Articolo metodologico

Valutazione dell'effetto dei fattori SASP sulla proliferazione delle cellule tumorali utilizzando un'analisi comparativa di tre metodologie distinte

DOI:

10.3791/68883

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19 settembre 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Gazi University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio valuta gli effetti proliferativi dei fattori del fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP) delle cellule HeLa senescenti su cellule HeLa non senescenti utilizzando tre modelli in vitro con monitoraggio in tempo reale. I vantaggi e i limiti di ciascun metodo sono stati sistematicamente confrontati per comprendere meglio le interazioni cellula-cellula nel cancro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule tumorali senescenti indotte dalla chemioterapia secernono anche vari fattori, chiamati fenotipo secretorio associato alla senescenza, per regolare il loro microambiente extracellulare. Studi precedenti hanno riportato che questi fattori SASP esercitano effetti paracrini dannosi sulle cellule circostanti, tra cui la promozione della proliferazione, della transizione epitelio-mesenchimale (EMT), dell'angiogenesi e della migrazione. Diverse tecniche di co-coltura in vitro sono ampiamente utilizzate per comprendere i processi cellulari risultanti dall'interazione coltivando insieme lo stesso tipo di cellule e diversi tipi di cellule. Qui, i potenziali effetti proliferativi dei fattori SASP secreti dalle cellule HeLa senescenti sulle cellule HeLa non senescenti sono stati studiati utilizzando tre approcci complementari in vitro . Il primo approccio ha comportato la co-coltura di cellule senescenti e non senescenti per studiare la segnalazione paracrina mediata dal SASP. Nel secondo approccio, i terreni condizionati raccolti da cellule tumorali senescenti sono stati concentrati e successivamente utilizzati per esaminare l'impatto dei terreni condizionati con monitoraggio in tempo reale della proliferazione. Nel terzo metodo, le cellule senescenti e non senescenti sono state coltivate fianco a fianco per valutare gli effetti juxtacrini di SASP attraverso il contatto diretto cellula-cellula. Tutti e tre i modelli sperimentali hanno costantemente dimostrato che i fattori SASP hanno aumentato significativamente la proliferazione delle cellule tumorali non senescenti. In particolare, la co-coltura di cellule senescenti ha aumentato il tasso di proliferazione del 64,6% e i terreni condizionati con SASP 3 volte più concentrati hanno aumentato la proliferazione di oltre il 50% rispetto ai controlli. L'imaging basato sulla fluorescenza ha mostrato un aumento del 49,3% del numero di cellule GFP-positive in condizioni di juxtacrina. Questi metodi hanno consentito collettivamente una valutazione quantitativa e qualitativa dei cambiamenti proliferativi indotti da SASP. L'analisi comparativa di questi approcci ne evidenzia i rispettivi punti di forza e i limiti, fornendo preziose informazioni sugli effetti paracrini delle cellule senescenti.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Negli organismi pluricellulari, le cellule comunicano attraverso la segnalazione paracrina e juxtacrina scambiando messaggi con il loro microambiente, influenzando così il comportamento reciproco. Questa comunicazione può avvenire direttamente, attraverso nanotubi a effetto tunnel e giunzioni gap, o indirettamente attraverso la secrezione di molecole chimiche solubili come citochine, fattori di crescita e chemochine nella matrice extracellulare. Questi meccanismi di segnalazione svolgono un ruolo essenziale nella regolazione di vari processi fisiologici, tra cui lo sviluppo dei tessuti e le risposte delle cellule immunitarie, e sono anche implicati nella patogenesi di numerose malattie, come il cancro, l'HIV, l'ipertensione e l'Alzheimer1.

Negli anni '60, Leonard Hayflick scoprì che i fibroblasti umani normali hanno una capacità limitata di replicarsi in vitro2. Questo stato di proliferazione cellulare limitata che si sviluppa a causa dell'accorciamento della telomerasi è chiamato senescenza replicativa. Studi successivi hanno rivelato che varie forme di stress cellulare possono anche innescare la senescenza cellulare. È stato determinato che i trattamenti antitumorali comuni come la chemioterapia e la radioterapia inducono anche la senescenza cellulare sia nel cancro che nelle cellule stromali, chiamata senescenza indotta dalla terapia 3,4. La senescenza cellulare e l'invecchiamento sono processi gerarchicamente correlati; Rappresentano processi biologici distinti. L'accumulo di cellule senescenti nell'organismo contribuisce all'invecchiamento promuovendo l'infiammazione, la disfunzione dei tessuti e lo sviluppo di malattie legate all'età. Tuttavia, l'invecchiamento comprende una gamma molto più ampia di eventi e meccanismi sistemici rispetto alla senescenza5.

Le cellule senescenti sono caratterizzate dal fatto che il loro citoplasma espanso è significativamente più grande e ha una morfologia appiattita rispetto alle cellule normali6. Queste cellule senescenti hanno un aumento dell'attività lisosomiale e sono positive per l'attività della β-galattosidasi associata alla senescenza (SA-β-gal), un enzima lisosomiale che rimane attivo anche a pH acido 6,0. La colorazione SA-β-gal è il biomarcatore più utilizzato per rilevare le cellule senescenti7. L'ingrossamento e la morfologia irregolare dei nuclei sono comunemente osservati nelle cellule in fase di senescenza. Inoltre, queste cellule sono caratterizzate da riarrangiamenti unici della cromatina chiamati focolai eterocromatici associati alla senescenza (SAHF) che mediano l'arresto irreversibile del ciclo cellulare 8,9.

Sebbene le cellule tumorali senescenti alla fine abbiano perso la loro capacità di proliferare, sono rimaste vitali e metabolicamente attive. È noto che le cellule senescenti secernono anche vari fattori per regolare il loro microambiente tumorale extracellulare, chiamato fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP)10,11. Questi fattori SASP includono fattori di segnalazione solubili (interleuchine, chemochine e fattori di crescita), proteasi secrete e proteine insolubili/componenti della matrice extracellulare (ECM) secerniti. Collettivamente, questi fattori esercitano effetti paracrini dannosi, tra cui la promozione della proliferazione, della migrazione, dell'invasione e dell'induzione della transizione da epitelio a mesenchimale (EMT)4,12. Inoltre, gli effetti avversi indotti dalla chemioterapia sono stati parzialmente attribuiti all'accumulo di cellule senescenti13. Pertanto, lo studio dell'interazione tra cellule senescenti e non senescenti è diventato un'importante area di ricerca nel contesto della terapia del cancro. In particolare, l'analisi dei fattori SASP, in particolare la loro composizione e gli effetti sul microambiente tumorale, è considerata una strategia promettente per identificare nuove molecole bersaglio per la terapia del cancro e scoprire nuovi farmaci per queste molecole.

Le tecniche di co-coltura in vitro sono state a lungo utilizzate per studiare la comprensione delle interazioni cellula-cellula14. In questo articolo metodologico, l'obiettivo è stato quello di valutare la possibile attività proliferativa di fattori secreti da cellule senescenti su cellule tumorali non senescenti utilizzando tre diversi metodi. Inoltre, sono stati confrontati i risultati ottenuti dai tre diversi metodi e sono stati valutati criticamente i rispettivi vantaggi e svantaggi di ciascun approccio.

In primo luogo, è stato messo a punto un modello di co-coltura tra cellule HeLa senescenti e cellule HeLa non senescenti per monitorare i possibili cambiamenti nella proliferazione delle cellule tumorali in tempo reale utilizzando il sistema di analisi cellulare in tempo reale12. Questo sistema è costituito da due piastre per valutare le interazioni cellula-cellula. La vista della piastra elettronica, che forma lo strato inferiore, ha una superficie in cui vengono seminate le cellule bersaglio, con microelettrodi posizionati nella parte inferiore della piastra. La resistenza elettrica creata dall'adesione delle cellule bersaglio a questa superficie è espressa dal parametro misurabile Cell Index (CI). Il valore CI è proporzionale al numero di celle e al grado di adesione alla superficie15. Inoltre, la vista e-plate consente l'esame morfologico delle cellule al microscopio a contrasto di fase. L'inserto della piastra elettronica, che forma lo strato superiore, è l'area in cui vengono seminate le cellule effettrici. Il fondo di questa piastra è ricoperto da una membrana semipermeabile con pori di 0,4 μm. I fattori secreti dalle cellule effettrici possono passare attraverso la membrana e influenzare le cellule bersaglio nella vista della piastra elettronica. Se questa interazione stimola la proliferazione cellulare, si osserva un aumento del valore CI. Pertanto, le interazioni tra le cellule possono essere valutate quantitativamente.

Nel secondo metodo, i terreni condizionati raccolti dalle cellule HeLa senescenti sono stati concentrati e aggiunti alle cellule HeLa non senescenti. Il potenziale effetto proliferativo su queste cellule è stato monitorato utilizzando il sistema di analisi cellulare in tempo reale.

Nel terzo metodo, è stato previsto di co-coltivare le cellule HeLa senescenti e le cellule GFP-HeLa non senescenti direttamente in 2D e monitorare le possibili alterazioni proliferative nelle cellule tumorali in tempo reale al microscopio.

L'obiettivo di questo esperimento è quello di mettere a punto tre modelli per studiare l'interazione tra cellule HeLa senescenti e cellule HeLa non senescenti e monitorare possibili cambiamenti nella proliferazione delle cellule tumorali in tempo reale. Pertanto, l'effetto dei fattori SASP secreti dalle cellule tumorali senescenti sulle altre cellule tumorali può essere facilmente studiato. Di conseguenza, i vantaggi e i limiti dei tre approcci sono stati valutati sistematicamente.

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Protocollo

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NOTA: Tutte le procedure di coltura cellulare sono state condotte in condizioni di biosicurezza di livello II+ (BSL2+) all'interno di una cabina di sicurezza certificata. La doxorubicina è un agente chemioterapico pericoloso. Tutte le procedure devono essere eseguite in un armadio certificato di biosicurezza di livello II+ (BSL2+) utilizzando dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati, inclusi camici e guanti da laboratorio. Tutti i rifiuti contenenti doxorubicina, compresi i terreni e i fissativi, devono essere raccolti in contenitori per rifiuti pericolosi designati e chiaramente etichettati e smaltiti attraverso il sistema istituzionale di gestione dei rifiuti pericolosi.

1. Modello 1: Co-coltura utilizzando il sistema di analisi cellulare in tempo reale

  1. Coltura delle cellule e induzione della senescenza (Giorno 1-2)
    1. Seminare 8 x 105 cellule HeLa in un pallone di coltura T25 contenente 5 mL di Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), penicillina (100 U/mL) e streptomicina (0,1 μg/mL) e incubare le cellule a 37 °C in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2.
    2. Il giorno successivo, sostituire il terreno delle cellule con 5 mL di terreno completo fresco. Trattare le cellule con 300 nM di doxorubicina direttamente aggiungendole al terreno per indurre la senescenza cellulare. Mantenere il matraccio T25 in un'incubatrice con CO2 al 5% a 37 °C per 72 ore.
  2. Semina cellulare non senescente (Giorno 4)
    1. Seminare 8 x 105 cellule HeLa non trattate (controllo non senescente) in un nuovo pallone T25 in 5 mL di DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino, penicillina (100 U/mL) e streptomicina (0,1 μg/mL) e conservare in un'incubatrice umidificata a 37 °C con il 5% di CO2.
  3. Confermare l'induzione della senescenza (Giorno 5)
    1. Per determinare se 72 ore di trattamento con doxorubicina hanno indotto senescenza, eseguire la colorazione SA-β-gal6. Eseguire questo test su un set separato di cellule non utilizzate negli esperimenti principali. Per i risultati ottenuti, vedere la Figura 1A, B.
    2. Misurare l'IL-6 nel terreno condizionato delle cellule HeLa senescenti del cancro per valutarne l'attività secretoria. Trattare le cellule con doxorubicina per 72 ore, seguita da incubazione in terreno privo di siero e rosso fenolo per altri 2 giorni. Normalizzare il terreno condizionato raccolto al numero di cellule e misurare i livelli di IL-6.
      NOTA: IL-6 è una citochina caratteristica di SASP12. I risultati della misurazione dell'IL-6 sono presentati nella Figura 1C.
  4. Configurazione del sistema di analisi cellulare in tempo reale (giorno 5)
    1. Accendi il sistema di analisi cellulare in tempo reale prima della semina cellulare. Avvia il software RTCA 2.0. Fare clic sul pulsante Note Exp (Figura 2) e inserire i dettagli dell'esperimento.
    2. Fare clic sul pulsante Pianifica e aggiungere due passaggi. Il primo passo è per lo sfondo. Il secondo passo consiste nel monitorare la proliferazione cellulare ogni 15 minuti per 72 ore.
    3. Scegliere il Primo passaggio e fare clic su Riproduci per registrare l'impedenza di fondo aggiungendo 50 μL di terreno completo a ciascun pozzetto della vista della piastra elettronica.
  5. Semina delle cellule nella vista e-plate (giorno 5)
    1. Controllare sia le cellule HeLa trattate con doxorubicina (senescenti) che quelle non trattate (non senescenti) al microscopio a contrasto di fase utilizzando un ingrandimento 10x prima di seminare le cellule. Al microscopio, le cellule senescenti hanno una morfologia molto più ingrandita rispetto alle cellule normali.
    2. Lavare sia le cellule HeLa senescenti che quelle non senescenti con 5 ml di PBS sterile preriscaldato, quindi aspirare.
    3. Aggiungere 1 mL di tripsina preriscaldata allo 0,05% e mantenere i matracci a 37 °C per 2 minuti per staccare le cellule. Neutralizzare la tripsina con 5 mL di DMEM completo integrato con il 10% di siero fetale bovino, penicillina (100 U/mL) e streptomicina (0,1 μg/mL).
    4. Centrifugare le cellule a 500 x g a temperatura ambiente per 10 minuti, scartare il surnatante e risospendere i pellet cellulari in 5 mL di DMEM completo integrato con siero fetale bovino al 10%, penicillina (100 U/mL) e streptomicina (0,1 μg/mL).
    5. Contare le cellule vitali utilizzando il metodo di esclusione del colorante blu di tripano utilizzando un emocitometro.
    6. Semina di cellule HeLa non senescenti a una densità di 5 x 103 cellule/pozzetto in ciascun pozzetto di una vista della piastra elettronica in 100 μL completi di DMEM integrati con il 10% di siero fetale bovino, penicillina (100 U/mL) e streptomicina (0,1 μg/mL).
    7. Posiziona la vista della piastra elettronica nella culla del sistema di analisi cellulare in tempo reale per consentire alle cellule di attaccarsi alla superficie della piastra nell'incubatore.
    8. Scegliere il secondo passaggio sul pulsante di programmazione e fare clic sul pulsante Riproduci per avviare la misurazione dell'impedenza utilizzando il software RTCA 2.0 per 72 ore (Figura 2).
  6. Semina delle celle nell'inserto della piastra elettronica
    1. Le cellule del seme in una piastra elettronica inseriscono pozzetti in 60 μL di DMEM completo integrato con il 10% di siero fetale bovino, penicillina (100 U/mL) e streptomicina (0,1 μg/mL).
    2. Seminare le cellule sull'inserto e-plate in tre diverse configurazioni sperimentali: Gruppo 1 (controllo negativo): nessuna cellula seminata (solo terreno)
      Gruppo 2: 2 × 104 cellule HeLa non senescenti
      Gruppo 3: 1 × 105 cellule HeLa senescenti
    3. Mantenere l'inserto della piastra elettronica a 37 °C in un'incubatrice con il 5% di CO2 per 6 ore per il fissaggio.
  7. Cellule di co-coltura
    1. Fare clic su Pausa dopo 6 ore di semina delle cellule. Aspirare delicatamente il terreno di coltura da ciascun pozzetto della vista della piastra elettronica per rimuovere il siero e le cellule non aderenti.
    2. Lavare i pozzetti 2 volte con PBS preriscaldato a 37 °C.Aggiungere 140 μL di DMEM privo di siero a ciascun pozzetto della vista della piastra elettronica.
    3. Prendere l'inserto della piastra elettronica e aspirare il terreno di coltura. Lavare delicatamente i pozzetti con PBS a 37 °C 2x e aggiungere 60 μl di DMEM senza siero.
    4. Posizionare l'inserto della piastra elettronica nella vista della piastra elettronica e premere delicatamente verso il basso fino a quando l'inserto non è completamente inserito nel pozzetto.
    5. Inserire la piastra combinata nel sistema di analisi cellulare in tempo reale e fare clic su Riproduci per riprendere il monitoraggio in tempo reale dei valori dell'indice cellulare a intervalli di 15 minuti utilizzando il software (Figura 2).
    6. Spegnere il sistema di analisi cellulare in tempo reale quando il tempo dell'esperimento è scaduto (Figura 3A).
  8. Celle di imaging su inserto per piastra elettronica
    NOTA: Poiché nel pozzetto dell'inserto della piastra elettronica è presente una membrana, le cellule seminate qui non possono essere visualizzate sulla membrana utilizzando la microscopia a contrasto di fase. Pertanto, per verificare se le cellule hanno mantenuto la vitalità fino alla fine dell'esperimento e se le cellule senescenti hanno conservato la loro integrità strutturale, sono state colorate con DAPI (Figura 3B).
    1. Rimuovere l'inserto della piastra elettronica dalla vista della piastra elettronica. Colorare le cellule nell'inserto della piastra elettronica con DAPI e verificare la presenza di cellule al microscopio a fluorescenza16. È noto che i nuclei delle cellule senescenti sono più grandi di quelli delle cellule normali. Pertanto, in base alle dimensioni nucleari delle cellule colorate con DAPI, determinare quale pozzetto è stato seminato con cellule non senescenti e quale con cellule senescenti.
  9. Imaging delle cellule nella vista della piastra elettronica
    1. Esamina direttamente la vista della piastra elettronica con un microscopio a contrasto di fase utilizzando un ingrandimento 10x (Figura 3B). Poiché quattro file di sensori a microelettrodi sono state rimosse dal centro di ciascun pozzetto nella vista della piastra elettronica, lo spazio 6 è stato creato per consentire il monitoraggio delle cellule mediante microscopia.
  10. Analisi dei dati
    1. Normalizza i valori CI nel momento in cui la vista della piastra elettronica e l'inserto della piastra elettronica vengono combinati e inseriti nel sistema di analisi delle celle in tempo reale.
    2. Fare clic sul pulsante Analisi dati per calcolare il tasso di proliferazione e la quantità utilizzando l'indice cellulare massimo e i dati di pendenza ottenuti dal sistema di analisi cellulare in tempo reale (Figura 2). Quindi, analizzare i dati utilizzando un programma statistico appropriato (Figura 3C, D).

2. Modello 2: Saggio di trattamento condizionato dei terreni utilizzando il sistema di analisi cellulare in tempo reale

  1. Coltura delle cellule e induzione della senescenza (Giorno 1-2)
    1. Seminare 35 x 104 cellule HeLa in ciascun pozzetto di 6 piastre contenenti 2,5 mL di Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), penicillina (100 U/mL) e streptomicina (0,1 μg/mL) e incubare le cellule a 37 °C in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2.
    2. Il giorno successivo, sostituire il terreno di coltura con 2,5 mL di terreno completo fresco. Trattare le cellule con doxorubicina 300 nM direttamente aggiungendola al terreno per indurre la senescenza cellulare. Mantenere la piastra a 6 pozzetti in un incubatore con il 5% di CO2 a 37 °C per 72 ore.
  2. Semina cellulare non senescente (Giorno 4)
    1. Seminare 35 x 104 cellule HeLa non trattate (controllo non senescente) in ciascun pozzetto di una nuova piastra a 6 pozzetti in 2,5 mL di DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino, penicillina (100 U/mL) e streptomicina (0,1 μg/mL) e conservare in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2.
  3. Effettuare la conferma dell'induzione della senescenza come descritto al punto 1.3.
  4. Preparazione di terreno condizionato da cellule HeLa senescenti e non senescenti
    1. Controllare al microscopio a contrasto di fase sia le cellule trattate con doxorubicina (cellule senescenti) che le cellule HeLa non trattate (cellule non senescenti). Al microscopio, le cellule senescenti hanno una morfologia molto più ingrandita rispetto alle cellule normali.
    2. Aspirare il terreno di coltura da entrambe le due piastre a 6 pozzetti (cellule HeLa senescenti e non senescenti). Lavare le cellule 2 volte con PBS preriscaldato a 37 °C per rimuovere il siero residuo e i detriti cellulari.
    3. Aggiungere 2 mL di DMEM senza siero integrato con penicillina (100 U/mL) e streptomicina (0,1 μg/mL) in ciascun pozzetto. Incubare le cellule in un incubatore umidificato a 37 °C con CO2 al 5% per 48 ore.
  5. Raccolta e concentrazione dei terreni condizionati (Giorno 7)
    1. Raccogliere i terreni condizionati da ciascun pozzetto in provette sterili in una cabina di sicurezza laminare.
    2. Tripsinizzare le cellule e contare le cellule utilizzando il metodo di esclusione del colorante blu di tripano utilizzando un emocitometro per normalizzare i terreni condizionati al numero di cellule.
    3. Regolare il terreno condizionato, normalizzato in base al numero di cellule, a un volume finale di 2 mL con DMEM privo di siero integrato con penicillina (100 U/mL) e streptomicina (0,1 μg/mL) in provette sterili da 2 mL.
    4. Centrifugare il terreno condizionato raccolto a 1.000 x g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere i detriti cellulari, seguito da centrifugazione a 10.000 x g per 10 minuti a 4 °C per ottenere il surnatante chiarificato.
    5. Centrifugare il terreno condizionato utilizzando unità filtranti ultracentrifughe da 2 mL a 4 °C per 60 minuti a 3.000 x g per concentrarlo. Questa procedura concentra i 2 mL di terreno condizionato a 5 volte i 400 μL concentrati di terreno condizionato.
    6. Diluire i 40 μl di terreno condizionato ottenuti con terreno fresco privo di siero per preparare 1x, 2x e 3x terreno condizionato concentrato in provette sterili in una cabina di sicurezza laminare.
      NOTA: Poiché il terreno rimasto sulle celle per 48 ore si esaurisce a causa del consumo cellulare, il terreno condizionato raccolto e concentrato viene successivamente diluito con nuovo terreno.
  6. Visualizzazione delle celle di semina su piastra elettronica
    1. Impostare il sistema di analisi cellulare in tempo reale come descritto nei passaggi 1.1-1.4.Lavare le cellule HeLa non senescenti con PBS preriscaldato, quindi aspirare.
    2. Aggiungere 1 mL di tripsina preriscaldata allo 0,05% e mantenere i matracci a 37 °C per 2 minuti per staccare le cellule. Neutralizzare la tripsina con 5 mL di DMEM completo integrato con il 10% di siero fetale bovino, penicillina (100 U/mL) e streptomicina (0,1 μg/mL).
    3. Centrifugare le cellule a 500 x g a temperatura ambiente per 10 minuti, scartare il surnatante e risospendere i pellet cellulari in 5 mL di DMEM completo integrato con siero fetale bovino al 10%, penicillina (100 U/mL) e streptomicina (0,1 μg/mL).
    4. Contare le cellule vitali utilizzando il metodo di esclusione del colorante blu di tripano utilizzando un emocitometro.
    5. Semina di cellule HeLa non senescenti a una densità di 5 x 103 cellule/pozzetto in ciascun pozzetto di una vista e-piastra in 200 μL di DMEM completo integrato con il 10% di siero fetale bovino, penicillina (100 U/mL) e streptomicina (0,1 μg/mL).
    6. Posiziona la vista della piastra elettronica nella culla del sistema di analisi cellulare in tempo reale per consentire alle cellule di attaccarsi alla superficie della piastra nell'incubatore.
    7. Scegliere il secondo passaggio sul pulsante di programmazione e fare clic sul pulsante Riproduci per avviare la misurazione dell'impedenza utilizzando il software RTCA 2.0 (Figura 2). Fare clic sul pulsante Pausa sul software dopo 6 ore di placcatura di celle HeLa non senescenti (Figura 2).
    8. Aspirare delicatamente il terreno di coltura da ciascun pozzetto della vista della piastra elettronica per rimuovere il siero e le cellule non aderenti. Lavare i pozzetti 2 volte con PBS preriscaldato a 37 °C.
    9. Aggiungere il fluido condizionato preriscaldato a 37 °C nei gruppi appropriati:
      Gruppo 1: Supporti freschi
      Gruppo 2: 1x terreno condizionato con cellule HeLa non senescenti
      Gruppo 3: 2 terreni condizionati con cellule HeLa non senescenti
      Gruppo 4: 3 terreni condizionati con cellule HeLa non senescenti
      Gruppo 5: 1 terreno senescente condizionato con cellule HeLa
      Gruppo 6: 2 terreni senescenti condizionati con cellule HeLa
      Gruppo 7: 3 terreni senescenti condizionati con cellule HeLa
    10. Inserire la vista e-plate nel sistema di analisi delle cellule in tempo reale e fare clic su Riproduci per riprendere il monitoraggio in tempo reale dei valori dell'indice delle celle a intervalli di 15 minuti per 48 ore (Figura 2).
    11. Spegnere il sistema di analisi cellulare in tempo reale quando il tempo dell'esperimento è scaduto (Figura 4A).
  7. Imaging delle cellule nella vista della piastra elettronica
    1. Esamina direttamente la vista della piastra elettronica con un microscopio a contrasto di fase con un ingrandimento di 10x (Figura 4B). Poiché quattro file di sensori a microelettrodi sono state rimosse dal centro di ciascun pozzetto nella vista della piastra elettronica, è stato creato uno spazio per consentire il monitoraggio delle celle mediante microsopia.
  8. Analisi dei dati
    1. Normalizzare i valori di CI nel momento in cui i mezzi condizionati concentrati sono stati somministrati alle cellule HeLa non senescenti.
    2. Fare clic sul pulsante Analisi dati per calcolare il tasso di proliferazione e la quantità utilizzando l'indice cellulare massimo e i dati di pendenza ottenuti dal sistema di analisi cellulare in tempo reale (Figura 2). Quindi, analizzare i dati utilizzando un programma statistico appropriato (Figura 4C, D).

3. Modello 3: Monitoraggio in tempo reale dell'interazione cellula-cellula

  1. Coltura delle cellule e induzione della senescenza (Giorno 1-2)
    1. Seminare 8 x 105 cellule HeLa in un pallone di coltura T25 contenente 5 mL di Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), penicillina (100 U/mL) e streptomicina (0,1 μg/mL) e incubare le cellule a 37 °C in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2.
    2. Il giorno successivo, sostituire il terreno delle cellule con 5 mL di terreno completo fresco. Trattare le cellule con 300 nM di doxorubicina direttamente aggiungendole al terreno per indurre la senescenza cellulare. Mantenere il matraccio T25 in un'incubatrice con CO2 al 5% a 37 °C per 72 ore.
  2. Semina cellulare non senescente (Giorno 4)
    1. Seminare 8 x 105 cellule GFP-HeLa (controllo non senescente) in un nuovo pallone T25 in 5 mL di DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino, penicillina (100 U/mL) e streptomicina (0,1 μg/mL) e conservare in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2.
    2. Seminare 8 x 105 cellule HeLa (controllo non senescente) in un nuovo pallone T25 in 5 mL di DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino, penicillina (100 U/mL) e streptomicina (0,1 μg/mL) e conservare in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2.
  3. Effettuare la conferma dell'induzione della senescenza come descritto al punto 1.3 (giorno 5).
  4. Cellule di co-coltura
    1. Controllare le cellule trattate con doxorubicina, la GFP-HeLa non trattata e le cellule HeLa non trattate al microscopio a contrasto di fase prima di seminare le cellule. Al microscopio, le cellule senescenti hanno una morfologia molto più ingrandita rispetto alle cellule normali.
    2. Lavare tutti e tre i matracci T25 con 5 mL di PBS sterile preriscaldato, quindi aspirare. Aggiungere 1 mL di tripsina preriscaldata allo 0,05% e mantenere i matracci a 37 °C per 2 minuti per staccare le cellule.
    3. Neutralizzare la tripsina con 5 mL di DMEM completo integrato con il 10% di siero fetale bovino, penicillina (100 U/mL) e streptomicina (0,1 μg/mL).
    4. Centrifugare le cellule a 500 x g a temperatura ambiente per 10 minuti, scartare il surnatante e risospendere i pellet cellulari in 5 mL di DMEM completo integrato con siero fetale bovino al 10%, penicillina (100 U/mL) e streptomicina (0,1 μg/mL).
    5. Contare le cellule vitali utilizzando il metodo di esclusione del colorante blu di tripano utilizzando un emocitometro. Cellule seme in 200 μL di DMEM completo integrato con il 10% di siero fetale bovino, penicillina (100 U/ml) e streptomicina (0,1 μg/mL).
    6. Seminare le cellule su μ-slide a 8 pozzetti in tre diverse configurazioni sperimentali:
      Gruppo 1: 7 x 103 cellule GFP-HeLa
      Gruppo 2: 18 x 103 cellule HeLa non senescenti + 7 x 103 cellule GFP-HeLa
      Gruppo 3: 18 x 103 cellule HeLa senescenti + 7 x 103 cellule GFP-HeLa
    7. Mantenere il vetrino μ per 8 ore per il fissaggio a 37 °C in un'incubatrice con il 5% di CO2. Dopo 8 ore, lavare le cellule con PBS preriscaldato (37 °C) 2 volte per eliminare l'effetto del siero sulle cellule.
    8. Aggiungere 200 μL di DMEM privo di siero contenente penicillina (100 U/mL) e streptomicina (0,1 μg/mL) in ciascun pozzetto.
  5. Configurazione del microscopio
    1. Accendere il regolatore di temperatura e il CO2-Controller e lasciare che il sistema di incubazione del palco si stabilizzi per 30 minuti.
    2. Controllare manualmente le impostazioni della concentrazione e della temperatura di CO2 e assicurarsi che vengano raggiunte le condizioni fisiologiche (5% CO2, 37 °C).
    3. Accendere il microscopio a fluorescenza invertito e lasciare che il sistema completi l'autocalibrazione. Accendere la sorgente luminosa a fluorescenza. Avvia il software di imaging e analisi per controllare i parametri di imaging e l'acquisizione delle immagini.
  6. Imaging time-lapse
    1. Posizionare il vetrino sulla camera di incubazione del tavolino della microscopia a fluorescenza invertita con una fotocamera digitale ad alta risoluzione. Aprire il software e selezionare le modalità Parte X, Y, Z e T e mettere in scena gli esperimenti nelle impostazioni di acquisizione (Figura 5A).
    2. È possibile selezionare un obiettivo 20x con contrasto elevato per l'imaging a fluorescenza e a contrasto di fase (Figura 5A). Aggiungere i canali del contrasto di fase e della fluorescenza (filtro FITC) per abilitare l'imaging in entrambe le modalità (Figura 5A).
    3. Fare clic sul pulsante Live per avviare l'imaging di cellule vive, quindi mettere a fuoco le cellule con contrasto di fase (Figura 5A). Aprire la finestra z-stack e segnare la posizione delle celle di interesse (contenenti sia cellule HeLa senescenti/non senescenti che cellule HeLa GFP). Naviga lo stadio tra i pozzetti utilizzando il controller automatico dello stadio, che consente di localizzare con precisione le aree selezionate per la marcatura della posizione (Figura 5A).
      NOTA: In questo modo, è possibile selezionare più di un'area nello stesso pozzetto di un vetrino.
    4. Passare il canale al canale della fluorescenza per iniziare l'imaging a fluorescenza. Impostare le impostazioni appropriate di esposizione (89,506 ms), guadagno (10) e intensità (136) (Figura 5A).
      NOTA: Questi parametri variano a seconda dell'intensità di fluorescenza delle cellule che esprimono la proteina fluorescente.
    5. Selezionare un intervallo di z-stack in μm, impostare le posizioni superiore e inferiore e configurare lo z-stack in contrasto di fase (Figura 5A). Fare clic su Interrompi per chiudere l'opzione Live.
    6. Impostare la durata (48 h) e l'intervallo di tempo (30 min) utilizzando i campi Durata e Intervallo di tempo per l'imaging time-lapse.
    7. Fare clic su Avvia per iniziare l'imaging per 48 ore (Figura 5A). Salvare il progetto dopo 48 ore (Figura 5A).
    8. In ogni punto temporale (0 h e 48 h), selezionare il fotogramma migliore dallo z-stack ed esportare l'immagine (Figura 5A).
    9. Contare le celle GFP-positive a 0 h e 48 h, calcolare l'aumento percentuale delle celle GFP-positive e analizzare i dati utilizzando un programma software appropriato (Figura 1D,E).
  7. Generazione di filmati
    1. Fare clic su Mostra galleria per visualizzare tutte le immagini acquisite organizzate per punti temporali e livelli z-stack (Figura 5B).
    2. Per ogni punto temporale, fai clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine più focalizzata dallo z-stack corrispondente e seleziona Seleziona pollici in una riga. Salvare i fotogrammi selezionati (Figura 5B).
    3. Ripetere questo processo individualmente per ogni posizione. Per facilitare la selezione delle immagini più a fuoco, utilizzare la funzione Trova le migliori cornici a fuoco. Salva le immagini selezionate tramite l'opzione Salva fotogrammi selezionati. Le immagini salvate vengono caricate automaticamente nella sezione Apri progetto.
    4. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul filmato e selezionare Esporta immagine una volta che le sequenze di immagini sono completamente caricate.
    5. Passare alla scheda Filmato nella finestra di esportazione, impostare la frequenza fotogrammi desiderata (fotogrammi al secondo), selezionare opzioni aggiuntive come la barra di scala, il timestamp, ecc., se necessario, e finalizzare l'esportazione scegliendo una destinazione utilizzando l'opzione Sfoglia (Figura 5B, Video 1, Video 2 e Video 3).

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Risultati

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Questa serie rappresentativa di esperimenti ha studiato i potenziali effetti del fenotipo secretorio associato alla senescenza derivato da cellule tumorali senescenti su altre cellule tumorali. Pertanto, è stato confermato per la prima volta se il trattamento con doxorubicina per 72 ore potesse indurre la senescenza nelle cellule HeLa utilizzando la colorazione SA-β-Gal. Nelle cellule senescenti, l'enzima lisosomiale β-galattosidasi rimane attivo anche a pH basso e scinde il substrato cromogenico X-gal, formando un preci...

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Discussione

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Le interazioni dinamiche delle cellule tumorali nel loro microambiente sono cruciali per la progressione del tumore, che influenza l'induzione di metastasi e lo sviluppo di un tumore secondario. È stato anche riportato che il cancro senescente e le cellule stromali regolano i microambienti tumorali attraverso i fattori secreti dalle cellule senescenti4. Questi fattori stimolano la proliferazione, la migrazione, l'invasione, la differenziazione cellulare

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato supportato dall'Unità di Progetto Scientifico dell'Università di Gazi (codice sovvenzione: TOA-2021-7321) e TUBITAK (codice sovvenzione: 122S564 e 223S969).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
µ-Slide 8 Well highfigure-materials-1bidi80806
0,05% Tripsina-EDTA (1X)Gibco25300-054
Unità di filtro centrifugo Amicon Ultra (Ultracel-3K)MilliporeUFC200324
Incubatore CO2 (37° C, 5% CO2)Sanyo
CO2-Controllore 2000 Pecon 
DMEMGibco41966-029
DoxorubicinaTocris2252
E-plate INSERT 16 ACEA Biosciences/Agilent6 465 382 001
E-plate VIEW 16 ACEA Biosciences/Agilent300 601 140
FBSGibcoA5256701
Cellule HeLafigure-materials-2AP Institute, Ankara, TurchiaHÜ KÜ K No: 90061901 
Microscopio a fluorescenza invertita Leica DMi8  Leica
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Gibco70011-044
kit di colorazione β-galactosidasi (SA-β-gal) associata alla senescenza  Segnalazione cellulare9860S
Sistema di incubazione a livello superiorePecon 
Regolatore di temperatura 2002-2 Pecon 
Tintura blu TrypanSigmaT8154
xCELLigence RTCA DP system ACEA Biosciences/Agilent

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  16. zdemir, A., Ibisoglu, B., Simay, Y. D., Polat, B., Ark, M. Ouabain induces Rho-dependent rock activation and membrane blebbing in cultured endothelial cells. Mol Biol. 49 (1), 138-143 (2015).
  17. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  18. Simay Demir, Y. D., et al. Antimigratory effect of pyrazole derivatives through the induction of STAT1 phosphorylation in A549 cancer cells. J Pharm Pharmacol. 73 (6), 808-815 (2021).
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  20. Li, D., et al. Decoding the crossroads of aging and cancer through single-cell analysis: Implications for precision oncology. Int J Cancer. 157 (5), 807-818 (2025).

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