l'addome dell'ape utilizzando un bisturi sterile e trasferire il tessuto sezionato in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
      NOTA: Per il rilevamento degli agenti patogeni, sono stati utilizzati solo gli addomi e le parti del corpo rimanenti sono state scartate.
    2. Aggiungere 400 μl di tampone HotSHOT, macerare il tessuto con un pestello usa e getta e omogeneizzarlo ulteriormente mediante vortex.
      NOTA: Il pestello può essere riutilizzato se decontaminato incubando il materiale per una notte in una soluzione di NaOH 0,1 N, quindi risciacquato con doppia acqua deionizzata, seguito da un ciclo in autoclave e successiva essiccazione in un'incubatrice.
    3. Incubare l'omogeneizzato a 95 °C per 10 minuti per lisare le cellule. Dopo l'incubazione, posizionare immediatamente la provetta sul ghiaccio per raffreddarla.
    4. Per neutralizzare la reazione, aggiungere un volume uguale (400 μL) di 40 mM di Tris-HCl, ottenendo una concentrazione finale di 20 mM di Tris-HCl nella soluzione.
      NOTA: Questa procedura di lisi è illustrata nella Figura 2.

2. Amplificazione isoterma mediante RPA

NOTA: La progettazione dei primer è stata realizzata con l'aiuto dello strumento software eprimer3 (https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/eprimer3), sebbene sia stato possibile utilizzare altri strumenti di progettazione dei primer.

  1. Preparazione di soluzioni di lavoro
    1. Soluzioni di primer RPA
      1. Preparare le soluzioni madre a una concentrazione di 100 μM secondo le istruzioni del produttore. Ad esempio, ricostituire 10,0 nmol di primer liofilizzato in 100 μl di acqua trattata con pirocarbonato di dietil (DEPC) e conservare a -20 °C. Preparare soluzioni di lavoro a una concentrazione di 10 μM diluendo il materiale 1:10; miscelare 90 μl di acqua trattata con DEPC con 10 μl della soluzione madre da 100 μM in una provetta da 0,2 mL. Conservare queste soluzioni a -20 °C.
  2. Protocollo RPA
    1. Preparare la miscela master in base al numero di reazioni da eseguire. Includere sia un controllo negativo (sostituendo l'ARCL con acqua trattata con DEPC) sia un controllo positivo utilizzando il DNA del patogeno (in questo esempio, DNA proveniente da colture cellulari di L. passim promastigotes e api positive per Nosema spp. (spore rilevate al microscopio)) (Tabella 1).
      NOTA: Preparare sempre la miscela master RPA su ghiaccio e utilizzare i puntali del filtro per evitare contaminazioni.
    2. Trasferire un'aliquota di 46,5 μl della miscela master in ciascuna provetta da 0,2 mL.
    3. Aggiungere l'acetato di magnesio (MgOAc) e il DNA stampo ai tappi delle provette, seguendo i volumi specificati nella Tabella 2. Centrifugare brevemente le provette per miscelare il contenuto e avviare la reazione RPA.
      NOTA: Per una migliore riproducibilità, agitare brevemente e centrifugare tutti i componenti prima dell'uso. I controlli positivi e negativi devono essere inclusi in ogni lotto per convalidare la reazione.
    4. Incubare i campioni a 39 °C per 40 minuti per la reazione di amplificazione RPA.
      NOTA: Dopo l'incubazione, le reazioni RPA possono essere utilizzate direttamente per la rilevazione a valle (ad esempio, saggi basati su CRISPR/Cas12a), descritti nella sezione 3.

3. Rilevamento del DNA patogeno mediante CRISPR/Cas12a

NOTA: Il rilevamento dopo l'RPA può essere eseguito in diversi modi. In questo protocollo, descriveremo in dettaglio la rilevazione mediante fluorescenza (FAM-TTTTTTTT-MGB) e strisce immunocromatografiche (Biotin-TTTTTTTT-FITC).

Eseguire tutte le procedure in un'area pulita e priva di DNA (ad esempio, uno spazio dedicato alla PCR). Pulire le superfici di lavoro e le pipette con candeggina allo 0,5%, seguita da etanolo al 70%. Utilizzare sempre le punte del filtro e indossare guanti. Maneggiare il DNA o il materiale amplificato in un'area separata dalla zona di preparazione del reagente. Scongelare tutti i reagenti con ghiaccio e mantenere le condizioni di freddo durante la preparazione.

  1. Preparazione di soluzioni di lavoro
    1. di cra RNA
      NOTA: La progettazione del crRNA di Nosema ceranae e Lotmaria passim è stata eseguita utilizzando lo strumento di progettazione dell'RNA/DNA guida CRISPR (EuPaGDT) http://grna.ctegd.uga.edu/. Per la progettazione personalizzata di crRNA, possono essere utilizzati altri software come GPP sgRNA Designer (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) o CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/).
      1. Per preparare una soluzione madre di crRNA da 100 μM, ricostituire 10 nmol di ciascun crRNA liofilizzato con 100 μl di acqua trattata con DEPC e conservare a -20 °C. Per preparare una soluzione di lavoro da 1 μM, eseguire una diluizione 1:100 mescolando 1 μL della soluzione madre da 100 μM con 99 μL di acqua trattata con DEPC in una provetta da 0,2 mL (Figura 3).
        NOTA: Entrambe le soluzioni devono essere conservate a -20 °C.
    2. Preparazione Cas12a
      NOTA: Cas12a può essere fornito a concentrazioni di 1 μM o 100 μM.
      1. Se fornito a 100 μM, diluirlo in una soluzione di lavoro da 1 μM prima dell'uso mescolando 1 μL dell'enzima Cas12a da 100 μM con 99 μL del diluente fornito nel kit (diluizione 1:100, Figura 3).
        NOTA: La concentrazione dell'enzima Cas12a può essere regolata a seconda del tipo di campione. Poiché l'enzima è conservato in un diluente a base di glicerolo, è importante assicurarsi che il volume dell'enzima aggiunto non superi il 20% del volume totale di reazione per evitare potenziali effetti inibitori.
    3. Preparazione di soluzioni di sonde FAM e biotina
      NOTA: La sonda FAM viene fornita in forma liofilizzata.
      1. Per preparare una soluzione madre da 100 μM, risospendere la sonda aggiungendo 1 μL di acqua trattata con DEPC per 1 nmol di sonda (ad esempio, per 102 nmol, aggiungere 102 μL di acqua trattata con DEPC). Conservare la soluzione madre a -20 °C. Per l'uso nel mastermix di rivelazione, diluire il brodo 1:10 (90 μl di acqua trattata con DEPC con 10 μl di 100 μM FAM) per ottenere una soluzione di lavoro da 10 μM (Figura 3).
  2. Protocollo di rilevamento CRISPR/Cas12a
    1. Rilevamento basato sulla fluorescenza (sonda FAM)
      1. In una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, preparare la miscela di reazione come descritto nella Tabella 3, esclusi gli ampliconi.
      2. Mescolare accuratamente con un vortice e distribuire la miscela in provette per PCR.
      3. Quindi, aggiungere 4 μL di RPA amplicon (descritto al punto 2.2) a ciascuna provetta.
      4. Incubare le reazioni a 37 °C per 120 minuti in un termociclatore con capacità di lettura della fluorescenza, registrando la fluorescenza ogni minuto.
      5. Opzionale: Al termine dell'incubazione, trasferire le reazioni in provette da 0,2 mL e visualizzarle utilizzando un sistema di documentazione su gel per l'imaging.
    2. Rilevamento con una sonda di biotina in un test a flusso laterale
      1. In una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL, aggiungere i componenti mostrati nella Tabella 4.
      2. Preparare la miscela come descritto nel paragrafo 3.2.1, mescolarla e distribuirla in una piastra PCR. Infine, aggiungere 4 μL di amplicone ai rispettivi pozzetti.
      3. Incubare per 120 minuti in un termociclatore (senza lettura di fluorescenza) o in un blocco termico a 37 °C.
      4. Trasferire i campioni in provette da 0,2 mL ed eseguire la rilevazione con immunostrips. A tale scopo, aggiungere 50 μl di tampone di corsa e 10 μl di miscela di reazione in ciascuna provetta e inserire la striscia direttamente nella provetta. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente e leggere i risultati dopo 10 minuti di immersione, come illustrato nella Figura 3.

Risultati

Qui abbiamo descritto un metodo rapido in loco che utilizza la lisi alcalina degli addomi delle api operaie accoppiata all'amplificazione RPA e al rilevamento basato su CRISPR/Cas12a mediante approcci a fluorescenza e/o flusso laterale. Lo schema dell'intero flusso di lavoro è rappresentato nella Figura 3 e lo schema della lisi alcalina HotSHOT dell'adduscolo delle api operaie è nella Figura 4. I risultati rappresentativi del test RPA/CRISPR/Cas12a sono mostrati nella Figura 5. Per rilevare L. passim e N. ceranae, è stato utilizzato un termociclatore per quantificare le unità di fluorescenza relative (RFU) utilizzando una sonda marcata con FAM (Figura 4A). Le reazioni RPA sono state eseguite utilizzando 10 ng di DNA e i dati di fluorescenza sono stati tracciati in un grafico (Figura 4B). Nella fase finale del saggio, i campioni in provette coniche sono stati fotografati utilizzando un sistema di imaging su gel (Figura 4C). Per il rilevamento con una sonda marcata con biotina, i campioni sono stati incubati in un termoblocco (Figura 4A); la soluzione di rivelazione è stata preparata secondo le istruzioni del produttore e applicata su una striscia di flusso laterale (Figura 4B, C). Il metodo ha portato a un rilevamento di successo di entrambi i patogeni delle api.

Per determinare l'efficienza delle reazioni RPA, abbiamo confrontato questo metodo con la qPCR standard utilizzando il DNA purificato dalle api mellifere utilizzando il kit di riferimento (vedere la Tabella dei materiali). Un totale di 32 campioni di api sono stati testati con primer mirati al gene della β-tubulina di L. passim per entrambi i metodi e poi rilevati mediante trans-scissione CRISPR/Cas12a di sonde fluorescenti. In particolare, di conseguenza, 12 campioni sono risultati positivi mediante qPCR, mentre RPA/CRISPR/Cas12a ha rilevato L. passim in 16 campioni (Figura 5A). Ciò indica che le prestazioni della reazione RPA sono più sensibili della PCR, come metodo di amplificazione del DNA gold standard.

Allo stesso modo, abbiamo determinato il limite di rilevamento (LOD) per qPCR e RPA accoppiato al rilevamento CRISPR/Cas12a per il DNA di L. passim come modello patogeno utilizzando diluizioni seriali di DNA di L. passim che vanno da 66 ng a 6 fg. La qPCR ha rilevato un minimo di 6 pg, corrispondenti a circa 96 parassiti (Figura 5B). In confronto, il LOD per l'RPA corrispondeva a 96 parassiti (Figura 5C, D).

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Figura 1: Flusso di lavoro generale della lisi alcalina HotSHOT accoppiata con l'amplificazione RPA e i metodi di rilevamento Cas12 nelle api. Abbreviazioni: RPA = amplificazione della polimerasi ricombinasi; CRISPR = brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente intervallate; Cas = proteina associata a CRISPR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Elaborazione di lisi cellulare pronta per l'amplificazione con tampone HotSHOT. (A) Tagliare l'addome dell'ape con un bisturi e metterlo in una provetta da centrifuga; (B) con un pestello, effettuare una macerazione con 400 μL di HotShot; C) incubare su un termoblocco a 95 °C per 10 minuti; e (D) neutralizzare con 400 μL di Tris-HCl da 40 mM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Flusso di lavoro generale per la preparazione dell'enzima Cas12a e delle soluzioni di sonde reporter marcate con FAM e Biotina. Abbreviazioni: DEPC-acqua = acqua trattata con dietil pirocarbonato; crRNA= RNA CRISPR; Cas12 = tipo di proteina associata a CRISPR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Rilevamento di Lotmaria passim e Nosema ceranae. con il metodo CRISPR/Cas12a con sonde FAM e biotina. Per la rilevazione di FAM, (A) i campioni vengono incubati in un termociclatore; (B) le unità di fluorescenza relative (RFU) di L. passim e N. ceranae; (C) visualizzazione degli stessi campioni in un sistema di fotodocumentazione. Nelle prove della biotina, a) un campione in incubazione in un blocco termico; b) i campioni sono stati aggiunti in una striscia immunologica del kit (cfr. la tabella dei materiali); c) i risultati dopo l'incubazione. Abbreviazioni: LP= Lotmaria passim; NC= Nosema ceranae; NTC= nessun controllo modello; RFU: unità di fluorescenza relative Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Confronto tra qPCR e RPA e limite di rilevamento di Lotmaria passim. (A) Rilevamento di L. passim in campioni di api mellifere utilizzando qPCR e RPA convenzionali. (B) limite di rilevamento qPCR di L. passim utilizzando SsoFast EvaGreen. (C) Limite di rilevamento di L. passim utilizzando CRISPR/Cas12a con una sonda marcata FAM; (D) visualizzazione dello stesso rilevamento CRISPR/Cas12a (da C) sotto un sistema di imaging su gel (riga superiore) e risultati corrispondenti del flusso laterale utilizzando CRISPR/Cas12a con una sonda marcata con biotina (riga inferiore). Abbreviazioni: RPA = amplificazione della polimerasi ricombinasi; qPCR= reazione quantitativa della polimerasi a catena. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

ReagenteConcentrazione finale10 μl50 μl
2x tampone di reazione1x5 μl25 μl
dNTP (10 mM)1,8 mM1,8 μl9 μl
10x E-Mix di base1x1 μl5 μl
Primer in avanti (10 μM)480 nM0,5 μl2,4 μl
Primer inverso (10 μM)480 nM0,5 μl2,4 μl
20x Miscela di reazione del nucleo1x0,5 μl2,5 μl
DEPC Acqua--0,7 μl3,7 μl

Tabella 1: Componenti Mastermix per RPA con volumi finali di 10 μl e 50 μl e corrispondenti concentrazioni di lavoro:

ReagenteConcentrazione finaleReazione da 10 μlReazione da 50 μl
280 mM di MgOAc1,8 mM0,5 μl2,5 μl
DNA10-0,1 ng1 μl2 μl

Tabella 2: Volume di reagenti da aggiungere per campione in una reazione di RPA

Reagente[Stock][finale]1x (μL)
Enzima Cas12a1 μM50 nM2.5
cRNA1 μM100 nM5
Sonda FAM10 μM250 nM1.25
Tampone NEB 10x10 volte1x5
Amplicone RPA--4
Acqua--32.25
Totale50

Tabella 3: Concentrazioni di reagenti per ottenere una miscela di rilevazione FAM con il metodo CRISPR/Cas 12a.

Reagente[Stock][finale]1x (μL)
Enzima Cas12a1 μM50 nM2.5
cRNA1 μM100 nM5
Sonda per biotina10 μM500 nM2.5
Tampone NEB 10x10 volte1X5
Amplicone RPA--4
Acqua--31
Totale50

Tabella 4: Concentrazioni di reagenti per ottenere una miscela di biotina per la rilevazione con il metodo CRISPR/Cas 12a.

Discussione

In questo studio, abbiamo sviluppato e convalidato un pratico protocollo diagnostico molecolare per rilevare i patogeni delle api. Il flusso di lavoro integra la lisi cellulare pronta per l'amplificazione, l'amplificazione isotermica tramite RPA e il rilevamento altamente specifico tramite CRISPR/Cas12a. Tra i metodi di estrazione chimica del DNA valutati, il protocollo di lisi alcalina HotSHOT offre vantaggi significativi in termini di costi, velocità e semplicità. Produce in modo efficiente lisati pronti per l'amplificazione senza la necessità di kit commerciali. Questo metodo si è dimostrato affidabile in varie applicazioni, tra cui il rilevamento di agenti patogeni nelle apimellifere 14,15,16,17,18. Le condizioni alcaline ad alta temperatura interrompono le membrane cellulari e il legame idrogeno tra i filamenti di DNA, rilasciando DNA a filamento singolo adatto per l'amplificazione a valle. Sebbene le potenziali limitazioni includano la presenza di inibitori della PCR o una neutralizzazione non ottimale, è stato dimostrato che la lisi alcalina funziona efficacemente in diversi organismi come gli archei19, i batteri20 e i funghi14 ed è compatibile con PCR, qPCR e metodi isotermici come LAMP21 e RPA12.

Nelle nostre mani, il sistema RPA/CRISPR/Cas12a ha mostrato una forte specificità e una sensibilità soddisfacente. L'uso di crRNA mirati alle regioni conservate in ciascun patogeno ha permesso un'identificazione accurata senza cross-reattività al DNA ospite o a microrganismi non correlati. Precedenti applicazioni di questo sistema nelle api mellifere hanno raggiunto limiti di rilevamento di circa 6,5 × 102 e 6,2 × 101 copie/μL per i virus delle ali deformate di tipo A eB 8,12. Tuttavia, questi saggi non sono stati ottimizzati per le condizioni sul campo con una rapida estrazione di RNA e/o DNA. In questo lavoro, abbiamo adattato il metodo specificamente per i patogeni del DNA - N. ceranae e L. passim - consentendo il rilevamento compatibile con il campo.

I nostri risultati mostrano che RPA/CRISPR/Cas12a ha sovraperformato la PCR convenzionale nell'identificazione di campioni positivi (16 vs. 12), probabilmente a causa del miglioramento del segnale che utilizza l'attività di scissione collaterale CRISPR/Cas12a, che rimane efficace anche nei lisati grezzi. Il miglioramento della sensibilità rispetto ai metodi basati sulla PCR è stato precedentemente riportato in diversi modelli di patogeni come Yersinia enterocolitica22, Diaporthe aspalathi23 o Vibrio vulnificus24. Inoltre, l'analisi quantitativa ha rivelato un limite equivalente di rilevamento di RPA/CRISPR/Cas12a e qPCR in condizioni di laboratorio (~96 copie di parassiti/μL). Ciò implica una buona prestazione del metodo con specificità paragonabile alla qPCR TaqMan, grazie al riconoscimento della sequenza aggiunto fornito dal crRNA. Inoltre, il test richiede solo un'attrezzatura minima, non dipende da un termociclatore o da un lettore di fluorescenza e può essere visualizzato utilizzando strisce a flusso laterale come precedentemente sviluppato per altri patogeni25,26. Ciò semplifica l'interpretazione e rende il test altamente accessibile per i tecnici sul campo e gli apicoltori.

L'attuale protocollo produce risultati solidi, ma sono possibili ulteriori miglioramenti. L'adattamento del test per colpire altri patogeni delle api basati sul DNA richiederebbe solo la riprogettazione dei primer RPA e dei crRNA. Per i virus a RNA, il protocollo può essere ampliato per includere una fase di trascrizione inversa (RT-RPA) come precedentemente dimostrato per diverse malattie infettive virali 26,27,28, tra cui DWV-A e DWV-B nelle api mellifere 15. Inoltre, il tempo totale del test, attualmente di circa 180 minuti, può essere probabilmente ridotto attraverso l'ottimizzazione del protocollo per ridurre la tempistica di ogni fase. Un'altra alternativa potrebbe essere RPA/CRISPR/Cas12a one-pot che combina tutti i reagenti RPA/CRISPR/Cas12a in un'unica reazione. Questa metodologia all-in-one è stata applicata con successo per il rilevamento di un'ampia gamma di agenti patogeni virali e batterici 25,26,29. Oltre e nonostante le sonde ssDNA siano state estese e rese popolari per il rilevamento di Cas12a, alcuni studi hanno riportato la capacità di Cas12a di sonde di DNA a doppio filamento trans-clivaggio (dsDNA) che potrebbero essere utili per essere testate a causa della stabilità del dsDNA30. Ciò porterebbe a un tempo di ottenimento del risultato inferiore a 30 minuti, migliorando ulteriormente l'applicabilità sul campo. La liofilizzazione dei reagenti RPA e CRISPR migliorerebbe anche la stabilità dei reagenti ed eliminerebbe la necessità di una catena del freddo, aumentando l'idoneità per ambienti remoti o con poche risorse. Il successo delle prestazioni di RPA/CRISPR/Cas12a utilizzando reagenti liofilizzati è stato determinato con successo per la rilevazione di Actinobacillus pleuropneumonia31 e virus infettivi respiratori28,32, incluso SARS-Cov226.

In sintesi, questo studio presenta una piattaforma diagnostica molecolare completamente sul campo, economica e portatile per il rilevamento di agenti patogeni delle api. Questa metodologia, allo stato attuale, durerebbe circa 180 minuti, ma la sua tempistica totale potrebbe ancora essere soggetta a ulteriori miglioramenti. Mentre ci siamo concentrati su L. passim e Nosema spp. come bersagli proof-of-concept, il sistema è modulare e adattabile a un'ampia gamma di patogeni apistici basati sul DNA (ad esempio, larve di Paenibacillus o Melisococcus plutonious) e per il monitoraggio di simbionti commensali di interesse. Questo approccio amplia l'accesso alla diagnostica molecolare oltre i tradizionali contesti di laboratorio e supporta le strategie di intervento precoce in apicoltura. Più in generale, i nostri risultati dimostrano la fattibilità delle tecnologie basate su CRISPR in applicazioni diagnostiche pronte per il campo.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione "Nuovi strumenti molecolari per il monitoraggio rapido delle malattie delle api mellifere negli apiari della provincia di Granada" (GOPG-GR-23-0002) nell'ambito del bando Aid to operational groups of the European Innovation Association (AEI) in agricultural productivity and sustainability del governo andaluso. Ringraziamo anche il sostegno del Programma Spagnolo per la Generazione di Conoscenza e il Rafforzamento Scientifico e Tecnologico del Sistema R+S+I, sovvenzione PID2021-126938OB-I00 finanziata da MCIN/AEI/10.13039/501100011033 e da "FESR/UE". Abbiamo molto apprezzato l'aiuto e le risorse fornite dagli apicoltori dell'Asociación de Pequeños Apicultores de Granada (APAG) e delle Cooperativas Agroalimentarias de Granada (FAECA). Lo studio fa parte della tesi di dottorato di D. Pedro García Olmedo. Programma di dottorato in Biologia Fondamentale e dei Sistemi (Università di Granada, UGR).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette Eppendorf da 0,2 mL prive di DNAsi e RNAsiAxygenMTC-02-C
Provette Eppendorf da 1,5 mL prive di DNAsi e RNAsiAxygenMTC-150-C
10 μ L puntali filtrati a bassa ritenzioneLabCliniche5-063-P5-0
100 μ L puntali filtrati a bassa ritenzioneLabCliniche5-120-P5-0
1000 μ L puntali filtrati a bassa ritenzioneLabCliniche5-203-P4-0
Riscaldatore a blocco secco Stuart serie BH-200Cole-ParmerEW-36610-00
Acqua trattata con DEPCAmbiconAM9906
EDTASigma-Aldrich798681
EnGen Lba Cas12a (Cpf1)Biolaboratori del New EnglandCodice: M0653T
Sigma-AldrichSigma-Aldrich64-17-5
HclSigma-Aldrich7647-01-0
Pestelli a microprovetteFisherbrand12141364
Milenia GenLine HybriDetectMileniaMGHD 1
NaOHSigma-Aldrich221465
RPA kit TwistAmp Liquid BasicTwistAmp  TALQBAS01
Lame per bisturiSwann-Morton201
Singola Chanel Pipete PIPETMAN P1000L Micropipetta Espulsione del metalloGilsonF144059M
Singola Chanel Pipete PIPETMAN P100L Micropipetta Espulsione del metalloGilsonF144057M
Singola Chanel Pipete PIPETMAN P10L Micropipetta Espulsione del metalloGilsonF144055M
Ipoclorito di sodio
Sistema di rilevamento PCR in tempo reale touchBioRadPannello CFX96
Tris-HClSigma-AldrichT1503
TwistAmp Liquido di baseCurvaTALQBAS01

Riferimenti

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Ristampe e permessi

Errata corrige


Formal Correction: Erratum: On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System
Posted by JoVE Editors on 8/14/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68874

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Amplificazione tramite ricombinasi polimerasisaggio a flusso lateralerilevamento di patogeni delle api melliferediagnostica sul campodiagnostica molecolare
Rilevamento del DNA in loco di parassiti tripanosomatidi e nosema ceranae attraverso lisi alcalina accoppiata al sistema RPA/CRISPR/Cas12a
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